Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Đinh Thị Thanh Thủy, với đề tài "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang)", được thực hiện tại Viện Dược liệu (Bộ Y tế) dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Phạm Thanh Kỳ và PGS. Phạm Thanh Huyền, thuộc chuyên ngành Dược liệu – Dược học cổ truyền (mã số: 9720206), bảo vệ năm 2023.
Giảo cổ lam là tên gọi chung cho các loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí - Cucurbitaceae). Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của GS. Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện và ghi nhận 6 loài Giảo cổ lam. Trong số đó, 5 loài đã có các công bố khoa học về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học gồm: G. pentaphyllum (Thunb.) Makino, G. laxum (Wall.) Cogn., G. longipes C.Y. Wu, G. burmanicum King ex Chakrav., và G. guangxiense X.X. Chen & D.H. Qin. Riêng loài Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang (Giảo cổ lam quả dẹt) mới được phát hiện bổ sung vào hệ thực vật Việt Nam từ năm 2015 và chưa từng có công trình nào nghiên cứu toàn diện về đặc điểm vi học, thành phần hóa thực vật cũng như hoạt tính sinh học. Xuất phát từ khoảng trống nghiên cứu này, luận án được triển khai nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc định danh, kiểm nghiệm, khai thác và sử dụng nguồn tài nguyên dược liệu này.
Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:
- Nghiên cứu về thực vật học: Mô tả đặc điểm thực vật, xác định đặc điểm vi học và thẩm định tên khoa học của loài Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang).
- Nghiên cứu về thành phần hoá học: Định tính các nhóm chất hữu cơ; chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất phân lập được từ phần trên mặt đất của loài Giảo cổ lam quả dẹt.
- Nghiên cứu về tác dụng sinh học: Đánh giá độc tính cấp và một số tác dụng sinh học của cao chiết và một số hợp chất phân lập được từ phần trên mặt đất của loài Giảo cổ lam quả dẹt.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án:
- Đối tượng nghiên cứu: Phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang), bao gồm mẫu tươi dùng cho nghiên cứu thực vật và mẫu phơi sấy khô dùng cho chiết xuất cao (cao ethanol 80% GCT, cao phân đoạn n-hexan GCH, cao ethyl acetat GCE, cao n-butanol GCB, cắn nước GCW) cùng các hợp chất tinh khiết phân lập (từ GC1 đến GC17).
- Phạm vi không gian và thời gian: Mẫu dược liệu được thu hái tự nhiên tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn vào các đợt tháng 3, tháng 4 năm 2018 và tháng 9, tháng 10 năm 2019. Tiêu bản thực vật được lưu trữ tại Khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu (mã số: NIMM0019225) và Phòng Tiêu bản cây thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội (mã số: HNIP/18590/19 và HNIP/18591/19).
- Đối tượng thực nghiệm sinh học: Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss albino (cả hai giống đực và cái, trọng lượng 22,0 ± 3,0 g) do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp; hệ thống tế bào nuôi cấy in vitro gồm tế bào ung thư gan HepG2 và tế bào tiền mô mỡ 3T3-L1.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các dữ liệu khoa học về phân loại thực vật, hóa thực vật và tác dụng dược lý của chi Gynostemma Blume trên thế giới và tại Việt Nam:
Về phân loại thực vật: Chi Gynostemma được nhà thực vật học Carl Ludwig Blume xác lập năm 1825 từ mẫu điển hình loài G. simplicifolium Blume thu thập tại Java (Indonesia). Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan (2009), chi này thuộc họ Bí (Cucurbitaceae), phân họ Nhandiroboideae, tông Zanonieae. Trên phạm vi toàn cầu, chi có 19 loài được chấp nhận, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và Đông Á, tập trung nhiều nhất tại Trung Quốc với 14 loài (trong đó có 9 loài đặc hữu). Tại Việt Nam, các tài liệu thực vật học cổ điển của Phạm Hoàng Hộ (1999) và Nguyễn Hữu Hiển (2003) chỉ ghi nhận 2 loài là G. laxum và G. pentaphyllum. Các nghiên cứu điều tra sau đó của nhóm GS. Phạm Thanh Kỳ tại Trường Đại học Dược Hà Nội đã bổ sung thêm 4 loài: G. burmanicum, G. longipes, G. guangxiense và G. compressum. Đến năm 2019, loài G. pubescens tiếp tục được ghi nhận bổ sung tại Lào Cai bởi nhóm nghiên cứu của Suleman Bid.
| STT | Tên khoa học loài Giảo cổ lam tại Việt Nam | Tác giả công bố / ghi nhận | Tình trạng nghiên cứu trước luận án |
|---|---|---|---|
| 1 | Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino | Phạm Hoàng Hộ (1999), Võ Văn Chi (2012) | Đã nghiên cứu sâu về thành phần và dược lý |
| 2 | Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. | Phạm Hoàng Hộ (1999), Võ Văn Chi (2012) | Đã nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng |
| 3 | Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. | Nhóm nghiên cứu GS. Phạm Thanh Kỳ | Đã nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng |
| 4 | Gynostemma longipes C.Y. Wu | Nhóm nghiên cứu GS. Phạm Thanh Kỳ | Đã nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng |
| 5 | Gynostemma guangxiense X.X. Chen & D.H. Qin | Nhóm nghiên cứu GS. Phạm Thanh Kỳ | Đã nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng |
| 6 | Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang | Phát hiện tại Việt Nam năm 2015 | Chưa có công bố về hóa học và sinh học tại VN |
Về thành phần hóa học: Chi Gynostemma đặc trưng bởi nhóm saponin triterpenoid tetracyclic khung dammaran (thường gọi là gypenosid) với khoảng 200 hợp chất đã được phân lập, phân chia thành các nhóm cấu trúc chính: saponin khung 3β,20β-dihydroxydammar-24-en; khung 3β,12β,20β-trihydroxydammar-24-en (cấu trúc protopanaxadiol tương tự nhân sâm Panax ginseng với các ginsenosid Rb1, Rb3, Rd, F2); saponin có cấu trúc biến đổi ở mạch nhánh C-17 (oxy hóa tại C-21, C-25, C-26, dẫn chất hydroperoxyl, đóng vòng epoxy 21,23 hoặc 20,25). Ngoài ra, chi còn chứa các dẫn chất flavonoid (kaempferol, quercetin và các glycosid tương ứng), sterol (β-sitosterol, ergostanol, stigmastan), 15 dẫn chất chlorophyll và các heteropolysaccharid (GP-1, GPTP-3).
Về hoạt tính sinh học: Các công bố quốc tế và trong nước ghi nhận cao chiết và các hợp chất từ chi Gynostemma thể hiện tác dụng:
- Điều hòa chuyển hóa lipid: Cao chiết ức chế lipase (IC50 = 2,968 mg/mL), hoạt hóa con đường tín hiệu AMPK-ACC, tăng biểu hiện GLUT4, SIRT1, PGC-1α và PPARα.
- Bảo vệ gan và chống oxy hóa: Giảm nồng độ ALT, AST, giảm malondialdehyd (MDA) trong dịch đồng thể gan chuột, ức chế tế bào sao gan t-HSC/Cl-6, quét gốc tự do DPPH (IC50 = 0,317 mg/mL).
- Hạ glucose máu: Kích thích giải phóng insulin qua hoạt chất phanosid, ức chế enzym α-glucosidase (IC50 = 0,184 mg/mL).
- Tác dụng điều hòa miễn dịch, tim mạch, chống ngưng tập tiểu cầu, bảo vệ hệ thần kinh trung ương và ức chế các dòng tế bào ung thư (A549, HepG2, Hep3B, SW-480, S180, HL-60, MCF-7...).
Vị trí và khoảng trống nghiên cứu của luận án: Loài Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang lần đầu tiên được Chen Xin Xiang và Liang Ding Ren mô tả tại Long Châu (Quảng Tây, Trung Quốc) năm 1991. Năm 1993, nhóm tác giả Ding S. phân lập được 4 saponin gồm gycomosid I, II, III, IV từ mẫu thu hái ở Trung Quốc. Tại Việt Nam, loài này được tìm thấy năm 2015 nhưng hoàn toàn chưa có nghiên cứu nào làm rõ về đặc điểm hình thái chi tiết, cấu tạo giải phẫu vi học, thành phần hóa học phân lập cũng như các tác dụng sinh học in vitro và in vivo. Luận án của NCS. Đinh Thị Thanh Thủy là công trình đầu tiên giải quyết trọn vẹn khoảng trống khoa học này đối với mẫu Giảo cổ lam quả dẹt thu hái tại Việt Nam.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án kết hợp đồng bộ các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trong ngành dược liệu, bao gồm thực vật học hình thái - vi học, hóa thực vật tách chiết - phân lập cấu trúc, và dược lý thực nghiệm in vitro - in vivo:
Khung lý thuyết và phân tích hóa thực vật:
- Chiết xuất phân đoạn: Sử dụng phương pháp ngấm kiệt hoặc chiết hồi lưu với dung môi ethanol 80% để thu cao toàn phần (GCT/GCT1), sau đó phân bố lỏng - lỏng phân đoạn liên tục qua các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), n-butanol (BuOH) và lớp nước còn lại.
- Phân lập hợp chất: Sử dụng sắc ký cột pha thường (Silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm), sắc ký cột pha đảo (RP-C18), sắc ký rây phân tử (Sephadex LH-20) và sắc ký lớp mỏng (TLC) để theo dõi và tinh chế các phân đoạn B1, B2, B3, B7 từ cao n-butanol.
- Xác định cấu trúc hóa học: Kết hợp các phương pháp quang phổ hiện đại gồm phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) để xác định khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1D-NMR: 1H-NMR tần số 500 MHz, 13C-NMR tần số 125 MHz, DEPT-90, DEPT-135) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D-NMR: 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) để xác lập vị trí liên kết hóa học, cấu hình lập thể của khung aglycon và các mạch đường.
Phương pháp nghiên cứu thực vật học:
- Phương pháp hình thái so sánh: Quan sát, đo đạc kích thước các cơ quan sinh dưỡng (thân, lá, cuống lá, tua cuốn) và cơ quan sinh sản (cụm hoa đực, hoa cái, quả, hạt) ở trạng thái tươi dưới kính lúp soi nổi và kính hiển vi quang học; đối chiếu với bản mô tả gốc loài Gynostemma compressum.
- Phương pháp giải phẫu vi học: Cắt vi phẫu tươi cuống lá, phiến lá và thân bằng dao cắt tay; tẩy màu bằng dung dịch nước Javen; rửa sạch và trung hòa bằng acid acetic; nhuộm kép bằng phẩm nhuộm carmin và lục iod (hoặc xanh methylen); quan sát lát cắt và đặc điểm bột dược liệu khô dưới kính hiển vi quang học có gắn camera chụp ảnh kỹ thuật số.
Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp và hoạt tính sinh học:
- Độc tính cấp đường uống: Đánh giá theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Bộ Y tế trên chuột nhắt trắng Swiss albino; theo dõi các biểu hiện hành vi, hô hấp, tiêu hóa, triệu chứng nhiễm độc và tỷ lệ tử vong trong 72 giờ và 14 ngày liên tục sau khi cho uống liều duy nhất cao nước và cao cồn EtOH 80% (GCT1) để xác định các giá trị LD0, LD50 và LD100.
- Hoạt tính trên mô hình tế bào in vitro:
- Đánh giá độ sống sót của tế bào: Thử nghiệm khử muối tetrazolium (MTT assay) trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 và tế bào tiền mô mỡ 3T3-L1 khi ủ với cao chiết và các hợp chất tinh khiết ở các dải nồng độ khác nhau.
- Đánh giá tích tụ lipid: Đo lường hàm lượng lipid nội bào trên tế bào HepG2 được gây tích tụ lipid bằng acid oleic.
- Đánh giá cơ chế phân tử điều hòa chuyển hóa mỡ: Đánh giá mức độ biểu hiện và hoạt hóa phosphoryl hóa protein p-AMPK, p-ACC, ức chế enzym tổng hợp acid béo FAS và yếu tố phiên mã SREBP-1c trên tế bào 3T3-L1 của cao n-butanol (GCB) và hợp chất GC13 theo nồng độ và thời gian bằng phương pháp Western blot.
- Hoạt tính hạ glucose và lipid máu trên mô hình in vivo:
- Gây mô hình chuột đái tháo đường typ 2 thực nghiệm: Chuột nhắt trắng được nuôi bằng chế độ ăn giàu chất béo (High Fat Diet - HFD) kết hợp tiêm phúc mạc liều thấp streptozocin (STZ).
- Đánh giá dược lý: Đo nồng độ glucose máu tĩnh mạch đuôi sau 8 tuần gây bệnh; đánh giá sự biến đổi thể trọng chuột, các chỉ số lipid máu huyết thanh (TC, TG, HDL, LDL) sau 2 tuần uống cao GCT1; cân khối lượng gan, tụy; định lượng chỉ số malondialdehyd (MDA) trong mô tụy; đánh giá tổn thương mô bệnh học đại thể và vi thể mô gan, mô tụy chuột thông qua phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE, độ phóng đại x400).
Nội dung chính theo từng chương
Chương I: Tổng quan
Chương I tổng hợp có hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về chi Gynostemma Blume và loài Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang:
- Phân loại học thực vật: Phân tích lịch sử định danh từ năm 1825 của Blume, hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), phân chia 2 phân chi (Trirostellum và Gynostemma). Tổng hợp danh lục 19 loài trên thế giới, 14 loài tại Trung Quốc, 4 loài tại Thái Lan - Malaysia và 6 loài ghi nhận tại Việt Nam.
- Hóa học chi Gynostemma: Khái quát cấu trúc hóa học của khoảng 200 saponin dammaran phân lập từ chi Giảo cổ lam, phân loại theo các nhóm thế trên khung (3β,19β,20β-trihydroxy; 3β,20β-dihydroxy-19-al; protopanaxadiol; 3β,12β,19β,20β-tetrahydroxy; 2α,3β,12β,20β-tetrahydroxy; 2α,3β,20β-trihydroxy-12-on; các dẫn chất biến đổi mạch nhánh C-17 oxy hóa tại C-21, C-25, C-26, peroxid hóa và đóng vòng epoxy). Tổng hợp 13 flavonoid tiêu biểu thuộc khung kaempferol và quercetin, 18 sterol, 15 dẫn chất chlorophyll, các polysaccharid liên kết protein (GP-1, GPTP-3) và các acid hữu cơ.
- Dược lý và độc tính chi Gynostemma: Điểm lại các bằng chứng thực nghiệm về tác dụng điều hòa chuyển hóa lipid, bảo vệ gan (giảm AST, ALT, MDA), hạ glucose huyết (kích thích tế bào beta tụy tiết insulin), điều hòa miễn dịch (thúc đẩy giải phóng NO, TNF-α, IL-1β, IL-6), tác dụng tim mạch, chống ngưng tập tiểu cầu, bảo vệ tế bào thần kinh, chống loét dạ dày, kháng u và độc tính (LD50 cấp và độc tính bán trường diễn 28 ngày, 90 ngày, 6 tháng và thử nghiệm lâm sàng).
- Tổng quan về loài Giảo cổ lam quả dẹt: Tổng hợp các đặc điểm về nguồn gốc phát hiện tại Quảng Tây (1991), vùng phân bố sinh thái núi đá vôi ở độ cao 350 – 1000 m tại Cao Bằng, Lạng Sơn, và 4 saponin gycomosid I-IV do Ding S. công bố năm 1993.
Chương II: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương II mô tả chi tiết nguyên vật liệu, trang thiết bị và quy trình thực nghiệm:
- Mẫu nghiên cứu: Phần trên mặt đất của Gynostemma compressum thu hái tại Bắc Sơn (Lạng Sơn), được thẩm định tên khoa học và xử lý thành các dạng mẫu tươi (nghiên cứu thực vật), mẫu bột khô (chiết xuất hóa học) và các phân đoạn cao, chất tinh khiết (thử nghiệm sinh học).
- Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng Swiss albino 22,0 ± 3,0 g, nuôi ổn định ở điều kiện chuẩn (25 ± 1°C, độ ẩm và ánh sáng tiêu chuẩn, thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
- Hóa chất và thiết bị: Trình bày chi tiết danh mục dung môi phân tích, hóa chất tẩy nhuộm (Javen, acid acetic), thuốc thử định tính hữu cơ, kháng thể Western blot, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz, máy đo khối phổ HR-ESI-MS, máy quang phổ vi giếng đọc ELISA, kính hiển vi quang học và hệ thống máy ly tâm, cô quay chân không.
- Phương pháp nghiên cứu: Trình bày quy trình chi tiết về kỹ thuật vi phẫu và soi bột thực vật; quy trình chiết xuất cao cồn 80% và phân bố phân đoạn lỏng - lỏng; quy trình sắc ký phân lập các hợp chất; phương pháp xác định cấu trúc phân tử qua phổ NMR và MS; quy trình thử độc tính cấp đường uống xác định LD50; quy trình thử nghiệm MTT, Western blot (p-AMPK, p-ACC, FAS, SREBP-1c) trên tế bào 3T3-L1 và HepG2; quy trình thiết lập mô hình chuột ĐTĐ typ 2 bằng HFD + STZ và các xét nghiệm hóa sinh, mô bệnh học đại thể, vi thể nhuộm HE gan - tụy.
Chương III: Kết quả nghiên cứu và bàn luận
Chương III trình bày toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm thu được, được cấu trúc thành 3 nội dung chính kèm phần bàn luận khoa học:
- Kết quả nghiên cứu về thực vật học:
- Đặc điểm hình thái: Gynostemma compressum là dây leo thảo nhiều năm, thân mảnh có rãnh dọc, nhẵn. Tua cuốn dạng chỉ, đỉnh chẻ đôi. Lá kép chân vịt gồm 7 lá chét (lá chét giữa kích thước 3,6 - 6,5 x 2 - 2,25 cm, hình elip đến trứng - elip, mép khía răng cưa tai bèo nhỏ; các lá chét bên nhỏ hơn và bất đối xứng). Cây đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực dạng chùy mọc ở nách lá dài 2 - 5 cm; hoa đực màu xanh lục nhạt, đường kính khoảng 1,5 mm, 5 nhị hợp sinh chỉ nhị ngắn, bao phấn hình trứng. Hoa cái mọc đơn độc hoặc từng đôi ở nách lá; bầu dưới 2 ô, mỗi ô 1 noãn, 2 vòi nhụy rời nhau, đầu nhụy chẻ đôi. Quả mọng dẹt đặc trưng hình tam giác ngược, kích thước 5 - 8 x 5 - 7 mm, đỉnh mang bao hoa và vòi nhụy tồn tại. Hạt màu nâu nhạt, hình tam giác ngược dài khoảng 3 mm, đường kính đỉnh khoảng 3,5 mm, hai mặt có nốt sần, mép có khía rãnh.
- Đặc điểm vi học: Vi phẫu cuống lá có thiết diện tròn khuyết ở mặt trên, biểu bì mang lông che chở đa bào; mô dày nằm sát dưới biểu bì; các bó libe - gỗ xếp thành vòng. Vi phẫu phiến lá có cấu tạo dị thể không đối xứng, gồm biểu bì trên và dưới có lỗ khí, mô mềm giậu ở mặt trên và mô mềm xốp ở mặt dưới, gân giữa lồi rõ ở mặt dưới mang bó mạch dẫn. Vi phẫu thân có thiết diện đa giác có cạnh lồi và rãnh lõm, mô dày góc, các bó mạch dẫn kiểu hở. Bột dược liệu thể hiện các đặc điểm đặc trưng: mảnh biểu bì mang lỗ khí kiểu dị bào, mảnh mạch vạch, mạch mạng, sợi mô cứng, lông che chở đa bào đầu nhọn và hạt tinh thể calci oxalat.
- Giám định khoa học: Đối chiếu mẫu nghiên cứu với mẫu chuẩn và mô tả gốc xác nhận mẫu nghiên cứu là Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang.
- Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học:
- Định tính hóa học: Phần trên mặt đất của dược liệu phản ứng dương tính với các nhóm chất hữu cơ: saponin (tạo bọt bền, phản ứng Lieberman-Burchard), flavonoid (phản ứng Cyanidin), sterol, acid hữu cơ, polysaccharid và carotenoid.
- Chiết xuất và phân lập: Từ cao phân đoạn n-butanol (GCB), kết hợp sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo RP-C18 và Sephadex LH-20 đối với các phân đoạn B1, B2, B3 và B7, đã phân lập thành công 17 hợp chất tinh khiết được ký hiệu từ GC1 đến GC17.
- Xác định cấu trúc: Dựa trên phân tích phổ khối HR-ESI-MS và hệ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR (1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY), cấu trúc hóa học của cả 17 hợp chất (GC1 - GC17) đã được làm sáng tỏ, chủ yếu thuộc nhóm saponin triterpenoid khung dammaran (gypenosid).
| Ký hiệu hợp chất | Phương pháp xác định cấu trúc | Đặc điểm cấu trúc chính |
|---|---|---|
| GC1 | HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC | Saponin triterpenoid khung dammaran |
| GC2 | HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC | Saponin triterpenoid khung dammaran |
| GC3 | HR-ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR (COSY, HMBC, NOESY) | Saponin dammaran có mạch đường liên kết |
| GC4 | HR-ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR (COSY, HMBC, NOESY) | Saponin dammaran có mạch đường liên kết |
| GC5 – GC7 | HR-ESI-MS, 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) | Nhóm saponin dammaran đồng đẳng |
| GC8 – GC9 | HR-ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR (COSY, HMBC, NOESY) | Dẫn chất dammaran biến đổi mạch nhánh |
| GC10 – GC13 | HR-ESI-MS, 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) | Nhóm gypenosid chứa khung genin đa hydroxyl |
| GC14 – GC17 | HR-ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR (COSY, HMBC, NOESY) | Các dẫn chất saponin dammaran glycosid |
- Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp và tác dụng sinh học:
- Độc tính cấp: Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng Swiss albino cho thấy cao chiết nước và cao chiết cồn EtOH 80% (GCT1) từ phần trên mặt đất của Giảo cổ lam quả dẹt có độ an toàn cao ở đường uống. Chuột không có biểu hiện nhiễm độc bất thường ở các mức liều khảo sát; không xác định được giá trị LD50 do không có chuột chết ở mức liều cao nhất thử nghiệm.
- Đánh giá in vitro trên tế bào:
- Trên tế bào HepG2: Thử nghiệm MTT cho thấy các cao chiết và phân đoạn không gây độc tế bào ở nồng độ khảo sát; làm tăng tỷ lệ tế bào sống sót khi kết hợp với mô hình nạp acid oleic gây stress chuyển hóa lipid.
- Trên tế bào tiền mô mỡ 3T3-L1: Cao phân đoạn n-butanol (GCB) và hợp chất tinh khiết GC13 làm tăng tỷ lệ sống sót của tế bào mô mỡ.
- Cơ chế tác dụng: Cao GCB và hợp chất GC13 thể hiện tác dụng hoạt hóa rõ rệt sự phosphoryl hóa của p-AMPK và p-ACC, đồng thời ức chế sự biểu hiện của enzym tổng hợp acid béo FAS và yếu tố điều hòa phiên mã SREBP-1c trên tế bào 3T3-L1 theo cơ chế phụ thuộc nồng độ và thời gian can thiệp.
| Mô hình thực nghiệm | Mẫu thử | Chỉ số đánh giá | Kết quả thực nghiệm chính |
|---|---|---|---|
| Độc tính cấp đường uống (chuột Swiss albino) | Cao nước, cao cồn EtOH 80% (GCT1) | LD0, LD50, triệu chứng lâm sàng | Không gây chết chuột, dung nạp tốt ở đường uống |
| Tế bào HepG2 nạp acid oleic | Cao chiết phân đoạn | Tỷ lệ sống sót (MTT), tích tụ mỡ | Giảm độc tính acid oleic, cải thiện sống sót tế bào |
| Tế bào tiền mô mỡ 3T3-L1 | Cao GCB, hợp chất GC13 | p-AMPK, p-ACC, FAS, SREBP-1c | Hoạt hóa p-AMPK, p-ACC; ức chế FAS và SREBP-1c |
| Chuột ĐTĐ typ 2 (HFD + STZ) in vivo | Cao ethanol 80% (GCT1) | Nồng độ glucose máu, thể trọng | Giảm glucose máu rõ rệt, cải thiện thể trọng chuột |
| Rối loạn lipid máu in vivo | Cao ethanol 80% (GCT1) | TC, TG, LDL, HDL huyết thanh | Cải thiện nồng độ lipid máu sau 2 tuần điều trị |
| Đánh giá tổn thương gan, tụy | Cao ethanol 80% (GCT1) | Trọng lượng tạng, MDA, vi thể HE | Giảm MDA mô tụy, cải thiện cấu trúc vi thể gan, tụy |
- Đánh giá tác dụng hạ glucose và lipid máu in vivo trên chuột đái tháo đường typ 2:
- Sau 8 tuần can thiệp trên mô hình chuột đái tháo đường typ 2 thực nghiệm gây bởi HFD kết hợp STZ, lô chuột uống cao GCT1 có sự suy giảm rõ rệt và có ý nghĩa thống kê về nồng độ glucose máu so với lô đối chứng bệnh lý.
- Sau 2 tuần dùng thuốc, cao GCT1 cải thiện rõ rệt các chỉ số bilan lipid máu (giảm nồng độ cholesterol toàn phần - TC, triglyceride - TG, lipoprotein tỷ trọng thấp - LDL, và duy trì/tăng lipoprotein tỷ trọng cao - HDL).
- Khối lượng gan và tụy của chuột ở nhóm điều trị được phục hồi về gần mức sinh lý bình thường. Chỉ số MDA (chỉ thị của quá trình peroxy hóa lipid màng) trong mô tụy giảm rõ rệt ở nhóm dùng cao GCT1.
- Đánh giá giải phẫu bệnh đại thể và vi thể (nhuộm HE x 400) cho thấy cao GCT1 có tác dụng bảo tồn cấu trúc tiểu đảo tụy, hạn chế thoái hóa mỡ và hoại tử tế bào gan so với nhóm chuột mô hình không điều trị.
Kết quả và những đóng góp mới
Các đóng góp mới về mặt khoa học của luận án:
- Về thực vật học: Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam mô tả chi tiết, đầy đủ đặc điểm hình thái học cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản của loài Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang); cung cấp trọn bộ dữ liệu giải phẫu vi học gồm vi phẫu cuống lá, phiến lá, thân và đặc điểm bột dược liệu; xác định bộ tiêu chuẩn thực vật giúp định danh chính xác loài này, phân biệt với các loài Giảo cổ lam khác trong chi.
- Về hóa học: Lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc hóa học hoàn chỉnh của 17 hợp chất tinh khiết (GC1 đến GC17) từ phân đoạn cao n-butanol của loài Giảo cổ lam quả dẹt thu hái tại Việt Nam bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS, bổ sung dữ liệu hóa thực vật phong phú cho loài và chi Gynostemma.
- Về tác dụng sinh học: Chứng minh cao chiết nước và cao cồn 80% của Giảo cổ lam quả dẹt an toàn ở đường uống trong thử nghiệm độc tính cấp. Lần đầu tiên chứng minh tác dụng hạ glucose máu và cải thiện rối loạn lipid máu của cao GCT1 trên mô hình chuột đái tháo đường typ 2 thực nghiệm (HFD + STZ), gắn liền với cơ chế chống oxy hóa màng (giảm MDA mô tụy) và bảo vệ tế bào gan - tụy trên hình ảnh vi thể. Đồng thời, luận án đã làm sáng tỏ cơ chế phân tử của cao n-butanol (GCB) và hợp chất GC13 trong việc kích hoạt con đường tín hiệu p-AMPK, p-ACC và ức chế các đích phân tử FAS, SREBP-1c trên tế bào mô mỡ 3T3-L1.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất của tác giả:
- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về độc tính bán trường diễn và trường diễn của các phân đoạn cao chiết Giảo cổ lam quả dẹt nhằm hoàn thiện hồ sơ tiền lâm sàng.
- Mở rộng nghiên cứu cơ chế phân tử chi tiết của từng hợp chất tinh khiết còn lại trong số 17 chất đã phân lập trên các mô hình bệnh lý chuyển hóa.
- Đề xuất giải pháp bảo tồn, di thực và quy hoạch vùng trồng đạt chuẩn đối với loài Giảo cổ lam quả dẹt tại các vùng núi đá vôi phía Bắc (Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang) nhằm chủ động nguồn nguyên liệu làm thuốc.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của luận án:
- Phạm vi thu hái mẫu nghiên cứu mới chỉ tập trung tại địa bàn huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn trong các năm 2018 và 2019, chưa bao phủ toàn bộ các vùng phân bố tiềm năng khác của loài như Cao Bằng hay Hà Giang.
- Các thử nghiệm dược lý in vivo mới tập trung đánh giá tác dụng hạ đường huyết và lipid máu trên mô hình ngắn ngày (2 tuần uống thuốc đối với lipid máu và 8 tuần mô hình đái tháo đường), chưa khảo sát độc tính bán trường diễn dài ngày cũng như thử nghiệm lâm sàng trên người.
Hướng nghiên cứu tiếp theo được văn bản đề cập:
- Triển khai các nghiên cứu bán trường diễn trên động vật thực nghiệm để đánh giá toàn diện chức năng gan, thận, huyết học khi sử dụng cao chiết dài ngày.
- Nghiên cứu khảo sát hoạt tính sinh học in vitro và in vivo của các hợp chất tinh khiết từ GC1 đến GC17 (ngoài GC13) trên các đích tác dụng chuyển hóa và kháng u.
- Xây dựng quy trình định lượng tiêu chuẩn hóa các hoạt chất chính phục vụ kiểm nghiệm dược liệu Giảo cổ lam quả dẹt.
Giá trị tham khảo
Luận án có giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao đối với các nhóm đối tượng:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Dược liệu - Dược học cổ truyền, Thực vật học, Hóa thực vật: Tài liệu tham khảo chuẩn xác về quy trình giải phẫu vi học, phương pháp phân lập các hợp chất saponin phân cực cao bằng sắc ký đa hệ và kỹ thuật phân tích phổ cấu trúc (HR-ESI-MS, COSY, HSQC, HMBC, NOESY).
- Các nhà nghiên cứu Dược lý và Hóa dược: Khung phương pháp chuẩn mực trong việc kết hợp mô hình sàng lọc in vitro (MTT, Western blot khảo sát AMPK, ACC, FAS, SREBP-1c) với mô hình bệnh lý in vivo chuyển hóa (chuột đái tháo đường typ 2 gây bởi HFD phối hợp STZ).
- Các nhà quản lý dược liệu, nhà hoạch định chính sách bảo tồn nguồn gen cây thuốc và doanh nghiệp dược phẩm: Dữ liệu khoa học nền tảng để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm dược liệu Giảo cổ lam quả dẹt, phân biệt với Giảo cổ lam 5 lá (G. pentaphyllum), làm căn cứ phát triển các chế phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường và rối loạn chuyển hóa lipid từ nguồn dược liệu trong nước.
Câu hỏi thường gặp
-
Loài Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum) có đặc điểm thực vật nào đặc trưng nhất để nhận diện và phân biệt với các loài khác trong chi? Cây có lá kép chân vịt gồm 7 lá chét (mép khía răng cưa tai bèo nhỏ). Cơ quan sinh sản cái có bầu dưới 2 ô (mỗi ô 1 noãn) và 2 vòi nhụy rời nhau. Đặc điểm chẩn đoán đặc trưng nhất là quả mọng dẹt hình tam giác ngược, kích thước 5 - 8 x 5 - 7 mm, đỉnh quả mang bao hoa và vòi nhụy tồn tại; hạt dẹt hình tam giác ngược màu nâu nhạt với hai mặt có nốt sần.
-
Luận án đã phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của bao nhiêu hợp chất từ Giảo cổ lam quả dẹt? Luận án đã phân lập thành công và xác định cấu trúc hóa học của 17 hợp chất tinh khiết, được ký hiệu từ GC1 đến GC17, từ các phân đoạn B1, B2, B3 và B7 của cao phân đoạn n-butanol (GCB). Các hợp chất này chủ yếu thuộc nhóm saponin triterpenoid tetracyclic khung dammaran (gypenosid).
-
Cơ chế phân tử chính của hợp chất GC13 và cao chiết n-butanol (GCB) trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 được làm sáng tỏ là gì? Cao GCB và hợp chất tinh khiết GC13 làm tăng tỷ lệ sống sót của tế bào mô mỡ 3T3-L1, đồng thời hoạt hóa con đường truyền tín hiệu p-AMPK và p-ACC (phosphoryl hóa protein), kết hợp ức chế enzym tổng hợp acid béo FAS và yếu tố điều hòa phiên mã liên kết yếu tố sterol SREBP-1c theo cơ chế phụ thuộc vào nồng độ và thời gian.
-
Cao chiết ethanol 80% (GCT1) thể hiện những tác dụng dược lý nào trên mô hình chuột đái tháo đường typ 2 thực nghiệm? Trên chuột nhắt trắng được gây đái tháo đường typ 2 bằng chế độ ăn giàu chất béo (HFD) kết hợp tiêm Streptozocin (STZ), cao GCT1 giúp hạ nồng độ glucose máu có ý nghĩa thống kê sau 8 tuần, cải thiện các chỉ số lipid máu (TC, TG, LDL, HDL) sau 2 tuần điều trị, giảm chỉ số peroxy hóa lipid MDA trong mô tụy, đồng thời bảo tồn và phục hồi cấu trúc vi thể của tế bào tiểu đảo tụy và tế bào gan.
-
Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đường uống của các cao chiết Giảo cổ lam quả dẹt như thế nào? Cả cao chiết nước và cao chiết cồn ethanol 80% (GCT1) từ phần trên mặt đất của Giảo cổ lam quả dẹt đều không gây ra các biểu hiện ngộ độc bất thường trên hành vi, hô hấp, tiêu hóa và không làm chết chuột ở các mức liều khảo sát cao nhất, cho thấy độ an toàn cao ở đường uống và không xác định được giá trị LD50.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của NCS. Đinh Thị Thanh Thủy là công trình khoa học toàn diện đầu tiên tại Việt Nam về loài Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen & D.R. Liang). Luận án đã xác lập đầy đủ bộ dữ liệu thực vật học hình thái - vi học, phân lập và cấu trúc hóa học 17 hợp chất saponin khung dammaran (GC1 – GC17), đồng thời chứng minh tính an toàn qua độc tính cấp và hiệu quả điều hòa chuyển hóa thông qua tác dụng hạ glucose, cải thiện lipid máu trên động vật thực nghiệm gắn với cơ chế hoạt hóa p-AMPK, p-ACC và ức chế FAS, SREBP-1c. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học tin cậy cho công tác giám định, kiểm nghiệm tiêu chuẩn và định hướng ứng dụng nguồn dược liệu Gynostemma compressum trong y dược học.