Lê Đăng Huy: Phát hiện hợp chất ức chế enzym protease mpro và plpro của virus SARS-CoV-2

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu Lê đăng huy phát hiện hợp chất ức chế enzym protease mpro và plpro của virus sars cov 2 sử dụng mô, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Lê Đăng Huy
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thế Hải
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Phát hiện hợp chất ức chế enzym protease (Mpro và PLpro) của virus SARS-CoV-2 sử dụng mô phỏng động lực học phân tử
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về protease của SARS-CoV-2
• 1.2. Cấu trúc và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2
• 1.3. Protease của virus SARS-CoV-2
• 1.4. Sự tương đồng giữa các chủng coronavirus
• 1.5. Cấu trúc của Mpro và PLpro
• 1.6. Tổng quan về mô phỏng động lực học phân tử
• 1.7. Đại cương về mô phỏng động lực học phân tử. Năng lượng tự do liên kết
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Xây dựng mô hình 2D QSAR và sàng lọc sơ bộ
• 2.5. Mô phỏng docking
• 2.6. Mô phỏng động lực học phân tử
• 2.7. Kiểm tra tính ổn định của phức hợp
• 2.8. Tính toán năng lượng tự do liên kết
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Xây dựng mô hình 2D QSAR và sàng lọc sơ bộ
• 3.2. Mô phỏng docking
• 3.3. Mô phỏng động lực học phân tử
• 3.4. Ưu điểm của phương pháp
• 3.5. Nhược điểm của phương pháp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hợp chất ức chế enzym protease SARS CoV 2

Nghiên cứu về hợp chất ức chế enzym protease của virus SARS-CoV-2 đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả cho COVID-19. Virus SARS-CoV-2, gây ra đại dịch toàn cầu, có hai loại protease chính là Mpro và PLpro, đóng vai trò quan trọng trong chu trình sinh sản của virus. Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế này thông qua mô phỏng động lực học phân tử không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của virus mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị. Nghiên cứu này sẽ trình bày tổng quan về các phương pháp hiện có và những thách thức trong việc phát hiện các hợp chất tiềm năng.

1.1. Ứng dụng của mô phỏng động lực học phân tử trong nghiên cứu

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) là một công cụ mạnh mẽ trong việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein. Bằng cách mô phỏng các tương tác giữa ligand và protein, MD giúp xác định các hợp chất có khả năng ức chế enzym protease SARS-CoV-2. Phương pháp này cho phép nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc của protein trong quá trình tương tác, từ đó đánh giá được tính ổn định và hoạt tính của các hợp chất tiềm năng.

1.2. Tầm quan trọng của protease trong chu trình sinh sản của virus

Protease Mpro và PLpro là hai enzym chính trong quá trình phân cắt polyprotein của virus SARS-CoV-2. Chúng không chỉ tham gia vào việc tạo ra các protein cần thiết cho sự sinh sản của virus mà còn có khả năng điều chỉnh các phản ứng miễn dịch của tế bào chủ. Do đó, việc phát triển các hợp chất ức chế nhắm vào các enzym này có thể làm giảm khả năng lây lan và tăng cường hiệu quả điều trị.

II. Thách thức trong việc phát hiện hợp chất ức chế enzym protease SARS CoV 2

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu hợp chất ức chế enzym, vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phát hiện và phát triển các hợp chất này. Một trong những thách thức lớn nhất là sự đa dạng của virus SARS-CoV-2 và các biến thể của nó. Các biến thể này có thể làm thay đổi cấu trúc của protease, từ đó ảnh hưởng đến khả năng tương tác với các hợp chất ức chế. Hơn nữa, việc phát hiện các hợp chất có hoạt tính cao trong một thời gian ngắn là một nhiệm vụ khó khăn, đòi hỏi sự kết hợp giữa các phương pháp nghiên cứu hiện đại và truyền thống.

2.1. Sự đa dạng của các biến thể virus và ảnh hưởng đến nghiên cứu

SARS-CoV-2 đã xuất hiện nhiều biến thể với các đột biến khác nhau, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protease. Những biến thể này có thể làm giảm hiệu quả của các hợp chất ức chế đã được phát triển, do đó cần có các nghiên cứu liên tục để cập nhật và điều chỉnh các phương pháp điều trị.

2.2. Khó khăn trong việc sàng lọc hợp chất tiềm năng

Quá trình sàng lọc các hợp chất tiềm năng để ức chế enzym protease thường gặp khó khăn do số lượng lớn các hợp chất cần được kiểm tra. Việc sử dụng các phương pháp như mô phỏng động lực học phân tử có thể giúp giảm thiểu thời gian và chi phí, nhưng vẫn cần có sự kết hợp với các thử nghiệm thực nghiệm để xác nhận hoạt tính của các hợp chất.

III. Phương pháp nghiên cứu hợp chất ức chế enzym protease SARS CoV 2

Nghiên cứu này áp dụng các phương pháp hiện đại để phát hiện và đánh giá hoạt tính của các hợp chất ức chế enzym protease SARS-CoV-2. Các phương pháp chính bao gồm mô phỏng docking, mô phỏng động lực học phân tử và xây dựng mô hình QSAR. Những phương pháp này cho phép đánh giá khả năng tương tác giữa các hợp chất và enzym, từ đó xác định được các hợp chất tiềm năng có thể phát triển thành thuốc điều trị.

3.1. Mô phỏng docking để xác định tương tác ligand protein

Mô phỏng docking là một phương pháp quan trọng trong việc xác định cách mà các hợp chất ức chế tương tác với protease. Phương pháp này cho phép dự đoán vị trí liên kết và năng lượng liên kết của các hợp chất, từ đó giúp chọn lọc các hợp chất có khả năng ức chế cao nhất.

3.2. Mô phỏng động lực học phân tử để đánh giá tính ổn định

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) được sử dụng để theo dõi sự thay đổi cấu trúc của protease trong quá trình tương tác với các hợp chất. Phương pháp này giúp đánh giá tính ổn định của phức hợp ligand-protein và cung cấp thông tin về động lực học của quá trình ức chế enzym.

3.3. Xây dựng mô hình QSAR để dự đoán hoạt tính

Mô hình QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) được xây dựng để dự đoán hoạt tính của các hợp chất dựa trên cấu trúc hóa học của chúng. Phương pháp này giúp tối ưu hóa quá trình phát hiện các hợp chất ức chế bằng cách xác định các đặc điểm cấu trúc quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số hợp chất ức chế enzym có hoạt tính cao đối với protease SARS-CoV-2. Các hợp chất này không chỉ thể hiện khả năng ức chế mạnh mà còn có tính ổn định cao trong các mô phỏng động lực học phân tử. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị COVID-19, đặc biệt là trong bối cảnh các biến thể virus đang gia tăng.

4.1. Các hợp chất tiềm năng được phát hiện

Nghiên cứu đã phát hiện ra một số hợp chất có khả năng ức chế Mpro và PLpro với hoạt tính cao. Những hợp chất này có thể được phát triển thành thuốc điều trị COVID-19, giúp giảm thiểu tác động của đại dịch.

4.2. Ứng dụng trong phát triển thuốc điều trị

Các hợp chất ức chế enzym được phát hiện có thể được sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả điều trị. Việc phát triển các phương pháp điều trị mới từ những hợp chất này có thể giúp cải thiện tình hình sức khỏe cộng đồng trong bối cảnh dịch bệnh.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu

Nghiên cứu về hợp chất ức chế enzym protease SARS-CoV-2 thông qua mô phỏng động lực học phân tử đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển thuốc điều trị COVID-19. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng với sự phát triển của công nghệ và phương pháp nghiên cứu, hy vọng sẽ có nhiều hợp chất tiềm năng được phát hiện và phát triển trong tương lai.

5.1. Tương lai của nghiên cứu hợp chất ức chế

Nghiên cứu trong lĩnh vực này sẽ tiếp tục được mở rộng với sự kết hợp của các công nghệ mới, giúp phát hiện nhanh chóng và hiệu quả hơn các hợp chất ức chế. Điều này không chỉ có ý nghĩa trong việc điều trị COVID-19 mà còn trong việc phòng ngừa các dịch bệnh do virus khác.

5.2. Tầm quan trọng của hợp tác nghiên cứu

Sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu, tổ chức y tế và ngành công nghiệp dược phẩm là rất quan trọng để thúc đẩy quá trình phát triển thuốc. Việc chia sẻ dữ liệu và kinh nghiệm sẽ giúp tăng cường hiệu quả nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về protease của SARS-CoV-2 1. Cấu trúc và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2 Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gây ra hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng, biểu hiện trên lâm sàng bao gồm sốt, ho khan và mệt mỏi và thường có liên quan đến phổi. SARS-CoV-2 dễ lây lan, có vật chủ là động vật hoang dã hoặc người [51].

Có bốn phân nhóm chính của coronavirus là α, β, γ và δ, trong đó SARS-CoV-2 là một loại β coronavirus [69]. Nhìn chung cấu trúc của SARS-CoV-2 mang đặc trưng của các chủng coronavirus, chứa sợi đơn ARN dương tính với đầu 5’ và đuôi 3’ poly-A, mã hóa bốn protein cấu trúc chính (S: gai; E: vỏ; M: màng; N: nucleocapsid) và nhiều protein phi cấu trúc (nsp). Hạt virion coronavirus thường có hình tròn hoặc nhiều hình dạng, có đường kính 120–160 nm. Protein S làm trung gian cho sự gắn kết của virus và hợp nhất màng trong quá trình lây nhiễm.

Protein M có 218-263 acid amin, có đầu tận cùng N được biến đổi bởi một O- hoặc N-glycan và một đầu tận cùng C ưa nước. Protein E, 74- 109 acid amin, có thể tham gia vào việc thúc đẩy độc lực của virus; thường có khoảng 20 bản sao của protein này trên mỗi virion. Protein N của coronavirus, 349-470 acid amin, là một protein được phosphoryl hóa liên kết với ARN, tạo điều kiện thuận lợi cho việc gấp bộ gen ARN vào nucleocapsid một cách thích hợp [29]. Chu kỳ xâm nhập và sao chép tế bào bắt đầu khi virus xâm nhập vào tế bào chủ, dẫn đến sự dung hợp màng tế bào - virus.

Sau quá trình nhập bào và thoát vỏ, hai phần ba bộ gen tính từ đầu 5’ bao gồm hai khung đọc mở (ORF1a và ORF1b) được dịch mã thành hai polyprotein (pp1a và pp1ab) thông qua cơ chế chuyển dịch khung ribosome. Hai polyprotein được phân cắt để tạo ra 16 protein phi cấu trúc, trong đó bao gồm hai cystein protease là Mpro (main protease hay 3-chymotrypsin-like protease, được mã hóa bởi nsp5) và PLpro (papain-like protease, được mã hóa trong nsp3) [22]. Những protease này là yếu tố chính cho sự phân cắt protein, đóng vai trò quan trọng trong vòng đời của virus. Bên cạnh việc phân cắt các cơ chất của virus, chúng cũng có thể sửa đổi hoặc vô hiệu hóa hoạt động của các protein tế bào, do đó làm tăng khả năng tương thích đối với virus [36].

Bước đầu quá trình dịch mã được thể hiện ở Hình 1. Bộ gen và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2 2 1. Protease của virus SARS-CoV-2 1. Sự tương đồng giữa các chủng coronavirus Tương tự như những phát hiện liên quan đến SARS-CoV [13] và coronavirus gây hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS-CoV) [67], SARS-CoV-2 được cho là lai giữa các loài để khởi phát các bệnh nhiễm trùng sơ cấp ở người; hiện nay nó lây lan chủ yếu qua đường lây truyền từ người sang người.

Trình tự bộ gen của SARS-CoV-2 có sự đồng nhất đến 80% với SARS-CoV và 50% với MERS-CoV [33]. Mặc dù giữa các chủng có những đột biến khác nhau, các protein quan trọng của các coronavirus được bảo tồn rất cao vì hầu hết các đột biến trong các protein này đều gây chết virus, trong đó có Mpro và PLpro [68]. Sự bắt cặp nhiều trình tự trên Mpro (A) và PLpro (B) ở ba chủng coronavirus ở người (SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV). Các cấu trúc thứ cấp được thể hiện ở dòng đầu tiên mỗi hàng.

Xoắn α được biểu thị bằng chuỗi xoắn và nếp gấp β được biểu thị bằng mũi tên. Các acid amin bảo tồn tuyệt đối được đánh dấu bằng màu đỏ và acid amin bảo tồn tương đối được đánh dấu bằng màu vàng. Acid amin xúc tác được đánh dấu bằng hình tam giác màu xanh. Sự bắt cặp được thực hiện bằng ClustalW và hiển thị bằng ESpript 3.

Bắt cặp nhiều trình tự giữa các các chủng coronavirus trên Mpro và PLpro được thể hiện trong Hình 1. Trình tự của Mpro trên SARS-CoV-2 giống 96% so với SARS- CoV Mpro và 50% so với MERS-CoV, trong khi trình tự của PLpro trên SARS-CoV-2 giống 83% và 31% so với SARS-CoV và MERS-CoV tương ứng. Hầu hết các đặc điểm trong cấu trúc di truyền được bảo tồn giữa các chủng coronavirus khác nhau. Ngoài ra, Mpro và PLpro cho thấy sự bảo tồn mạnh mẽ trong cấu trúc ba chiều (Hình 1.

Những 4 điều này làm cho Mpro và PLpro trở thành mục tiêu tiềm năng để phát triển các tác nhân điều trị kháng virus phổ rộng và giảm nguy cơ kháng thuốc qua trung gian đột biến ở các chủng virus nguy hiểm trong tương lai. Xếp chồng các cấu trúc monomer của Mpro (A) and PLpro (B) trên SARS- CoV-2 (hồng), SARS-CoV (xanh ngọc), và MERS-CoV (xanh lá). Cấu trúc của Mpro và PLpro Mpro Mpro (main protease, hay protease giống 3-chymotrypsin) được mã hóa bởi nsp5 và chỉ hoạt động ở dạng dimer (các monomer riêng lẻ không hoạt động về mặt enzym) [26]. Trong SARS-CoV-2 và SARS-CoV, tất cả các acid amin tham gia vào hoạt động 5 xúc tác, liên kết cơ chất và dimer hóa đều được bảo toàn 100%.

Ngoài ra các trình tự polyprotein pp1ab giống nhau là 86% và các vị trí phân cắt Mpro hầu như không thay đổi [7]. Mpro bước đầu sẽ tự trưởng thành từ các polyprotein thông qua quá trình tự động phân cắt và sau đó phân cắt pp1a và pp1ab tại 11 vị trí (được biểu thị qua các mũi tên màu xanh ngọc trong Hình 1.1 ) để giải phóng các nsp từ 4 đến 16. Sự phân cắt cơ chất tuân theo mô hình chung: X- (Leu/Phe/Met)-Gln↓(Gly/Ala/Ser)-X (X là bất kỳ acid amin nào; ↓ là vị trí phân cắt ). Hiện tại không có protease nào ở tế bào chủ có đặc tính phân cắt tương tự như Mpro được báo cáo, do đó các chất ức chế Mpro có thể hạn chế được tác dụng không mong muốn đối với cơ thể [24].

Mỗi đơn vị cấu trúc của Mpro được chia thành ba miền (Hình 1. Miền I và miền II là các thùng β (β-barrels) cấu tạo bởi 6 dải đối song. Miền III là một cụm hình cầu (globular cluster) tạo bởi 5 vòng xoắn α và được nối với miền II bằng một vùng mạch loop dài. Bộ đôi xúc tác (Cys145-His41) nằm trong khe giữa miền I và miền II.

Miền III được coi là rất quan trọng đối với quá trình dimer hóa [20]. Do đó, sự phát triển của các chất ức chế chống lại enzyme này đã được thực hiện theo hai hướng: (i) nhắm vào túi liên kết cơ chất để ngăn chặn hoạt động xúc tác và (ii) ức chế phản ứng dimer hóa. Bộ đôi xúc tác được bảo tồn tuyệt đối giữa các chủng coronavirus khác nhau, thuận lợi để trở thành chất ức chế phổ rộng (Hình 1. Quá trình xúc tác của Mpro nhằm phân cắt protein được minh họa trong Hình 1.4, bao gồm 5 bước chính: Deprotonate nhóm thiol của Cys145 bằng His41 (hay nói cách khác, proton hóa His41) (I) để tạo thành tác nhân nucleophile tấn công cơ chất có cấu trúc carbonyl carbon (II), giải phóng một peptid có đầu cuối amin và khôi phục trạng thái deproton hóa của His41 (III).

Sau đó, thioester tạo thành được thủy phân (IV) để giải phóng acid carboxylic, tái tạo lại enzym tự do (V). Có hai cách tiếp cận chính để tìm ra các chất ức chế nhắm tới mục tiêu là túi liên kết cơ chất: peptidomimetic (chất có cấu trúc giống peptid) và các phân tử nhỏ. Hầu hết các chất ức chế peptidomimetic đều có vị trí thực hiện phản ứng Michael (Michael acceptor) để hình thành liên kết cộng hóa trị với Cys145 cạnh tranh với cơ chất peptid. Các phân tử nhỏ được chia làm hai nhóm là chất ức chế không cộng hóa trị và chất ức chế cộng hóa trị thuận nghịch [45].

Nhiều hợp chất có hoạt tính đã được phát hiện, trong đó baicalein là chất ức chế không cộng hóa trị, không phải peptidomimetic đầu tiên của SARS-CoV-2 Mpro với cơ chế hoạt động như một “lá chắn” phía trước bộ đôi xúc tác để ngăn cơ chất peptid tiếp cận trung tâm hoạt động. Hợp chất này có hoạt tính kháng virus in vitro tốt nên có thể giả định rằng các chất theo cơ chế hoạt động này có tiềm năng phát triển thuốc [65]. Chu trình xúc tác của Mpro với bộ đôi xúc tác (Cys145-His41). PLpro PLpro (papain-like protease) được mã hóa là một trong nhiều miền khác nhau của nsp3.

Các coronavirus có thể mã hóa hai PLpro, tuy nhiên trong SARS-CoV-2, SARS-CoV và MERS-CoV thì PLpro là một monomer [14]. Ngoài chức năng phân cắt polyprotein của virus, SARS-CoV-2 PLpro có 2 hoạt động phân giải protein khác: loại bỏ ubiquitin (Ub) và gen kích thích interferon 15 (ISG15, protein giống ubiquitin) của tế bào chủ để ngăn chặn các phản ứng miễn dịch bẩm sinh, trong đó ISG15 được ưu tiên hơn [52]. PLpro có thể thực hiện các chức năng đó là bởi khả năng nhận ra mô típ tetrapeptid Leu-X-Gly-Gly↓X (X là bất kỳ acid amin nào; ↓ là vị trí phân cắt ). Mô típ này được tìm thấy ở giữa nsp1/nsp2, nsp2/nsp3 và nsp3/nsp4 (được hiển thị trong mũi tên màu hồng trong Hình 1.1) và được PLpro phân cắt để tạo ra 3 nsp trưởng thành.

Bên cạnh đó, PLpro cũng thực hiện chức năng loại bỏ ubiquitin và ISG15 bằng cách phân cắt ở đầu cuối C của các protein có dạng Leu-Arg-Gly-Gly↓X (hoàn toàn phù hợp với mô-típ nhận dạng của PLpro) [48]. Về cấu trúc, PLpro ở SARS-CoV- 2 chứa bốn miền: miền giống ubiquitin (Ubl, β1-3), miền ngón cái (thumb, α2-7), miền ngón tay (finger, β4-7) và miền lòng bàn tay (palm, β8-13) (Hình 1. Trong miền ngón tay, bốn cystein (Cys189, Cys192, Cys224 và Cys226) được bảo tồn, tạo thành một ngón tay kẽm (zinc finger) cần thiết cho hoạt động phân giải protein và loại bỏ ubiquitin [14]. Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của PLpro ở SARS-CoV-2 và SARS-CoV là tương đồng nhau.

Tất cả các acid amin cần thiết cho quá trình xúc tác đều được bảo tồn [14]. Bộ ba xúc tác (Cys111- His272-Asp286) nằm trong một rãnh nằm giữa miền ngón tay cái và miền lòng bàn tay. Cys111 và His272 tương ứng được tìm thấy ở gốc của miền ngón tay cái và miền lòng bàn tay, trong khi His272 cho liên kết hydro cho Asp286. Một hố oxyanion có chứa Trp106 là điều cần thiết để ổn định sự hình thành điện tích âm trong quá trình thủy phân 7 peptid.

Liên kết hydro giữa Asp108 và Trp93 là rất quan trọng để ngăn hố oxyanion sụp đổ, duy trì trung tâm hoạt động để cơ chất có thể tiếp cận được [46]. Có một số mục tiêu chiến lược cho sự phát triển của chất ức chế PLpro, chẳng hạn như bộ ba xúc tác, vị trí liên kết ISG15 hoặc miền ngón tay kẽm [30]. Mặc dù có sự khác biệt về acid amin giữa các coronavirus, bộ ba xúc tác được bảo tồn tuyệt đối (Hình 1.