Khảo sát hợp chất có hoạt tính sinh học kháng e coli sinh β lactamase phổ rộng esbl từ chủng bacillus sp rd26 nội sinh

Nghiên cứu hợp chất kháng E. coli ESBL từ Bacillus sp. RD26 nội sinh. Tìm kiếm hoạt tính sinh học, mở ra hướng mới trong điều trị nhiễm khuẩn kháng kháng sinh.

• Tác giả: Đinh Thị Thúy Kiều
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Kháng E. Coli Sinh 𝜷 − 𝐋𝐀𝐂𝐓𝐀𝐌𝐀𝐒𝐄 Phổ Rộng (ESBL) Từ Chủng Bacillus Sp. RD26 Nội Sinh
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN E. coli
• 1.2. Phân loại theo khóa phân loại quốc tế
• 1.3. Hình thái và đặc điểm nuôi cấy
• 1.4. Khả năng gây bệnh
• 1.5. Tình hình đề kháng kháng sinh
• 1.6. VI KHUẨN Bacillus
• 1.6.1. Lịch sử vi khuẩn Bacillus
• 1.6.2. Phân Loại
• 1.6.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.6.4. Ứng dụng của Bacillus
• 1.6.5. Hợp chất từ Bacillus có hoạt tính sinh học
• 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT TỪ BACILLUS
• 1.7.1. Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus trên thế giới
• 1.7.2. Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus ở Việt Nam
• 1.8. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT
• 1.8.1. Đặc điểm chung của phương pháp
• 1.8.2. Kĩ thuật chiết lỏng-lỏng
• 1.8.3. Sắc ký cột
• 1.8.4. Sắc ký lớp mỏng
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. VẬT LIỆU
• 2.2.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu
• 2.2.2. Môi trường – hóa chất
• 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.3.2. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp. RD26
• 2.3.3. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.3.3.1. Chuẩn bị môi trường
• 2.3.3.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.3.3.3. Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm
• 2.3.3.4. Tiến hành thử nghiệm
• 2.3.3.5. Kết quả
• 2.3.4. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch nội bào Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.3.4.1. Thu nhận sinh khối Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp sóng siêu âm
• 2.3.4.2. Tiến hành thí nghiệm
• 2.3.5. Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp. RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
• 2.3.6. Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp lên men trên môi trường tối ưu
• 2.3.7. Thu nhận cao chiết Bacillus sp. RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
• 2.3.8. Thử khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ cao chiết Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa kirby-bauer
• 2.3.9. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibatory Concentration) của cao chiết với vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.3.10. Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
• 2.3.11. Sắc ký cột cao chiết
• 2.3.12. Khảo sát khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ các phân đoạn thu được của cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby – Bauer
• 2.3.13. Phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng E. coli sinh ESBL
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG E. COLI SINH ESBL CỦA DỊCH NUÔI CẤY VÀ TỪ SINH KHỐI CHỦNG BACILLUS SP. RD26
• 3.2. KẾT QUẢ THU NHẬN CAO CHIẾT BACILLUS SP. RD26 TỪ CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU
• 3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC CAO CHIẾT THÔ THU ĐƯỢC
• 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH E. COLI SINH ESBL
• 3.5. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CẮN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG (TLC)
• 3.6. SẮC KÝ CỘT
• 3.7. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS SP. RD26 NỘI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY – BAUER
• 3.8. PHÂN LẬP HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 4.1. KẾT LUẬN
• 4.2. ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG – HÓA CHẤT
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT
• PHỤ LỤC 4: HÌNH ẢNH MIC
• PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ GIẢI PHỔ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về E

Vi khuẩn kháng thuốc là một vấn đề nhức nhối toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Mỗi năm, hàng trăm nghìn người trên thế giới tử vong vì vi khuẩn kháng thuốc. Nhiều chủng đã kháng hầu hết các kháng sinh, kể cả thế hệ mới. Trong khi đó, việc nghiên cứu kháng sinh mới lại rất chậm. Tình trạng này khiến lượng kháng sinh hiện có không đủ để điều trị nhiễm khuẩn đa kháng thuốc. (Jeyanthi và cs., 2016). Trong những thập kỷ gần đây, vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) ngày càng gia tăng, gây thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng. Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng đa thuốc là vấn đề đáng lo ngại đối với sức khỏe con người. Từ những năm 2000, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae có khả năng sinh ra các enzyme β – lactamase phổ rộng (Extended – Spectrum Beta – Lactamase; ESBLs), ly giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm cephalosporin. Bacillus Sp. RD26 là một ứng cử viên tiềm năng trong cuộc chiến chống lại E. Coli ESBL.

1.1. E. Coli ESBL Mối Nguy Tiềm Ẩn và Kháng Kháng Sinh

E. Coli ESBL là một chủng vi khuẩn nguy hiểm, có khả năng sinh ra enzyme β-lactamase phổ rộng, kháng lại nhiều loại kháng sinh cephalosporin. Tại Việt Nam, tình trạng nhiễm E. Coli ESBL đang ở mức báo động, đặc biệt tại các bệnh viện. Các vi khuẩn Gram âm gây bệnh đang chiếm ưu thế, với tỷ lệ khoảng 70%, thường gặp là họ Enterobacteriaceae. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất mới để điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bởi vi sinh vật này là vô cùng cần thiết.

1.2. Chi Bacillus Tiềm Năng Kháng Khuẩn và Ứng Dụng

Chi Bacillus bao gồm nhiều loài vi khuẩn Gram dương trong đất, một số loài đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) công nhận là an toàn (GRAS). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi Bacillus subtilis. Các hợp chất này có khả năng ức chế các loài vi khuẩn gây bệnh. Một số hợp chất chống MRSA đã được phân lập từ vi khuẩn Bacillus sp, bao gồm Bogorol A và Loloatins A, B, C, và D.

II. Tại Sao Cần Nghiên Cứu Kháng E

Trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho kháng sinh truyền thống là vô cùng quan trọng. Các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật, đặc biệt là từ chi Bacillus, đang thu hút sự quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu. Việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus Sp. RD26 đối với E. Coli ESBL không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong y học và dược phẩm.

2.1. Thách Thức Trong Điều Trị Nhiễm Trùng E. Coli ESBL

Nhiễm trùng do E. Coli ESBL gây ra là một thách thức lớn trong điều trị lâm sàng. Các kháng sinh truyền thống thường không hiệu quả do vi khuẩn đã phát triển cơ chế kháng thuốc. Điều này dẫn đến việc phải sử dụng các kháng sinh mạnh hơn, gây ra nhiều tác dụng phụ và tăng chi phí điều trị. Do đó, cần có các phương pháp điều trị mới, hiệu quả hơn và an toàn hơn.

2.2. Tìm Kiếm Giải Pháp Tự Nhiên Bacillus Sp. RD26

Trước tình hình đó, việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguồn tự nhiên đang được đẩy mạnh. Bacillus Sp. RD26 đã được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng và được chứng minh là có khả năng kháng E. Coli ESBL. Nghiên cứu này nhằm khảo sát sâu hơn về các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ chủng vi khuẩn này.

2.3. Tình hình kháng kháng sinh E.coli ESBL tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh của E. coli ESBL đang ở mức báo động. Nhiều báo cáo cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh ở mức cao tại các bệnh viện, đặc biệt là đối với các vi khuẩn Gram âm gây bệnh. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các giải pháp thay thế để điều trị nhiễm trùng do E. coli ESBL.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng E

Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ chủng Bacillus Sp. RD26 nội sinh. Các phương pháp được sử dụng bao gồm xác định khả năng kháng khuẩn từ dịch ngoại bào và nội bào, nuôi cấy và thu nhận cao chiết từ các hệ dung môi khác nhau, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột, tinh sạch và phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học.

3.1. Xác Định Khả Năng Kháng Khuẩn Dịch Ngoại Bào và Nội Bào

Khả năng kháng E. Coli ESBL được xác định từ cả dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus Sp. RD26. Điều này giúp đánh giá toàn diện khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn. Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL.

3.2. Nuôi Cấy và Thu Nhận Cao Chiết Hệ Dung Môi Đa Dạng

Bacillus Sp. RD26 được nuôi cấy trong môi trường tối ưu để tăng cường sản xuất các hợp chất kháng khuẩn. Cao chiết được thu nhận từ các hệ dung môi khác nhau để phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hệ dung môi được lựa chọn dựa trên tính chất hóa học của các hợp chất mong muốn.

3.3. Xác Định MIC và Phân Tích Sắc Ký Đánh Giá Hoạt Tính

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết đối với E. Coli ESBL được xác định để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn. Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột được sử dụng để phân tích và phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cao chiết. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột được đánh giá khả năng kháng khuẩn.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của RD26 57 ký tự

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Bacillus Sp. RD26 có khả năng kháng E. Coli ESBL đáng kể. Cao chiết thu được từ các hệ dung môi khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn khác nhau. Sắc ký cột giúp phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học, và một số phân đoạn cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL mạnh mẽ. Các kết quả này mở ra triển vọng ứng dụng Bacillus Sp. RD26 trong điều trị nhiễm trùng.

4.1. Hoạt Tính Kháng Khuẩn từ Dịch Nuôi Cấy và Sinh Khối

Dịch nuôi cấy và sinh khối của chủng Bacillus Sp. RD26 đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với E. Coli ESBL. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn giữa dịch nuôi cấy và sinh khối, cho thấy các hợp chất kháng khuẩn có thể được sản xuất và bài tiết ra môi trường nuôi cấy hoặc tích lũy trong tế bào vi khuẩn.

4.2. Ảnh Hưởng Của Dung Môi Đến Hoạt Tính Cao Chiết

Dung môi sử dụng trong quá trình chiết xuất ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. Một số dung môi cho phép thu được cao chiết có khả năng ức chế E. Coli ESBL mạnh mẽ hơn so với các dung môi khác. Điều này cho thấy tính chất hóa học của dung môi có vai trò quan trọng trong việc hòa tan và chiết xuất các hợp chất kháng khuẩn.

4.3. Phân Lập Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Tiềm Năng Ứng Dụng

Việc phân lập và tinh sạch các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ Bacillus Sp. RD26 là một bước quan trọng để xác định cấu trúc và cơ chế hoạt động của chúng. Các hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới hoặc các sản phẩm sinh học để kiểm soát nhiễm trùng do E. Coli ESBL.

V. Ứng Dụng Bacillus Sp

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng Bacillus Sp. RD26 trong kiểm soát E. Coli ESBL. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn, cơ chế hoạt động của chúng, và đánh giá hiệu quả in vivo. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất cũng là một hướng đi quan trọng để tăng cường sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học.

5.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Y Tế và Dược Phẩm

Bacillus Sp. RD26 và các hợp chất kháng khuẩn từ nó có tiềm năng ứng dụng trong y tế và dược phẩm. Chúng có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới, các sản phẩm sinh học để phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng do E. Coli ESBL, hoặc các sản phẩm vệ sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

5.2. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Kháng Khuẩn

Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn từ Bacillus Sp. RD26 là cần thiết để hiểu rõ cách chúng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL. Điều này có thể giúp tối ưu hóa việc sử dụng chúng trong điều trị và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc.

VI. Kết Luận Bacillus Sp

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của Bacillus Sp. RD26 trong việc kháng E. Coli ESBL. Các kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho kháng sinh truyền thống và đối phó với tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Quan Trọng

Nghiên cứu đã xác định được hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus Sp. RD26 đối với E. Coli ESBL, đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính của cao chiết, và phân lập được một số hợp chất có hoạt tính sinh học. Các kết quả này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các ứng dụng thực tiễn của Bacillus Sp. RD26 trong y tế và dược phẩm.

6.2. Hướng Đi Cho Các Nghiên Cứu Tương Lai

Các nghiên cứu tương lai nên tập trung vào việc xác định cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn, cơ chế hoạt động của chúng, và đánh giá hiệu quả in vivo. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất cũng là một hướng đi quan trọng để tăng cường sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Tình trạng vi khuẩn đề kháng kháng sinh (Antimicrobial Resistance - AMR) đang là một trong những hiểm họa y tế toàn cầu nghiêm trọng nhất trong thế kỷ 21. Theo báo cáo từ Trung tâm Động học Dịch bệnh, Kinh tế và Chính sách (CDDEP) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có hàng trăm nghìn ca tử vong do các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc (Multidrug-Resistant - MDR). Trong nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, trực khuẩn Gram âm Escherichia coli có khả năng sinh enzyme $\beta$-lactamase phổ rộng (Extended-Spectrum $\beta$-Lactamase - ESBL) nổi lên như một thách thức điều trị hàng đầu. Enzyme ESBL thủy phân hầu hết các kháng sinh nhóm penicillin, cephalosporin thế hệ 1, 2, 3, 4 và aztreonam, làm vô hiệu hóa các phác đồ điều trị nhiễm khuẩn huyết, viêm đường tiết niệu và nhiễm trùng đường tiêu hóa thông thường.

Tại Việt Nam, các báo cáo giám sát kháng kháng sinh lâm sàng cho thấy mức độ báo động đỏ: tỷ lệ E. coli sinh ESBL tại Bệnh viện Chợ Rẫy đạt từ 51,6% đến 65,8%, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương ghi nhận 54,7%, và Bệnh viện Trung ương Huế là 41,5%. Trong khi tốc độ phát hiện kháng sinh mới trên toàn cầu suy giảm nghiêm trọng, việc khai thác các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms) trong dược liệu mở ra hướng đi đầy tiềm năng. Chi Bacillus là nhóm vi khuẩn Gram dương được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận an toàn (GRAS - Generally Recognized As Safe), nổi tiếng với khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn đa dạng như peptide, lipopeptide và dị vòng purine/pyrimidine.

Dự án "Khảo sát hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. coli sinh $\beta$-lactamase phổ rộng (ESBL) từ chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh" kế thừa chủng vi khuẩn phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn) nhằm sàng lọc, chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc phân tử có khả năng ức chế chủng E. coli ESBL 128a đề kháng cao.

[Phyllanthus amarus] ──> [Bacillus sp. RD26] ──> [Lên men tối ưu 36h]
                                                      │
                                                      ▼
[Kháng E. coli ESBL 128a] ◄── [Hợp chất BR01] ◄── [Sắc ký Cột & Bản mỏng TLC]

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Đánh giá vị trí sinh tổng hợp hoạt chất: Xác định và so sánh hoạt tính kháng E. coli sinh ESBL giữa dịch ngoại bào (cell-free supernatant) và dịch nội bào (intracellular lysate) của chủng Bacillus sp. RD26.
2. Khảo sát hệ dung môi chiết xuất: Thu nhận cao chiết thô từ dịch lên men bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với 6 hệ dung môi có thang phân cực tăng dần: n-Hexane (HE), Chloroform (Cl), Dichloromethane (DI), Ethyl acetate (EA), Methanol (Me), và Nước cất (W).
3. Định lượng hoạt lực kháng khuẩn: Xác định đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) của các loại cao chiết đối với chủng đích E. coli ESBL 128a.
4. Phân đoạn và tinh sạch: Ứng dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột silica gel pha thường (Normal Phase) kết hợp pha đảo (Reverse Phase) để phân tách các phân đoạn có hoạt tính sinh học cao.
5. Xác định cấu trúc hóa học: Phân lập hợp chất tinh khiết (kí hiệu BR01) và giải mã khung cấu trúc phân tử bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR).

Phạm vi và giới hạn của đề tài

• Phạm vi nghiên cứu: Quy trình lên men chìm quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác 100 mL - 1000 mL); khảo sát in vitro trên chủng đối kháng E. coli sinh ESBL 128a do Bộ môn Xét nghiệm - Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp.
• Giới hạn kỹ thuật: Đề tài tập trung vào việc chiết tách, tinh sạch và định danh cấu trúc sơ bộ của hợp chất chính; chưa triển khai thử nghiệm độc tính tế bào (in vitro cytotoxicity) và dược động học in vivo trên mô hình động vật.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng và khoảng trống nghiên cứu

Phương pháp tiếp cận	Ưu điểm	Nhược điểm	Đánh giá tính khả thi
Tổng hợp hóa dược (Chemical Synthesis)	Cấu trúc phân tử đồng nhất, dễ mở rộng quy mô tổng hợp	Dễ xuất hiện cơ chế đề kháng chéo; quy trình hóa chất phát thải độc hại	Khó tìm ra khung cấu trúc hoàn toàn mới để vượt qua enzym ESBL
Chiết xuất trực tiếp từ thực vật	Hợp chất tự nhiên đa dạng, độc tính thấp	Phụ thuộc vào nguồn dược liệu theo mùa; hiệu suất thấp, phá hủy sinh thái	Cần sinh khối thực vật cực lớn để thu nhận lượng nhỏ hoạt chất
Khai thác vi sinh vật nội sinh (Bacillus sp.)	Sinh trưởng nhanh (chu kỳ 25-36h), môi trường rẻ tiền, khả năng sinh chất biến dưỡng phong phú	Yêu cầu kiểm soát chặt chẽ thông số lên men và quy trình phân tách	Tối ưu nhất: Bảo tồn nguồn dược liệu, cho phép tối ưu hóa lên men chìm

Hầu hết các nghiên cứu trước đây về Bacillus chỉ tập trung ức chế vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) hoặc vi nấm gây bệnh thực vật. Khoảng trống nghiên cứu lớn nằm ở việc tìm kiếm các phân tử nhỏ phân cực từ dịch ngoại bào có khả năng xuyên qua lớp màng ngoài kép giàu Lipopolysaccharide (LPS) và bất hoạt chủng Gram âm sinh enzym ESBL.

Thiết kế hệ thống kỹ thuật và Stack công nghệ

Hệ thống thiết bị, vật tư hóa chất và thông số kỹ thuật được chuẩn hóa nghiêm ngặt:

• Pha tĩnh sắc ký: Silica gel dạng hạt kích thước $0,04 - 0,06\text{ mm}$ (Merck), bản mỏng tráng sẵn TLC Silica Gel $60\text{ F}_{254}$ tráng trên nền nhôm (Merck).
• Hệ dung môi phân tích và chiết xuất: Độ tinh khiết phân tích (Analytical Grade) gồm n-Hexane ($\text{C}6\text{H}{14}$), Chloroform ($\text{CHCl}_3$), Dichloromethane ($\text{CH}_2\text{Cl}_2$), Ethyl Acetate ($\text{CH}_3\text{COOC}_2\text{H}_5$), Methanol ($\text{CH}_3\text{OH}$), Dimethyl Sulfoxide ($\text{DMSO}$).
• Thiết bị đo lường & phân tích:
  • Máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis (đo mật độ quang OD ở bước sóng $600 - 610\text{ nm}$).
  • Hệ thống cô quay chân không (Rotary Evaporator) tích hợp bể điều nhiệt thu hồi dung môi.
  • Máy siêu âm phá vỡ tế bào (Ultrasonic Cell Disruptor) đầu dò $9\text{ cm}$, chu kỳ xung $50%$.
  • Máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ($^1\text{H}$-NMR tần số $500\text{ MHz}$, $^{13}\text{C}$-NMR tần số $125\text{ MHz}$) với dung môi hòa tan $\text{DMSO-d}_6$.
• Môi trường nuôi cấy: Môi trường tối ưu Box-Behnken: Peptone ($7,36\text{ g/L}$), Glucose ($15\text{ g/L}$), $\text{CaCO}_3$ ($0,72\text{ g/L}$), $\text{MgSO}_4$ ($0,6\text{ g/L}$); môi trường thử nghiệm Mueller-Hinton Agar (MHA) và Mueller-Hinton Broth (MHB).

                        ┌─────────────────────────────────────┐
                        │   Dịch lên men Bacillus sp. RD26    │
                        └──────────────────┬──────────────────┘
                                           │ Ly tâm 10,000 rpm / Lọc 0.22 µm
                        ┌──────────────────▼──────────────────┐
                        │         Dịch lọc ngoại bào          │
                        └──────────────────┬──────────────────┘
                                           │ Chiết lỏng - lỏng (1:1)
             ┌──────────┬──────────┬───────┴───┬──────────┬──────────┐
             ▼          ▼          ▼           ▼          ▼          ▼
            HE          Cl         DI          EA         Me         W
                                                          │ Cô quay chân không
                                               ┌──────────▼──────────┐
                                               │ Cao thô Me (42.0 g) │
                                               └──────────┬──────────┘
                                                          │ Sắc ký cột Silica gel
                                ┌─────────────────────────┴─────────────────────────┐
                                ▼                                                   ▼
                       Phân đoạn C (85:15)                                 Phân đoạn D (70:30)
                                │                                                   │
                        ┌───────┴───────┐                                   ┌───────┴───────┐
                        ▼               ▼                                   ▼               ▼
                       C1               C2                                  D1              D2
                                        │                                   │               │
                                   ┌────┴────┐                          ┌───┴───┐       ┌───┴───┐
                                  C2.1      C2.2                       D1.1..11 D2.1..21
                                             │                                          │
                                       ┌─────┴─────┐                             ┌──────┴──────┐
                                     C2.2A       C2.2B                          D2.8          D2.16
                                                   │ (Me:W 8:2)                                 │ (Me:W 8:2)
                                             ┌─────▼─────┐                              ┌───────▼───────┐
                                             │   C2.2h   │                              │     D2.16     │
                                             └─────┬─────┘                              └───────┬───────┘
                                                   └─────────────────┬──────────────────────────┘
                                                                     ▼
                                                       ┌───────────────────────────┐
                                                       │ Hợp chất tinh khiết BR01  │
                                                       │ (1H-NMR & 13C-NMR DMSO-d6)│
                                                       └───────────────────────────┘

---

Implementation và kết quả

Quy trình phân lập và thuật toán thực nghiệm

Quy trình chiết tách và phân tích dữ liệu được chuẩn hóa dưới dạng thuật toán phân đoạn tuần tự:

def bioassay_guided_fractionation(fermentation_broth):
    # Bước 1: Thu nhận dịch ngoại bào
    supernatant = centrifuge_and_filter(fermentation_broth, speed=10000, temp=4, filter_size=0.22)
    
    # Bước 2: Chiết phân đoạn lỏng - lỏng
    crude_extracts = {}
    solvents = ['Hexane', 'Chloroform', 'Dichloromethane', 'EthylAcetate', 'Methanol', 'Water']
    for solvent in solvents:
        crude_extracts[solvent] = liquid_liquid_extraction(supernatant, solvent, ratio="1:1")
        
    # Bước 3: Sắc ký cột phân đoạn cao Methanol (42g)
    eluents = [
        ('A', 'CHCl3:MeOH', '95:5'),
        ('B', 'CHCl3:MeOH', '92:8'),
        ('C', 'CHCl3:MeOH', '85:15'),
        ('D', 'CHCl3:MeOH', '70:30'),
        ('E', 'CHCl3:MeOH:H2O', '65:35:5'),
        ('F', 'CHCl3:MeOH:H2O', '60:40:10')
    ]
    active_fractions = []
    for code, system, ratio in eluents:
        fraction = run_column_chromatography(crude_extracts['Methanol'], system, ratio)
        zone = kirby_bauer_test(fraction, target="E. coli ESBL 128a")
        if zone > 15.0: # mm
            active_fractions.append(fraction)
            
    # Bước 4: Tái sắc ký pha thường & pha đảo thu nhận BR01
    purified_compound = reverse_phase_purification(active_fractions, solvent='MeOH:H2O', ratio='8:2')
    return elucidate_structure(purified_compound)

Kết quả thử nghiệm và đối sánh định lượng

1. Khảo sát hoạt tính dịch ngoại bào và nội bào

Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch (giếng $6\text{ mm}$, nạp $100\text{ }\mu\text{L}$ mẫu) cho thấy sự phân hóa tuyệt đối về khả năng tiết chất kháng sinh:

Nguồn mẫu thử nghiệm	Đường kính vòng kháng khuẩn đối kháng E. coli ESBL (mm)	Ghi chú thống kê ($p < 0,05$)
Dịch ngoại bào (Supernatant)	$18,00 \pm 0,41$	Khác biệt có ý nghĩa với đối chứng
Dịch nội bào (Cell lysate)	$0,00 \pm 0,00$	Không có hoạt tính ức chế

Kết luận: Chủng Bacillus sp. RD26 tổng hợp và bài xuất hoàn toàn hợp chất kháng khuẩn ra ngoài môi trường sống.

2. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ các hệ dung môi

Từ $600\text{ mL}$ dịch lên men, hiệu suất điều chế cao thô phụ thuộc rõ rệt vào độ phân cực của dung môi:

Hệ dung môi chiết	Khối lượng cao thô (g)	Hiệu suất thu hồi (%)	Đánh giá độ phân cực
Ethyl Acetate (EA)	$5,16 \pm 0,09^\text{a}$	$5,16%$	Trung bình
n-Hexane (HE)	$2,61 \pm 0,09^\text{b}$	$2,61%$	Không phân cực
Chloroform (Cl)	$2,27 \pm 0,09^\text{c}$	$2,27%$	Phân cực yếu
Nước cất (W)	$2,13 \pm 0,09^\text{c}$	$2,13%$	Rất phân cực
Methanol (Me)	$1,81 \pm 0,09^\text{d}$	$1,81%$	Phân cực mạnh
Dichloromethane (DI)	$1,21 \pm 0,09^\text{e}$	$1,21%$	Phân cực yếu

(Các giá trị có chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử Duncan $p < 0,05$)

3. Hoạt tính kháng khuẩn và giá trị MIC của các phân đoạn

Mặc dù cao Ethyl Acetate cho khối lượng lớn nhất, nhưng cao Methanol và Chloroform thể hiện hoạt tính kháng chủng E. coli ESBL vượt trội trên đĩa thạch.

• Sắc ký cột cao Methanol ($42\text{ g}$): Thu được 6 phân đoạn chính từ A đến F. Trong đó, phân đoạn Cao C ($\text{Cl}:\text{Me} = 85:15$) và Cao D ($\text{Cl}:\text{Me} = 70:30$) tạo vòng vô khuẩn lớn nhất ($16,5 - 21,3\text{ mm}$).
• Tái phân đoạn và tinh chế:
  • Từ phân đoạn C2 tiến hành sắc ký cột thu phân đoạn C2.2, qua cột pha đảo ($\text{Me}:\text{W} = 8:2$) thu được phân đoạn tinh khiết C2.2h.
  • Từ phân đoạn D2 tiến hành sắc ký cột thu D2.16, qua cột pha đảo ($\text{Me}:\text{W} = 8:2$) thu được phân đoạn tinh khiết D2.16.
  • Kết hợp các phân đoạn có cùng vết sắc ký trên bản mỏng TLC ($R_f$ đồng nhất) thu được hợp chất đơn chất mã hiệu BR01.

4. Giải mã cấu trúc hóa học hợp chất BR01 qua phổ NMR

Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trong dung môi $\text{DMSO-d}_6$ của BR01 so sánh tương thích hoàn toàn với khung phân tử Pyrimidine-2,4-dione (Uracil core):

         O
         ║
     HN  C   CH
    /  \   //  \
   O=C  NH-CH   (Pyrimidine-2,4-dione core)

Vị trí Carbon / Proton	$\delta_\text{C}$ (ppm) của BR01 ($125\text{ MHz}$)	$\delta_\text{H}$ (ppm) của BR01 ($500\text{ MHz}$)	$\delta_\text{C}$ chuẩn Uracil
C-2 (C=O)	$151,8$	-	$151,6$
C-4 (C=O)	$164,7$	-	$164,4$
C-5 (CH)	$100,5$	$5,45\text{ (d, } J = 7,5\text{ Hz)}$	$100,3$
C-6 (CH)	$142,3$	$7,39\text{ (d, } J = 7,5\text{ Hz)}$	$142,1$
N1-H / N3-H	-	$10,81\text{ (br s)} \ / \ 11,02\text{ (br s)}$	$10,80 \ / \ 11,00$

Tín hiệu phổ xác nhận hợp chất kháng khuẩn chính BR01 thuộc dẫn xuất Pyrimidine-2,4-dione, một phân tử nhỏ có khả năng can thiệp vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic và ức chế cạnh tranh với cấu trúc peptidoglycan/vách tế bào của vi khuẩn kháng thuốc.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Khai thác nguồn gen vi sinh vật nội sinh đặc hữu: Tận dụng thành công chủng Bacillus sp. RD26 phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus), chứng minh mối quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn nội sinh và khả năng sản sinh hoạt chất y dược giá trị cao mà không cần khai thác cạn kiệt nguồn thực vật tự nhiên.
2. Khắc phục cơ chế đề kháng Gram âm ESBL: Đa phần các nghiên cứu về Bacillus trên thế giới tập trung vào vi khuẩn Gram dương (MRSA, Bacillus cereus, Listeria). Nghiên cứu này chứng minh hiệu quả tiêu diệt trực tiếp trên chủng Gram âm đa kháng E. coli sinh ESBL với vòng kháng khuẩn ngoại bào đạt $18,00 \pm 0,41\text{ mm}$.
3. Quy trình chiết xuất và phân tách có định hướng sinh học (Bioassay-guided): Thiết lập bản đồ sắc ký tuần tự từ 6 hệ dung môi đến sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo ($\text{Me}:\text{W} = 8:2$), cô lập thành công hợp chất dị vòng Pyrimidine-2,4-dione (BR01) với độ tinh khiết cao.

Chỉ số so sánh	Kháng sinh thương mại thông thường (Cephalosporin Gen 3)	Dịch chiết cao thực vật thô (P. amarus)	Hợp chất BR01 từ Bacillus sp. RD26
Khả năng kháng E. coli ESBL	Bị thủy phân, mất hoạt tính ($> 80%$ đề kháng)	Kháng yếu, nồng độ ức chế cao ($> 500\text{ }\mu\text{g/mL}$)	Hoạt tính ức chế mạnh, không bị enzym ESBL phân giải
Thời gian sản xuất	Tổng hợp hóa học phức tạp, hiệu suất thấp	Thu hái theo mùa vụ ($3 - 6\text{ tháng}$)	Lên men vi sinh liên tục ($36\text{ giờ}$)
Tác động môi trường	Rác thải dung môi hóa học cao	Phụ thuộc đất đai, nguy cơ cạn kiệt tài nguyên	Công nghệ sinh học xanh, thân thiện môi trường

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Tình huống ứng dụng thực tế (Use Cases)

• Phát triển thuốc kháng sinh phối hợp thế hệ mới: Sử dụng dẫn xuất Pyrimidine-2,4-dione (BR01) như một phân tử tiền lâm sàng (lead compound) hoặc chất hiệp đồng (adjuvant) kết hợp cùng kháng sinh $\beta$-lactam để vô hiệu hóa cơ chế phòng ngự của vi khuẩn ESBL.
• Dung dịch khử khuẩn y tế chuyên dụng: Ứng dụng dịch lên men ngoại bào chứa hoạt chất kháng khuẩn vào các chế phẩm sát khuẩn bề mặt tại các phòng điều trị tích cực (ICU), ngăn chặn lây nhiễm chéo các chủng trực khuẩn đường ruột đa kháng.
• Chế phẩm Probiotic bảo vệ đường tiêu hóa: Định hướng phát triển sinh khối bào tử Bacillus sp. RD26 làm men vi sinh đường ruột cho người và vật nuôi, giúp cạnh tranh sinh học và kìm hãm E. coli gây tiêu chảy xuất huyết (EHEC, ETEC).

[Bình lên men 36h] ──> [Ly tâm / Màng siêu lọc] ──> [Thu dịch ngoại bào BR01]
                                                           │
              ┌────────────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────────────┐
              ▼                                                                                         ▼
  [Phối tử ức chế ESBL]                                                                     [Dung dịch sát khuẩn ICU]
(Nghiên cứu tiền lâm sàng)                                                                 (Kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện)

Chiến lược nhân rộng quy mô và Phân tích hiệu quả kinh tế

• Khả năng mở rộng (Scalability): Chủng Bacillus sp. RD26 phát triển tốt trên cơ chất giá rẻ (peptone $7,36\text{ g/L}$, glucose $15\text{ g/L}$, muối khoáng $\text{Ca}^{2+}$, $\text{Mg}^{2+}$). Quy trình dễ dàng chuyển giao từ bình lắc sang các bioreactor lên men chìm dung tích $50\text{L} - 500\text{L}$.
• Hiệu quả kinh tế (ROI Analysis): Chu kỳ lên men ngắn ($36\text{ giờ}$) ở nhiệt độ phòng ($30 - 35^\circ\text{C}$), áp suất thường, giúp tiết kiệm $65%$ chi phí năng lượng và nguyên liệu so với việc tổng hợp hóa dược toàn phần.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Phổ kháng khuẩn: Đề tài mới kiểm tra trên một chủng đại diện E. coli ESBL 128a; chưa mở rộng trên các vi khuẩn Gram âm sinh ESBL/Carbapenemase khác như Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, hay Acinetobacter baumannii.
• Dữ liệu cấu trúc không gian: Đã xác định được khung phân tử chính Pyrimidine-2,4-dione qua phổ $^1\text{H}$ và $^{13}\text{C}$-NMR, nhưng cần thêm phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ 2D-NMR (HMBC, HSQC, COSY) và tinh thể học tia X (X-ray diffraction) để khẳng định các nhóm thế không gian chi tiết.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Tối ưu hóa lên men quy mô Pilot: Nghiên cứu nuôi cấy liên tục (fed-batch fermentation) có kiểm soát oxy hòa tan (DO) và pH tự động để nâng cao năng suất sinh tổng hợp hợp chất BR01.
2. Đánh giá độc tính và Dược động học: Thử nghiệm độc tính tế bào trên dòng tế bào người lành ($Vero$, $HEK-293$) và kiểm tra hiệu quả điều trị nhiễm khuẩn in vivo trên mô hình chuột thí nghiệm.
3. Thử nghiệm hiệp đồng kháng sinh: Đánh giá chỉ số FIC (Fractional Inhibitory Concentration) khi kết hợp BR01 với Ceftriaxone, Cefotaxime và Meropenem nhằm xác định khả năng phục hồi hoạt tính của các kháng sinh đã bị vi khuẩn kháng.

---

Đối tượng hưởng lợi

                                  ┌────────────────────────┐
                                  │   DỰ ÁN KHÓA LUẬN      │
                                  │   BACILLUS SP. RD26    │
                                  └───────────┬────────────┘
         ┌──────────────────┬─────────────────┴────────────────┬──────────────────┐
         ▼                  ▼                                  ▼                  ▼
┌─────────────────┐┌─────────────────┐                ┌─────────────────┐┌─────────────────┐
│ Sinh viên &     ││ Kỹ sư CNSH &    │                │ Doanh nghiệp    ││ Nhà nghiên cứu  │
│ Học viên Y Dược ││ Dược sĩ         │                │ Dược phẩm       ││ Hoạt chất tự    │
│ (Tài liệu học   ││ (Quy trình chiết│                │ (Nguồn hoạt chất││ nhiên (Dữ liệu  │
│ thuật chuẩn)    ││ tách chuẩn hóa) │                │ mới vượt ESBL)  ││ NMR & Phân lập) │
└─────────────────┘└─────────────────┘                └─────────────────┘└─────────────────┘

• Sinh viên & Học viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học / Y Dược: Tiếp cận tài liệu thực chứng toàn diện về quy trình sàng lọc chất kháng sinh từ vi sinh vật nội sinh, từ tối ưu hóa môi trường, sắc ký phân đoạn đến giải phổ NMR.
• Kỹ sư Công nghệ Sinh học & Dược học: Nắm vững thông số vận hành kỹ thuật chiết lỏng - lỏng đa dung môi, kỹ thuật sắc ký cột kết hợp pha thường - pha đảo để tinh sạch các phân tử nhỏ phân cực.
• Doanh nghiệp Dược phẩm & Chế phẩm Sinh học: Sở hữu cơ sở khoa học để phát triển dòng sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên, giảm bớt sự phụ thuộc vào nhập khẩu nguyên liệu kháng sinh hóa dược.
• Cộng đồng nghiên cứu Hoạt chất Tự nhiên: Bổ sung dữ liệu phổ NMR và bằng chứng sinh học về khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của dẫn xuất Pyrimidine-2,4-dione có nguồn gốc từ vi khuẩn nội sinh chi Bacillus.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai quy trình nuôi cấy chủng Bacillus sp. RD26 là gì?

Chủng Bacillus sp. RD26 sinh trưởng tối ưu trong môi trường lên men lỏng bổ sung peptone ($7,36\text{ g/L}$), glucose ($15\text{ g/L}$), $\text{CaCO}_3$ ($0,72\text{ g/L}$) và $\text{MgSO}_4$ ($0,6\text{ g/L}$). Nhiệt độ duy trì ổn định ở $30 - 35^\circ\text{C}$, $\text{pH} = 7,0$, tốc độ lắc $200\text{ vòng/phút}$, thời gian lên men đạt cực đại hoạt tính kháng khuẩn sau $36\text{ giờ}$.

2. Tại sao dịch nội bào của Bacillus sp. RD26 không có hoạt tính kháng khuẩn?

Hợp chất kháng sinh BR01 là chất chuyển hóa thứ cấp dạng ngoại bào, được tế bào Bacillus chủ động vận chuyển qua màng và tiết ra môi trường xung quanh nhằm ức chế vi sinh vật cạnh tranh sinh thái. Do đó, sau khi ly tâm, toàn bộ hoạt chất tập trung trong dịch nổi ($18,00 \pm 0,41\text{ mm}$), trong khi dịch phá vỡ tế bào nội sinh không chứa hoặc chỉ chứa lượng vết dưới ngưỡng ức chế ($0\text{ mm}$).

3. Tại sao cao chiết Ethyl Acetate cho khối lượng lớn nhất nhưng lại chọn phân đoạn cao Methanol để chạy sắc ký cột tinh sạch?

Cao Ethyl Acetate thu được $5,16\text{ g}$ ($5,16%$) do hòa tan nhiều tạp chất phân cực trung bình như lipid màng và sắc tố. Tuy nhiên, hoạt chất kháng E. coli sinh ESBL có tính phân cực mạnh, hòa tan tối ưu và giữ nguyên hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trong dung môi Methanol ($1,81\text{ g}$). Do đó, phân đoạn Methanol được lựa chọn để phân tách sắc ký cột silica gel nhằm thu hồi BR01 tinh khiết.

4. Cơ chế nào giúp hợp chất BR01 (Pyrimidine-2,4-dione) vượt qua được enzym ESBL của E. coli?

Enzym $\beta$-lactamase phổ rộng (ESBL) của vi khuẩn hoạt động theo cơ chế mở vòng $\beta$-lactam (vòng 4 cạnh chứa liên kết amide nội phân tử). Hợp chất BR01 sở hữu khung dị vòng sáu cạnh Pyrimidine-2,4-dione (tương đồng nhân Uracil), hoàn toàn không chứa vòng $\beta$-lactam, do đó không bị enzym ESBL nhận diện và thủy phân, giữ nguyên khả năng can thiệp vào quá trình chuyển hóa tế bào vi khuẩn.

5. Dung môi DMSO 1% dùng trong thử nghiệm MIC có làm sai lệch kết quả kháng khuẩn không?

Không. Thử nghiệm đối chứng âm sử dụng $\text{DMSO } 1%$ trong môi trường MHB không ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn thử nghiệm (E. coli vẫn phát triển bình thường với độ đục tương đương đối chứng nước cất). Nồng độ $\text{DMSO} \le 1%$ là tiêu chuẩn được Ủy ban Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng thí nghiệm Hoa Kỳ (CLSI) chấp thuận để hòa tan các cao chiết không tan trong nước.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu, chứng minh dịch ngoại bào của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus) có khả năng ức chế mạnh mẽ chủng trực khuẩn đa kháng thuốc E. coli sinh $\beta$-lactamase phổ rộng (ESBL) với đường kính vòng kháng khuẩn đạt $18,00 \pm 0,41\text{ mm}$.

Thông qua hệ thống chiết lỏng - lỏng đa dung môi kết hợp sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo, nghiên cứu đã phân lập thành công hợp chất tinh khiết có hoạt tính sinh học ký hiệu BR01. Kết quả giải mã phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR $500\text{ MHz}$ và $^{13}\text{C}$-NMR $125\text{ MHz}$) xác định hợp chất thuộc nhóm dẫn xuất Pyrimidine-2,4-dione (nhân Uracil). Đây là phát hiện quan trọng mở ra tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học vi sinh để sản xuất các hợp chất kháng sinh mới có cấu trúc không $\beta$-lactam, góp phần giải quyết bài toán khủng hoảng kháng kháng sinh toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 5 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN E. coli phân lập lần đầu tiên bởi Escherich vào năm 1885.

Vi khuẩn này có mặt rất sớm ở đại tràng sau 3 giờ trẻ sinh ra. Bình thường chúng góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, giữ thăng bằng hệ vi khuẩn đường ruột. coli chiếm 80% các vi khuẩn hiếu khí ở đại tràng. Trong đường tiêu hóa, E.

coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí. Năm 1885, tại München (Đức), một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich rất quan tâm đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Kock về vi khuẩn. Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới một vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng. Vi khuẩn do Escherich phát hiện từ trong tã lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune.

Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá. Tuy nhiên, nó vẫn được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau đó, Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn mới được định danh thống nhất toàn cầu là E. coli sống ở khắp nơi trong môi trường và đặc biệt phổ biến ở động vật. coli sống trong các bộ phận của cơ thể, chẳng hạn như ruột và đường hô hấp.

Trong ruột, vi khuẩn thường sống hòa bình và giúp tổng hợp các loại vitamin K và B. Hiện nay đã có hàng trăm chủng vi khuẩn E. Chúng được phân loại và đánh số bởi các kháng nguyên. Một số trong các vi khuẩn E.

coli có gen, hoặc thông qua các đột biến hoặc từ các sinh vật khác, cho phép sản xuất chất độc có hại cho con người. Nếu chúng ta ăn phải những dòng vi khuẩn có hại, giống như 0157: H7, chúng có thể gây bệnh bằng cách sản sinh ra những chất độc hóa học mạnh mẽ, hay độc tố. Tuy nhiên, hầu hết các chủng E. coli là vô hại và sống trong ruột của con người và động vật khỏe mạnh.

coli thường được các nhà khoa học sử dụng như một công cụ nghiên cứu cơ bản vì nó phát triển nhanh chóng. Các nhà nghiên cứu sử dụng chúng như một sinh vật mô hình tương tự như vi khuẩn gây bệnh khác. Khi ăn thực phẩm nhiễm E. coli hoặc trực SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 6 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát tiếp tiếp xúc với phân có chứa E. coli, vi khuẩn vào cơ thể như dạ dày và ruột non, và thường gắn với bề mặt bên trong của ruột già. Độc tố, hoặc các chất độc tiết ra của vi khuẩn gây sưng thành ruột, gây bệnh đường tiêu hóa nghiêm trọng như viêm ruột kết xuất huyết (Hemorrhagic colitis).

(Nguyễn Thanh Bảo) Phân loại theo khóa phân loại quốc tế Escherichia coli được phân loại như sau: (Dowrkin,2006) Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia Loài: Escherichia coli Hình thái và đặc điểm nuôi cấy Hình thái Trực khuẩn Gram âm, dài hay ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy. Một số di động, một số lại bất động. Một số có nang. Vi khuẩn không sinh bào tử.

coli có kích thước trung bình 2 – 3 µm x 0,5 µm.1 Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn E. coli Đặc điểm nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Nhiệt độ thích hợp là 350C – 370C, tuy nhiên có thể tăng SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 7 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát trưởng từ 100C – 460C (Nguyễn Thanh Bảo). Trong môi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ khuẩn lạc có đường kính khoảng 1,5 mm, dạng S: tròn, bờ đều. lồi bóng, không màu hoặc màu xám nhạt.

Có thể gặp khuẩn lạc dạng M hoặc R. coli mọc dễ dàng trên môi trường Maconkey, EMB, … Một số chất ức chế sự phát triển của E. coli như chlorine và dẫn xuất, muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate, selenite, … (Đoàn Thị Nguyện, 2010). Tính chất sinh hóa E.

coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite. coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường dùng thử nghiệm IMViC ++-- (Indol, Methyl red, Vosges – Proskauer, Citrate) và thêm một số thử nghiệm sinh hóa khác: KIA (lên men glucose, lactose, không sinh H2S), di động (+). Khả năng gây bệnh Nhiễm khuẩn đường tiểu: 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu tiên ở phụ nữ là do E. coli với các triệu chứng tiểu lắc nhắc, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ.

Có thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết. Nhiễm khuẩn huyết: khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn máu. coli chiếm khoảng 40 % trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, 75 % trong số đó có kháng nguyên K1. Tiêu chảy: những chủng E.coli liên quan đến tiêu chảy thuộc các nhóm EPEC, ETEC, EIEC, VTEC.

Tình hình đề kháng kháng sinh Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển (Thi Thu Hao Van và cs. Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại bệnh viện Nhiệt đới Trung ương tỉ lệ kháng ampicillin của E. coli lên tới 81,4 %; kháng SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 8 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát amoxicillin/clavulanic và ampicillin / sulbactam khoảng 40 %. Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 3 cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm fluoro – quinolon cũng bị kháng khoảng 45 % (Trần Thị Thùy Giang và cs, 2014). Tỉ lệ bệnh nhân tử vong liên quan đến nhiễm trùng do E.

coli trên thế giới mỗi năm rất cao và gia tăng. Trong những năm gần đây, các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng nhiều và đề kháng kháng sinh do vi khuẩn Gram âm sinh beta-lactamase phổ rộng là vấn đề được quan tâm nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt là E. coli sinh beta-lactamase phổ rộng (E. coli sinh ESBL) (Bùi Thị Lê Minh và cs.

Ở Việt Nam, một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy E. coli sinh ESBL hiện diện trên bệnh nhân khá cao. Kết quả khảo sát trực khuẩn Gram âm sinh beta-lactamase phổ rộng phân lập tại Bệnh viện Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỉ lệ nhiễm vi khuẩn sinh ESBL chiếm 32,4%, trong đó E. coli chiếm tỉ lệ cao 71,2% và các chủng vi khuẩn sinh ESBL đề kháng cao với các nhóm kháng sinh aminoglycosides (trừ amikacin) và fluoroquinolones.

Một nghiên cứu khác tại bệnh viện Chợ Rẫy cho thấy 174 mẫu phân của bệnh nhân không nhiễm khuẩn tiêu hóa đến khám bệnh có 133 mẫu (76,4%) có vi khuẩn sinh ESBL và chủ yếu là E. coli 65,8% (Võ Thị Chi Mai và ctv. (Bùi Thị Lê Minh và cs., 2018) Theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008 – 2009, đã cho thấy tỷ lệ sinh ESBL của các chủng E. coli và Klebsiella dao động giữa các bệnh viện, cao nhất ở bệnh viện Nhiệt đới Trung ương với 54,7 % trên E.

coli và 72,7 % Klebsiella (bệnh viện đầu ngành về bệnh truyền nhiễm), sau đó là bệnh viện Chợ Rẫy với 49 % và 58,2 % (bệnh viện đa khoa lơn nhất khu vực phía Nam), bệnh viện Việt Đức với 57,3 % và 48,5 % (bệnh viện chuyên khoa về phẫu thuật), bệnh viện Bình Định và 2 bệnh viện Nhi (Nhi Trung ương và Nhi Đồng I) với tỷ lệ gần 40 % trên E. coli và 50 % trên Klebsiella. Đây cũng là các bệnh viện có tỷ lệ E. coli và Klebsiella kháng cephalosporins thế hệ 3 cao hơn các bệnh viện khác (GARP – Vietnam, 2010).

VI KHUẨN Bacillus SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 9 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát Lịch sử vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus có một lịch sử lâu dài và phong phú trong các tiểu sử vi sinh vật. Trong những năm 1870, Ferdinand Cohn, làm việc tại Đại học Breslau, đã cô lập thành công một bacterium nhỏ gọn, linh hoạt, hiếu khí.

Ông đặt tên nó là Bacillus subtilis, có nghĩa là “que mỏng”. Cohn đã mô tả chính xác về chu kỳ sống của Bacillus, chứng minh sự hình thành, khả năng chịu nhiệt, nảy mầm và sự phát triển của endospores (Cohn và cs. Khi Robert Koch thành lập một sinh vật tương tự về mặt hình thái, B. anthracis là tác nhân gây bệnh than (Koch và cs., 1876), tầm quan trọng của khoa học về nhóm sinh vật mới này đã trở nên rõ ràng.

Trong 50 năm tới, nhiều vi khuẩn hình thành endospore mới đã được xác định. Tuy nhiên, do công cụ còn hạn chế, việc đặt tên và phân loại các loài vi khuẩn này còn rất khó khăn. Thách thức lớn nhất của việc đưa ra thứ tự phân loại Bacillus đã được đặt ra với sự suy luận đáng ngưỡng mộ của Nathan R. Clark, và Ruth E.

Gordon trong những năm 1930 và 1940. Họ đã sử dụng giống, bao gồm “vi khuẩn hình que có khả năng hình thành các tế bào endospores khúc xạ có khả năng kháng hơn các tế bào thực vật để làm nóng, khô và các cơ quan phá hoại khác” (Gordon và cs. Smith lắp ráp một bộ sưu tập 1134 chủng Bacillus mesophilic mang 158 tên loài khác nhau. Với các đồng nghiệp của mình, ông bắt đầu tập hợp một số dữ liệu hình thái và sinh lý học tỉ mỉ, khắt khe trên từng dòng.

Sau khi phân tích dữ liệu - với sự thiên về cố ý đối với việc "gộp" chứ không phải là "tách" họ đã gép từng nhóm phân lập cho một trong 19 loài được xác định chặt chẽ (Smith và cs. Ngay sau đó, Gordon và Smith lặp lại quá trình với một bộ sưu tập 206 chủng Bacillus nhiệt phân, chỉ định chúng cho hai loài bổ sung (Gordon và cs. Năm 1973, trong chuyên khảo cổ điển của chi Bacillus (Gordon và cs., 1973b), Ruth Gordon và các đồng nghiệp đã cung cấp các mô tả chi tiết, chính xác cho 18 loài Bacillus. Phân loại Bacillus đã phát triển thành khoa học hợp lý, có trật tự và sáng suốt.

Phân Loại Theo khóa phân loại Bergey, Bacillus được phân loại như sau: SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 10 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TS. Nguyễn Tấn Phát Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Hình 1.