KHẢO SÁT HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC KHÁNG E. COLI SINH 𝜷 − 𝐋𝐀𝐂𝐓𝐀𝐌𝐀𝐒𝐄 PHỔ RỘNG (ESBL) TỪ CHỦNG BACILLUS SP. RD26 NỘI SINH

• Tác giả: Đinh Thị Thúy Kiều
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Kháng E. Coli Sinh 𝜷 − 𝐋𝐀𝐂𝐓𝐀𝐌𝐀𝐒𝐄 Phổ Rộng (ESBL) Từ Chủng Bacillus Sp. RD26 Nội Sinh
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN E. coli
• 1.2. Phân loại theo khóa phân loại quốc tế
• 1.3. Hình thái và đặc điểm nuôi cấy
• 1.4. Khả năng gây bệnh
• 1.5. Tình hình đề kháng kháng sinh
• 1.6. VI KHUẨN Bacillus
• 1.6.1. Lịch sử vi khuẩn Bacillus
• 1.6.2. Phân Loại
• 1.6.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.6.4. Ứng dụng của Bacillus
• 1.6.5. Hợp chất từ Bacillus có hoạt tính sinh học
• 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT TỪ BACILLUS
• 1.7.1. Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus trên thế giới
• 1.7.2. Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus ở Việt Nam
• 1.8. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT
• 1.8.1. Đặc điểm chung của phương pháp
• 1.8.2. Kĩ thuật chiết lỏng-lỏng
• 1.8.3. Sắc ký cột
• 1.8.4. Sắc ký lớp mỏng
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. VẬT LIỆU
• 2.2.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu
• 2.2.2. Môi trường – hóa chất
• 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.3.2. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp. RD26
• 2.3.3. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.3.3.1. Chuẩn bị môi trường
• 2.3.3.2. Chuẩn bị dịch vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.3.3.3. Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm
• 2.3.3.4. Tiến hành thử nghiệm
• 2.3.3.5. Kết quả
• 2.3.4. Xác định khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ dịch nội bào Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.3.4.1. Thu nhận sinh khối Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp sóng siêu âm
• 2.3.4.2. Tiến hành thí nghiệm
• 2.3.5. Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp. RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
• 2.3.6. Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp lên men trên môi trường tối ưu
• 2.3.7. Thu nhận cao chiết Bacillus sp. RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
• 2.3.8. Thử khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ cao chiết Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa kirby-bauer
• 2.3.9. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibatory Concentration) của cao chiết với vi khuẩn E. coli sinh ESBL
• 2.3.10. Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
• 2.3.11. Sắc ký cột cao chiết
• 2.3.12. Khảo sát khả năng kháng E. coli sinh ESBL từ các phân đoạn thu được của cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby – Bauer
• 2.3.13. Phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng E. coli sinh ESBL
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG E. COLI SINH ESBL CỦA DỊCH NUÔI CẤY VÀ TỪ SINH KHỐI CHỦNG BACILLUS SP. RD26
• 3.2. KẾT QUẢ THU NHẬN CAO CHIẾT BACILLUS SP. RD26 TỪ CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU
• 3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC CAO CHIẾT THÔ THU ĐƯỢC
• 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH E. COLI SINH ESBL
• 3.5. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CẮN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG (TLC)
• 3.6. SẮC KÝ CỘT
• 3.7. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS SP. RD26 NỘI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY – BAUER
• 3.8. PHÂN LẬP HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 4.1. KẾT LUẬN
• 4.2. ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG – HÓA CHẤT
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT
• PHỤ LỤC 4: HÌNH ẢNH MIC
• PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ GIẢI PHỔ

I. Tổng Quan Về E

Vi khuẩn kháng thuốc là một vấn đề nhức nhối toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Mỗi năm, hàng trăm nghìn người trên thế giới tử vong vì vi khuẩn kháng thuốc. Nhiều chủng đã kháng hầu hết các kháng sinh, kể cả thế hệ mới. Trong khi đó, việc nghiên cứu kháng sinh mới lại rất chậm. Tình trạng này khiến lượng kháng sinh hiện có không đủ để điều trị nhiễm khuẩn đa kháng thuốc. (Jeyanthi và cs., 2016). Trong những thập kỷ gần đây, vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR) ngày càng gia tăng, gây thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng. Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng đa thuốc là vấn đề đáng lo ngại đối với sức khỏe con người. Từ những năm 2000, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae có khả năng sinh ra các enzyme β – lactamase phổ rộng (Extended – Spectrum Beta – Lactamase; ESBLs), ly giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm cephalosporin. Bacillus Sp. RD26 là một ứng cử viên tiềm năng trong cuộc chiến chống lại E. Coli ESBL.

1.1. E. Coli ESBL Mối Nguy Tiềm Ẩn và Kháng Kháng Sinh

E. Coli ESBL là một chủng vi khuẩn nguy hiểm, có khả năng sinh ra enzyme β-lactamase phổ rộng, kháng lại nhiều loại kháng sinh cephalosporin. Tại Việt Nam, tình trạng nhiễm E. Coli ESBL đang ở mức báo động, đặc biệt tại các bệnh viện. Các vi khuẩn Gram âm gây bệnh đang chiếm ưu thế, với tỷ lệ khoảng 70%, thường gặp là họ Enterobacteriaceae. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất mới để điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bởi vi sinh vật này là vô cùng cần thiết.

1.2. Chi Bacillus Tiềm Năng Kháng Khuẩn và Ứng Dụng

Chi Bacillus bao gồm nhiều loài vi khuẩn Gram dương trong đất, một số loài đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) công nhận là an toàn (GRAS). Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi Bacillus subtilis. Các hợp chất này có khả năng ức chế các loài vi khuẩn gây bệnh. Một số hợp chất chống MRSA đã được phân lập từ vi khuẩn Bacillus sp, bao gồm Bogorol A và Loloatins A, B, C, và D.

II. Tại Sao Cần Nghiên Cứu Kháng E

Trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho kháng sinh truyền thống là vô cùng quan trọng. Các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật, đặc biệt là từ chi Bacillus, đang thu hút sự quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu. Việc nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus Sp. RD26 đối với E. Coli ESBL không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong y học và dược phẩm.

2.1. Thách Thức Trong Điều Trị Nhiễm Trùng E. Coli ESBL

Nhiễm trùng do E. Coli ESBL gây ra là một thách thức lớn trong điều trị lâm sàng. Các kháng sinh truyền thống thường không hiệu quả do vi khuẩn đã phát triển cơ chế kháng thuốc. Điều này dẫn đến việc phải sử dụng các kháng sinh mạnh hơn, gây ra nhiều tác dụng phụ và tăng chi phí điều trị. Do đó, cần có các phương pháp điều trị mới, hiệu quả hơn và an toàn hơn.

2.2. Tìm Kiếm Giải Pháp Tự Nhiên Bacillus Sp. RD26

Trước tình hình đó, việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguồn tự nhiên đang được đẩy mạnh. Bacillus Sp. RD26 đã được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng và được chứng minh là có khả năng kháng E. Coli ESBL. Nghiên cứu này nhằm khảo sát sâu hơn về các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ chủng vi khuẩn này.

2.3. Tình hình kháng kháng sinh E.coli ESBL tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh của E. coli ESBL đang ở mức báo động. Nhiều báo cáo cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh ở mức cao tại các bệnh viện, đặc biệt là đối với các vi khuẩn Gram âm gây bệnh. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các giải pháp thay thế để điều trị nhiễm trùng do E. coli ESBL.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng E

Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ chủng Bacillus Sp. RD26 nội sinh. Các phương pháp được sử dụng bao gồm xác định khả năng kháng khuẩn từ dịch ngoại bào và nội bào, nuôi cấy và thu nhận cao chiết từ các hệ dung môi khác nhau, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột, tinh sạch và phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học.

3.1. Xác Định Khả Năng Kháng Khuẩn Dịch Ngoại Bào và Nội Bào

Khả năng kháng E. Coli ESBL được xác định từ cả dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus Sp. RD26. Điều này giúp đánh giá toàn diện khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn. Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL.

3.2. Nuôi Cấy và Thu Nhận Cao Chiết Hệ Dung Môi Đa Dạng

Bacillus Sp. RD26 được nuôi cấy trong môi trường tối ưu để tăng cường sản xuất các hợp chất kháng khuẩn. Cao chiết được thu nhận từ các hệ dung môi khác nhau để phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hệ dung môi được lựa chọn dựa trên tính chất hóa học của các hợp chất mong muốn.

3.3. Xác Định MIC và Phân Tích Sắc Ký Đánh Giá Hoạt Tính

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết đối với E. Coli ESBL được xác định để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn. Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột được sử dụng để phân tích và phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cao chiết. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột được đánh giá khả năng kháng khuẩn.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của RD26 57 ký tự

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Bacillus Sp. RD26 có khả năng kháng E. Coli ESBL đáng kể. Cao chiết thu được từ các hệ dung môi khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn khác nhau. Sắc ký cột giúp phân tách các hợp chất có hoạt tính sinh học, và một số phân đoạn cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL mạnh mẽ. Các kết quả này mở ra triển vọng ứng dụng Bacillus Sp. RD26 trong điều trị nhiễm trùng.

4.1. Hoạt Tính Kháng Khuẩn từ Dịch Nuôi Cấy và Sinh Khối

Dịch nuôi cấy và sinh khối của chủng Bacillus Sp. RD26 đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với E. Coli ESBL. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn giữa dịch nuôi cấy và sinh khối, cho thấy các hợp chất kháng khuẩn có thể được sản xuất và bài tiết ra môi trường nuôi cấy hoặc tích lũy trong tế bào vi khuẩn.

4.2. Ảnh Hưởng Của Dung Môi Đến Hoạt Tính Cao Chiết

Dung môi sử dụng trong quá trình chiết xuất ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. Một số dung môi cho phép thu được cao chiết có khả năng ức chế E. Coli ESBL mạnh mẽ hơn so với các dung môi khác. Điều này cho thấy tính chất hóa học của dung môi có vai trò quan trọng trong việc hòa tan và chiết xuất các hợp chất kháng khuẩn.

4.3. Phân Lập Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Tiềm Năng Ứng Dụng

Việc phân lập và tinh sạch các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E. Coli ESBL từ Bacillus Sp. RD26 là một bước quan trọng để xác định cấu trúc và cơ chế hoạt động của chúng. Các hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh mới hoặc các sản phẩm sinh học để kiểm soát nhiễm trùng do E. Coli ESBL.

V. Ứng Dụng Bacillus Sp

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng Bacillus Sp. RD26 trong kiểm soát E. Coli ESBL. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn, cơ chế hoạt động của chúng, và đánh giá hiệu quả in vivo. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất cũng là một hướng đi quan trọng để tăng cường sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học.

5.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Y Tế và Dược Phẩm

Bacillus Sp. RD26 và các hợp chất kháng khuẩn từ nó có tiềm năng ứng dụng trong y tế và dược phẩm. Chúng có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới, các sản phẩm sinh học để phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng do E. Coli ESBL, hoặc các sản phẩm vệ sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.

5.2. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Kháng Khuẩn

Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn từ Bacillus Sp. RD26 là cần thiết để hiểu rõ cách chúng ức chế sự phát triển của E. Coli ESBL. Điều này có thể giúp tối ưu hóa việc sử dụng chúng trong điều trị và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc.

VI. Kết Luận Bacillus Sp

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của Bacillus Sp. RD26 trong việc kháng E. Coli ESBL. Các kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho kháng sinh truyền thống và đối phó với tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Quan Trọng

Nghiên cứu đã xác định được hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus Sp. RD26 đối với E. Coli ESBL, đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính của cao chiết, và phân lập được một số hợp chất có hoạt tính sinh học. Các kết quả này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các ứng dụng thực tiễn của Bacillus Sp. RD26 trong y tế và dược phẩm.

6.2. Hướng Đi Cho Các Nghiên Cứu Tương Lai

Các nghiên cứu tương lai nên tập trung vào việc xác định cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn, cơ chế hoạt động của chúng, và đánh giá hiệu quả in vivo. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất cũng là một hướng đi quan trọng để tăng cường sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học.