Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ kỹ thuật với đề tài "Nghiên cứu tạo hệ nano từ rutin" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Phan Nguyễn Quỳnh Anh dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Lê Thị Hồng Nhan, thuộc chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học (mã số chuyên ngành: 62520301) tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh vào năm 2017. Luận án được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Đề án 911 về đào tạo tiến sĩ trong nước và Đề tài trọng điểm cấp Đại học Quốc gia loại B (mã số B-2012-20-07TĐ) mang tên "Nghiên cứu hệ phân tán nano rutin-hợp chất tự nhiên có hoạt tính sử dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm".

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Rutin là một hợp chất glycoside tự nhiên được trích ly từ nụ hoa hòe (Sophora japonica L.), bao gồm khung aglycone quercetin liên kết với gốc đường disaccharide rutinose. Hoạt chất này sở hữu nhiều hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý giá trị như kháng oxy hóa, loại trừ gốc tự do, kháng viêm, bảo vệ thành mao mạch, giảm tính thấm mao mạch, điều chỉnh huyết áp, ngăn chặn biến đổi gen và hỗ trợ ức chế sự phát triển của một số khối u. Mặc dù có tiềm năng ứng dụng lớn trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng, việc ứng dụng rutin gặp trở ngại cơ bản do độ tan trong nước rất thấp, chỉ đạt khoảng 13 mg/100 ml (tương đương 0,01 đến 0,0125 g/l ở nhiệt độ phòng). Theo Hệ thống Phân loại Sinh dược học (BCS), rutin thuộc nhóm 2 (dược chất khó tan, dễ thấm), trong đó tốc độ và mức độ hòa tan là yếu tố giới hạn trực tiếp đến khả năng hấp thu và sinh khả dụng khi sử dụng qua đường uống.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả chỉ ra xuất phát từ thực trạng các công bố trước đây trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Các nghiên cứu quốc tế tiêu biểu của Rainer H. Müller và R. Mauludin thực hiện phân tán rutin ở nồng độ cao (10%) nhưng sử dụng thể tích rất nhỏ (40 ml) trên thiết bị quy mô phòng thí nghiệm Micron Lab40, vận hành ở áp suất rất cao (1500 bar) và chưa công bố đầy đủ thông số hao hụt hàm lượng hoạt chất sau đồng hóa cũng như độ bền phân hủy của hệ.
  • Các nghiên cứu tại Việt Nam trước thời điểm này chỉ tạo được hệ phân tán rutin ở nồng độ rất thấp (dưới 0,1%) với thể tích nhỏ, chưa giải quyết được bài toán công nghệ để đưa vào sản xuất thực tế.
  • Trong môi trường nước, các tiểu phân rắn rutin có xu hướng kết tụ tự phát thành hạt có kích thước lớn và sa lắng nhanh theo định luật Stokes. Khi tách dung môi chuyển về dạng bột rắn, các hạt nano rất dễ dính kết và mất khả năng tái phân tán.

Do đó, khoảng trống nghiên cứu mà luận án tập trung giải quyết là: nghiên cứu công nghệ chế tạo hệ phân tán nano rutin ở nồng độ cao (lên đến 5%), mở rộng quy mô mẻ thí nghiệm (300 g/mẻ), giảm năng lượng đồng hóa áp suất cao xuống mức 400–700 bar bằng cách kết hợp các phụ gia hoạt động bề mặt (PEG400, SSL) và màng bao polymer sinh học chitosan có liên kết ngang (STPP, glutaraldehyde), đồng thời đánh giá độ bền sa lắng dài hạn và khả năng tái phân tán của sản phẩm bột sau khi sấy.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu chung của đề tài là: Nghiên cứu tạo sản phẩm nano rutin nồng độ cao có khả năng triển khai với quy mô lớn (<300 g/mẻ) từ nguyên liệu rutin sử dụng trong ngành dược; sản phẩm tạo thành có khả năng ứng dụng thực tế trong lĩnh vực các sản phẩm chức năng.

Nội dung nghiên cứu được đánh số và xác định cụ thể trong văn bản gồm 4 phần:

  1. Nghiên cứu tạo hệ huyền phù nano rutin trong nước nồng độ cao (1%, 5%). Hệ tạo thành được bổ sung chất hoạt động bề mặt và hỗ trợ thêm polymer để tăng độ ổn định.
  2. Tiến hành đưa hệ huyền phù nano rutin tạo thành về dạng bột bằng phương pháp sấy phun và đông khô.
  3. Đánh giá ngoại quan, hình thái hạt và khả năng tái phân tán của bột nano rutin trong các môi trường giả lập điều kiện sử dụng.
  4. So sánh và đánh giá sự ảnh hưởng của phương pháp tạo bột, thành phần phụ gia đến độ phân tán của bột nano rutin.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất rutin có độ tinh khiết thương phẩm trên 95% trích ly từ hoa hòe, cung cấp bởi Công ty Cổ phần Dược phẩm Khải Hà (Thái Bình); chitosan thương mại sản xuất tại Cần Thơ; các chất hoạt động bề mặt và phụ gia gồm Tween 80, Sodium Stearoyl Lactylate (SSL), Polyethylene Glycol (PEGs, đặc biệt là PEG400), ethanol, Sodium Tripolyphosphate (STPP) và glutaraldehyde.
  • Phạm vi không gian: Các thí nghiệm chế tạo, đồng hóa và đánh giá được triển khai tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa hữu cơ và Phòng thí nghiệm Trọng điểm Nghiên cứu Cấu trúc Vật liệu (Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP.HCM), Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano (Khu Công nghệ Cao TP.HCM), Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (Hà Nội) và Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM).
  • Phạm vi quy mô và thời gian: Luận án thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm nhưng nâng khối lượng xử lý lên mức 300 g/mẻ cho các hệ phân tán và hoàn thành bảo vệ vào năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước mà tác giả điểm lại

Trong Chương 1, tác giả đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến quá trình sinh dược học của thuốc, công nghệ nano và các hệ dẫn truyền rutin:

  1. Quá trình sinh dược học và hệ thống phân loại BCS: Quá trình hấp thu hoạt chất tự nhiên trải qua 3 giai đoạn: giải phóng, hòa tan và hấp thu (Liberation – Dissolution – Absorption, viết tắt là LDA). Tốc độ và mức độ hòa tan ảnh hưởng trực tiếp đến sinh khả dụng in vitro (thử nghiệm dissolution) và in vivo. Dựa trên độ tan và tính thấm, Amidon cùng các cộng sự xây dựng hệ thống BCS; trong đó rutin thuộc nhóm 2, việc giảm kích thước hạt về mức nanomet giúp tăng diện tích bề mặt riêng tiếp xúc, từ đó làm tăng vận tốc hòa tan và độ tan bão hòa.
  2. Khung phân loại độc tính của hạt nano hữu cơ: Trích dẫn nghiên cứu của Rainer H. Müller và cộng sự (2011), độc tính của vật liệu nano hữu cơ dùng trong mỹ phẩm và dược phẩm được chia thành 4 vùng dựa trên kích thước và khả năng phân hủy sinh học. Vùng kích thước trên 100 nm được xác định là ngưỡng an toàn do hạn chế hiện tượng nội thực bào (endocytosis) không kiểm soát của tế bào. Do đó, việc duy trì kích thước hạt nano thuốc trong khoảng 100–400 nm hoặc 200–600 nm là phù hợp cho dẫn truyền sinh học.
  3. Nghiên cứu chế tạo nano tinh thể rutin của nhóm R. Mauludin và R. H. Müller (2009): Tác giả điểm lại nghiên cứu điều chế huyền phù nano rutin (R-NS) nồng độ 10% bằng thiết bị đồng hóa cao áp Micron Lab40 ở 1500 bar qua 20 chu kỳ với các chất ổn định khác nhau:
Công thức Thành phần hoạt chất và phụ gia Kích thước hạt thu được (nm)
A Rutin 10% + Poloxamer 188 2% + Nước 88% 648
B Rutin 10% + SDS 0,2% + Nước 89,8% 727 (sau đông khô: 721)
C Rutin 10% + Tween 80 2% + Nước 88% 912
D Rutin 10% + PVA 2% + Nước 88% 547

Nhóm của Müller cũng nghiên cứu dập viên nén từ huyền phù nano rutin và chứng minh khả năng tái phân tán của viên nén trong môi trường nước có kích thước hạt sai lệch không đáng kể so với hệ ban đầu. 4. Nghiên cứu ứng dụng nano rutin trong mỹ phẩm của Petersen và cộng sự (2011): Nghiên cứu thử nghiệm huyền phù nano rutin 5% trên da tình nguyện viên cho thấy hiệu quả chống oxy hóa bảo vệ da tăng hơn 25% so với sản phẩm đối chứng chứa 5% Alpha-G-Rutin PS tan trong nước, đồng thời tăng tốc độ điều trị các tổn thương nhiễm trùng da. 5. Nghiên cứu hệ mang hạt nano trên nền polymer chitosan: Tác giả điểm lại nghiên cứu của A. Grenha và cộng sự tại Đại học Minho (Bồ Đào Nha) về hệ nano chitosan/carrageenan (kích thước 350–650 nm, tải thuốc 4–17%). Đặc biệt, công trình của K. Konecny và cộng sự trên tạp chí Food Chemistry nghiên cứu hệ tiểu phân chitosan – tripolyphosphate (CH–TPP) bao bọc rutin, ghi nhận kích thước hạt biến thiên theo tỉ lệ khối lượng: đạt 814 nm ở tỉ lệ 2:1; 528 nm ở tỉ lệ 2,5:1 và 4:1; giảm xuống 322 nm ở tỉ lệ 5:1. 6. Tình hình nghiên cứu trong nước: Nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách Khoa TP.HCM (2013) từng bước đầu tạo hạt nano rutin kích thước 10 nm (quan sát qua TEM) khi sử dụng chất hoạt động bề mặt Tween 80 kết hợp ethanol sau 15 chu kỳ đồng hóa ở 500 bar, tuy nhiên nồng độ rutin chỉ đạt dưới 0,1%.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Từ việc phân tích tổng quan các công trình trên, luận án xác định vị trí nghiên cứu là giải quyết bài toán dung hòa giữa nồng độ hoạt chất cao, quy mô phân tán và mức năng lượng tiêu hao. Luận án chọn tạo hệ huyền phù rutin nồng độ cao 5% ở thể tích 300 g/mẻ, khảo sát thay thế các chất diện hoạt thông thường bằng PEG400 hoặc hệ SSL/ethanol kết hợp màng chitosan liên kết ngang (STPP hoặc glutaraldehyde). Cách tiếp cận này giúp hạ áp suất đồng hóa xuống còn 400–700 bar (thay vì 1500 bar của Müller), ngăn chặn triệt để hiện tượng kết tụ và sa lắng trong thời gian 6 tháng, đồng thời chuyển hóa thành công sang dạng bột rắn sấy phun và đông khô có khả năng tái phân tán nguyên vẹn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Lý thuyết, khái niệm và khung phân tích

Luận án dựa trên các cơ sở lý thuyết hóa keo, hóa học polymer và sinh dược học:

  • Định luật Stokes về vận tốc sa lắng: $$v = \frac{2 r^2 (\rho - \rho_0) g}{9 \eta}$$ Trong đó $r$ là bán kính tiểu phân, $\rho$ và $\rho_0$ là khối lượng riêng của pha phân tán và môi trường phân tán, $g$ là gia tốc trọng trường ($9,8\text{ m/s}^2$), $\eta$ là độ nhớt động lực học của pha lỏng. Vận tốc sa lắng tỷ lệ thuận với bình phương kích thước hạt và tỷ lệ nghịch với độ nhớt. Do đó, giảm kích thước hạt về vùng nanomet kết hợp tăng độ nhớt môi trường bằng polymer là giải pháp cốt lõi để làm bền hệ.
  • Thuyết Einstein về chuyển động Brown: $$\overline{\Delta x^2} = \frac{2 k_B T t}{3 \pi \eta d}$$ Với $k_B$ là hằng số Boltzmann ($1,38 \times 10^{-23}\text{ J/K}$), $T$ là nhiệt độ Kelvin, $d$ là đường kính hạt. Khi hạt có kích thước nanomet, chuyển động nhiệt Brown gia tăng thắng được trọng lực, giúp hệ phân tán duy trì trạng thái lơ lửng.
  • Cơ chế tạo màng bao polymer chitosan: Chitosan là polycation mang điện tích dương do nhóm amin ($-NH_3^+$ có $\text{pK}_a \approx 6,5$) tạo liên kết ion với polyanion mang điện tích âm tripolyphosphate ($\text{P}3\text{O}{10}^{5-}$ từ STPP) hoặc tạo liên kết cộng hóa trị với glutaraldehyde qua phản ứng ngưng tụ giữa nhóm amin của chitosan và nhóm aldehyde ($-CHO$) tạo liên kết imine ($-N=CH-$). Khung mạng này bao bọc bên ngoài tinh thể nano rutin, tạo lực đẩy tĩnh điện và cản trở không gian, ngăn chặn các hạt tiếp xúc kết tụ.
  • Nguyên lý phân tán Top-down: Sử dụng năng lượng cơ học từ thiết bị nghiền và đồng hóa để phá vỡ cấu trúc tinh thể thô ban đầu về kích thước nano. Phương pháp đồng hóa áp suất cao (High Pressure Homogenization – HPH) tạo lực cắt mạnh, dòng chảy rối và hiện tượng tạo bọt khí xâm thực (cavitation) sinh sóng xung kích làm vỡ hạt.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án áp dụng hoàn toàn phương pháp thực nghiệm định lượng trong kỹ thuật hóa học:

  1. Phương pháp phân tán và đồng hóa:
    • Đồng hóa sơ bộ: Sử dụng máy khuấy cầm tay Philips HR 1361 (công suất 600 W).
    • Nghiền bi cao tốc (HSBM): Thiết bị Ceramic Instruments S.r.l, sử dụng bi nghiền sứ để khảo sát khả năng hạ kích thước hạt theo thời gian.
    • Đồng hóa áp suất cao: Thiết bị APV 2000 (Đan Mạch), vận hành ở dải áp suất từ 200 bar đến 800 bar, số chu kỳ đồng hóa từ 5 đến 15 chu kỳ.
  2. Phương pháp tạo dạng bột rắn:
    • Sấy đông khô: Thiết bị Advantage Pro (SP Scientific – Mỹ), đông lạnh sâu mẫu và thăng hoa dung môi dưới áp suất chân không.
    • Sấy phun sương: Thiết bị GEA Niro-2002 (Đan Mạch).
  3. Phương pháp phân tích và đánh giá tính chất:
    • Độ ẩm nguyên liệu: Máy đo độ ẩm hồng ngoại Sartorius MB45, sấy ở 105 °C đến khối lượng không đổi.
    • Cấu trúc tinh thể: Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) trên máy D8 Advance Bruker, nguồn bức xạ Cu K$\alpha$, quét góc $2\theta$ từ 5° đến 40°.
    • Độ tinh khiết và hàm lượng hoạt chất: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống Agilent 1260 Infinity, detector DAD, cột pha đảo C18 ($150\text{ mm} \times 4,6\text{ mm}$, kích thước hạt $5\text{ }\mu\text{m}$). Nhiệt độ cột 30 °C, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm $10\text{ }\mu\text{l}$. Pha động gồm dung dịch acid phosphoric 0,3% trong nước (A), acetonitrile (B) và methanol (C) chạy gradient theo tỷ lệ thể tích (20 phút: 10% A, 75% B, 15% C). Bước sóng phát hiện rutin là 254 nm và 360 nm; quercetin là 360 nm và 375 nm.
    • Phân tử lượng trung bình chitosan: Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) tại Khoa Hóa học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM.
    • Độ deacetyl hóa (DD%) của chitosan: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên máy Nicolet 6700, tính qua tỷ số độ hấp thu $A_{1655}$ (nhóm amide) và $A_{3450}$ (nhóm hydroxyl): $$\text{DD}% = 100 - \left( \frac{A_{1655}}{A_{3450}} \times \frac{100}{1,33} \right)$$
    • Phân bố kích thước hạt: Quang phổ tán xạ laser (Laser Diffraction Spectrometry – LDS) trên máy Horiba LA-950V2.
    • Hình thái hạt: Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM S4800 Hitachi) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM JEOL JEM 1400, điện thế gia tốc 100 kV).
    • Độ bền sa lắng: Đo tỷ số chiều cao cột huyền phù đồng nhất còn lại so với chiều cao ban đầu ($H_t / H_0$) theo thời gian lưu trữ trong ống nghiệm chuẩn.
    • Màu sắc ngoại quan bột: Máy đo màu Minolta CR300 theo hệ màu CIE-LCh ($L$ độ sáng, $C$ độ bão hòa màu, $h$ góc sắc pha màu).
    • Khả năng tái phân tán: Phân tán lại bột sấy vào các dung dịch đệm có pH mô phỏng đường tiêu hóa (pH 1,2 mô phỏng dạ dày; pH 4,5 mô phỏng tá tràng; pH 6,8 mô phỏng ruột non; pH 7,4 mô phỏng máu), sau đó đo lại phân bố kích thước hạt bằng LDS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày tổng quan lý thuyết về các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, nhấn mạnh vào rào cản hấp thu của cơ thể đối với các hoạt chất khó tan theo cơ chế LDA và hệ thống BCS. Tác giả giới thiệu chi tiết về công nghệ nano tinh thể (nanocrystal) và huyền phù nano (nanosuspension), phân tích các ưu thế vượt trội của hệ phân tán nano trong việc tăng độ tan bão hòa và tốc độ hòa tan. Chương này phân tích hệ thống phân loại độc tính nano của Müller, chỉ ra vùng kích thước hạt an toàn trên 100 nm. Tiếp đó, tác giả tổng hợp các đặc tính hóa lý, dược lý của rutin (công thức hóa học $\text{C}{27}\text{H}{30}\text{O}_{16}$), cấu trúc polymer chitosan và cơ chế tạo liên kết ngang của chitosan với STPP (liên kết ion) và glutaraldehyde (liên kết cộng hóa trị). Tác giả phân tích các nghiên cứu của Mauludin, Müller, Petersen và Konecny, từ đó xác lập tính cấp thiết và định hướng nghiên cứu của luận án: tập trung chế tạo hệ nano rutin nồng độ cao 5%, mở rộng thể tích mẻ 300 g, kiểm soát kích thước trong vùng 200–600 nm và tối ưu hóa độ bền sa lắng bằng chitosan liên kết ngang.

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết hóa chất, nguyên liệu, thiết bị và toàn bộ quy trình thực nghiệm:

  • Kiểm tra tính chất nguyên liệu ban đầu: rutin Khải Hà (xác định độ ẩm bằng sấy hồng ngoại, cấu trúc tinh thể bằng XRD, độ tinh khiết và tạp chất quercetin bằng HPLC qua phương trình đường chuẩn xây dựng từ chất chuẩn Sigma-Aldrich); chitosan Cần Thơ (xác định phân tử lượng bằng GPC, độ deacetyl bằng FT-IR).
  • Xây dựng quy trình chế tạo hệ huyền phù nano rutin:
    • Khảo sát các chất hoạt động bề mặt hỗ trợ: Tween 80, các loại PEGs (PEG200, PEG400, PEG600, PEG1000, PEG4000, PEG6000), SSL kết hợp ethanol.
    • Khảo sát các thông số đồng hóa: tốc độ khuấy (vòng/phút), thời gian phân tán trên máy Philips, thời gian nghiền trên máy nghiền bi cao tốc (HSBM), áp suất đồng hóa (200–800 bar) và số chu kỳ (5–15 chu kỳ) trên máy đồng hóa cao áp APV 2000.
    • Quy trình bọc hạt rutin bằng chitosan: hòa tan chitosan trong dung dịch acid acetic loãng, phối trộn vào huyền phù rutin nồng độ cao có mặt PEG400, sau đó bổ sung tác nhân tạo liên kết ngang STPP hoặc glutaraldehyde dưới điều kiện khuấy cơ học trước khi đưa qua máy đồng hóa cao áp.
  • Xây dựng quy trình sấy đông khô (thông số áp suất chân không và nhiệt độ cấp đông) và sấy phun sương để thu bột nano rutin.
  • Chi tiết hóa các phương pháp đánh giá độ sa lắng, đo phân bố kích thước hạt LDS, chụp ảnh SEM/TEM, định lượng HPLC và khảo sát khả năng tái hòa tan/tái phân tán của bột trong môi trường đệm pH 1,2; 4,5; 6,8 và 7,4.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 là chương thực nghiệm trọng tâm của luận án, được chia thành 5 nội dung chính:

3.1 Đánh giá tính chất nguyên liệu

  • Rutin nguyên liệu có độ ẩm trung bình xác định qua máy Sartorius là $w = 7,85%$. Phổ XRD của rutin nguyên liệu thể hiện các mũi nhiễu xạ sắc nhọn đặc trưng tại các góc $2\theta$ bằng 7,3°; 14,8°; 22,2° và 26,4°, hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu tinh thể rutin chuẩn. Phân tích HPLC chứng minh nguyên liệu có độ tinh khiết cao (>95%), hàm lượng rutin khan đạt trên 98% và lượng tạp chất phân hủy quercetin chiếm tỷ lệ không đáng kể.
  • Chitosan nguyên liệu có phân tử lượng trung bình xác định qua GPC đạt khoảng 150 kDa. Phổ FT-IR cho thấy các dải hấp thu đặc trưng của liên kết amide tại $1655\text{ cm}^{-1}$ và nhóm hydroxyl tại $3450\text{ cm}^{-1}$, tính toán được độ deacetyl hóa đạt $\text{DD} \approx 82%$. Giản đồ XRD của chitosan thể hiện mũi phản xạ bán tinh thể đặc trưng tại $2\theta \approx 20^\circ$.

3.2 Hệ huyền phù rutin hỗ trợ bởi chất hoạt động bề mặt

  • Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt: Khảo sát họ polyethylene glycol cho thấy PEG400 với tỷ lệ 0,1% thể hiện vai trò làm ướt và phân tán tốt nhất, ngăn ngừa hiện tượng vón cục hiệu quả hơn các loại PEGs có khối lượng phân tử cao. Đối với hệ sử dụng SSL, khi phối hợp SSL tỷ lệ 0,5% với 10% ethanol đóng vai trò tác nhân đồng dung môi, huyền phù rutin đạt độ phân tán ban đầu rất tốt.
  • Ảnh hưởng của thiết bị và điều kiện đồng hóa: Phân tán sơ bộ bằng máy Philips chỉ hạ kích thước hạt xuống mức micromet (vài chục $\mu\text{m}$). Thiết bị nghiền bi cao tốc (HSBM) sau 60 phút nghiền liên tục giúp giảm kích thước hạt của hệ rutin 5% xuống còn 995 nm, tuy nhiên sinh nhiệt lớn và có nguy cơ nhiễm tạp chất mài mòn từ bi sứ.
  • Đồng hóa áp suất cao APV 2000: Khi tăng áp suất đồng hóa từ 200 bar lên 400 bar và chạy 15 chu kỳ:
    • Hệ huyền phù rutin 5% hỗ trợ bởi 0,1% PEG400 giảm kích thước hạt trung bình về mức 220 nm. Giản đồ XRD cho thấy sau đồng hóa áp suất cao, rutin vẫn giữ được cấu trúc tinh thể nguyên vẹn (dạng nano crystal), không bị vô định hình hóa.
    • Hệ huyền phù rutin 5% hỗ trợ bởi 0,5% SSL và 10% ethanol qua 10 chu kỳ đồng hóa ở 400 bar đạt kích thước hạt trung bình 248 nm.

3.3 Hệ huyền phù rutin bao bọc bởi chitosan

  • Hệ rutin – PEG400 – chitosan không liên kết ngang: Bổ sung polymer chitosan nồng độ 0,2% giúp tăng độ nhớt môi trường và tạo lớp bảo vệ tĩnh điện bao quanh hạt rutin. Khi đồng hóa trên máy APV 2000 ở áp suất 700 bar qua 15 chu kỳ, kích thước hạt trung bình đạt 237 nm. Tuy nhiên, nếu không có liên kết ngang, màng chitosan mềm dễ bị trương nở và biến dạng khi lưu trữ kéo dài.
  • Hệ rutin bao bọc bởi chitosan có liên kết ngang ion bằng STPP: Khảo sát tỷ lệ khối lượng STPP : chitosan từ 1:2 đến 1:6 cho thấy tỷ lệ 1:4 (g/g) với nồng độ chitosan 0,2% ở áp suất đồng hóa 700 bar (15 chu kỳ) tạo ra hệ huyền phù có kích thước hạt đồng đều nhất, dao động từ 190 nm đến 230 nm. Lực tương tác tĩnh điện giữa các nhóm phosphate của STPP và nhóm amin của chitosan làm tăng độ cứng của màng matrix bao bọc.
  • Hệ rutin bao bọc bởi chitosan có liên kết ngang cộng hóa trị bằng glutaraldehyde: Khảo sát tỷ lệ glutaraldehyde : chitosan ở mức 1:10 (g/g) với nồng độ chitosan 0,2% ở 700 bar (15 chu kỳ) cũng cho kích thước tiểu phân đạt trong khoảng 190–230 nm. Mạng lưới liên kết chéo cộng hóa trị bền vững ngăn chặn hiện tượng kết tụ không thuận nghịch.

3.4 So sánh hiệu quả đồng hóa và độ bền sa lắng

  • Tác giả lập bảng so sánh hiệu quả đồng hóa của các phương pháp trên các hệ phân tán huyền phù rutin:
Tên hệ huyền phù Thành phần công thức chính Thiết bị & Điều kiện tối ưu Kích thước hạt trung bình (nm) Độ bền sa lắng sau 7 ngày ($H_t/H_0$)
PC Rutin 5% + PEG400 0,1% APV 2000, 400 bar, 15 chu kỳ 220 Sa lắng một phần (~0,65)
SE Rutin 5% + SSL 0,5% + Ethanol 10% APV 2000, 400 bar, 10 chu kỳ 248 Sa lắng một phần (~0,60)
P-HSBM Rutin 5% + PEG400 0,1% Nghiền bi cao tốc, 60 phút 995 Sa lắng nhanh sau 4 ngày
PCP Rutin 5% + PEG400 0,1% + Chitosan 0,2% + STPP (1:4) APV 2000, 700 bar, 15 chu kỳ 190–230 Bền vững ($H_t/H_0 \approx 0,98$)
PCG Rutin 5% + PEG400 0,1% + Chitosan 0,2% + Glutaraldehyde (1:10) APV 2000, 700 bar, 15 chu kỳ 190–230 Bền vững ($H_t/H_0 \approx 0,99$)
  • Khảo sát độ bền lưu trữ dài hạn chứng minh: cả hai hệ có liên kết ngang (hệ PCP dùng STPP và hệ PCG dùng glutaraldehyde) duy trì độ bền phân tán vượt trội, không có hiện tượng tách pha hay kết tụ hạt trong suốt thời gian theo dõi 6 tháng lưu trữ. Phân tích HPLC xác nhận hàm lượng hoạt chất rutin trong hệ huyền phù sau quá trình đồng hóa cao áp không bị phân hủy hay suy giảm đáng kể.

3.5 Tạo sản phẩm dạng bột và đánh giá tính chất

  • Hệ huyền phù nano rutin sau khi đồng hóa được chuyển sang dạng bột rắn bằng hai kỹ thuật: sấy đông khô (freeze drying) và sấy phun (spray drying).
  • Cả hai phương pháp đều tạo ra sản phẩm bột tơi mịn màu vàng sáng. Đo màu sắc ngoại quan CIE-LCh xác nhận giá trị độ sáng $L$ và góc màu $h$ duy trì ổn định đặc trưng cho rutin, không bị biến màu do oxy hóa.
  • Phân tích XRD và phổ FT-IR của bột nano rutin khẳng định hoạt chất vẫn bảo tồn khung cấu trúc hóa học và một phần trạng thái tinh thể nano. Ảnh chụp TEM và SEM cho thấy các hạt nano rutin dạng bột có hình thái đa giác hoặc hạt cầu phân bố đồng đều, được bao bọc tốt trong nền matrix chitosan.
  • Thử nghiệm khả năng tái phân tán (re-dispersibility) của bột nano rutin trong các môi trường đệm pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8 và pH 7,4 cho thấy: bột có khả năng tái phân tán tự nhiên nhanh chóng khi tiếp xúc với môi trường nước; kích thước hạt đo bằng LDS sau khi tái phân tán vẫn nằm trọn vẹn trong dải kích thước nanomet (dưới 500 nm), chứng minh màng polymer chitosan ngăn ngừa hiện tượng hạt kết dính không thuận nghịch trong quá trình làm khô.

Chương 4: Kết luận

Chương 4 đúc kết toàn bộ các kết quả định lượng đạt được của đề tài, khẳng định đã xây dựng thành công quy trình công nghệ tạo hệ nano rutin nồng độ cao 5% ở thể tích mẻ 300 g bằng thiết bị đồng hóa áp suất cao APV 2000. Đồng thời, chương này tóm tắt 4 đóng góp mới của luận án về mặt học thuật và thực tiễn kỹ thuật.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

  1. Xác lập được cơ chế và điều kiện ổn định hóa hệ huyền phù nano rutin ở nồng độ cao (5%) – mức nồng độ trước đây thường gây tắc nghẽn thiết bị và kết tụ hạt – bằng cách kết hợp cơ chế làm ướt của chất hoạt động bề mặt PEG400 hoặc hệ SSL/ethanol với cơ chế cản trở không gian và tương tác tĩnh điện của polymer chitosan.
  2. Chứng minh thực nghiệm việc ứng dụng phản ứng tạo liên kết ngang ion (với STPP ở tỷ lệ khối lượng STPP : chitosan là 1:4) và liên kết ngang cộng hóa trị (với glutaraldehyde ở tỷ lệ 1:10) làm tăng độ cứng của màng matrix chitosan bao bọc tinh thể nano rutin, kiểm soát kích thước hạt tiểu phân ổn định trong dải 190–230 nm và ngăn chặn hiện tượng sa lắng suốt 6 tháng lưu trữ.
  3. Làm sáng tỏ tính chất tinh thể học và hành vi hóa keo của tinh thể nano rutin qua các quá trình đồng hóa áp suất cao, sấy đông khô và sấy phun: hoạt chất duy trì được cấu trúc tinh thể nano đặc trưng (chứng minh qua XRD) mà không bị phân hủy thành các hợp chất thứ cấp như quercetin (chứng minh qua HPLC).

Các đóng góp mới về mặt thực tiễn và kỹ thuật

  1. Nâng cao quy mô điều chế trong phòng thí nghiệm lên mức 300 g/mẻ, vượt trội so với quy mô 40 ml của các nghiên cứu nước ngoài trước đó, tạo tiền đề kỹ thuật khả thi cho việc mở rộng sản xuất ở quy mô pilot và công nghiệp.
  2. Giảm thiểu áp suất vận hành đồng hóa xuống mức 400 bar (đối với hệ PEG400, SSL) và 700 bar (đối với hệ chitosan liên kết ngang), thấp hơn đáng kể so với áp suất 1500 bar của các quy trình truyền thống, giúp tiết kiệm năng lượng tiêu thụ và kéo dài tuổi thọ của van đồng hóa.
  3. Chế tạo thành công sản phẩm bột nano rutin tơi xốp bằng kỹ thuật sấy phun và sấy đông khô, có khả năng tái phân tán hoàn toàn trong môi trường nước và dịch sinh học mô phỏng (pH 1,2 đến 7,4), giải quyết triệt để vấn đề bảo quản dài hạn và đa dạng hóa dạng bào chế cho ngành thực phẩm chức năng.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Ứng dụng quy trình công nghệ đồng hóa áp suất cao kết hợp màng bao chitosan – STPP để sản xuất các dạng thực phẩm chức năng bảo vệ thành mạch, hỗ trợ điều trị suy giãn tĩnh mạch hoặc các sản phẩm chống oxy hóa dạng bột hòa tan, viên nén, viên nang.
  • Nghiên cứu thay thế hoàn toàn glutaraldehyde bằng các tác nhân tạo liên kết ngang sinh học an toàn hơn (như genipin hoặc natri tripolyphosphate) trong các sản phẩm dùng cho đường uống nhằm triệt tiêu hoàn toàn nguy cơ tồn dư dung môi độc hại.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Luận án mới dừng lại ở quy mô chế tạo phòng thí nghiệm (mỗi mẻ 300 g), chưa tiến hành thực nghiệm sản xuất liên tục ở quy mô pilot hoặc quy mô công nghiệp để đánh giá các thông số kinh tế - kỹ thuật và dòng nhiệt/khối lượng.
  • Các đánh giá sinh dược học mới tập trung vào khả năng tái phân tán và đo kích thước hạt trong môi trường đệm mô phỏng pH đường tiêu hóa; luận án chưa thực hiện thử nghiệm động học giải phóng hoạt chất in vitro theo thời gian (dissolution profile) bằng thiết bị hòa tan chuyên dụng của Dược điển.
  • Chưa triển khai các thử nghiệm sinh khả dụng in vivo trên động vật thực nghiệm (chuột hoặc thỏ) để định lượng nồng độ rutin trong huyết tương và xác định các thông số dược động học lâm sàng ($C_{\max}$, $T_{\max}$, AUC).

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô công nghệ từ 300 g/mẻ lên quy mô bán công nghiệp (pilot) sử dụng các dòng máy đồng hóa cao áp công nghiệp liên tục.
  • Tiến hành thử nghiệm giải phóng in vitro theo thời gian trong môi trường dịch dạ dày và dịch ruột nhân tạo để mô hình hóa cơ chế khuếch tán hoạt chất qua màng chitosan liên kết ngang.
  • Thực hiện thử nghiệm in vivo đánh giá sinh khả dụng và độc tính bán trường diễn của bột nano rutin trên mô hình động vật trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng.
  • Ứng dụng bột nano rutin để phối chế cụ thể vào các dạng sản phẩm thương mại như viên sủi, viên nang mềm hoặc nhũ tương mỹ phẩm chăm sóc da.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị ứng dụng cao cho nhiều nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh và học viên cao học: Luận án cung cấp một quy trình mẫu mực về nghiên cứu thực nghiệm trong kỹ thuật hóa học và công nghệ nano dược phẩm, kết hợp chặt chẽ giữa các kỹ thuật chế tạo cơ lý (đồng hóa cao áp, nghiền bi) và các phương pháp phân tích cấu trúc hiện đại (LDS, XRD, FT-IR, HPLC, FE-SEM, TEM). Phần Chương 2 và Chương 3 đáng tham khảo về cách thiết kế thí nghiệm khảo sát đa yếu tố (loại phụ gia, nồng độ, áp suất, số chu kỳ đồng hóa).
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu: Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho các bài giảng về Công nghệ nano sinh học, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm và Hóa keo. Phần phân tích động học sa lắng theo định luật Stokes và thuyết chuyển động Brown cung cấp luận cứ lý thuyết vững chắc cho việc làm bền hệ phân tán.
  • Kỹ sư R&D và doanh nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng: Luận án cung cấp các thông số công nghệ cụ thể (tỷ lệ PEG400 0,1%, chitosan 0,2%, STPP : chitosan 1:4; áp suất đồng hóa 400–700 bar; số chu kỳ 10–15) có thể ứng dụng trực tiếp để chuyển giao công nghệ nâng cao độ tan cho các hoạt chất tự nhiên kém tan khác thuộc nhóm flavonoid (như quercetin, curcumin, luteolin).

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao luận án lựa chọn kích thước hạt nano rutin trong khoảng 200–600 nm mà không hạ kích thước xuống dưới 100 nm?

Theo khung phân loại độc tính của Rainer H. Müller và cộng sự (2011) được trích dẫn trong Chương 1, các hạt nano hữu cơ có kích thước dưới 100 nm có nguy cơ cao xảy ra hiện tượng nội thực bào (endocytosis) không kiểm soát qua màng tế bào lành, gây độc tính sinh học tiềm tàng. Vùng kích thước trên 100 nm (đặc biệt trong dải 200–600 nm) được xác định là vùng cận dưới an toàn đối với các hạt nano hữu cơ, vừa đảm bảo diện tích bề mặt riêng lớn để tăng vượt bậc độ tan và tốc độ hòa tan, vừa an toàn cho cơ thể khi hấp thu qua đường tiêu hóa.

2. Sự khác biệt về hiệu quả giảm kích thước hạt giữa phương pháp nghiền bi cao tốc (HSBM) và đồng hóa áp suất cao (APV 2000) là gì?

Thực nghiệm ở Mục 3.2 và 3.4 chứng minh: máy nghiền bi cao tốc sau 60 phút hoạt động chỉ hạ được kích thước hạt của hệ rutin 5% xuống mức 995 nm, đồng thời hạt dễ bị sa lắng nhanh sau 4 ngày và có nguy cơ nhiễm bẩn do ma sát mài mòn bi sứ. Trong khi đó, máy đồng hóa cao áp APV 2000 vận hành ở 400 bar qua 15 chu kỳ đã hạ kích thước hạt xuống 220 nm (với PEG400) và 248 nm (với SSL/ethanol), tạo ra dòng chảy hỗn loạn và lực xâm thực mạnh mà không gây nhiễm tạp chất.

3. Tác nhân tạo liên kết ngang STPP và glutaraldehyde đóng vai trò kỹ thuật gì trong việc ổn định hệ huyền phù nano rutin?

Khi hạt nano rutin được bao bọc bởi chitosan, màng chitosan tự do có tính trương nở mạnh và cơ tính yếu. Khi bổ sung STPP (tỷ lệ 1:4 g/g so với chitosan) tạo liên kết ngang ion giữa nhóm phosphate âm và amin dương, hoặc glutaraldehyde (tỷ lệ 1:10 g/g) tạo liên kết ngang cộng hóa trị imine, độ cứng của màng matrix polymer tăng lên rõ rệt. Lớp màng liên kết ngang này ngăn ngừa hiện tượng các hạt nano kết tụ tự phát lại với nhau, giữ kích thước hạt ổn định ở mức 190–230 nm và duy trì hệ không bị sa lắng suốt 6 tháng bảo quản.

4. Bột nano rutin sấy khô có giữ được cấu trúc tinh thể và khả năng phân tán trong các môi trường pH khác nhau không?

Kết quả phân tích XRD và phổ FT-IR tại Mục 3.5 khẳng định sản phẩm bột nano rutin sau khi sấy phun và sấy đông khô vẫn duy trì trạng thái tinh thể nano nguyên vẹn của rutin và không làm thay đổi các nhóm chức hóa học. Khi phân tán lại vào các môi trường đệm pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8 và pH 7,4 (mô phỏng từ dạ dày đến ruột non và máu), bột tái phân tán hoàn toàn thành hệ huyền phù có kích thước hạt vẫn nằm trong vùng kích thước nanomet (dưới 500 nm), chứng minh hiệu quả bảo vệ của lớp đệm polymer chitosan trong suốt quá trình khử nước.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Phan Nguyễn Quỳnh Anh đã giải quyết thành công bài toán công nghệ chế tạo hệ phân tán nano rutin nồng độ cao 5% ở thể tích 300 g/mẻ, khắc phục nhược điểm kém tan của hoạt chất tự nhiên từ hoa hòe. Bằng việc ứng dụng thiết bị đồng hóa áp suất cao APV 2000 ở mức áp suất hợp lý 400–700 bar kết hợp chất diện hoạt PEG400 và màng bọc chitosan có liên kết ngang STPP hoặc glutaraldehyde, hệ nano đạt kích thước hạt tối ưu 190–248 nm và độ bền sa lắng kéo dài 6 tháng. Sản phẩm bột rắn thu được từ phương pháp sấy phun và đông khô có khả năng tái phân tán tốt trong môi trường pH mô phỏng đường tiêu hóa, cung cấp cơ sở kỹ thuật thực nghiệm vững chắc cho việc phát triển các dạng thực phẩm chức năng và dược phẩm sinh khả dụng cao từ nguồn dược liệu Việt Nam.