MỞ ĐẦU Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao và được nuôi phổ biến ở hơn 22 quốc gia trên thế giới như Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ…Tại Việt Nam, nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ, với trên 600.000 ha diện tích nuôi, sản lượng mỗi năm đạt khoảng 300. Theo thông tin của Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu tôm tăng trưởng mạnh trong năm 2017, kim ngạch đạt 3,85 tỷ USD, tăng 22,3% so với năm 2016. Ở Việt Nam, tôm sú là đối tượng quan trọng thứ hai sau tôm thẻ chân trắng, với kim ngạch xuất khẩu chiếm khoảng 1/3 kim ngạch xuất khẩu về tôm nước lợ. Nghề nuôi tôm sú có ưu thế lớn là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, đóng góp quan trọng vào vấn đề an toàn lương thực, xóa đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước nhưng đang đối mặt với nhiều thách thức và có xu hướng giảm dần.
Nguyên nhân chính của hiện tượng này là không chủ động được tôm bố mẹ do khai thác từ tự nhiên và các loại dịch bệnh tràn lan gây chết tôm hàng loạt. Nếu như trước năm 2003, đối tượng tôm nuôi chủ yếu ở châu Á là tôm sú, chiếm tới 80% thị phần trên toàn thể giới, thì từ năm 2004, tôm thẻ chân trắng từ châu Mỹ tràn sang với lợi thế là chủ động được tôm bố mẹ, tạo được đàn tôm giống sạch bệnh đã lấn át dần tôm sú. Tại Thái Lan, tỷ lệ phần trăm giữa tôm sú/tôm thẻ chân trắng năm 2003 là 60/40, thì đến nay chỉ còn khoảng 1/99. Chiến lược phát triển lâu dài của các nước còn diện tích nuôi tôm sú trong đó có Việt Nam là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường sinh thái.
Nền tảng cho chiến lược phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục 1 đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng. Nghiên cứu hệ gen tôm sú sẽ cung cấp thông tin chính xác cho việc xác định các tính trạng quan trọng như: tính trạng tăng trưởng, tính kháng bệnh, tính chống chịu với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến chất lượng tôm. Do kích thước hệ gen tôm sú khá lớn, ước tính khoảng 2,17 Gb, nên việc giải mã toàn bộ hệ gen tôm sú đòi hỏi thời gian và tốn nhiều kinh phí.
Vì vậy, để có thể từng bước khai thác các thông tin cần thiết từ hệ gen tôm sú, đặc biệt là khai thác các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống thì việc giải trình tự và phân tích hệ gen phiên mãvới phương pháp xác định trình tự gen thế hệ mới NGS (Next generation sequencing), chú giải chức năng gen và sàng lọc các chỉ thị phân tử liên quan tới các tính trạng quan trọng như tăng trưởng nhanh, chống chịu bệnh tốt.để phục vụ công tác chọn giốnglà cách tiếp cận hợp lý và khả thi. Với những luận cứ nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ gen phiên mã (Transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống”. Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Mục tiêu chung: Nghiên cứu phân tích hệ gen phiên mã của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống.
Mục tiêu cụ thể: 2 - Giải mã hệ gen phiên mã (transcriptome) từ 4 mô (mô cơ, môt tim, mô gan tụy, mô gốc mắt) của tôm sú (Penaeus monodon), thiết lập cơ sở dữ liệu hệ phiên mã phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Sàng lọc các gen giả định liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. - Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã. - Xác định bộ SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú.
PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Thu nhận mẫu tôm sú gia hóa và tôm sú tự nhiên từ vùng biển Việt Nam. - Kiểm tra, đánh giá, sàng lọc để lựa chọn các mẫu tôm sú không bị nhiễm một số bệnh nguy hiểm theo tổ chức sức khỏe động vật thế giới (World Organisation for Animal health – OIE) như bệnh đốm trắng (WSSV), hoại tử gan tụy cấp (IHHNV), đầu vàng (YHV), bệnh còi (MBV) và bệnh taura(TSV). - Tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tạo thư viện cDNA cho 4 mô (gan tụy, tim, cơ và gốc mắt). - Giải trình tự gen hệ phiên mã transcriptome từ 4 mô của tôm sú, phân tích và đánh giá chất lượng dữ liệu thu nhận được.
- Xây dựng cơ sở dữ liệu transcriptome tôm sú Việt Nam. - Sàng lọc các gen giả định từ hệ phiên mã liên quan đến tính trạng tăng trưởng. - Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã. - Xác định các SNP từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã liên quan đến tính trạng tăng trưởng.
3 - Xác định các SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Lần đầu tiên ở Việt Nam xây dựng được Cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên (http://www.vn)trên cơ cở giải mã và phân tích 04 mô (cơ, gan tụy, tim và gốc mắt). Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo ở tôm sú nuôi và tôm sú tự nhiên thu tại vùng biển Việt Nam. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Ý nghĩa khoa học Các thông tin khoa học về hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên thu tại vùng biển Việt Nam có nghĩa khoa học lớn đối với các nghiên cứu tiếp theo về tôm sú.
Kết quả khoa học nghiên cứu này (bài báo đăng trên tạp chí quốc tế Aquaculture) đã được hàng trăm công trình đọc, trích dẫn và các tác giả đã được mời báo cáo tham luận tại các hội nghị quốc tế về nuôi trồng thủy sản. Ý nghĩa thực tiễn Luận án tạo được cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã ở tôm sú tự nhiên và bước đầu phân tích hệ gen phiên mã tôm sú tăng trưởng nhanh và chậm, tìm kiếm các chỉ thị phân tử SNP chỉ có ở tôm tăng trưởng nhanh với mục tiêu có được bộ chỉ thị phân tử chất lượng để phát triển các chip sử dụng trong nghiên cứu tạo giống tôm sú bố mẹ sạch bệnh, sức sinh sản cao, tăng trưởng tốt bằng công nghệ “Nghiên cứu tương quan toàn phần hệ gen” (GWAS, Genome Wide Association Study). T TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TÔM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM SÚ Ở VIỆT T NAM 1.
Giới thiệu về tôm sú Tôm sú là mộtt trong các loài tôm nuôi quan trọng tr thuộcc hhọ Penaeidae, (Holthuis, 1980; Thái Trần và được phân loại(Holthuis, Tr Bái, 2013)như sau:: Ngành: Arthropoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Bộ: Decapoda (Mười (Mư chân) Họ: Penaeidae (Tôm he) Chi: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên tiếng ng Anh: Black Tiger Shrimp Tên địaa phương: Tôm Sú Hình 1.1: Tôm sú thu đư được từ vùng biển Nghệ An, Việtt Nam. Về đặc điểm sinh học, h tôm sú là loài sống ở nơi chấtt đáy bùn pha với v cát n 40 m nước ở độ sâu ven bờ đến nư và độ mặn từ 5 – 34‰. Tôm sú sinh trư trưởng nhanh, trong 3 – 4 tháng có th thể đạt cỡ trung bình 40 – 50 g. Tôm sú thu thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước th lớn hơn con đực ở cùng đđộ tuổi.
Tôm 5 trưởng thành tối đa với con cái có chiều dài từ 220 – 250 mm, trọng lượng đạt từ 100 – 300 g, con đực dài từ 160 – 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 – 200 g. Tôm có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ và giáp xác. Về mặt phân bố, ở nước ta tôm sú phân bố từ Bắc vào Nam, vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ (Nguyễn Văn Chung và Phạm Thị Dự, 1995; Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009). Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích thước và trọng lượng.
Sau mỗi lần lột xác, tôm sú tăng trưởng về chiều dài và trọng lượng trung bình từ 10-15% so với trước khi lột xác. Quá trình này tùy thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và các giai đoạn phát triển của cá thể (Nguyễn Văn Chung và Phạm Thị Dự, 1995; Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009). Trong tự nhiên, tôm sú sống trong môi trường nước mặn, tới mùa sinh sản chúng tiến vào gần bờ đẻ trứng. Có hai đặc điểm cần chú ý trong vòng đời tôm sú: tăng trưởng ở giai đoạn hậu ấu trùng xảy ra ở vùng cửa sông (đặc trưng bởi vùng nước lợ); sự thành thục sinh dục, kết cặp xảy ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối dao động từ 28-34 ‰ và ổn định.
Sau khi trứng tôm sú được đẻ 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-280C sẽ nở thành ấu trùng. Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các vùng nước lợ. Trong môi trường này, ấu trùng (larvae) chuyển sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) rồi tôm giống (juvenile) và bơi ra biển tiếp tục chu trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản của chúng (Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009). Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và Việt Nam 1.
Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới Tổng quan lịch sử phát triển của ngành nuôi tôm, có hai đối tượng quan trọng là: tôm sú - bắt đầu từ các nước châu Á, ngay đầu những năm của thập niên 80 và tôm he Nam Mỹ - từ những năm giữa thập niên 80. Ngành nuôi tôm sú của thế giới phát triển nhanh chóng vào cuối những năm 1980 đến đầu những năm 2000 với sản lượng cao nhất là 700.000 tấn vào năm 2003 (Aziz và cs. Ở Châu Á, nghề nuôi tôm đã có từ lâu với mô hình nuôi truyền thống, năng suất thấp và chỉ tiêu thụ nội địa.