Khảo sát hợp chất có hoạt tính sinh học kháng e coli sinh β lactamase phổ rộng esbl từ chủng bacillus sp rd26 nội sinh

Nghiên cứu hợp chất kháng E. coli ESBL từ Bacillus sp. RD26 nội sinh. Tìm kiếm hoạt tính sinh học, mở ra hướng mới trong điều trị nhiễm khuẩn kháng kháng sinh.

• Tác giả: Đinh Thị Thúy Kiều
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Kháng E. Coli Sinh 𝜷 − 𝐋𝐀𝐂𝐓𝐀𝐌𝐀𝐒𝐄 Phổ Rộng (ESBL) Từ Chủng Bacillus Sp. RD26 Nội Sinh
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN E. coli
• 1.2. Phân loại theo khóa phân loại quốc tế
• 1.3. Hình thái và đặc điểm nuôi cấy
• 1.4. Khả năng gây bệnh
• 1.5. Tình hình đề kháng kháng sinh
• 1.6. VI KHUẨN Bacillus
• 1.6.1. Lịch sử vi khuẩn Bacillus
• 1.6.2. Phân Loại
• 1.6.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.6.4. Ứng dụng của Bacillus
• 1.6.5. Hợp chất từ Bacillus có hoạt tính sinh học
• 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT TỪ BACILLUS
• 1.7.1. Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus trên thế giới
• 1.7.2. Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus ở Việt Nam
• 1.8. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT
• 1.8.1. Đặc điểm chung của phương pháp
• 1.8.2. Kĩ thuật chiết lỏng-lỏng
• 1.8.3. Sắc ký cột
• 1.8.4. Sắc ký lớp mỏng
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. VẬT LIỆU
• 2.2.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu
• 2.2.2. Môi trường – hóa chất
• 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.3.2. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp. RD26
• 2.3.3. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.3.3.1. Chuẩn bị môi trường
• 2.3.3.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.3.3.3. Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm
• 2.3.3.4. Tiến hành thử nghiệm
• 2.3.3.5. Kết quả
• 2.3.4. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch nội bào Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.3.4.1. Thu nhận sinh khối Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp sóng siêu âm
• 2.3.4.2. Tiến hành thí nghiệm
• 2.3.5. Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp. RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
• 2.3.6. Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp lên men trên môi trường tối ưu
• 2.3.7. Thu nhận cao chiết Bacillus sp. RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
• 2.3.8. Thử khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ cao chiết Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa kirby-bauer
• 2.3.9. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibatory Concentration) của cao chiết với vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.3.10. Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
• 2.3.11. Sắc ký cột cao chiết
• 2.3.12. Khảo sát khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ các phân đoạn thu được của cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby – Bauer
• 2.3.13. Phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng E. coli sinh ESBL
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG E. COLI SINH ESBL CỦA DỊCH NUÔI CẤY VÀ TỪ SINH KHỐI CHỦNG BACILLUS SP. RD26
• 3.2. KẾT QUẢ THU NHẬN CAO CHIẾT BACILLUS SP. RD26 TỪ CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU
• 3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC CAO CHIẾT THÔ THU ĐƯỢC
• 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH E. COLI SINH ESBL
• 3.5. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CẮN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG (TLC)
• 3.6. SẮC KÝ CỘT
• 3.7. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS SP. RD26 NỘI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY – BAUER
• 3.8. PHÂN LẬP HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 4.1. KẾT LUẬN
• 4.2. ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG – HÓA CHẤT
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT
• PHỤ LỤC 4: HÌNH ẢNH MIC
• PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ GIẢI PHỔ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về E

Vi khuẩn kháng thuốc là một vấn đề nhức nhối toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Mỗi năm, hàng trăm nghìn người trên thế giới tử vong vì vi khuẩn kháng thuốc. Nhiều chủng đã kháng hầu hết các kháng sinh, kể cả thế hệ mới. Trong khi đó, việc nghiên cứu kháng sinh mới lại rất chậm. Tình trạng này khiến lượng kháng sinh hiện có không đủ để điều trị nhiễm khuẩn đa kháng thuốc. (Jeyanthi và cs., 2016). Trong những thập kỷ gần đây, vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) ngày càng gia tăng, gây thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng. Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng đa thuốc là vấn đề đáng lo ngại đối với sức khỏe con người. Từ những năm 2000, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae có khả năng sinh ra các enzyme β – lactamase phổ rộng (Extended – Spectrum Beta – Lactamase; ESBLs), ly giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm cephalosporin. Bacillus Sp. RD26 là một ứng cử viên tiềm năng trong cuộc chiến chống lại E. Coli ESBL.

1.1. E. Coli ESBL Mối Nguy Tiềm Ẩn và Kháng Kháng Sinh

E. Coli ESBL là một chủng vi khuẩn nguy hiểm, có khả năng sinh ra enzyme β-lactamase phổ rộng, kháng lại nhiều loại kháng sinh cephalosporin. Tại Việt Nam, tình trạng nhiễm E. Coli ESBL đang ở mức báo động, đặc biệt tại các bệnh viện. Các vi khuẩn Gram âm gây bệnh đang chiếm ưu thế, với tỷ lệ khoảng 70%, thường gặp là họ Enterobacteriaceae. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất mới để điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bởi vi sinh vật này là vô cùng cần thiết.

1.2. Chi Bacillus Tiềm Năng Kháng Khuẩn và Ứng Dụng

Chi Bacillus bao gồm nhiều loài vi khuẩn Gram dương trong đất, một số loài đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) công nhận là an toàn (GRAS). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi Bacillus subtilis. Các hợp chất này có khả năng ức chế các loài vi khuẩn gây bệnh. Một số hợp chất chống MRSA đã được phân lập từ vi khuẩn Bacillus sp, bao gồm Bogorol A và Loloatins A, B, C, và D.

II. Tại Sao Cần Nghiên Cứu Kháng E

Trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho kháng sinh truyền thống là vô cùng quan trọng. Các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật, đặc biệt là từ chi Bacillus, đang thu hút sự quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu. Việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus Sp. RD26 đối với E. Coli ESBL không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong y học và dược phẩm.

2.1. Thách Thức Trong Điều Trị Nhiễm Trùng E. Coli ESBL

Nhiễm trùng do E. Coli ESBL gây ra là một thách thức lớn trong điều trị lâm sàng. Các kháng sinh truyền thống thường không hiệu quả do vi khuẩn đã phát triển cơ chế kháng thuốc. Điều này dẫn đến việc phải sử dụng các kháng sinh mạnh hơn, gây ra nhiều tác dụng phụ và tăng chi phí điều trị. Do đó, cần có các phương pháp điều trị mới, hiệu quả hơn và an toàn hơn.

2.2. Tìm Kiếm Giải Pháp Tự Nhiên Bacillus Sp. RD26

Trước tình hình đó, việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguồn tự nhiên đang được đẩy mạnh. Bacillus Sp. RD26 đã được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng và được chứng minh là có khả năng kháng E. Coli ESBL. Nghiên cứu này nhằm khảo sát sâu hơn về các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ chủng vi khuẩn này.

2.3. Tình hình kháng kháng sinh E.coli ESBL tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh của E. coli ESBL đang ở mức báo động. Nhiều báo cáo cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh ở mức cao tại các bệnh viện, đặc biệt là đối với các vi khuẩn Gram âm gây bệnh. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các giải pháp thay thế để điều trị nhiễm trùng do E. coli ESBL.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng E

Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ chủng Bacillus Sp. RD26 nội sinh. Các phương pháp được sử dụng bao gồm xác định khả năng kháng khuẩn từ dịch ngoại bào và nội bào, nuôi cấy và thu nhận cao chiết từ các hệ dung môi khác nhau, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột, tinh sạch và phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học.

3.1. Xác Định Khả Năng Kháng Khuẩn Dịch Ngoại Bào và Nội Bào

Khả năng kháng E. Coli ESBL được xác định từ cả dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus Sp. RD26. Điều này giúp đánh giá toàn diện khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn. Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL.

3.2. Nuôi Cấy và Thu Nhận Cao Chiết Hệ Dung Môi Đa Dạng

Bacillus Sp. RD26 được nuôi cấy trong môi trường tối ưu để tăng cường sản xuất các hợp chất kháng khuẩn. Cao chiết được thu nhận từ các hệ dung môi khác nhau để phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hệ dung môi được lựa chọn dựa trên tính chất hóa học của các hợp chất mong muốn.

3.3. Xác Định MIC và Phân Tích Sắc Ký Đánh Giá Hoạt Tính

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết đối với E. Coli ESBL được xác định để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn. Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột được sử dụng để phân tích và phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cao chiết. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột được đánh giá khả năng kháng khuẩn.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của RD26 57 ký tự

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Bacillus Sp. RD26 có khả năng kháng E. Coli ESBL đáng kể. Cao chiết thu được từ các hệ dung môi khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn khác nhau. Sắc ký cột giúp phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học, và một số phân đoạn cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL mạnh mẽ. Các kết quả này mở ra triển vọng ứng dụng Bacillus Sp. RD26 trong điều trị nhiễm trùng.

4.1. Hoạt Tính Kháng Khuẩn từ Dịch Nuôi Cấy và Sinh Khối

Dịch nuôi cấy và sinh khối của chủng Bacillus Sp. RD26 đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với E. Coli ESBL. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn giữa dịch nuôi cấy và sinh khối, cho thấy các hợp chất kháng khuẩn có thể được sản xuất và bài tiết ra môi trường nuôi cấy hoặc tích lũy trong tế bào vi khuẩn.

4.2. Ảnh Hưởng Của Dung Môi Đến Hoạt Tính Cao Chiết

Dung môi sử dụng trong quá trình chiết xuất ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. Một số dung môi cho phép thu được cao chiết có khả năng ức chế E. Coli ESBL mạnh mẽ hơn so với các dung môi khác. Điều này cho thấy tính chất hóa học của dung môi có vai trò quan trọng trong việc hòa tan và chiết xuất các hợp chất kháng khuẩn.

4.3. Phân Lập Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Tiềm Năng Ứng Dụng

Việc phân lập và tinh sạch các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ Bacillus Sp. RD26 là một bước quan trọng để xác định cấu trúc và cơ chế hoạt động của chúng. Các hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới hoặc các sản phẩm sinh học để kiểm soát nhiễm trùng do E. Coli ESBL.

V. Ứng Dụng Bacillus Sp

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng Bacillus Sp. RD26 trong kiểm soát E. Coli ESBL. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn, cơ chế hoạt động của chúng, và đánh giá hiệu quả in vivo. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất cũng là một hướng đi quan trọng để tăng cường sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học.

5.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Y Tế và Dược Phẩm

Bacillus Sp. RD26 và các hợp chất kháng khuẩn từ nó có tiềm năng ứng dụng trong y tế và dược phẩm. Chúng có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới, các sản phẩm sinh học để phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng do E. Coli ESBL, hoặc các sản phẩm vệ sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

5.2. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Kháng Khuẩn

Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn từ Bacillus Sp. RD26 là cần thiết để hiểu rõ cách chúng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL. Điều này có thể giúp tối ưu hóa việc sử dụng chúng trong điều trị và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc.

VI. Kết Luận Bacillus Sp

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của Bacillus Sp. RD26 trong việc kháng E. Coli ESBL. Các kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho kháng sinh truyền thống và đối phó với tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Quan Trọng

Nghiên cứu đã xác định được hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus Sp. RD26 đối với E. Coli ESBL, đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính của cao chiết, và phân lập được một số hợp chất có hoạt tính sinh học. Các kết quả này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các ứng dụng thực tiễn của Bacillus Sp. RD26 trong y tế và dược phẩm.

6.2. Hướng Đi Cho Các Nghiên Cứu Tương Lai

Các nghiên cứu tương lai nên tập trung vào việc xác định cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn, cơ chế hoạt động của chúng, và đánh giá hiệu quả in vivo. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất cũng là một hướng đi quan trọng để tăng cường sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tình trạng vi khuẩn kháng thuốc và đa kháng thuốc (multidrug resistant – MDR) đang là vấn đề y tế nghiêm trọng trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển như Việt Nam. Hàng năm, số lượng bệnh nhân tử vong do nhiễm khuẩn đề kháng tăng cao trong bối cảnh tốc độ nghiên cứu và phát triển các thế hệ kháng sinh mới diễn ra rất chậm. Đáng lưu ý, các vi khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, tiêu biểu là Escherichia coli, có khả năng sinh enzyme $\beta$-lactamase phổ rộng (Extended-Spectrum Beta-Lactamase – ESBL), gây thủy phân và làm mất hoạt tính của hầu hết các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ mới.

Tại Việt Nam, các báo cáo giám sát lâm sàng cho thấy vi khuẩn Gram âm chiếm khoảng 70% các ca nhiễm khuẩn bệnh viện. Tỷ lệ phân lập các chủng E. coli sinh ESBL tại các bệnh viện lớn ở mức rất cao: Bệnh viện Chợ Rẫy (51,6% năm 2005; 49% giai đoạn 2008–2009), Bệnh viện Bạch Mai (18,5% năm 2005), Bệnh viện Trung ương Huế (41,5% năm 2006) và Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (54,7% giai đoạn 2008–2009). Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất kháng sinh mới từ nguồn vi sinh vật tự nhiên nhằm ức chế các chủng vi khuẩn sinh ESBL là nhu cầu cấp thiết.

Chi vi khuẩn Bacillus (nhóm vi khuẩn Gram dương sống tự do hoặc nội sinh) có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng như peptide kháng khuẩn, lipopeptide (surfactin, subtilin), polyketide và nhiều enzyme thủy phân. Nhiều loài thuộc chi này được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận an toàn (GRAS). Đề tài "Khảo sát hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. coli sinh $\beta$-lactamase phổ rộng (ESBL) từ chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh" được thực hiện nhằm khai thác nguồn hoạt chất tự nhiên từ chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.), kế thừa kết quả nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy từ công trình trước đó của nhóm nghiên cứu.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là khảo sát, thu nhận, đánh giá hoạt tính và phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. coli sinh ESBL từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 nội sinh. Để đạt được mục tiêu này, tác giả đã xác định và triển khai 8 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và dịch nội bào của chủng Bacillus sp. RD26.
2. Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp. RD26 từ các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau.
3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn từ các cao chiết thô thu được.
4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết đối với chủng kiểm định E. coli sinh ESBL.
5. Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
6. Thực hiện sắc ký cột phân đoạn cao chiết thô.
7. Khảo sát khả năng kháng E. coli sinh ESBL của các phân đoạn thu nhận sau sắc ký cột.
8. Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. coli sinh ESBL.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 (phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng) và chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh E. coli sinh ESBL 128a (do Bộ môn Xét nghiệm, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Vi sinh 01 (Cơ sở 3, Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh) và Phòng 19 – Phòng các chất có hoạt tính sinh học (Viện Công nghệ Hóa học, TP. Hồ Chí Minh).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được tiến hành thực nghiệm từ tháng 09 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh học y dược, sinh hóa học vi sinh vật và hóa học các hợp chất thiên nhiên:

• Tổng quan phân loại học, đặc điểm hình thái và sinh lý học của Escherichia coli (trực khuẩn Gram âm, kích thước 2–3 $\mu$m $\times$ 0,5 $\mu$m, lên men đường, thử nghiệm sinh hóa IMViC ++--) và cơ chế đề kháng qua enzyme ESBL.
• Tổng quan phân loại học Bergey và đặc tính sinh học của chi Bacillus (trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,5–1,2 $\mu$m $\times$ 2,5–10 $\mu$m, tạo nội bào tử chịu nhiệt), cùng các nhóm chất biến dưỡng thứ cấp có tính kháng sinh (kháng sinh peptide, lipopeptide, bacteriocin).
• Lý thuyết về chiết lỏng - lỏng phân đoạn dựa trên sự phân bố chất tan trong hai pha dung môi không đồng tan, lý thuyết sắc ký cột hấp phụ pha thường dựa trên hệ số phân bố $K = C_s / C_m$, và sắc ký lớp mỏng (TLC) dựa trên hệ số dịch chuyển $R_f = l / l_o$.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Phương pháp vi sinh và lên men: Hoạt hóa chủng giống trên môi trường Nutrient Agar (NA) và Nutrient Broth (NB). Lên men lắc chủng Bacillus sp. RD26 trên môi trường dinh dưỡng tối ưu đã được xác lập từ nghiên cứu trước: Peptone 7,36 g/L; Glucose 15 g/L; $\text{CaCO}_3$ 0,72 g/L; $\text{MgSO}_4$ 0,6 g/L; pH 7,0; nuôi lắc ở $30^\circ\text{C}$ trong 36 giờ với tốc độ 200 vòng/phút.
• Phương pháp thu nhận dịch nội bào: Tế bào sinh khối được rửa bằng dung dịch NaCl 0,9%, chỉnh mật độ quang $\text{OD}_{600} = 1$ bằng dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH 7,0), bổ sung chất chống oxy hóa Dithiothreitol (DTT) 10 mM. Phá vỡ cấu trúc màng tế bào bằng phương pháp tán sóng siêu âm (sonication) 6 chu kỳ, mỗi chu kỳ 30 giây ở nhiệt độ $0–5^\circ\text{C}$, chu kỳ xung 50% với đầu dò dài 9 cm; sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút ở $4^\circ\text{C}$ trong 10 phút thu dịch nổi.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) trên môi trường Mueller Hinton Agar (MHA). Đục lỗ thạch đường kính 6 mm, nạp 100 $\mu$L dịch thử nghiệm, mật độ vi khuẩn chỉ thị E. coli sinh ESBL đạt độ đục McFarland 0,5 ($1–2 \times 10^8\text{ CFU/mL}$), ủ ở $37^\circ\text{C}$ trong 24 giờ và đo đường kính vòng vô khuẩn (mm).
• Phương pháp chiết tách hóa học: Chiết lỏng - lỏng phân đoạn 600 mL dịch lọc nuôi cấy với các dung môi có độ phân cực tăng dần theo tỷ lệ thể tích 1:1, bao gồm: $n$-hexane (HE), chloroform (Cl), dichloromethane (DI), ethyl acetate (EA), methanol (Me) và nước cất (W). Cô quay đuổi dung môi dưới áp suất giảm để thu hồi cao chiết thô.
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Tiến hành bằng phương pháp pha loãng vi lượng trên phiến 96 giếng (microwell dilution) với môi trường Mueller Hinton Broth (MHB), mật độ vi khuẩn thử nghiệm $10^3\text{ CFU/mL}$, ủ ở $37^\circ\text{C}$ trong 18–20 giờ; nồng độ dung môi DMSO trong mẫu thử $\le 1%$.
• Phương pháp sắc ký và phân lập: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản nhôm tráng sẵn Silica gel $60\text{ F}_{254}$ (Merck), phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử. Sắc ký cột cổ điển pha thường (Normal Phase Column Chromatography) sử dụng chất nhồi silica gel hạt mịn (kích thước hạt 0,04–0,06 mm) với 42 g cao thô methanol, rửa giải bằng hệ dung môi gradient Cl:Me và Cl:Me:W. Tái sắc ký cột và sắc ký pha đảo với hệ dung môi Me:W (8:2) để tinh sạch hợp chất.
• Phương pháp xác định cấu trúc: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H-NMR}$, 500 MHz) và carbon ($^{13}\text{C-NMR}$, 125 MHz) hòa tan trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$.
• Xử lý số liệu: Phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và kiểm định Duncan ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan tài liệu

Chương I hệ thống hóa toàn diện các cơ sở lý luận và y văn liên quan đến đề tài:

• Vi khuẩn Escherichia coli: Lịch sử định danh từ năm 1885 bởi Theodor Escherich; vị trí phân loại học trong giới Bacteria, ngành Proteobacteria, họ Enterobacteriaceae; đặc điểm trực khuẩn Gram âm hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, kích thước 2–3 $\mu$m $\times$ 0,5 $\mu$m. Trình bày đặc tính sinh hóa và bệnh học của vi khuẩn (nhiễm trùng đường tiết niệu chiếm 90% ở phụ nữ, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não sơ sinh chiếm 40% ca bệnh). Cập nhật số liệu dịch tễ đề kháng kháng sinh tại Việt Nam: tỷ lệ kháng ampicillin đạt 81,4%, kháng cephalosporin thế hệ 3 và fluoroquinolone gần 50%; mức độ sinh ESBL tại các bệnh viện trung ương dao động từ 32,4% đến hơn 70%.
• Vi khuẩn Bacillus: Lược sử nghiên cứu từ Ferdinand Cohn (1870) mô tả B. subtilis, Robert Koch (1876) phát hiện B. anthracis, đến các công trình phân loại của Nathan R. Smith và Ruth E. Gordon (1940–1973). Đặc điểm tế bào sinh dưỡng (0,5–1,2 $\mu$m $\times$ 2,5–10 $\mu$m), khả năng tạo nội bào tử chịu nhiệt và sinh tổng hợp 167 hợp chất có hoạt tính kháng vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật (tiêu biểu như surfactin, subtilin, bacteriocin).
• Tình hình nghiên cứu hợp chất tự nhiên: Điểm lại các công trình quốc tế về chất ức chế $\beta$-lactamase và kháng sinh từ vi sinh vật nội sinh (Strobel và cs., 2000; Phongpaichit, 2006; Tabbene và cs., 2008, 2010 với hợp chất S07-2 khối lượng 905,6 Da). Tại Việt Nam, tổng hợp các nghiên cứu của Trần Thị Như Hằng (2009), Phạm Văn Cường (2015), Phan Thị Hoài Trinh (2016) và công trình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Bacillus sp. RD26 của Dương Nhật Linh và cộng sự (2018).
• Nguyên lý các phương pháp chiết tách: Cơ sở lý thuyết của chiết lỏng - lỏng phân chia theo độ phân cực dung môi, kỹ thuật làm khan và thu hồi dung môi; nguyên lý sắc ký cột hấp phụ dựa trên ái lực phân bố chất tan giữa pha tĩnh và pha động; nguyên lý sắc ký lớp mỏng TLC và phương pháp tính giá trị $R_f$.

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và phương tiện nghiên cứu:

• Địa điểm, thời gian và nguyên vật liệu: Nghiên cứu thực hiện từ 09/2018 đến 12/2018 tại Đại học Mở TP.HCM và Viện Công nghệ Hóa học. Vật liệu gồm chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh từ cây Diệp Hạ Châu Đắng và chủng E. coli sinh ESBL 128a; các môi trường nuôi cấy NA, NB, MHA, MHB; hóa chất và dung môi hữu cơ tinh khiết ($n$-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol, DMSO, DTT); silica gel kích thước 0,04–0,06 mm và bản mỏng TLC Silica gel $60\text{ F}_{254}$.
• Quy trình thực nghiệm:
  • Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể gồm 8 giai đoạn liên hoàn từ khâu lên men đến phân lập hợp chất tinh khiết.
  • Quy trình thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch ngoại bào và dịch nội bào (sau tán sóng siêu âm ở $0–5^\circ\text{C}$ với DTT 10 mM) bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
  • Quy trình lên men bán mẻ 600 mL trong môi trường dinh dưỡng tối ưu (Peptone 7,36 g/L; Glucose 15 g/L; $\text{CaCO}_3$ 0,72 g/L; $\text{MgSO}_4$ 0,6 g/L; pH 7,0; $30^\circ\text{C}$; 36 giờ; 200 vòng/phút).
  • Quy trình chiết lỏng - lỏng thu nhận 6 phân đoạn cao chiết thô tương ứng với 6 dung môi.
  • Phương pháp xác định MIC bằng kỹ thuật pha loãng nồng độ trên phiến 96 giếng.
  • Quy trình sắc ký cột pha thường nạp 42 g cao thô methanol, rửa giải qua các tỷ lệ dung môi Cl:Me (95:5, 92:8, 85:15, 70:30) và Cl:Me:W (65:35:5, 60:40:10), thu nhận 6 phân đoạn lớn ký hiệu từ Cao A đến Cao F.
  • Sơ đồ phân lập chi tiết phân đoạn C (qua các phân đoạn C1, C2, C2.1, C2.2, C2.2A, C2.2B) và phân đoạn D (chia cột D1, D2, kết hợp sắc ký pha đảo với dung môi Me:W 8:2) để thu nhận hợp chất tinh sạch.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày số liệu thực nghiệm thu được và thảo luận học thuật:

• Khảo sát hoạt tính của dịch nuôi cấy và sinh khối: Dịch ngoại bào của Bacillus sp. RD26 tạo vòng kháng khuẩn rõ rệt đối với E. coli sinh ESBL với đường kính trung bình $18 \pm 0,41\text{ mm}$, trong khi dịch nội bào không tạo vòng kháng khuẩn (0 mm). Kết quả chứng minh các hợp chất có hoạt tính sinh học được vi khuẩn sinh tổng hợp và bài tiết hoàn toàn ra môi trường ngoại bào trong quá trình nuôi cấy.
• Hiệu suất thu nhận cao chiết thô: Quá trình chiết lỏng - lỏng 600 mL dịch nuôi cấy với các dung môi khác nhau cho khối lượng và hiệu suất thu hồi có sự khác biệt rõ rệt ($p < 0,05$):
  • Dung môi Ethyl acetate (EA) cho lượng cao thô lớn nhất đạt $5,16 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 5,16%).
  • Dung môi $n$-Hexane (HE) thu được $2,61 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 2,61%).
  • Dung môi Chloroform (Cl) thu được $2,27 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 2,27%).
  • Dung môi Nước (W) thu được $2,13 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 2,13%).
  • Dung môi Methanol (Me) thu được $1,81 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 1,81%).
  • Dung môi Dichloromethane (DI) thu được lượng cao thấp nhất là $1,21 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 1,21%).
• Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và phân đoạn sắc ký: Khảo sát hoạt tính kháng E. coli sinh ESBL và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các cao chiết thô; phân tích thành phần các phân đoạn cắn trên bản mỏng TLC nhằm xác định hệ số dịch chuyển $R_f$.
• Phân đoạn sắc ký cột và phân lập hợp chất: Sắc ký cột 42 g cao thô methanol thu được 6 phân đoạn chính từ A đến F. Thử nghiệm hoạt tính khẳng định các phân đoạn C [hệ dung môi Cl:Me (85:15)] và D [hệ dung môi Cl:Me (70:30)] thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất đối với E. coli sinh ESBL. Tiến hành tái sắc ký cột và sắc ký pha đảo đối với phân đoạn C và D đã phân lập thành công hợp chất tinh sạch ký hiệu BR01.
• Nhận danh cấu trúc hóa học của hợp chất BR01: Dựa trên phân tích đối chiếu dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz) và $^{13}\text{C-NMR}$ (125 MHz) đo trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$, hợp chất tinh sạch BR01 được xác định có khung cấu trúc hóa học là pyrimidine-2,4-dione (dẫn xuất uracil).

Chương IV: Kết luận và đề nghị

Chương IV tổng kết các kết quả đạt được và nêu các đề xuất tiếp theo:

• Kết luận: Chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh từ cây Diệp Hạ Châu Đắng có khả năng sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn ngoại bào ức chế vi khuẩn E. coli sinh ESBL. Đã thiết lập được quy trình chiết phân đoạn bằng các hệ dung môi hữu cơ, thực hiện phân tách thành công 6 phân đoạn qua sắc ký cột silica gel và phân lập, nhận danh được hợp chất có hoạt tính sinh học BR01 mang khung cấu trúc pyrimidine-2,4-dione.
• Đề nghị: Tiếp tục mở rộng thử nghiệm phổ kháng khuẩn của hợp chất BR01 trên các chủng vi khuẩn lâm sàng đa kháng khác; khảo sát độc tính sinh học in vitro và in vivo; nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động ở mức độ phân tử và tối ưu hóa quy trình tinh sạch để nâng cao hiệu suất thu hồi ở quy mô lớn hơn.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu được các kết quả định lượng cụ thể:

• Xác định hoạt tính kháng E. coli sinh ESBL tập trung ở dịch ngoại bào của chủng Bacillus sp. RD26 với đường kính vòng ức chế đạt $18 \pm 0,41\text{ mm}$, trong khi dịch nội bào không có hoạt tính (0 mm).
• Thiết lập dữ liệu định lượng về khối lượng và hiệu suất thu hồi cao chiết thô từ 600 mL dịch lọc nuôi cấy vi khuẩn qua các hệ dung môi khác nhau:

Dung môi chiết	Thể tích dịch lọc (mL)	Khối lượng cao thô (g)	Hiệu suất thu hồi (%)
Ethyl acetate (EA)	100	$5,16 \pm 0,09^\text{a}$	5,16
$n$-Hexane (HE)	100	$2,61 \pm 0,09^\text{b}$	2,61
Chloroform (Cl)	100	$2,27 \pm 0,09^\text{c}$	2,27
Nước cất (W)	100	$2,13 \pm 0,09^\text{c}$	2,13
Methanol (Me)	100	$1,81 \pm 0,09^\text{d}$	1,81
Dichloromethane (DI)	100	$1,21 \pm 0,09^\text{e}$	1,21

(Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị có ký tự chữ cái đi kèm khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,05$ qua phép thử Duncan).

• Phân tách thành công 42 g cao thô methanol bằng sắc ký cột hấp phụ pha thường thành 6 phân đoạn chính: Cao A [Cl:Me (95:5)], Cao B [Cl:Me (92:8)], Cao C [Cl:Me (85:15)], Cao D [Cl:Me (70:30)], Cao E [Cl:Me:W (65:35:5)], và Cao F [Cl:Me:W (60:40:10)].
• Tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất có hoạt tính kháng E. coli sinh ESBL ký hiệu BR01 là dẫn xuất pyrimidine-2,4-dione dựa trên phổ $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz) và $^{13}\text{C-NMR}$ (125 MHz).

Đóng góp khoa học và thực tiễn của đề tài:

• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về hoạt tính kháng trực khuẩn Gram âm đa kháng sinh enzyme ESBL từ chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 phân lập từ nguồn dược liệu Việt Nam (cây Diệp Hạ Châu Đắng).
• Xây dựng quy trình chiết tách phân đoạn, định hướng phân lập bằng hoạt tính sinh học kết hợp kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, tạo cơ sở cho các nghiên cứu phát triển kháng sinh mới từ nguồn vi sinh vật nội sinh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài theo phạm vi thực hiện:

• Nghiên cứu thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm (thể tích lên men 600 mL, khối lượng cao thô đưa vào sắc ký cột 42 g).
• Phổ kháng khuẩn của các phân đoạn và hợp chất BR01 mới được khảo sát trên một chủng kiểm định E. coli sinh ESBL 128a, chưa tiến hành đánh giá trên tập hợp các chủng vi khuẩn lâm sàng đa kháng khác.
• Chưa tiến hành thử nghiệm độc tính tế bào in vitro/in vivo cũng như chưa đi sâu phân tích cơ chế ức chế enzyme hoặc tác động màng của phân tử BR01.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Mở rộng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất BR01 trên các chủng vi khuẩn gây bệnh lâm sàng Gram âm và Gram dương đa kháng thuốc khác (như MRSA, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae).
• Đánh giá độc tính tế bào, độ an toàn dược lý và cơ chế ức chế sinh học ở mức độ phân tử.
• Nghiên cứu nâng cấp quy mô lên men trong hệ thống bioreactor và tối ưu hóa quy trình sắc ký để nâng cao hiệu suất phân lập hợp chất.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Đối tượng: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học (định hướng Y Dược, Vi sinh), Hóa dược, Dược học và Hóa sinh học.
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình thực nghiệm nuôi cấy vi khuẩn nội sinh sinh tổng hợp chất kháng sinh trên môi trường tối ưu.
  • Kỹ thuật phá vỡ màng tế bào bằng sóng siêu âm kết hợp chất bảo vệ DTT để đánh giá phân bố hoạt chất nội bào và ngoại bào.
  • Sơ đồ chiết lỏng - lỏng phân đoạn có hệ thống từ phân cực thấp đến phân cực cao.
  • Thông số vận hành sắc ký cột silica gel (tỷ lệ pha động Cl:Me và Cl:Me:W, kết hợp sắc ký pha đảo Me:W) dùng để phân tách và tinh chế các dẫn xuất pyrimidine từ dịch lên men vi sinh vật.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 trong khóa luận có nguồn gốc từ đâu và được nuôi cấy trong điều kiện môi trường nào?
Chủng Bacillus sp. RD26 là vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.), do Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh (Đại học Mở TP.HCM) cung cấp. Chủng được lên men trong môi trường dinh dưỡng tối ưu gồm: Peptone 7,36 g/L; Glucose 15 g/L; $\text{CaCO}_3$ 0,72 g/L; $\text{MgSO}_4$ 0,6 g/L ở $30^\circ\text{C}$, pH 7,0, thời gian 36 giờ với tốc độ lắc 200 vòng/phút.

2. Khả năng kháng E. coli sinh ESBL thể hiện ở dịch ngoại bào hay dịch nội bào của Bacillus sp. RD26?
Hoạt tính kháng khuẩn chỉ xuất hiện ở dịch ngoại bào (dịch nuôi cấy sau khi ly tâm loại sinh khối) với đường kính vòng vô khuẩn đạt $18 \pm 0,41\text{ mm}$. Dịch nội bào (thu nhận qua phá vỡ màng tế bào bằng sóng siêu âm 6 chu kỳ $\times$ 30 giây có DTT 10 mM) hoàn toàn không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn (đường kính vòng kháng 0 mm).

3. Trong các dung môi thử nghiệm chiết lỏng - lỏng, dung môi nào cho khối lượng cao thô cao nhất và thấp nhất từ dịch lọc nuôi cấy?
Từ 100 mL dịch lọc nuôi cấy (tổng thể tích khảo sát 600 mL), dung môi Ethyl acetate (EA) cho lượng cao thô cao nhất đạt $5,16 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 5,16%). Dung môi Dichloromethane (DI) cho lượng cao thô thấp nhất đạt $1,21 \pm 0,09\text{ g}$ (hiệu suất 1,21%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,05$.

4. Quy trình sắc ký cột phân đoạn 42 g cao thô methanol đã sử dụng các hệ dung môi nào để thu nhận các phân đoạn chính?
Sắc ký cột pha thường sử dụng pha tĩnh silica gel (0,04–0,06 mm) và rửa giải tuần tự bằng 6 hệ dung môi gradient: Chloroform : Methanol tỉ lệ (95:5) thu Cao A; (92:8) thu Cao B; (85:15) thu Cao C; (70:30) thu Cao D; Chloroform : Methanol : Nước tỉ lệ (65:35:5) thu Cao E; và (60:40:10) thu Cao F. Trong đó, phân đoạn C và D thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.

5. Hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng E. coli sinh ESBL được phân lập trong nghiên cứu là chất gì?
Hợp chất tinh khiết phân lập được từ các phân đoạn hoạt tính ký hiệu là BR01. Qua đối chiếu dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H-NMR}$ (500 MHz) và $^{13}\text{C-NMR}$ (125 MHz) đo trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$, cấu trúc hóa học của BR01 được xác định là dẫn xuất pyrimidine-2,4-dione (uracil).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đinh Thị Thúy Kiều đã chứng minh thực nghiệm khả năng tiết chất kháng khuẩn ngoại bào của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 (phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng) chống lại vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli sinh ESBL 128a. Đề tài đã xây dựng quy trình chiết lỏng - lỏng phân đoạn từ dịch nuôi cấy lên men tối ưu, đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết qua 6 hệ dung môi và phân tách thành công 6 phân đoạn chính qua sắc ký cột silica gel từ 42 g cao thô methanol. Kết quả nghiên cứu đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất có hoạt tính sinh học BR01 mang khung cấu trúc pyrimidine-2,4-dione, cung cấp dữ liệu khoa học nền tảng cho việc nghiên cứu và phát triển các hoạt chất kháng sinh tự nhiên chống vi khuẩn đa kháng thuốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 5 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN E. coli phân lập lần đầu tiên bởi Escherich vào năm 1885.

Vi khuẩn này có mặt rất sớm ở đại tràng sau 3 giờ trẻ sinh ra. Bình thường chúng góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, giữ thăng bằng hệ vi khuẩn đường ruột. coli chiếm 80% các vi khuẩn hiếu khí ở đại tràng. Trong đường tiêu hóa, E.

coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí. Năm 1885, tại München (Đức), một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich rất quan tâm đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Kock về vi khuẩn. Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới một vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng. Vi khuẩn do Escherich phát hiện từ trong tã lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune.

Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá. Tuy nhiên, nó vẫn được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau đó, Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn mới được định danh thống nhất toàn cầu là E. coli sống ở khắp nơi trong môi trường và đặc biệt phổ biến ở động vật. coli sống trong các bộ phận của cơ thể, chẳng hạn như ruột và đường hô hấp.

Trong ruột, vi khuẩn thường sống hòa bình và giúp tổng hợp các loại vitamin K và B. Hiện nay đã có hàng trăm chủng vi khuẩn E. Chúng được phân loại và đánh số bởi các kháng nguyên. Một số trong các vi khuẩn E.

coli có gen, hoặc thông qua các đột biến hoặc từ các sinh vật khác, cho phép sản xuất chất độc có hại cho con người. Nếu chúng ta ăn phải những dòng vi khuẩn có hại, giống như 0157: H7, chúng có thể gây bệnh bằng cách sản sinh ra những chất độc hóa học mạnh mẽ, hay độc tố. Tuy nhiên, hầu hết các chủng E. coli là vô hại và sống trong ruột của con người và động vật khỏe mạnh.

coli thường được các nhà khoa học sử dụng như một công cụ nghiên cứu cơ bản vì nó phát triển nhanh chóng. Các nhà nghiên cứu sử dụng chúng như một sinh vật mô hình tương tự như vi khuẩn gây bệnh khác. Khi ăn thực phẩm nhiễm E. coli hoặc trực SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 6 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát tiếp tiếp xúc với phân có chứa E. coli, vi khuẩn vào cơ thể như dạ dày và ruột non, và thường gắn với bề mặt bên trong của ruột già. Độc tố, hoặc các chất độc tiết ra của vi khuẩn gây sưng thành ruột, gây bệnh đường tiêu hóa nghiêm trọng như viêm ruột kết xuất huyết (Hemorrhagic colitis).

(Nguyễn Thanh Bảo) Phân loại theo khóa phân loại quốc tế Escherichia coli được phân loại như sau: (Dowrkin,2006) Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia Loài: Escherichia coli Hình thái và đặc điểm nuôi cấy Hình thái Trực khuẩn Gram âm, dài hay ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy. Một số di động, một số lại bất động. Một số có nang. Vi khuẩn không sinh bào tử.

coli có kích thước trung bình 2 – 3 µm x 0,5 µm.1 Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn E. coli Đặc điểm nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Nhiệt độ thích hợp là 350C – 370C, tuy nhiên có thể tăng SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 7 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát trưởng từ 100C – 460C (Nguyễn Thanh Bảo). Trong môi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ khuẩn lạc có đường kính khoảng 1,5 mm, dạng S: tròn, bờ đều. lồi bóng, không màu hoặc màu xám nhạt.

Có thể gặp khuẩn lạc dạng M hoặc R. coli mọc dễ dàng trên môi trường Maconkey, EMB, … Một số chất ức chế sự phát triển của E. coli như chlorine và dẫn xuất, muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate, selenite, … (Đoàn Thị Nguyện, 2010). Tính chất sinh hóa E.

coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite. coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường dùng thử nghiệm IMViC ++-- (Indol, Methyl red, Vosges – Proskauer, Citrate) và thêm một số thử nghiệm sinh hóa khác: KIA (lên men glucose, lactose, không sinh H2S), di động (+). Khả năng gây bệnh Nhiễm khuẩn đường tiểu: 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu tiên ở phụ nữ là do E. coli với các triệu chứng tiểu lắc nhắc, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ.

Có thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết. Nhiễm khuẩn huyết: khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn máu. coli chiếm khoảng 40 % trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, 75 % trong số đó có kháng nguyên K1. Tiêu chảy: những chủng E.coli liên quan đến tiêu chảy thuộc các nhóm EPEC, ETEC, EIEC, VTEC.

Tình hình đề kháng kháng sinh Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển (Thi Thu Hao Van và cs. Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại bệnh viện Nhiệt đới Trung ương tỉ lệ kháng ampicillin của E. coli lên tới 81,4 %; kháng SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 8 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát amoxicillin/clavulanic và ampicillin / sulbactam khoảng 40 %. Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 3 cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm fluoro – quinolon cũng bị kháng khoảng 45 % (Trần Thị Thùy Giang và cs, 2014). Tỉ lệ bệnh nhân tử vong liên quan đến nhiễm trùng do E.

coli trên thế giới mỗi năm rất cao và gia tăng. Trong những năm gần đây, các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng nhiều và đề kháng kháng sinh do vi khuẩn Gram âm sinh beta-lactamase phổ rộng là vấn đề được quan tâm nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt là E. coli sinh beta-lactamase phổ rộng (E. coli sinh ESBL) (Bùi Thị Lê Minh và cs.

Ở Việt Nam, một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy E. coli sinh ESBL hiện diện trên bệnh nhân khá cao. Kết quả khảo sát trực khuẩn Gram âm sinh beta-lactamase phổ rộng phân lập tại Bệnh viện Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỉ lệ nhiễm vi khuẩn sinh ESBL chiếm 32,4%, trong đó E. coli chiếm tỉ lệ cao 71,2% và các chủng vi khuẩn sinh ESBL đề kháng cao với các nhóm kháng sinh aminoglycosides (trừ amikacin) và fluoroquinolones.

Một nghiên cứu khác tại bệnh viện Chợ Rẫy cho thấy 174 mẫu phân của bệnh nhân không nhiễm khuẩn tiêu hóa đến khám bệnh có 133 mẫu (76,4%) có vi khuẩn sinh ESBL và chủ yếu là E. coli 65,8% (Võ Thị Chi Mai và ctv. (Bùi Thị Lê Minh và cs., 2018) Theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008 – 2009, đã cho thấy tỷ lệ sinh ESBL của các chủng E. coli và Klebsiella dao động giữa các bệnh viện, cao nhất ở bệnh viện Nhiệt đới Trung ương với 54,7 % trên E.

coli và 72,7 % Klebsiella (bệnh viện đầu ngành về bệnh truyền nhiễm), sau đó là bệnh viện Chợ Rẫy với 49 % và 58,2 % (bệnh viện đa khoa lơn nhất khu vực phía Nam), bệnh viện Việt Đức với 57,3 % và 48,5 % (bệnh viện chuyên khoa về phẫu thuật), bệnh viện Bình Định và 2 bệnh viện Nhi (Nhi Trung ương và Nhi Đồng I) với tỷ lệ gần 40 % trên E. coli và 50 % trên Klebsiella. Đây cũng là các bệnh viện có tỷ lệ E. coli và Klebsiella kháng cephalosporins thế hệ 3 cao hơn các bệnh viện khác (GARP – Vietnam, 2010).

VI KHUẨN Bacillus SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 9 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát Lịch sử vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus có một lịch sử lâu dài và phong phú trong các tiểu sử vi sinh vật. Trong những năm 1870, Ferdinand Cohn, làm việc tại Đại học Breslau, đã cô lập thành công một bacterium nhỏ gọn, linh hoạt, hiếu khí.

Ông đặt tên nó là Bacillus subtilis, có nghĩa là “que mỏng”. Cohn đã mô tả chính xác về chu kỳ sống của Bacillus, chứng minh sự hình thành, khả năng chịu nhiệt, nảy mầm và sự phát triển của endospores (Cohn và cs. Khi Robert Koch thành lập một sinh vật tương tự về mặt hình thái, B. anthracis là tác nhân gây bệnh than (Koch và cs., 1876), tầm quan trọng của khoa học về nhóm sinh vật mới này đã trở nên rõ ràng.

Trong 50 năm tới, nhiều vi khuẩn hình thành endospore mới đã được xác định. Tuy nhiên, do công cụ còn hạn chế, việc đặt tên và phân loại các loài vi khuẩn này còn rất khó khăn. Thách thức lớn nhất của việc đưa ra thứ tự phân loại Bacillus đã được đặt ra với sự suy luận đáng ngưỡng mộ của Nathan R. Clark, và Ruth E.

Gordon trong những năm 1930 và 1940. Họ đã sử dụng giống, bao gồm “vi khuẩn hình que có khả năng hình thành các tế bào endospores khúc xạ có khả năng kháng hơn các tế bào thực vật để làm nóng, khô và các cơ quan phá hoại khác” (Gordon và cs. Smith lắp ráp một bộ sưu tập 1134 chủng Bacillus mesophilic mang 158 tên loài khác nhau. Với các đồng nghiệp của mình, ông bắt đầu tập hợp một số dữ liệu hình thái và sinh lý học tỉ mỉ, khắt khe trên từng dòng.

Sau khi phân tích dữ liệu - với sự thiên về cố ý đối với việc "gộp" chứ không phải là "tách" họ đã gép từng nhóm phân lập cho một trong 19 loài được xác định chặt chẽ (Smith và cs. Ngay sau đó, Gordon và Smith lặp lại quá trình với một bộ sưu tập 206 chủng Bacillus nhiệt phân, chỉ định chúng cho hai loài bổ sung (Gordon và cs. Năm 1973, trong chuyên khảo cổ điển của chi Bacillus (Gordon và cs., 1973b), Ruth Gordon và các đồng nghiệp đã cung cấp các mô tả chi tiết, chính xác cho 18 loài Bacillus. Phân loại Bacillus đã phát triển thành khoa học hợp lý, có trật tự và sáng suốt.

Phân Loại Theo khóa phân loại Bergey, Bacillus được phân loại như sau: SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 10 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Hình 1.