Lê Đăng Huy: Phát hiện hợp chất ức chế enzym protease mpro và plpro của virus SARS-CoV-2

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu Lê đăng huy phát hiện hợp chất ức chế enzym protease mpro và plpro của virus sars cov 2 sử dụng mô, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Lê Đăng Huy
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thế Hải
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Phát hiện hợp chất ức chế enzym protease (Mpro và PLpro) của virus SARS-CoV-2 sử dụng mô phỏng động lực học phân tử
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về protease của SARS-CoV-2
• 1.2. Cấu trúc và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2
• 1.3. Protease của virus SARS-CoV-2
• 1.4. Sự tương đồng giữa các chủng coronavirus
• 1.5. Cấu trúc của Mpro và PLpro
• 1.6. Tổng quan về mô phỏng động lực học phân tử
• 1.7. Đại cương về mô phỏng động lực học phân tử. Năng lượng tự do liên kết
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Xây dựng mô hình 2D QSAR và sàng lọc sơ bộ
• 2.5. Mô phỏng docking
• 2.6. Mô phỏng động lực học phân tử
• 2.7. Kiểm tra tính ổn định của phức hợp
• 2.8. Tính toán năng lượng tự do liên kết
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Xây dựng mô hình 2D QSAR và sàng lọc sơ bộ
• 3.2. Mô phỏng docking
• 3.3. Mô phỏng động lực học phân tử
• 3.4. Ưu điểm của phương pháp
• 3.5. Nhược điểm của phương pháp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hợp chất ức chế enzym protease SARS CoV 2

Nghiên cứu về hợp chất ức chế enzym protease của virus SARS-CoV-2 đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho COVID-19. Virus SARS-CoV-2, gây ra đại dịch toàn cầu, có hai loại protease chính là Mpro và PLpro, đóng vai trò quan trọng trong chu trình sinh sản của virus. Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế này thông qua mô phỏng động lực học phân tử không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của virus mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị. Nghiên cứu này sẽ trình bày tổng quan về các phương pháp hiện có và những thách thức trong việc phát hiện các hợp chất tiềm năng.

1.1. Ứng dụng của mô phỏng động lực học phân tử trong nghiên cứu

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) là một công cụ mạnh mẽ trong việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein. Bằng cách mô phỏng các tương tác giữa ligand và protein, MD giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế enzym protease SARS-CoV-2. Phương pháp này cho phép nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc của protein trong quá trình tương tác, từ đó đánh giá được tính ổn định và hoạt tính của các hợp chất tiềm năng.

1.2. Tầm quan trọng của protease trong chu trình sinh sản của virus

Protease Mpro và PLpro là hai enzym chính trong quá trình phân cắt polyprotein của virus SARS-CoV-2. Chúng không chỉ tham gia vào việc tạo ra các protein cần thiết cho sự sinh sản của virus mà còn có khả năng điều chỉnh các phản ứng miễn dịch của tế bào chủ. Do đó, việc phát triển các hợp chất ức chế nhắm vào các enzym này có thể làm giảm khả năng lây lan và tăng cường hiệu quả điều trị.

II. Thách thức trong việc phát hiện hợp chất ức chế enzym protease SARS CoV 2

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu hợp chất ức chế enzym, vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phát hiện và phát triển các hợp chất này. Một trong những thách thức lớn nhất là sự đa dạng của virus SARS-CoV-2 và các biến thể của nó. Các biến thể này có thể làm thay đổi cấu trúc của protease, từ đó ảnh hưởng đến khả năng tương tác với các hợp chất ức chế. Hơn nữa, việc phát hiện các hợp chất có hoạt tính cao trong một thời gian ngắn là một nhiệm vụ khó khăn, đòi hỏi sự kết hợp giữa các phương pháp nghiên cứu hiện đại và truyền thống.

2.1. Sự đa dạng của các biến thể virus và ảnh hưởng đến nghiên cứu

SARS-CoV-2 đã xuất hiện nhiều biến thể với các đột biến khác nhau, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protease. Những biến thể này có thể làm giảm hiệu quả của các hợp chất ức chế đã được phát triển, do đó cần có các nghiên cứu liên tục để cập nhật và điều chỉnh các phương pháp điều trị.

2.2. Khó khăn trong việc sàng lọc hợp chất tiềm năng

Quá trình sàng lọc các hợp chất tiềm năng để ức chế enzym protease thường gặp khó khăn do số lượng lớn các hợp chất cần được kiểm tra. Việc sử dụng các phương pháp như mô phỏng động lực học phân tử có thể giúp giảm thiểu thời gian và chi phí, nhưng vẫn cần có sự kết hợp với các thử nghiệm thực nghiệm để xác nhận hoạt tính của các hợp chất.

III. Phương pháp nghiên cứu hợp chất ức chế enzym protease SARS CoV 2

Nghiên cứu này áp dụng các phương pháp hiện đại để phát hiện và đánh giá hoạt tính của các hợp chất ức chế enzym protease SARS-CoV-2. Các phương pháp chính bao gồm mô phỏng docking, mô phỏng động lực học phân tử và xây dựng mô hình QSAR. Những phương pháp này cho phép đánh giá khả năng tương tác giữa các hợp chất và enzym, từ đó xác định được các hợp chất tiềm năng có thể phát triển thành thuốc điều trị.

3.1. Mô phỏng docking để xác định tương tác ligand protein

Mô phỏng docking là một phương pháp quan trọng trong việc xác định cách mà các hợp chất ức chế tương tác với protease. Phương pháp này cho phép dự đoán vị trí liên kết và năng lượng liên kết của các hợp chất, từ đó giúp chọn lọc các hợp chất có khả năng ức chế cao nhất.

3.2. Mô phỏng động lực học phân tử để đánh giá tính ổn định

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) được sử dụng để theo dõi sự thay đổi cấu trúc của protease trong quá trình tương tác với các hợp chất. Phương pháp này giúp đánh giá tính ổn định của phức hợp ligand-protein và cung cấp thông tin về động lực học của quá trình ức chế enzym.

3.3. Xây dựng mô hình QSAR để dự đoán hoạt tính

Mô hình QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) được xây dựng để dự đoán hoạt tính của các hợp chất dựa trên cấu trúc hóa học của chúng. Phương pháp này giúp tối ưu hóa quá trình phát hiện các hợp chất ức chế bằng cách xác định các đặc điểm cấu trúc quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số hợp chất ức chế enzym có hoạt tính cao đối với protease SARS-CoV-2. Các hợp chất này không chỉ thể hiện khả năng ức chế mạnh mà còn có tính ổn định cao trong các mô phỏng động lực học phân tử. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị COVID-19, đặc biệt là trong bối cảnh các biến thể virus đang gia tăng.

4.1. Các hợp chất tiềm năng được phát hiện

Nghiên cứu đã phát hiện ra một số hợp chất có khả năng ức chế Mpro và PLpro với hoạt tính cao. Những hợp chất này có thể được phát triển thành thuốc điều trị COVID-19, giúp giảm thiểu tác động của đại dịch.

4.2. Ứng dụng trong phát triển thuốc điều trị

Các hợp chất ức chế enzym được phát hiện có thể được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả điều trị. Việc phát triển các phương pháp điều trị mới từ những hợp chất này có thể giúp cải thiện tình hình sức khỏe cộng đồng trong bối cảnh dịch bệnh.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu

Nghiên cứu về hợp chất ức chế enzym protease SARS-CoV-2 thông qua mô phỏng động lực học phân tử đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển thuốc điều trị COVID-19. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng với sự phát triển của công nghệ và phương pháp nghiên cứu, hy vọng sẽ có nhiều hợp chất tiềm năng được phát hiện và phát triển trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu hợp chất ức chế

Nghiên cứu trong lĩnh vực này sẽ tiếp tục được mở rộng với sự kết hợp của các công nghệ mới, giúp phát hiện nhanh chóng và hiệu quả hơn các hợp chất ức chế. Điều này không chỉ có ý nghĩa trong việc điều trị COVID-19 mà còn trong việc phòng ngừa các dịch bệnh do virus khác.

5.2. Tầm quan trọng của hợp tác nghiên cứu

Sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu, tổ chức y tế và ngành công nghiệp dược phẩm là rất quan trọng để thúc đẩy quá trình phát triển thuốc. Việc chia sẻ dữ liệu và kinh nghiệm sẽ giúp tăng cường hiệu quả nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị mới.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đại dịch COVID-19 do virus SARS-CoV-2 gây ra bùng phát từ tháng 12 năm 2019 tại Vũ Hán (Trung Quốc) đã tạo nên cuộc khủng hoảng y tế công cộng trên phạm vi toàn cầu. Tính đến ngày 12 tháng 6 năm 2022, toàn thế giới ghi nhận hơn 533 triệu ca nhiễm và trên 6,3 triệu ca tử vong. Bệnh biểu hiện lâm sàng đa dạng từ nhẹ đến nặng, bao gồm hội chứng suy hô hấp cấp tính, tổn thương phổi cấp tính và suy đa cơ quan. Trong các chiến lược ứng phó, phát triển phác đồ điều trị bằng thuốc đóng vai trò trọng yếu. Tuy nhiên, quy trình nghiên cứu và phát triển thuốc truyền thống từ khâu sàng lọc hoạt chất đến thử nghiệm lâm sàng thường kéo dài trung bình 14 năm với kinh phí lên tới 800 triệu đô la Mỹ. Nhằm rút ngắn thời gian và tối ưu hóa chi phí, phương pháp thiết kế thuốc có sự trợ giúp của máy tính (CADD) được ứng dụng rộng rãi.

Hai cystein protease thiết yếu trong vòng đời của SARS-CoV-2 là protease chính (Mpro, mã hóa bởi nsp5) và protease giống papain (PLpro, thuộc nsp3). Cả hai enzym này chịu trách nhiệm phân cắt hai polyprotein pp1a và pp1ab thành 16 protein phi cấu trúc, đảm bảo quá trình sao chép và phiên mã của virus. Đáng chú ý, các acid amin xúc tác và cấu trúc không gian của Mpro và PLpro được bảo tồn rất cao giữa các biến thể SARS-CoV-2 cũng như giữa các chủng coronavirus ở người (SARS-CoV, MERS-CoV). Việc nhắm đích đồng thời cả Mpro và PLpro bằng các phân tử nhỏ không phải peptidomimetic và không tạo liên kết cộng hóa trị hứa hẹn mang lại hiệu quả kháng virus phổ rộng, hạn chế nguy cơ kháng thuốc do đột biến và giảm thiểu độc tính trên tế bào vật chủ.

Khóa luận xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Đề xuất được phương pháp sàng lọc nhiều lớp có thể áp dụng trên số lượng lớn các chất để tìm ra chất có hoạt tính ức chế đồng thời Mpro và PLpro của virus SARS-CoV-2.
2. Đánh giá được hoạt tính các chất tiềm năng bằng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử.

Đối tượng nghiên cứu là hai enzym Mpro và PLpro của virus SARS-CoV-2, cùng các phân tử nhỏ không tạo liên kết cộng hóa trị, không có cấu trúc khung peptidomimetic. Phạm vi không gian và dữ liệu nghiên cứu bao gồm: cấu trúc tinh thể tia X độ phân giải cao của Mpro (mã PDB: 7LMD) và PLpro (mã PDB: 7LBR) từ ngân hàng dữ liệu Protein Data Bank (biểu hiện trên chủng Escherichia coli BL21); tập dữ liệu thực nghiệm gồm 100 chất ức chế Mpro và 91 chất ức chế PLpro đã công bố giá trị $IC_{50}$; và thư viện 7,3 triệu hợp chất thỏa mãn quy tắc 5 điểm Lipinski trích xuất từ cơ sở dữ liệu ZINC. Toàn bộ nghiên cứu tính toán được thực hiện tại Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, hoàn thành vào tháng 06 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở sinh học phân tử về chu kỳ nhân lên của SARS-CoV-2. Bộ gen ARN sợi đơn dương chứa hai khung đọc mở ORF1a và ORF1b dịch mã thành pp1a và pp1ab. Enzym Mpro hoạt động ở dạng dimer, cắt polyprotein tại 11 vị trí theo mô típ bảo tồn X-(Leu/Phe/Met)-Gln↓(Gly/Ala/Ser)-X, dựa trên bộ đôi xúc tác Cys145-His41. Enzym PLpro hoạt động ở dạng monomer gồm 4 miền (Ubl, ngón cái, ngón tay chứa cụm ngón tay kẽm tạo bởi Cys189, Cys192, Cys224, Cys226, và lòng bàn tay), nhận diện mô típ Leu-X-Gly-Gly↓X tại 3 vị trí phân cắt, đồng thời mang hoạt tính khử ubiquitin và loại bỏ ISG15 ở tế bào chủ để ức chế miễn dịch bẩm sinh. Bộ ba xúc tác của PLpro là Cys111-His272-Asp286 kết hợp lỗ oxyanion chứa Trp106.

Về mặt tính toán hóa dược, nghiên cứu triển khai quy trình sàng lọc ảo tích hợp ba phương pháp kế tiếp nhau:

• Mô hình tương quan định lượng cấu trúc - tác dụng hai chiều (2D QSAR): Xây dựng bằng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến (MLR) kết hợp thuật toán di truyền (GA) và quy tắc QUIK (ngưỡng $\delta K = 0,05$) để chọn lọc tập con tối ưu từ 4179 tham số phân tử 2D tính toán bằng phần mềm AlvaDesc 2.0. Tập dữ liệu được phân chia thành tập huấn luyện và tập kiểm tra theo trật tự cấu trúc (tỷ lệ 80:20 cho Mpro và 74:17 cho PLpro). Mô hình được kiểm chứng sự phù hợp ($R^2$, $R^2_{adj}$), kiểm chứng nội qua thẩm định chéo loại một mẫu ($Q^2_{LOO}$), loại nhiều mẫu ($Q^2_{LMO}$ với 2000 lần lặp, loại 30% mẫu), xáo trộn ngẫu nhiên biến phản hồi Y (Y-randomization với 2000 lần lặp để thu được $R^2_Y$ và $Q^2_Y$), kiểm chứng ngoại ($Q^2_{F1}$, $Q^2_{F2}$, $Q^2_{F3}$) và xác định miền ứng dụng (AD) thông qua biểu đồ Williams với ngưỡng đòn bẩy $h^* = 3p'/n$.
• Mô phỏng gắn kết phân tử (Molecular Docking): Thực hiện trên phần mềm MOE 2009.10 với trường lực Amber10:EHT. Thuật toán Triangle Matcher được sử dụng để tìm kiếm cấu dạng phối tử, chấm điểm sơ bộ bằng hàm London dG và tái chấm điểm 30 cấu dạng hàng đầu bằng hàm Affinity dG. Quy trình gồm docking chéo các chất đã có hoạt tính thực nghiệm trên một enzym sang enzym còn lại, đồng thời docking 30 chất có hoạt tính dự đoán tốt nhất từ 2D QSAR vào cả hai đích Mpro và PLpro.
• Mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics - MD): Thiết lập hệ mô phỏng bằng công cụ CHARMM-GUI và thực hiện bằng phần mềm NAMD 2. Cấu trúc phức hợp protein-phối tử được đặt trong hộp nước chữ nhật có khoảng cách biên 20 Å, trung hòa điện tích bằng ion NaCl theo phương pháp Monte-Carlo. Tương tác tĩnh điện tầm xa được xử lý bằng thuật toán Particle-Mesh Ewald (PME). Hệ được cân bằng và mô phỏng ở điều kiện đẳng nhiệt - đẳng áp (NPT) tại 298,15 K trong thời gian 100 ns (ghi nhận 1000 khung hình). Độ ổn định của hệ được đánh giá qua độ lệch bình phương gốc (RMSD), dao động bình phương gốc của từng acid amin (RMSF) và khoảng cách liên kết hydro (ngưỡng $\le 3,5$ Å).
• Tính toán năng lượng tự do liên kết: Sử dụng phương pháp cơ học phân tử kết hợp diện tích bề mặt Born khái quát hóa (MM/GBSA) tích hợp trong công cụ MolAICal, tính toán trên quỹ đạo đơn trong 40 ns mô phỏng cuối cùng khi hệ đạt trạng thái cân bằng.

Hệ thống phần mềm hỗ trợ gồm: ClustalW, ChemDraw Ultra 12.0, Open Babel, QSARINS 2.0, VMD, PyMOL 2.2, Mona và Microsoft Excel 365, vận hành trên máy tính cá nhân Asus X556UF (Windows 10) và hệ thống máy chủ ảo Google Cloud.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương tổng quan hệ thống hóa cấu trúc bộ gen và các bước dịch mã ban đầu của virus SARS-CoV-2. Tác giả phân tích chuyên sâu về sự tương đồng trình tự và cấu trúc ba chiều của Mpro và PLpro trên ba chủng coronavirus gây nhiễm ở người: trình tự Mpro của SARS-CoV-2 đồng nhất 96% với SARS-CoV và 50% với MERS-CoV; trình tự PLpro của SARS-CoV-2 đồng nhất 83% với SARS-CoV và 31% với MERS-CoV. Đáng chú ý, các acid amin xúc tác bảo tồn 100%, khẳng định đây là các đích phân tử lý tưởng cho phát triển thuốc kháng virus phổ rộng.

Chương này trình bày chi tiết chu trình xúc tác 5 bước của Mpro qua bộ đôi Cys145-His41 và PLpro qua bộ ba Cys111-His272-Asp286. Cơ sở lý thuyết của mô phỏng MD được làm rõ thông qua định luật Newton và các thành phần trường lực (thế năng liên kết, biến dạng góc, góc nhị diện, tương tác tĩnh điện Coulomb và tương tác van der Waals). Đồng thời, tác giả so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp tính năng lượng tự do liên kết điểm cuối (MM/PBSA, MM/GBSA, LIE) và phương pháp chuyển đổi trạng thái giả kim.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm in silico theo sơ đồ đa lớp:

• Chuẩn bị tập dữ liệu: Thu thập 100 chất ức chế Mpro và 91 chất ức chế PLpro từ các công trình công bố, chuyển đổi giá trị thực nghiệm sang dạng $pIC_{50} = -\log(IC_{50})$.
• Lọc tham số phân tử: Sử dụng AlvaDesc thu được 4179 tham số 2D, loại bỏ các tham số thiếu giá trị, tham số có độ biến thiên thấp (trên 80% hợp chất có cùng giá trị) và các cặp tham số có hệ số tương quan $\ge 0,95$.
• Xây dựng mô hình 2D QSAR: Sử dụng phần mềm QSARINS 2.0 để huấn luyện mô hình MLR kết hợp GA, thiết lập quy chuẩn kiểm chứng nội (LOO CV, LMO CV 2000 chu kỳ), kiểm chứng ngoại trên tập test và phân tích miền ứng dụng qua giá trị đòn bẩy $h_i$ so với ngưỡng cảnh báo $h^*$.
• Sàng lọc ảo và docking: Sàng lọc 7,3 triệu phân tử ZINC qua bộ lọc Lipinski, bộ lọc miền ứng dụng AD và ngưỡng hoạt tính dự đoán $pIC_{50} \ge 6,2$. Chuẩn bị cấu trúc protein 7LMD và 7LBR bằng MOE 2009.10 (loại phân tử nước, phối tử đồng kết tinh, gán trường lực Amber10:EHT). Tiến hành redock để thẩm định thông số, sau đó docking chéo tập chất thực nghiệm và docking 30 phối tử tiềm năng từ 2D QSAR vào vị trí hoạt động.
• Mô phỏng MD và MM/GBSA: Chuẩn bị hệ bằng CHARMM-GUI, chạy NAMD 2 trong 100 ns ở điều kiện NPT 298,15 K, phân tích quỹ đạo bằng VMD để thu nhận dữ liệu RMSD, RMSF, mạng lưới liên kết hydro, và dùng MolAICal tính toán năng lượng tự do liên kết $\Delta G_{bind}$ trên 40 ns cuối.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả tính toán chi tiết kèm theo bàn luận khoa học:

1. Mô hình 2D QSAR: Phương trình hồi quy tốt nhất cho PLpro được xác lập: $$pIC_{50} = -0,9350 \times \text{VE1sign_H2} + 1,6334 \times \text{VE1sign_Dz(p)} + 1,3504 \times \text{MATS7m} - 0,9554 \times \text{GATS4m} - 1,3334 \times \text{P_VSA_v_3} + 3,884 \times \text{P_VSA_ppp_cyc} - 1,6052 \times \text{SaaCH} + 4,0988$$

Chỉ số thống kê	Mô hình Mpro	Mô hình PLpro
Tương quan tham số $K_{XX}$	0,3754	0,3674
Ngưỡng tương quan $\delta K$	0,0505	0,0643
Hệ số xác định tập huấn luyện $R^2$	0,8944	0,9165
Hệ số xác định hiệu chỉnh $R^2_{adj}$	0,8841	0,9076
Kiểm chứng chéo nội $Q^2_{LOO}$	0,8711	0,8965
Độ lệch ổn định $R^2 - Q^2_{LOO}$	0,0233	0,0200
Kiểm chứng chéo $Q^2_{LMO}$	0,8643	0,8901
Xáo trộn ngẫu nhiên $R^2_Y$	0,0893	0,0952
Xáo trộn ngẫu nhiên $Q^2_Y$	-0,1290	-0,1440
Kiểm chứng ngoại $Q^2_{F1}$	0,7441	0,8039
Kiểm chứng ngoại $Q^2_{F2}$	0,7423	0,8039
Kiểm chứng ngoại $Q^2_{F3}$	0,7617	0,8518
Ngưỡng đòn bẩy miền ứng dụng $h^*$	0,300	0,324

Biểu đồ Williams xác nhận hầu hết các chất đều nằm trong miền ứng dụng; chỉ có duy nhất 1 chất trong mô hình PLpro nằm ngoài AD ($h_i = 0,3287 > h^* = 0,324$).

2. Mô phỏng docking: Kết quả redock tái lập chính xác vị trí liên kết của phối tử đồng kết tinh với RMSD là 1,1642 Å đối với Mpro và 1,0732 Å đối với PLpro. Docking chéo và sàng lọc xác định được ba ứng viên tiêu biểu có khả năng ức chế kép:

Phối tử	Đích Mpro: Điểm docking	Đích Mpro: $pIC_{50}$	Đích PLpro: Điểm docking	Đích PLpro: $pIC_{50}$
Đồng kết tinh (Redock)	-5,67	—	-7,14	—
PL64 (công bố trên PLpro)	-5,84	—	—	5,96 (thực nghiệm)
M88 (công bố trên Mpro)	—	7,44 (thực nghiệm)	-10,09	—
1687828 (từ ZINC)	-7,47	6,46 (dự đoán)	-7,06	6,25 (dự đoán)

3. Mô phỏng động lực học phân tử (MD 100 ns): Biểu đồ RMSF cho thấy toàn bộ các acid amin thuộc túi gắn của cả hai enzym đều ổn định (RMSF < 2 Å). Độ biến thiên vị trí của phối tử trong 40 ns cuối đạt trạng thái bền vững:

Phức hợp mô phỏng	Giá trị RMSD phối tử 40 ns cuối (Å)
Mpro_PL64	$2,82 \pm 0,48$
Mpro_1687828	$7,55 \pm 0,51$
PLpro_M88	$4,09 \pm 0,69$
PLpro_1687828	$5,17 \pm 1,08$

4. Phân tích tương tác tại cấu dạng cuối:

Phức hợp	Liên kết hydro chính	Liên kết hydro phụ	Tương tác kỵ nước
Mpro_PL64	Cys44, Gly143, Glu166	His41, Ser144 (2)	Met165, Thr45, Arg166, Glu166
Mpro_1687828	Cys44 (2), Asp187	Thr24, Asp187	Thr190
PLpro_M88	Tyr264, Gln269	Arg166	Pro248, Tyr264
PLpro_1687828	Gly266 (2)	—	Pro247, Tyr264, Tyr268

5. Năng lượng tự do liên kết MM/GBSA (40 ns cuối):

Phức hợp	$E_{int}$ ($10^{-4}$ kJ/mol)	$E_{ele} + G_{sol}$ (kJ/mol)	$E_{vdW} + G_{sol}$ (kJ/mol)	$\Delta G_{bind}$ (kJ/mol)
Mpro_Đồng kết tinh	-8,32	37,31	-145,18	-107,87
Mpro_PL64	-13,54	37,18	-165,00	-127,83
Mpro_1687828	-12,08	29,51	-182,42	-152,91
PLpro_Đồng kết tinh	0,87	51,21	-143,41	-92,21
PLpro_M88	1,83	52,42	-150,29	-97,87
PLpro_1687828	1,04	62,64	-155,74	-93,10

Tác giả dành hai tiểu mục cuối để bàn luận về ưu điểm (tiết kiệm thời gian, chi phí, giải quyết được quy mô dữ liệu lớn, độ tin cậy nâng dần qua từng bậc sàng lọc) và nhược điểm của phương pháp (phụ thuộc miền ứng dụng của QSAR, mô phỏng docking loại bỏ phân tử nước và cố định thụ thể, hạn chế tài nguyên phần cứng khiến số lượng chạy MD bị giới hạn).

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu được các kết quả định lượng cụ thể:

• Thiết lập thành công hai mô hình 2D QSAR có độ tin cậy và khả năng ngoại suy cao đối với Mpro ($R^2 = 0,8944$; $Q^2_{LOO} = 0,8711$; $Q^2_{F1} = 0,7441$) và PLpro ($R^2 = 0,9165$; $Q^2_{LOO} = 0,8965$; $Q^2_{F1} = 0,8039$).
• Thực hiện sàng lọc ảo thành công trên cơ sở dữ liệu quy mô lớn gồm 7,3 triệu phân tử ZINC, thu hẹp xuống 30 cấu trúc tiềm năng nhất thỏa mãn đồng thời tiêu chuẩn miền ứng dụng và ngưỡng hoạt tính dự đoán $pIC_{50} \ge 6,2$ trên cả hai đích enzym.
• Phát hiện ba hợp chất tiềm năng có khả năng ức chế đồng thời Mpro và PLpro: hợp chất mới 1687828 trích xuất từ ZINC (điểm docking Mpro: -7,47; PLpro: -7,06; $pIC_{50}$ dự đoán lần lượt là 6,46 và 6,25) cùng hai hợp chất đối chứng tái định vị từ dữ liệu thực nghiệm là PL64 (điểm docking trên Mpro đạt -5,84 so với redock -5,67; $pIC_{50}$ thực nghiệm trên PLpro là 5,96) và M88 (điểm docking trên PLpro đạt -10,09 so với redock -7,14; $pIC_{50}$ thực nghiệm trên Mpro là 7,44).
• Chứng minh tính bền vững nhiệt động của các phức hợp qua mô phỏng MD 100 ns: tất cả các phức hợp đều đạt trạng thái cân bằng trong 40 ns cuối với độ dao động RMSD thấp ($< 1,1$ Å). Năng lượng tự do liên kết MM/GBSA tính toán được của các ứng viên đều âm hơn (ái lực liên kết tốt hơn) so với phối tử đồng kết tinh chuẩn: $\Delta G_{bind}$ của Mpro_PL64 (-127,83 kJ/mol) và Mpro_1687828 (-152,91 kJ/mol) vượt trội so với đối chứng (-107,87 kJ/mol); $\Delta G_{bind}$ của PLpro_M88 (-97,87 kJ/mol) và PLpro_1687828 (-93,10 kJ/mol) tốt hơn phối tử đồng kết tinh của PLpro (-92,21 kJ/mol).
• Đóng góp khoa học của tác giả: Đã xây dựng và hoàn thiện một quy trình sàng lọc ảo đa tầng hoàn chỉnh (kết hợp 2D QSAR $\rightarrow$ Molecular Docking $\rightarrow$ MD $\rightarrow$ MM/GBSA). Quy trình này khắc phục được nhược điểm tốn kém tài nguyên tính toán khi xử lý thư viện hàng triệu hợp chất, đồng thời giải quyết bài toán tìm kiếm chất ức chế kép tác động đồng thời trên hai đích protease có cơ chế phân tử khác nhau của virus SARS-CoV-2.

Tác giả đề xuất các kiến nghị: ứng dụng mô hình học sâu và mạng nơ-ron nhân tạo để nâng cao độ chính xác của bước sàng lọc QSAR; mở rộng kích thước tập dữ liệu huấn luyện thực nghiệm; nâng cao năng lực máy tính để mở rộng số lượng phức hợp chạy MD; và tiến hành tối ưu hóa hóa dược đối với cấu trúc của 1687828 và M88 (biến đổi các nhóm thế linh động như vòng imidazole hoặc vòng 2,6-difluorobenzyl) nhằm gia tăng ái lực và độ bền liên kết.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự xác định các hạn chế kỹ thuật:

• Mô hình 2D QSAR chỉ có giá trị dự đoán trong phạm vi miền ứng dụng (AD) xây dựng từ tập dữ liệu thực nghiệm sẵn có, do đó có thể bỏ sót các khung cấu trúc mới có hoạt tính nằm ngoài AD.
• Mô phỏng docking được thực hiện ở chế độ bán linh động (cố định khung protein, chỉ phối tử linh động) và loại bỏ hoàn toàn các phân tử nước trong tinh thể nhằm giảm áp lực tính toán, dẫn đến kết quả điểm docking chưa phản ánh trọn vẹn trạng thái sinh lý trong tế bào.
• Do rào cản về thời gian và tài nguyên phần cứng (vận hành trên máy tính cá nhân và máy chủ ảo hạn chế), nghiên cứu chỉ thực hiện mô phỏng MD 100 ns trên một số lượng rất ít các phức hợp hàng đầu, chưa thể bao quát toàn bộ các chất tiềm năng từ bước docking.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Mở rộng thu thập dữ liệu $IC_{50}$ thực nghiệm mới được công bố để tái huấn luyện và mở rộng miền ứng dụng của mô hình QSAR.
• Ứng dụng các thuật toán máy học tiên tiến (học sâu, mạng nơ-ron nhân tạo) trong việc dự đoán ái lực liên kết.
• Tăng số lượng phức hợp chạy mô phỏng MD và kéo dài thời gian mô phỏng.
• Dựa trên các phân tích tương tác cấu dạng cuối, thiết kế dẫn chất tối ưu hóa cấu trúc của các phối tử tiềm năng (1687828, M88) và tiến hành thử nghiệm sinh học in vitro nhằm kiểm chứng hoạt tính kháng virus thực tế.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược học, Hóa dược, Tin sinh học và Công nghệ sinh học định hướng thiết kế thuốc bằng máy tính (CADD).
• Các nhà nghiên cứu đang phát triển thuốc kháng virus nhắm vào các protease của coronavirus hoặc các đích enzym tương tự.
• Những nội dung đáng tham khảo chuyên sâu gồm:
  • Quy trình xây dựng và thẩm định nghiêm ngặt mô hình QSAR theo tiêu chuẩn quốc tế (kiểm tra đa cộng tuyến QUIK, thẩm định chéo LMO, ngẫu nhiên hóa biến phản hồi Y, thiết lập miền ứng dụng qua biểu đồ Williams).
  • Phương pháp chuẩn hóa điểm số và thiết lập chỉ số đánh giá sàng lọc kép đồng thời trên hai thụ thể enzym.
  • Các bước thiết lập và phân tích động học phân tử chuyên sâu (theo dõi độ dài biến thiên liên kết hydro theo thời gian, phân tích dao động RMSF/RMSD, phân rã năng lượng tự do liên kết theo phương pháp MM/GBSA bằng MolAICal).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn đồng thời cả hai enzym Mpro và PLpro làm đích tác dụng?
Mpro và PLpro là hai protease đóng vai trò quyết định trong việc cắt polyprotein thành 16 protein phi cấu trúc để virus nhân lên. Cả hai đều có trung tâm xúc tác bảo tồn 100% giữa các biến thể SARS-CoV-2 và bảo tồn rất cao giữa các coronavirus (Mpro giống 96% SARS-CoV, PLpro giống 83% SARS-CoV). Việc ức chế đồng thời cả hai enzym giúp nâng cao hiệu quả kháng virus, ngăn chặn cơ chế bù trừ sinh học và hạn chế tối đa nguy cơ virus kháng thuốc qua đột biến.

2. Hợp chất 1687828 được tìm ra từ đâu và có đặc điểm tương tác nổi bật nào?
Hợp chất 1687828 được phát hiện từ quá trình sàng lọc 7,3 triệu chất trong cơ sở dữ liệu ZINC. Trong mô phỏng MD, 1687828 gắn kết rất bền vững với Mpro nhờ tạo 2 liên kết hydro chính với Cys44 và 1 liên kết hydro với Asp187 sau 40 ns, đạt năng lượng $\Delta G_{bind} = -152,91$ kJ/mol (vượt trội so với phối tử đồng kết tinh là -107,87 kJ/mol). Trên đích PLpro, chất này tạo 2 liên kết hydro với Gly266 cùng các tương tác kỵ nước với Pro247, Tyr264, Tyr268, đạt $\Delta G_{bind} = -93,10$ kJ/mol.

3. Vì sao giá trị RMSD của phối tử trong phức hợp PLpro_M88 và PLpro_1687828 lại dao động lớn hơn phức hợp trên Mpro?
Phân tích cấu dạng cuối cho thấy trong phức hợp PLpro_M88, nhánh chứa vòng 2,6-difluorobenzyl không tạo được tương tác với acid amin nào nên chuyển động tự do. Tương tự, ở phức hợp PLpro_1687828, vòng imidazole nhô ra ngoài túi liên kết và quay linh động theo nhiều hướng. Mặc dù phần mạch nhánh dao động làm tăng biên độ RMSD, phần khung chính đóng vai trò "lá chắn" che phủ bộ ba xúc tác vẫn được giữ cố định chắc chắn, đảm bảo hoạt tính ức chế enzym.

4. Mô hình 2D QSAR của PLpro phụ thuộc vào những tham số phân tử nào theo phương trình hồi quy?
Phương trình 2D QSAR của PLpro gồm 7 tham số phân tử: VE1sign_H2 (hệ số -0,9350), VE1sign_Dz(p) (+1,6334), MATS7m (+1,3504), GATS4m (-0,9554), P_VSA_v_3 (-1,3334), P_VSA_ppp_cyc (+3,884) và SaaCH (-1,6052), cùng hằng số tự do là +4,0988. Các tham số này phản ánh cấu trúc điện tử, diện tích bề mặt phân cực và phân bố khối lượng nguyên tử ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính $pIC_{50}$.

5. Kiểm chứng ngẫu nhiên hóa Y (Y-randomization) chứng minh điều gì cho hai mô hình QSAR?
Quy trình thực hiện 2000 chu kỳ hoán đổi ngẫu nhiên giá trị hoạt tính $pIC_{50}$ thực nghiệm cho thấy hệ số tương quan giảm mạnh: ở mô hình Mpro, $R^2_Y$ trung bình chỉ đạt 0,0893 và $Q^2_Y = -0,1290$; ở mô hình PLpro, $R^2_Y = 0,0952$ và $Q^2_Y = -0,1440$. Kết quả này khẳng định độ chính xác của hai mô hình gốc không phải do trùng hợp ngẫu nhiên mà xuất phát từ mối quan hệ nội tại thực sự giữa các tham số cấu trúc phân tử và hoạt tính ức chế.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của dược sĩ Lê Đăng Huy đã xây dựng thành công quy trình sàng lọc ảo tích hợp đa lớp từ 2D QSAR, Molecular Docking đến mô phỏng động lực học phân tử (MD) và MM/GBSA nhằm phát hiện các hợp chất ức chế kép trên cả Mpro và PLpro của SARS-CoV-2. Nghiên cứu đã sàng lọc thư viện 7,3 triệu hợp chất ZINC và phát hiện ứng viên tiềm năng 1687828, đồng thời chứng minh tiềm năng ức chế chéo của hai chất đã công bố là PL64 và M88 với ái lực liên kết nhiệt động vượt trội so với phối tử đồng kết tinh gốc. Công trình cung cấp hệ thống dữ liệu tính toán chi tiết, có cơ sở khoa học vững chắc và mở ra hướng đi triển vọng trong nghiên cứu phát triển thuốc kháng virus SARS-CoV-2 phổ rộng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về protease của SARS-CoV-2 1. Cấu trúc và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2 Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gây ra hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng, biểu hiện trên lâm sàng bao gồm sốt, ho khan và mệt mỏi và thường có liên quan đến phổi. SARS-CoV-2 dễ lây lan, có vật chủ là động vật hoang dã hoặc người [51].

Có bốn phân nhóm chính của coronavirus là α, β, γ và δ, trong đó SARS-CoV-2 là một loại β coronavirus [69]. Nhìn chung cấu trúc của SARS-CoV-2 mang đặc trưng của các chủng coronavirus, chứa sợi đơn ARN dương tính với đầu 5’ và đuôi 3’ poly-A, mã hóa bốn protein cấu trúc chính (S: gai; E: vỏ; M: màng; N: nucleocapsid) và nhiều protein phi cấu trúc (nsp). Hạt virion coronavirus thường có hình tròn hoặc nhiều hình dạng, có đường kính 120–160 nm. Protein S làm trung gian cho sự gắn kết của virus và hợp nhất màng trong quá trình lây nhiễm.

Protein M có 218-263 acid amin, có đầu tận cùng N được biến đổi bởi một O- hoặc N-glycan và một đầu tận cùng C ưa nước. Protein E, 74- 109 acid amin, có thể tham gia vào việc thúc đẩy độc lực của virus; thường có khoảng 20 bản sao của protein này trên mỗi virion. Protein N của coronavirus, 349-470 acid amin, là một protein được phosphoryl hóa liên kết với ARN, tạo điều kiện thuận lợi cho việc gấp bộ gen ARN vào nucleocapsid một cách thích hợp [29]. Chu kỳ xâm nhập và sao chép tế bào bắt đầu khi virus xâm nhập vào tế bào chủ, dẫn đến sự dung hợp màng tế bào - virus.

Sau quá trình nhập bào và thoát vỏ, hai phần ba bộ gen tính từ đầu 5’ bao gồm hai khung đọc mở (ORF1a và ORF1b) được dịch mã thành hai polyprotein (pp1a và pp1ab) thông qua cơ chế chuyển dịch khung ribosome. Hai polyprotein được phân cắt để tạo ra 16 protein phi cấu trúc, trong đó bao gồm hai cystein protease là Mpro (main protease hay 3-chymotrypsin-like protease, được mã hóa bởi nsp5) và PLpro (papain-like protease, được mã hóa trong nsp3) [22]. Những protease này là yếu tố chính cho sự phân cắt protein, đóng vai trò quan trọng trong vòng đời của virus. Bên cạnh việc phân cắt các cơ chất của virus, chúng cũng có thể sửa đổi hoặc vô hiệu hóa hoạt động của các protein tế bào, do đó làm tăng khả năng tương thích đối với virus [36].

Bước đầu quá trình dịch mã được thể hiện ở Hình 1. Bộ gen và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2 2 1. Protease của virus SARS-CoV-2 1. Sự tương đồng giữa các chủng coronavirus Tương tự như những phát hiện liên quan đến SARS-CoV [13] và coronavirus gây hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS-CoV) [67], SARS-CoV-2 được cho là lai giữa các loài để khởi phát các bệnh nhiễm trùng sơ cấp ở người; hiện nay nó lây lan chủ yếu qua đường lây truyền từ người sang người.

Trình tự bộ gen của SARS-CoV-2 có sự đồng nhất đến 80% với SARS-CoV và 50% với MERS-CoV [33]. Mặc dù giữa các chủng có những đột biến khác nhau, các protein quan trọng của các coronavirus được bảo tồn rất cao vì hầu hết các đột biến trong các protein này đều gây chết virus, trong đó có Mpro và PLpro [68]. Sự bắt cặp nhiều trình tự trên Mpro (A) và PLpro (B) ở ba chủng coronavirus ở người (SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV). Các cấu trúc thứ cấp được thể hiện ở dòng đầu tiên mỗi hàng.

Xoắn α được biểu thị bằng chuỗi xoắn và nếp gấp β được biểu thị bằng mũi tên. Các acid amin bảo tồn tuyệt đối được đánh dấu bằng màu đỏ và acid amin bảo tồn tương đối được đánh dấu bằng màu vàng. Acid amin xúc tác được đánh dấu bằng hình tam giác màu xanh.