Tổng quan luận án

Bệnh ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Theo thống kê được tác giả trích dẫn, toàn cầu ước tính có 8,2 triệu người tử vong vì ung thư vào năm 2012, trong đó ung thư phổi (ung thư phế quản và khí quản) là nguyên nhân tử vong đứng hàng thứ 5 với 1,1 triệu nam giới và 0,5 triệu phụ nữ tử vong. Về mặt kinh tế y tế, chi phí dành cho các loại thuốc điều trị ung thư đã gia tăng từ 80,8 tỷ USD vào năm 2010 lên 100,2 tỷ USD vào năm 2014. Mặc dù nhiều loại thuốc chống ung thư mới đã được nghiên cứu và phát triển trong những thập kỷ gần đây, hiệu quả đáp ứng trong thực tiễn điều trị vẫn còn hạn chế và nhiều bệnh ung thư vẫn chưa thể chữa trị triệt để. Do đó, việc tìm kiếm và phát triển các phân tử thuốc mới có khả năng ức chế chọn lọc tế bào ung thư là nhu cầu cấp thiết.

Chiến lược lai hóa phân tử (molecular hybridization) – kết hợp các hợp phần có hoạt tính sinh học độc lập để tạo ra cấu trúc lai mang hoạt tính cải tiến hoặc vượt trội – đang là một hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm. Trong tự nhiên, nhóm hợp chất triterpenoid (như betulin, betulinic acid, ursolic acid, oleanolic acid) đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, kháng HIV và chống ung thư (trong đó betulinic acid gây độc tế bào ung thư thông qua cơ chế ức chế quá trình sinh tổng hợp protein p53). Ở một hướng khác, các nhóm chất tổng hợp như benzamide (ví dụ: MS-275, MGCD-0103, CI-994, CS055) và hydroxamate (ví dụ: SAHA/Vorinostat, Belinostat, Panobinostat, TSA) là những chất ức chế histone deacetylase (HDAC) đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US-FDA) phê duyệt hoặc đưa vào thử nghiệm lâm sàng trong điều trị nhiều dạng khối u ác tính. Tuy nhiên, các hợp chất lai kết hợp giữa khung triterpenoid với nhóm benzamide hoặc hydroxamate vẫn chưa được nghiên cứu toàn diện. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống này nhằm thiết kế, tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học của lớp chất lai mới.

Mục tiêu chung của luận án là: Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và nhóm hydroxamate nhằm tìm kiếm các hợp chất lai có hoạt tính sinh học cao, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra thuốc chống ung thư góp phần chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của luận án được đánh số bao gồm:

  1. Tổng hợp và phân lập các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và nhóm hydroxamate bằng các phương pháp sắc ký.
  2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất tổng hợp được bằng các phương pháp vật lý và hóa học.
  3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất lai tổng hợp được trên hai dòng tế bào ung thư ở người là KB và Hep-G2.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng hóa học: Các triterpenoid tự nhiên và dẫn xuất gồm betulin (1), betulinic acid (2), ursolic acid (3), oleanolic acid (4), 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid (5); các tác nhân ghép nối như anhydrid acid dicarboxylic, acid 6-aminohexanoic, 1,2-diaminobenzene, hydroxylamine hydrochloride và N,O-dimethylhydroxylamine hydrochloride.
  • Đối tượng sinh học: Đánh giá độc tính tế bào in vitro trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma) và ung thư gan Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma).
  • Phạm vi thực nghiệm: Thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Viện Hóa học, Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về chuyển hóa cấu trúc triterpenoid, các chất ức chế HDAC thuộc nhóm benzamide và nhóm hydroxamate:

Nghiên cứu dẫn xuất và hợp chất lai triterpenoid:

  • Oxana B. Kazakova và cộng sự (2010): Chuyển hóa nhóm OH tại C-3 và C-28 của betulin thành các dẫn xuất ester với nicotinic acid (chất 6, 7) thể hiện hoạt tính kháng virus ung thư cổ tử cung HPV-11, kháng HIV, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan, chống viêm; các dẫn xuất ester với acid carboxylic thơm (14, 15) có hoạt tính kháng khuẩn với đường kính vòng vô khuẩn 10–13 mm.
  • Sheng-Jie Yang và cộng sự (2015): Tổng hợp các dẫn xuất ester-amide tại C-28 của betulin (16a-c) qua phản ứng với anhydrid acid rồi ngưng tụ với amin trong dung môi DCM; thử nghiệm trên các dòng tế bào MGC-803 (ung thư dạ dày), PC3 (ung thư tuyến tiền liệt), Bcap-37 (ung thư biểu mô cổ tử cung), A375 (ung thư da) và MCF-7 (ung thư vú) cho giá trị IC50 từ 4–18 µM; hợp chất 16c chứa nhân piperidin thể hiện hoạt tính mạnh nhất với IC50 lần lượt là 4,3 µM; 4,5 µM; 5,2 µM; 7,5 µM và 5,2 µM.
  • Harish Komera và cộng sự (2010): Tổng hợp dẫn xuất carbamate 18–21 từ betulin với ethyl isocyanate và phenyl isocyanate trong DCM ở 60°C trong 48 giờ; hợp chất 18 và 20 có hoạt tính diệt tế bào ung thư phổi A549.
  • Nguyễn Văn Tuyến và cộng sự (2012): Tổng hợp các hợp chất lai giữa betulin với thuốc chống HIV gồm Zidovudine (AZT) và dẫn xuất Lamivudine (3TC) qua liên kết ester (25a-b, 26a-b); các chất 25a-b có hoạt tính kháng HIV cao hơn thuốc đối chứng (EC50 = 0,1–0,3 µM so với d4T 7,3 µM, AZT 0,47 µM, 3TC 3,3 µM). Nhóm tác giả tiếp tục tổng hợp hợp chất lai triterpenoid-AZT qua cầu nối ester-triazole (chất 29) và amide-triazole (chất 31), cho thấy khả năng ức chế dòng tế bào Hep-G2 với IC50 lần lượt là 8,55 µM và 5,91 µM; riêng chất 31 ức chế dòng KB với IC50 = 8,1 µM.

Nghiên cứu về dẫn xuất benzamide:

  • Suzuki và cộng sự (1999): Công bố các dẫn chất benzamide ức chế HDAC in vitro và in vivo như MS-275, CI-994, MGCD-0103, CS055. Chidamide (CS055) được US-FDA phê duyệt năm 2015 để điều trị u lympho tế bào T ngoại biên; MS-275 ức chế HDAC1 và HDAC3 với IC50 lần lượt là 0,51 µM và 1,7 µM; CI-994 ức chế HDAC 1, 2, 3, 8 với IC50 lần lượt là 0,9; 0,9; 1,2 và > 20 µM, đồng thời ức chế tế bào bạch cầu chuột BCLO với IC50 = 2,5 µM.
  • Yoshiyuki Hirata và cộng sự (2018): Tổng hợp dẫn xuất benzamide 42a-f từ trung gian carbamate; hợp chất 42c thể hiện tỷ lệ làm chết tế bào thần kinh vỏ não cao nhất ở nồng độ dưới 1 µM.
  • Rui Xie và cộng sự (2017): Tổng hợp dithiocarbamate benzamide M101, M122, M133; hợp chất M122 ức chế dòng tế bào HeLa và HCT116 với IC50 tương ứng là 0,79 µM và 0,54 µM.
  • Jin Cai và cộng sự (2015): Tổng hợp benzamide chứa nhân 1,2,4-oxadiazole 52a-j; các chất 52b, 52e, 52f, 52j có hoạt tính ức chế U937 và HCT116 với IC50 từ 0,97–2,33 µM, riêng chất 52j đạt IC50 = 0,38 µM trên dòng U937.

Nghiên cứu về dẫn xuất hydroxamate:

  • Các hoạt chất SAHA/Vorinostat (FDA phê duyệt 2006 trị u lympho da tế bào T), Belinostat, Panobinostat, TSA, CUDC-101.
  • Nguyễn Hải Nam và cộng sự (2018): Tổng hợp dẫn xuất quinazolinone-hydroxamate 57a-d với IC50 từ 0,62–1,50 µM trên SW620, PC3, NCI-H23; tổng hợp chuỗi benzothiazole-hydroxamate mang cầu nối 2–6 carbon (59a-g), trong đó chất 59g có IC50 trên SW620, AsPC-1, NCI-H460 lần lượt là 0,32; 0,34; 0,39 µg/ml (mạnh hơn SAHA có IC50 = 0,50; 0,69; 0,68 µg/ml) và ức chế 49,00% khối u PC-3 in vivo ở chuột so với SAHA (48,30%) ở liều 30 mg/kg; tổng hợp chuỗi 5-phenyl-1,3,4-thiadiazole (61a-o) với chất 61b có IC50 trên AsPC-1, SW620, NCI-H460 là 0,63; 0,34 và 0,11 µM.
  • Trần Khắc Vũ và cộng sự (2016): Tổng hợp hydroxamic acid từ dihydroartemisinin (64a-e); hợp chất 64a có hoạt tính độc tế bào trên HepG2, MCF-7, HL-60 với IC50 từ 6,41–14,17 µg/ml.
  • Chao Ding và cộng sự (2016): Tổng hợp 6-(1,2,3-triazol-4-yl)-4-aminoquinazolin hydroxamate 67a-e; chất 67b và 67d ức chế năm dòng tế bào ung thư (A549, A431, BT-474, SK-BR-3, NCI-H1975) với IC50 trong khoảng 0,49–8,76 µM.
  • Wiemann và cộng sự: Tổng hợp hydroxamate từ betulinic acid (70a-d, 71a-k), trong đó chất 71a đạt IC50 từ 1,1–1,6 µM trên các dòng tế bào 518A2, A2780, A549, MCF7, NIH 3T3; tổng hợp dẫn xuất hydroxamate từ ursolic acid và oleanolic acid (73a-h, 75a-c), trong đó chất 73a và 73b có EC50 trên dòng NIH 3T3 lần lượt là 2,6 ± 0,3 µM và 4,3 ± 0,2 µM.
Nhóm hợp chất Tác giả & Năm công bố Cấu trúc / Khung sườn Hoạt tính sinh học tiêu biểu
Ester triterpenoid Kazakova và cs. (2010) Betulin + nicotinic acid (6, 7) Kháng virus HPV-11, kháng HIV, kháng khuẩn
Ester-amide triterpenoid Yang và cs. (2015) Betulin + dicarboxylic acid + amin (16a-c) Ức chế MGC-803, PC3, Bcap-37, A375, MCF-7 (IC50 4–18 µM)
Lai Triterpenoid-AZT/3TC Nguyễn Văn Tuyến và cs. (2012) Betulin/AZT/3TC qua ester/triazole (25, 26, 29, 31) Kháng HIV (EC50 0,1–0,3 µM), ức chế Hep-G2 (IC50 5,91 µM), KB (IC50 8,1 µM)
Benzamide Suzuki và cs. (1999); Jin Cai và cs. (2015) MS-275, CI-994, Oxadiazole-benzamide (52a-j) Ức chế HDAC1, 2, 3, 8; ức chế U937, HCT116 (IC50 0,38–2,33 µM)
Hydroxamate Nguyễn Hải Nam và cs. (2018); Wiemann và cs. Benzothiazole (59g), Thiadiazole (61b), Betulinic hydroxamate (71a) Ức chế SW620, PC3, AsPC-1, NCI-H460 (IC50 < 1 µM); in vivo ức chế 49% u PC-3

Vị trí của luận án: Luận án kế thừa các kết quả nghiên cứu về hóa học triterpenoid và cơ chế ức chế HDAC của benzamide/hydroxamate, trực tiếp giải quyết khoảng trống trong việc thiết kế và tổng hợp các phân tử lai kết hợp khung triterpenoid với các nhóm chức benzamide và hydroxamate.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng nguyên lý thiết kế thuốc lai phân tử (hybrid drug design), kết hợp khung triterpenoid thiên nhiên đóng vai trò là phần thân ưa béo hướng đích màng tế bào/ức chế p53 với nhóm mang hoạt tính benzamide (chứa nhóm o-aminoanilide) hoặc hydroxamate (chứa nhóm -CONHOH) có khả năng tạo phức chelat với ion kẽm tại trung tâm hoạt động của enzym HDAC.

Các phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích được sử dụng gồm:

  • Phương pháp tổng hợp hữu cơ: Tiến hành các phản ứng este hóa mở vòng anhydrid acid, phản ứng oxy hóa chọn lọc nhóm hydroxyl bằng tác nhân Jones (CrO3/H2SO4), phản ứng khử chọn lọc nhóm carbonyl bằng NaBH4, phản ứng acetyl hóa bằng Ac2O/Et3N, phản ứng ghép mạch tạo liên kết amide/hydroxamate sử dụng tác nhân ghép nối BOP (benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate) kết hợp xúc tác DMAP (4-dimethylaminopyridine) và base Et3N, phản ứng thủy phân giải phóng nhóm bảo vệ/este bằng LiOH trong methanol hoặc dung dịch HCl 10%.
  • Phương pháp phân lập và tinh chế: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng silica gel (Merck) để theo dõi tiến trình phản ứng và độ tinh khiết; sắc ký cột cổ điển sử dụng pha tĩnh silica gel 100–200 mesh (Merck) với các hệ dung môi pha động như n-hexan/ethyl acetate (tỷ lệ 8:2, 7:3, 5:5) và dichloromethane/methanol (tỷ lệ 0–10%).
  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
    • Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Büchi Melting Point B-545.
    • Đo phổ hồng ngoại (IR) trên máy Spectrum Two (PerkinElmer), ép viên KBr rắn.
    • Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trên máy Bruker XL-500, sử dụng dung môi CDCl3 hoặc DMSO với chất chuẩn nội tetramethylsilane (TMS).
    • Đo phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) và LC-MS/MS trên máy Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) sử dụng nguồn ion hóa bụi điện tử ESI.
  • Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: Đánh giá độc tính tế bào in vitro bằng phép thử đo màu MTT theo phương pháp của Mosmann trên hai dòng tế bào ung thư người: KB (ung thư biểu mô) và Hep-G2 (ung thư gan).

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương I tổng kết các dữ liệu khoa học về cấu trúc hóa học và khả năng chuyển hóa của các triterpenoid tự nhiên. Phân tử betulin (1) thuộc khung lupane chứa hai nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 (hydroxyl bậc hai) và C-28 (hydroxyl bậc một), cùng một liên kết đôi isopropenyl tại vị trí C-20(29). Các trung tâm phản ứng này cho phép biến đổi hóa học chọn lọc mà vẫn bảo tồn bộ khung pentacyclic triterpenoid. Chương tổng quan phân tích chi tiết các con đường tổng hợp dẫn xuất ester, amide, carbamate và hợp chất lai qua cầu nối triazole của betulin, betulinic acid (2), ursolic acid (3), oleanolic acid (4) và 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid (5).

Đồng thời, chương này phân tích cơ chế tác dụng sinh học và các phương pháp tổng hợp hai nhóm chất ức chế HDAC:

  1. Nhóm benzamide: Điển hình là MS-275, CI-994, CS055, tác động ức chế chọn lọc các isoform HDAC class I, làm thay đổi mức độ acetyl hóa histone và điều hòa biểu hiện các protein kiểm soát chu kỳ tế bào như p21WAF1/CIP1. Các quy trình tổng hợp benzamide từ dẫn xuất acid benzoic, dithiocarbamate và dị vòng oxadiazole qua phản ứng ngưng tụ với 1,2-diaminobenzene được hệ thống hóa.
  2. Nhóm hydroxamate: Bao gồm SAHA, TSA, Belinostat, Panobinostat. Cơ sở hóa dược của nhóm này dựa trên cấu trúc liên kết chelat giữa nhóm hydroxamic acid (-CONHOH) với ion Zn2+ tại vị trí hoạt động của HDAC. Các phản ứng chuyển hóa dẫn xuất carboxylic acid thành hydroxamic acid qua tác nhân hydroxylamine hoặc O-protected hydroxylamine được tổng hợp chi tiết.

Chương II: Thực nghiệm

Chương II mô tả chi tiết hóa chất, thiết bị, quy trình tổng hợp từng bước và các dữ liệu phổ nhận dạng đầy đủ của các chất trung gian và sản phẩm lai mục tiêu:

  1. Tổng hợp các dẫn xuất ester của betulin (76a-f): Betulin (1,0 mmol) phản ứng với anhydrid acid carboxylic tương ứng (4,0 mmol) cùng Et3N (1,2 mmol) trong 5 ml DCM ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tinh chế qua sắc ký cột silica gel (n-hexan/ethyl acetate 8:2) thu được:
  • Hợp chất 76a (succinyl betulin): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 236–237°C.
  • Hợp chất 76b (glutaryl betulin): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 210–212°C.
  • Hợp chất 76c (2,2-dimethylsuccinyl betulin): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 205–207°C.
  • Hợp chất 76d (3-methylglutaryl betulin): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 220–222°C.
  • Hợp chất 76e (cyclohex-4-ene-1,2-dicarbonyl betulin): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 175–177°C.
  • Hợp chất 76f (2-methylsuccinyl betulin): Tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 203–205°C.
  1. Tổng hợp các hợp chất trung gian (79a-b, 69, 81, 82, 86):
  • Phản ứng oxy hóa Jones: Betulinic acid (2) hoặc 78a-b (1 mmol) trong 10 ml acetone ở 0°C được nhỏ chậm thuốc thử Jones (CrO3/H2SO4, 3,9 mmol), khuấy từ 0°C đến nhiệt độ phòng trong 24 giờ:
    • Hợp chất 79a: Tinh thể trắng, hiệu suất 90%, nhiệt độ nóng chảy 272–274°C, HRMS: m/z 441,3278 [M+H]+ (tính toán cho C29H45O3: 441,3290). Tín hiệu 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ 4,78 (1H, s, Ha-29); 4,53 (1H, d, J = 1,5 Hz, Hb-29); 2,98–3,07 (1H, m, H-19); 1,65 (3H, s, H-30); 0,98 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-24); 0,92 (3H, s, H-26); 0,89 (3H, s, H-27); 0,87 (3H, s, H-25).
    • Hợp chất 79b: Tinh thể trắng, hiệu suất 60%, nhiệt độ nóng chảy 270–271°C, HRMS: m/z 455,3156 [M+H]+ (tính toán cho C29H43O4: 455,3167).
    • Hợp chất 69: Tinh thể trắng, hiệu suất 73%, nhiệt độ nóng chảy 165–167°C, HRMS: m/z 455,3236 [M+H]+ (tính toán cho C30H47O3: 455,3447).
  • Phản ứng khử và acetyl hóa: Khử 79a bằng NaBH4 (4,0 mmol) trong MeOH/THF (3:0,5) ở 0–5°C trong 10 giờ thu được 81 (hiệu suất 78%, nhiệt độ nóng chảy 213–215°C, HRMS: m/z 443,3468 [M+H]+). Acetyl hóa 81 và ursolic acid (3) bằng Ac2O/Et3N trong DCM trong 15 giờ thu được 82 (hiệu suất 88%, nhiệt độ nóng chảy 214–216°C) và 86 (hiệu suất 79%, nhiệt độ nóng chảy 195–197°C).
  1. Tổng hợp các hợp chất lai chứa nhóm benzamide: Các chất trung gian (76a-e, 79b, 82, 2, 69, 86, 5) được hòa tan trong DMF, bổ sung BOP (1,0 mmol), DMAP (2,0 mmol), Et3N (1,2 mmol) và 1,2-diaminobenzene (1,2 mmol), khuấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ. Tinh chế qua sắc ký cột silica gel (n-hexan/ethyl acetate 7:3) thu được dãy sản phẩm benzamide:
  • 77a: Hiệu suất 61%, nhiệt độ nóng chảy 186–188°C, LC-MS/MS m/z: 633,4593 [M+H]+ (C40H61N2O4: 633,4553).
  • 77b: Hiệu suất 57%, nhiệt độ nóng chảy 201–203°C, LC-MS/MS m/z: 647,4748 [M+H]+ (C41H63N2O4: 647,4710).
  • 77c: Hiệu suất 67%, nhiệt độ nóng chảy 233–235°C, LC-MS/MS m/z: 661,4883 [M+H]+ (C42H65N2O4: 661,4866).
  • 77d: Hiệu suất 49%, nhiệt độ nóng chảy 213–215°C, LC-MS/MS m/z: 661,4903 [M+H]+ (C42H65N2O4: 661,4966).
  • 77e: Hiệu suất 55%, nhiệt độ nóng chảy 287–289°C, LC-MS/MS m/z: 685,4904 [M+H]+ (C44H65N2O4: 685,4939). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) ghi nhận 44 tín hiệu carbon: δ 174,7; 171,7; 150,1; 141,3; 127,2; 125,9; 125,8; 124,8; 123,8; 119,0; 117,5; 109,9; 79,0; 63,4; 55,3; 50,4; 48,9; 47,7; 46,5; 42,7; 41,2; 40,9; 38,9; 38,7; 37,7; 37,2; 34,6; 34,2; 29,8; 29,7; 29,6; 28,0; 27,4; 27,0; 26,7; 26,3; 25,2; 20,8; 19,2; 18,3; 16,1; 16,05; 15,4; 14,8.
  • 83a: Hiệu suất 61%, nhiệt độ nóng chảy 283–285°C, LC-MS/MS m/z: 575,4172 [M+H]+ (C37H55N2O3: 575,4134).
  • 80: Hiệu suất 46%, nhiệt độ nóng chảy 195–197°C, LC-MS/MS m/z: 545,3702 [M+H]+ (C35H49N2O3: 545,3737).
  • 84: Hiệu suất 56%, nhiệt độ nóng chảy 286–288°C, LC-MS/MS m/z: 547,4225 [M+H]+ (C36H55N2O2: 547,4258).
  • 85: Hiệu suất 61%, nhiệt độ nóng chảy 271–273°C, LC-MS/MS m/z: 545,4064 [M+H]+ (C36H53N2O2: 545,4029).
  • 87: Hiệu suất 49%, nhiệt độ nóng chảy 231–233°C, LC-MS/MS m/z: 589,4329 [M+H]+ (C38H57N2O3: 589,4363).
  • 88a: Hiệu suất 75%, nhiệt độ nóng chảy 299–301°C, LC-MS/MS m/z: 603,4115 [M+H]+ (C38H55N2O4: 603,4156).
  • Thủy phân nhóm acetyl của 83a và 88a bằng LiOH trong MeOH ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ tạo ra dẫn chất benzamide tự do 83b (hiệu suất 59%, nhiệt độ nóng chảy 251–253°C, LC-MS/MS m/z: 533,4070 [M+H]+) và 88b (hiệu suất 47%, nhiệt độ nóng chảy 207–209°C, LC-MS/MS m/z: 561,4012 [M+H]+).
  1. Tổng hợp các hợp chất lai chứa nhóm hydroxamate:
  • Tổng hợp các chất trung gian amide gắn chuỗi nối 6 carbon (91, 93, 95): Phản ứng của các hợp chất 5, 2 hoặc 81 (1,0 mmol) với 6-aminohexanoic acid (2,0 mmol) có mặt BOP (1,0 mmol) và DMAP (2,0 mmol) trong DMF ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
    • Hợp chất 91: Hiệu suất 67%, nhiệt độ nóng chảy 217–219°C, LC-MS/MS m/z: 626,4376 [M+H]+ (C38H60NO6: 626,4321).
    • Hợp chất 93: Hiệu suất 65%, nhiệt độ nóng chảy 236–238°C, LC-MS/MS m/z: 570,4482 [M+H]+ (C36H60NO4: 570,4445).
    • Hợp chất 95: Hiệu suất 77%, nhiệt độ nóng chảy 217–219°C, LC-MS/MS m/z: 556,4259 [M+H]+ (C35H58NO4: 556,4288).
  • Phản ứng tạo nhóm hydroxamate (89a-h, 90a-b, 92a-b, 94a-b, 96a-b): Hòa tan các chất trung gian (76a-b, 76e-f, 5, 91, 93, 95) trong DMF, thêm BOP (1,0 mmol), DMAP (2,0 mmol), sau đó thêm H2NOH.HCl (2,0 mmol) hoặc HNMeOMe.HCl (2,0 mmol), khuấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ. Sau đó chỉnh pH = 5 bằng dung dịch HCl 10%, chiết ethyl acetate và tinh chế bằng sắc ký cột (MeOH/DCM 0–10%):
    • Hợp chất 89a: Tinh thể trắng, hiệu suất 57%, nhiệt độ nóng chảy 227–229°C, LC-MS/MS m/z: 558,3437 [M+H]+ (C34H56NO5: 558,3458).
    • Hợp chất 89b: Sản phẩm dẫn xuất N-methoxy-N-methylamide tương ứng.
Ký hiệu chất Loại cấu trúc / Nhóm chức Tác nhân ghép / Phản ứng Hiệu suất (%) Điểm chảy (°C) Khối lượng HRMS tìm thấy [M+H]+ Công thức phân tử
76a Ester betulin Succinic anhydride, Et3N — 236–237 — C34H54O4
79a Oxo-triterpenoid Jones (CrO3/H2SO4) 90 272–274 441,3278 C29H45O3
79b Dioxo-triterpenoid Jones (CrO3/H2SO4) 60 270–271 455,3156 C29H43O4
69 Oxo-betulinic acid Jones (CrO3/H2SO4) 73 165–167 455,3236 C30H47O3
81 Hydroxy-triterpenoid Khử bằng NaBH4 78 213–215 443,3468 C29H47O3
82 Acetoxy-triterpenoid Ac2O, Et3N 88 214–216 — C31H48O4
86 Acetoxy-ursolic Ac2O, Et3N 79 195–197 — C32H50O4
77a Benzamide lai (ester) 76a + 1,2-diaminobenzene, BOP 61 186–188 633,4593 C40H61N2O4
77b Benzamide lai (ester) 76b + 1,2-diaminobenzene, BOP 57 201–203 647,4748 C41H63N2O4
77c Benzamide lai (ester) 76c + 1,2-diaminobenzene, BOP 67 233–235 661,4883 C42H65N2O4
77d Benzamide lai (ester) 76d + 1,2-diaminobenzene, BOP 49 213–215 661,4903 C42H65N2O4
77e Benzamide lai (ester) 76e + 1,2-diaminobenzene, BOP 55 287–289 685,4904 C44H65N2O4
83a Benzamide lai 82 + 1,2-diaminobenzene, BOP 61 283–285 575,4172 C37H55N2O3
80 Benzamide lai 79b + 1,2-diaminobenzene, BOP 46 195–197 545,3702 C35H49N2O3
84 Benzamide lai 2 + 1,2-diaminobenzene, BOP 56 286–288 547,4225 C36H55N2O2
85 Benzamide lai 69 + 1,2-diaminobenzene, BOP 61 271–273 545,4064 C36H53N2O2
87 Benzamide lai 86 + 1,2-diaminobenzene, BOP 49 231–233 589,4329 C38H57N2O3
88a Benzamide lai 5 + 1,2-diaminobenzene, BOP 75 299–301 603,4115 C38H55N2O4
83b Benzamide lai (hydroxyl) Thủy phân 83a bằng LiOH 59 251–253 533,4070 C35H53N2O2
88b Benzamide lai (hydroxyl) Thủy phân 88a bằng LiOH 47 207–209 561,4012 C36H53N2O4
91 Amide trung gian 5 + 6-aminohexanoic acid, BOP 67 217–219 626,4376 C38H60NO6
93 Amide trung gian 2 + 6-aminohexanoic acid, BOP 65 236–238 570,4482 C36H60NO4
95 Amide trung gian 81 + 6-aminohexanoic acid, BOP 77 217–219 556,4259 C35H58NO4
89a Hydroxamate lai 76a + H2NOH.HCl, BOP 57 227–229 558,3437 C34H56NO5

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên các nội dung thực nghiệm đã triển khai, luận án đã đạt được các kết quả và đóng góp mới về mặt học thuật và thực tiễn như sau:

Về mặt lý luận và phương pháp tổng hợp:

  • Xây dựng thành công các quy trình tổng hợp chuyển hóa chọn lọc khung triterpenoid pentacyclic (betulin, betulinic acid, ursolic acid và dẫn xuất) gắn với các nhóm chức có hoạt tính sinh học là benzamide và hydroxamate.
  • Phát triển chiến lược sử dụng các cầu nối linh hoạt bao gồm liên kết ester từ anhydrid dicarboxylic acid và liên kết amide từ acid 6-aminohexanoic, giúp kéo dài chuỗi liên kết giữa khung triterpenoid và nhóm chelat hóa/ức chế enzym.
  • Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ghép nối trực tiếp và gián tiếp sử dụng hệ tác nhân BOP/DMAP/Et3N trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng, đạt hiệu suất tổng hợp từ 46% đến 90%.

Về mặt thực tiễn và dữ liệu khoa học:

  • Đã tổng hợp, phân lập và tinh chế thành công một thư viện cấu trúc mới gồm các dẫn xuất ester (76a-f), dẫn xuất oxy hóa/khử (79a-b, 69, 81), dẫn xuất acetyl hóa (82, 86), các hợp chất lai benzamide (77a-e, 80, 83a-b, 84, 85, 87, 88a-b), các amide trung gian (91, 93, 95) và các hợp chất lai hydroxamate (89a-h, 90a-b, 92a-b, 94a-b, 96a-b).
  • Xác định đầy đủ các hằng số vật lý và thông số phổ cấu trúc (điểm nóng chảy, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, LC-MS/MS và HRMS) cho toàn bộ các hợp chất mới tổng hợp, làm giàu cơ sở dữ liệu hóa học về dẫn xuất triterpenoid.
  • Cung cấp quy trình thử nghiệm độc tính tế bào in vitro theo phương pháp MTT trên hai dòng tế bào ung thư người KB và Hep-G2, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu sàng lọc thuốc chống ung thư định hướng ức chế enzym HDAC.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế:

  • Phạm vi đánh giá hoạt tính sinh học trong khuôn khổ thực nghiệm của luận án tập trung chủ yếu vào sàng lọc độc tính tế bào in vitro trên hai dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô) và Hep-G2 (ung thư gan) theo phương pháp MTT, chưa mở rộng trên nhiều dòng tế bào ung thư khác.
  • Các dẫn xuất tổng hợp chỉ giới hạn trên các khung triterpenoid được lựa chọn (betulin, betulinic acid, ursolic acid, oleanolic acid và dẫn xuất 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic acid) kết hợp với các tác nhân benzamide và hydroxamate cụ thể.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người khác (như ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư bạch cầu).
  • Thực hiện các thử nghiệm sinh học chuyên sâu về cơ chế phân tử, bao gồm đánh giá khả năng ức chế trực tiếp enzym histone deacetylase (HDAC in vitro) và khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư.
  • Khảo sát hoạt tính ức chế khối u trên mô hình động vật in vivo đối với các hợp chất lai có hoạt tính in vitro tiềm năng.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về kỹ thuật tổng hợp hữu cơ, các phản ứng bảo vệ nhóm chức, phản ứng ghép nối amide/hydroxamate và phương pháp biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ khối lượng phân giải cao (HRMS).
  • Các nhà nghiên cứu và giảng viên tại các viện nghiên cứu, trường đại học: Tham khảo các quy trình thực nghiệm chuẩn để chuyển hóa hóa học trên các khung triterpenoid thiên nhiên phổ biến tại Việt Nam (như betulin chiết xuất từ vỏ cây bạch dương, ursolic acid, oleanolic acid) nhằm tạo ra các phân tử lai có hoạt tính sinh học.
  • Các nhà nghiên cứu phát triển thuốc: Cung cấp dữ liệu về cấu trúc hóa học, mối liên hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) ban đầu của các chất ức chế HDAC dạng lai triterpenoid-benzamide và triterpenoid-hydroxamate để phục vụ định hướng thiết kế phân tử thuốc kháng ung thư.

Câu hỏi thường gặp

1. Khung cấu trúc triterpenoid ban đầu được sử dụng trong luận án gồm những hợp chất nào? Các hợp chất triterpenoid và dẫn xuất được sử dụng làm nguyên liệu tổng hợp bao gồm: betulin (1), betulinic acid (2), ursolic acid (3), oleanolic acid (4) và acid 3β-acetoxy-21-oxolup-18-ene-28-oic (5).

2. Luận án sử dụng hệ tác nhân và điều kiện phản ứng nào để thực hiện phản ứng ghép nối tạo liên kết benzamide và hydroxamate? Phản ứng ghép nối được thực hiện bằng cách hòa tan hợp chất carboxylic acid trung gian trong dung môi DMF, bổ sung tác nhân ghép nối BOP (1,0 mmol), xúc tác DMAP (2,0 mmol) và base triethylamine (Et3N, 1,2 mmol), sau đó cho phản ứng với 1,2-diaminobenzene (để tạo benzamide) hoặc hydroxylamine hydrochloride/N,O-dimethylhydroxylamine hydrochloride (để tạo hydroxamate) ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ.

3. Các dẫn xuất ester của betulin (76a-f) được tổng hợp bằng phản ứng hóa học nào? Các dẫn xuất 76a-f được tổng hợp bằng phản ứng giữa betulin (1,0 mmol) với các anhydrid acid carboxylic dicarboxylic tương ứng (4,0 mmol) trong sự có mặt của Et3N (1,2 mmol) trong dung môi DCM ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, mở vòng anhydrid để tạo một liên kết ester tại vị trí C-28 và để lại một nhóm -COOH tự do.

4. Những phương pháp hóa lý và thiết bị nào được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các sản phẩm tổng hợp? Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua: đo nhiệt độ nóng chảy (máy Büchi B-545), phổ hồng ngoại IR ép viên KBr (máy Spectrum Two - PerkinElmer), phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) (máy Bruker XL-500 trong dung môi CDCl3/DMSO), và phổ khối lượng phân giải cao HRMS / LC-MS/MS nguồn ESI (máy Thermo Q-Exactive).

5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất lai tổng hợp được đánh giá trên các đối tượng nào và bằng phương pháp gì? Hoạt tính sinh học được đánh giá thông qua phép thử độc tính tế bào in vitro bằng phương pháp đo màu MTT theo Mosmann trên hai dòng tế bào ung thư người là ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma) và ung thư gan Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma).

Kết luận

Luận án "Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai của một số triterpenoid có chứa nhóm benzamide và hydroxamate" đã xây dựng thành công quy trình chuyển hóa hóa học và tổng hợp một chuỗi các hợp chất lai mới kết hợp giữa khung triterpenoid pentacyclic với các nhóm chức benzamide và hydroxamate. Cấu trúc hóa học của toàn bộ các chất trung gian và sản phẩm lai mục tiêu đã được xác định chính xác thông qua các phương pháp hóa lý hiện đại gồm điểm nóng chảy, IR, 1H-NMR, 13C-NMR và HRMS/LC-MS/MS. Công trình đã thiết lập quy trình đánh giá hoạt tính độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 bằng phương pháp MTT, đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho hướng nghiên cứu phát triển các phân tử thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên.