Xây Dựng Phương Pháp Xác Định Methadon Trong Máu Và Nước Tiểu Bằng GC-MS

Nghiên cứu phương pháp GC-MS xác định methadon trong máu và nước tiểu. Luận văn dược sĩ phân tích định lượng methadon, ứng dụng trong pháp y và kiểm nghiệm.

• Tác giả: Đỗ Thị Hương
• Người hướng dẫn: TS. Trần Nguyên Hà
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Sĩ
• Đề tài: Xây Dựng Phương Pháp Xác Định Methadon Trong Máu Và Nước Tiểu Bằng GC-MS
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Tổng quan về methadon
• 1.2. Công thức và danh pháp
• 1.3. Dược động học
• 1.4. Dược lực học
• 1.5. Tác dụng dược lý và độc tính
• 1.6. Chất chuẩn nội
• 1.7. Tổng quan về xử lý mẫu khi phân tích thuốc trong dịch sinh học
• 1.7.1. Kết tủa protein
• 1.7.2. Phương pháp chiết lỏng-lỏng (LLE)
• 1.7.3. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
• 1.8. Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS)
• 1.8.1. Hệ thống GC-MS
• 1.8.2. Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới
• 1.9. Các phương pháp xác định MTD
• 1.9.1. Sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)
• 1.9.2. Sắc ký khí khối phổ (GC-MS)
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị
• 2.3. Hóa chất, thuốc thử
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.4.1. Xây dựng phương pháp xác định methadon
• 2.4.2. Ứng dụng phân tích methadon trong mẫu thực
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Chuẩn bị mẫu
• 2.5.2. Lựa chọn điều kiện sắc kí và chất chuẩn nội
• 2.5.3. Áp dụng phương pháp chiết LLE để xử lý mẫu
• 2.5.4. Thẩm định phương pháp phân tích
• 2.5.5. Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế
• 2.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
• 3.1. Xây dựng phương pháp xác định MTD trong dịch sinh học bằng GC-MS
• 3.2. Khảo sát phổ khối của methadon và chuẩn nội diphenylamin
• 3.3. Thiết lập chương trình GC-MS xác định methadon
• 3.4. Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu
• 3.4.1. Khảo sát dung môi chiết
• 3.4.2. Quy trình xử lý mẫu
• 3.5. Thẩm định phương pháp
• 3.5.1. Tính phù hợp hệ thống sắc ký
• 3.5.2. Tính chọn lọc – đặc hiệu
• 3.5.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
• 3.5.4. Khoảng tuyến tính
• 3.5.5. Độ đúng và độ lặp lại của phương pháp
• 3.5.6. Đánh giá hiệu suất chiết
• 3.6. Áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tóm tắt

I. GC MS Methadon Tổng quan và ứng dụng năm 2024 55 ký tự

Nghiên cứu GC-MS định lượng Methadon trong máu và nước tiểu là một lĩnh vực quan trọng trong dược lâm sàng và độc chất học. Methadon được sử dụng rộng rãi trong điều trị thay thế nghiện opioid, và việc xác định Methadon chính xác là rất cần thiết để theo dõi điều trị và phát hiện lạm dụng. Luận văn dược 2024 này tập trung vào việc xây dựng và validation phương pháp GC-MS để định lượng Methadon trong các mẫu sinh học, góp phần nâng cao chất lượng phân tích và hỗ trợ quyết định lâm sàng hiệu quả. Các phương pháp truyền thống như immunoassay hoặc HPLC có thể không đủ độ nhạy hoặc độ đặc hiệu, khiến GC-MS trở thành lựa chọn ưu tiên trong nhiều trường hợp. Nghiên cứu này cũng giải quyết các thách thức liên quan đến extraction Methadon từ nền mẫu phức tạp như máu và nước tiểu.

1.1. Tầm quan trọng của định lượng Methadon bằng GC MS

Việc định lượng Methadon chính xác bằng GC-MS đóng vai trò then chốt trong việc theo dõi nồng độ thuốc trong quá trình điều trị, đảm bảo tuân thủ điều trị và phát hiện sớm các dấu hiệu quá liều hoặc lạm dụng. Theo tài liệu gốc, việc xác định phương pháp để phát hiện MTD trong cơ thể người rất quan trọng để kiểm soát vấn đề ma túy và chẩn đoán, điều trị ngộ độc. Kết quả định lượng chính xác cũng hỗ trợ các bác sĩ trong việc điều chỉnh liều lượng phù hợp cho từng bệnh nhân, tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Các phương pháp khác có thể bị ảnh hưởng bởi các chất can thiệp, ảnh hưởng đến độ chính xác.

1.2. Thách thức trong phân tích Methadon trong mẫu sinh học

Phân tích Methadon trong máu và nước tiểu đối mặt với nhiều thách thức do nền mẫu phức tạp và nồng độ Methadon thường rất thấp. Các thành phần nội sinh trong máu và nước tiểu có thể gây nhiễu, ảnh hưởng đến độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp. Bên cạnh đó, extraction Methadon từ mẫu sinh học đòi hỏi quy trình phức tạp để loại bỏ các chất gây nhiễu và đảm bảo thu hồi Methadon tối ưu. Theo tài liệu, mẫu phân tích là dịch sinh học có nền mẫu phức tạp, việc sử dụng chất chuẩn nội là cần thiết. Việc sử dụng các kỹ thuật tiền xử lý mẫu như chiết lỏng-lỏng (LLE) hoặc chiết pha rắn (SPE) là rất quan trọng.

II. Cách xây dựng phương pháp GC MS định lượng Methadon 58 ký tự

Xây dựng một phương pháp GC-MS hiệu quả để định lượng Methadon đòi hỏi sự tối ưu hóa nhiều yếu tố, bao gồm chuẩn bị mẫu, lựa chọn cột sắc ký, chương trình nhiệt độ, và chế độ phát hiện khối phổ. Validation phương pháp GC-MS là bước quan trọng để đảm bảo độ tin cậy và độ chính xác của kết quả. Các thông số cần được đánh giá bao gồm độ tin cậy GC-MS, độ chính xác GC-MS, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), và khoảng tuyến tính. Việc sử dụng chuẩn nội (internal standard) là cần thiết để kiểm soát sự biến thiên trong quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích. Theo tài liệu, chuẩn bị mẫu là một phần quan trọng của phương pháp phân tích và giúp giảm độ phức tạp của mẫu sinh học.

2.1. Lựa chọn chất chuẩn nội và dung môi chiết phù hợp

Việc lựa chọn chuẩn nội (internal standard) đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp. Chuẩn nội nên có cấu trúc tương tự Methadon và thời gian lưu gần nhau trên cột sắc ký. Các dung môi chiết như ethyl acetat, diclorometan,… cần được lựa chọn cẩn thận để đảm bảo hiệu quả extraction Methadon tối ưu và giảm thiểu sự chiết các chất gây nhiễu. Dữ liệu từ tài liệu cho thấy dung môi chiết cần được khảo sát kỹ lưỡng. Việc chọn đúng dung môi giúp tăng hiệu suất chiết và loại bỏ các chất gây nhiễu.

2.2. Tối ưu hóa chương trình GC MS và chế độ phát hiện

Chương trình nhiệt độ của sắc ký khí và chế độ phát hiện của khối phổ cần được tối ưu hóa để đạt được độ phân giải tốt và độ nhạy cao. Chế độ SIM (Single-ion Monitoring) thường được sử dụng để tăng cường độ nhạy cho Methadon. Các ion đặc trưng của Methadon và chuẩn nội cần được lựa chọn cẩn thận để đảm bảo độ đặc hiệu. Theo tài liệu gốc, thiết lập chương trình GC-MS xác định Methadon là một bước quan trọng trong quá trình xây dựng phương pháp.

2.3 Áp dụng phương pháp chiết LLE để xử lý mẫu

Việc áp dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng (LLE) để xử lý mẫu là một bước quan trọng để loại bỏ các chất gây nhiễu và tăng độ tinh khiết của mẫu trước khi đưa vào máy GC-MS. Cần tối ưu hóa các thông số như dung môi chiết, pH, và thời gian chiết để đạt hiệu quả chiết cao nhất. LLE là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất hoà tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn, có thể giúp loại bỏ các protein và lipid, tăng độ tinh khiết cho quá trình phân tích Methadon.

III. Validation GC MS Đảm bảo độ tin cậy định lượng 59 ký tự

Validation phương pháp GC-MS là quá trình chứng minh rằng phương pháp phân tích đáp ứng các tiêu chí chất lượng đã được xác định trước. Điều này bao gồm đánh giá độ tin cậy GC-MS, độ chính xác GC-MS, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, và độ lặp lại. Kết quả validation phải đáp ứng các tiêu chuẩn chấp nhận được để đảm bảo rằng kết quả định lượng Methadon là đáng tin cậy và có thể sử dụng trong các quyết định lâm sàng hoặc pháp y. Bảng 7 trong tài liệu có thể cung cấp dữ liệu về kết quả khảo sát độ đúng và độ lặp lại của phương pháp.

3.1. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của Methadon có thể được phát hiện một cách đáng tin cậy, trong khi giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất có thể được định lượng một cách chính xác và đáng tin cậy. Việc xác định LOD và LOQ là rất quan trọng để đánh giá khả năng của phương pháp trong việc phát hiện và định lượng Methadon ở nồng độ thấp. Theo tài liệu, Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của chất phân tích cần được xác định trong quá trình thẩm định phương pháp.

3.2. Đánh giá độ đúng Accuracy và độ lặp lại Precision

Độ đúng (Accuracy) đo lường sự gần gũi giữa kết quả phân tích và giá trị thực của Methadon, trong khi độ lặp lại (Precision) đo lường sự biến thiên giữa các kết quả phân tích khi thực hiện nhiều lần trên cùng một mẫu. Cả hai thông số này đều quan trọng để đánh giá độ tin cậy của phương pháp. Độ đúng và độ lặp lại thường được biểu thị bằng phần trăm thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối (RSD), theo tài liệu gốc. Việc đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng phân tích.

IV. Ứng dụng GC MS định lượng Methadon trong thực tế 57 ký tự

Phương pháp GC-MS định lượng Methadon đã được xây dựng và validation có thể được ứng dụng để phân tích các mẫu thực tế từ bệnh nhân điều trị thay thế nghiện opioid hoặc từ các trường hợp nghi ngờ ngộ độc Methadon. Kết quả phân tích có thể được sử dụng để theo dõi tuân thủ điều trị, điều chỉnh liều lượng, và hỗ trợ chẩn đoán và điều trị ngộ độc. Việc so sánh kết quả với các phương pháp khác như LC-MS/MS hoặc immunoassay cũng có thể cung cấp thông tin hữu ích về độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp. Theo tài liệu gốc, ứng dụng phương pháp trong phân tích các mẫu thực tế là một mục tiêu quan trọng của nghiên cứu.

4.1. Phân tích mẫu máu và nước tiểu từ bệnh nhân điều trị Methadon

Việc phân tích mẫu máu và nước tiểu từ bệnh nhân điều trị Methadon giúp theo dõi nồng độ thuốc trong cơ thể, đánh giá tuân thủ điều trị, và phát hiện sớm các dấu hiệu quá liều hoặc lạm dụng. Kết quả phân tích có thể được sử dụng để điều chỉnh liều lượng Methadon phù hợp cho từng bệnh nhân, tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Việc theo dõi thường xuyên giúp đảm bảo an toàn và hiệu quả điều trị.

4.2. Hỗ trợ chẩn đoán và điều trị ngộ độc Methadon

Trong trường hợp nghi ngờ ngộ độc Methadon, việc định lượng nhanh chóng và chính xác nồng độ Methadon trong máu và nước tiểu là rất quan trọng để hỗ trợ chẩn đoán và điều trị. Kết quả phân tích có thể giúp xác định mức độ ngộ độc và hướng dẫn các biện pháp điều trị thích hợp, như sử dụng naloxone để đảo ngược tác dụng của opioid. Phân tích nhanh chóng và chính xác có thể cứu sống bệnh nhân.

V. GC MS Methadon 2024 Tiềm năng và hướng phát triển 58 ký tự

Nghiên cứu về GC-MS định lượng Methadon trong luận văn dược 2024 đã đóng góp vào việc nâng cao năng lực phân tích và hỗ trợ các quyết định lâm sàng liên quan đến Methadon. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều tiềm năng để phát triển và cải tiến phương pháp, bao gồm việc sử dụng các cột sắc ký mới, tối ưu hóa chương trình nhiệt độ, và kết hợp với các kỹ thuật tiền xử lý mẫu tiên tiến hơn. Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các phương pháp GC-MS nhanh chóng, chính xác và dễ sử dụng hơn, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của các phòng thí nghiệm lâm sàng và pháp y. Việc áp dụng kỹ thuật khối phổ độ phân giải cao (HRMS) cũng có thể tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp.

5.1. Phát triển các phương pháp GC MS nhanh chóng và dễ sử dụng

Nhu cầu về các phương pháp GC-MS nhanh chóng và dễ sử dụng ngày càng tăng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng và pháp y. Việc phát triển các quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản hơn, thời gian phân tích ngắn hơn, và phần mềm xử lý dữ liệu thân thiện hơn có thể giúp giảm chi phí và tăng hiệu quả phân tích. Các phương pháp tự động hóa cũng có thể giúp giảm thiểu sai sót và tăng tính lặp lại.

5.2. Kết hợp GC MS với các kỹ thuật tiền xử lý mẫu tiên tiến

Việc kết hợp GC-MS với các kỹ thuật tiền xử lý mẫu tiên tiến như chiết pha rắn vi mô (SPME) hoặc chiết lỏng-lỏng phân tán (DLLME) có thể cải thiện đáng kể hiệu quả extraction Methadon và giảm thiểu sự chiết các chất gây nhiễu. Các kỹ thuật này có thể giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp, đồng thời giảm lượng dung môi sử dụng và giảm thiểu tác động đến môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Methadon (MTD) là một chất đồng vận toàn phần trên thụ thể $\mu$-opioid tổng hợp, được ứng dụng rộng rãi trong các chương trình điều trị thay thế nghiện các chất dạng thuốc phiện (opioids). Tại Việt Nam, chương trình điều trị thay thế bằng MTD đã được nghiên cứu từ năm 1996, triển khai thí điểm tại Hải Phòng và Thành phố Hồ Chí Minh từ năm 2008, sau đó mở rộng ra nhiều tỉnh thành nhằm hỗ trợ người nghiện cắt cơn, hạn chế lây nhiễm HIV và giảm thiểu tệ nạn xã hội. MTD thuộc danh mục kiểm soát của Công ước quốc tế năm 1961, Danh mục II theo Nghị định số 57/2022/NĐ-CP của Chính phủ và thuộc danh mục thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) từ năm 2005.

Mặc dù có hiệu quả điều trị cao, MTD có khoảng trị liệu hẹp và dược động học biến thiên lớn giữa các cá thể. Nồng độ điều trị thông thường trong máu dao động từ 30 đến 750 ng/ml; tuy nhiên, ngưỡng nồng độ gây độc có thể xuất hiện từ 240 đến 1000 ng/ml tùy theo mức độ dung nạp. Đối với người chưa từng sử dụng opioids hoặc trẻ em, liều gây độc có thể chỉ từ 10 đến 50 mg, dẫn tới các biến chứng ức chế hô hấp, ngưng thở, phù phổi và tử vong do thiếu oxy. Trong thực tiễn y tế và pháp y, việc sử dụng nhầm lẫn, quá liều hoặc lạm dụng MTD đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát hiện và định lượng chính xác chất này trong dịch sinh học để phục vụ cấp cứu, giám sát điều trị và giám định pháp y độc chất.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu công bố về phương pháp xác định MTD trong dịch sinh học còn rất hạn chế, chủ yếu sử dụng đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID) với độ nhạy và tính đặc hiệu chưa cao so với yêu cầu phân tích lượng vết. Trên cơ sở đó, đề tài "Xây dựng phương pháp xác định methadon trong máu và nước tiểu bằng GC-MS" được thực hiện tại Khoa Độc chất – Viện Pháp y Quốc gia nhằm giải quyết hai mục tiêu cụ thể:

1. Xây dựng phương pháp xác định MTD trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS).
2. Ứng dụng phương pháp trong phân tích các mẫu thực tế.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Methadon (dạng base và muối hydroclorid) cùng chất chuẩn nội diphenylamin (DPA).
• Mẫu nghiên cứu: Nền mẫu dịch sinh học không chứa chất phân tích (mẫu máu trắng và nước tiểu trắng) dùng để khảo sát, tối ưu hóa và thẩm định phương pháp; các mẫu máu và nước tiểu thu thập từ bệnh nhân/nạn nhân nghi ngờ ngộ độc MTD gửi tới giám định.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Khoa Độc chất – Viện Pháp y Quốc gia phối hợp với Trường Đại học Dược Hà Nội, hoàn thành vào năm 2024.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và nguyên lý kỹ thuật

• Đặc tính lý hóa và dược động học của Methadon: MTD ($C_{21}H_{27}NO$, khối lượng phân tử 309,45; dạng muối $C_{21}H_{27}NO.HCl$, khối lượng phân tử 345,91) là một base yếu có $pK_a = 9,2$ (dạng base) và $pK_a = 8,25$ (dạng muối). Thuốc tan nhiều trong dung môi hữu cơ và ít tan trong nước khi ở dạng phân tử. MTD liên kết mạnh với protein huyết tương (85%–90%), chuyển hóa chủ yếu tại gan qua hệ enzym Cytochrome P450 (chủ yếu là CYP2B6, CYP3A4) tạo thành hai chất chuyển hóa chính không có hoạt tính là EDDP và EMDP. Thải trừ qua thận chiếm 20%–50% dưới dạng MTD nguyên vẹn và chất chuyển hóa.
• Kỹ thuật xử lý mẫu chiết lỏng - lỏng (LLE): Dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn (pha nước và pha dung môi hữu cơ). Do MTD là base yếu tồn tại ở trạng thái cân bằng ion - phân tử trong môi trường nước, việc bổ sung dung dịch kiềm (NaOH 1M) giúp chuyển hoàn toàn MTD về dạng phân tử không tích điện, làm tăng hệ số phân bố $K_D$ vào pha hữu cơ, nâng cao hiệu suất chiết.
• Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Kết hợp khả năng tách chọn lọc trên cột mao quản của sắc ký khí với khả năng định danh cấu trúc, xác định khối lượng phân tử của đầu dò khối phổ. Phép phân tích sử dụng nguồn ion hóa va chạm điện tử (EI, 70 eV) kết hợp kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (Single Ion Monitoring - SIM) để loại bỏ nhiễu đường nền từ các hợp chất nội sinh trong dịch sinh học, tối ưu hóa độ nhạy và tỷ số tín hiệu trên nhiễu ($S/N$).
• Nguyên tắc lựa chọn chất chuẩn nội: Diphenylamin (DPA) được lựa chọn do có cấu trúc tương đồng, độ tinh khiết cao (99%), thời gian lưu tách biệt hoàn toàn nhưng gần với MTD trên cùng điều kiện sắc ký, đáp ứng yêu cầu bù trừ sai số trong quá trình xử lý mẫu và tiêm mẫu.

Phương pháp nghiên cứu và quy chuẩn thẩm định

• Quy chuẩn thẩm định: Phương pháp được thẩm định toàn diện dựa trên hướng dẫn của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA 2022) về thẩm định phương pháp phân tích sinh học (Bioanalytical Method Validation).
• Các thông số thẩm định: Tính phù hợp hệ thống sắc ký ($RSD \le 2%$), tính chọn lọc và đặc hiệu, khoảng tuyến tính ($R^2 \ge 0,99$), giới hạn phát hiện ($LOD, S/N \approx 3$), giới hạn định lượng ($LOQ, S/N \approx 10$), độ đúng (sai số $\le \pm 15%$), độ chính xác/độ lặp lại ($RSD \le 15%$), hiệu suất chiết và độ ổn định của mẫu ở điều kiện bảo quản $-20^\circ\text{C}$ sau 7 ngày và 21 ngày.
• Nguồn dữ liệu: Dữ liệu thực nghiệm thu nhận từ hệ thống Agilent 8890 GC kết nối đầu dò khối phổ MS 5977, xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel.

---

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các kiến thức nền tảng về lịch sử, nguồn gốc, tính chất lý hóa, dược lực học, dược động học và độc tính của methadon. Tác giả phân tích các phương pháp chuẩn bị mẫu sinh học phổ biến bao gồm kết tủa protein, chiết pha rắn (SPE) và chiết lỏng - lỏng (LLE). Đồng thời, chương 1 trình bày nguyên lý cấu tạo của hệ thống sắc ký khí khối phổ (hệ cấp pha động, buồng tiêm mẫu, cột mao quản, nguồn ion hóa, bộ phân tích khối, detector) và tổng quan các nghiên cứu định lượng MTD trên thế giới và tại Việt Nam.

STT	Phương pháp	Nền mẫu	Xử lý mẫu	Giới hạn phát hiện (LOD) / Định lượng (LOQ)	Khoảng tuyến tính	Tài liệu
1	LC-MS/MS	Nước tiểu, huyết tương	Kết tủa protein (MeOH)	Chưa nêu rõ trong bảng tổng kết	$10 - 1000\text{ ng/ml}$ (huyết tương); $20 - 2000\text{ ng/ml}$ (nước tiểu)	[14]
2	HPLC-UV	Máu, nước tiểu	Chiết pha rắn (SPE)	$\text{LOD: } 0,4\text{ ng/ml}$; $\text{LOQ: } 1\text{ ng/ml}$	$10 - 1500\text{ ng/ml}$	[26]
3	GC-MS	Nước tiểu	Chiết lỏng - lỏng (Chloroform)	$\text{LOD: } 2,1\text{ ng/ml}$; $\text{LOQ: } 7\text{ ng/ml}$	$7 - 1000\text{ ng/ml}$	[36]
4	GC-MS	Nước tiểu, huyết tương	Chiết pha rắn (SPE)	$\text{LOQ: } 10\text{ ng/ml}$	$10 - 600\text{ ng/ml}$	[13]
5	HPLC	Nước tiểu	DLLME (Chloroform / Aceton)	$\text{LOD: } 9 - 25\ \mu\text{g/l}$; $\text{LOQ: } 30 - 100\ \mu\text{g/l}$	$0,5 - 100\ \mu\text{g/l}$	[12]
6	GC-FID	Nước tiểu	Chiết lỏng - lỏng (Chloroform:Isopropanol 9:1)	$\text{LOD: } 9,4\ \mu\text{g/l}$; $\text{LOQ: } 30,3\ \mu\text{g/l}$	$0,0001 - 0,02\text{ mg/ml}$	[10]

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết hóa chất, chất chuẩn, thiết bị và các bước thực nghiệm:

• Hóa chất và thiết bị: Chuẩn Methadon hydrochlorid ($1\text{ mg/ml}$ trong methanol, Cayman - Mỹ), Diphenylamin ($99%$, Sigma-Aldrich - Mỹ), các dung môi hữu cơ đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck - Đức); Máy GC Agilent 8890 ghép nối MS 5977, cân phân tích Mettler AB240.
• Quy trình pha mẫu: Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội DPA ở các nồng độ $1\text{ mg/ml}$, $10\ \mu\text{g/ml}$, $1\ \mu\text{g/ml}$; chuẩn MTD ở các nồng độ $10\ \mu\text{g/ml}$, $1\ \mu\text{g/ml}$ trong methanol.
• Khảo sát điều kiện sắc ký: Dựa trên "Quy trình giám định pháp y" (2022) của Bộ Y tế để thiết lập thông số lò cột, nhiệt độ buồng tiêm, tốc độ dòng khí mang và phân mảnh khối phổ.
• Quy trình chiết xuất LLE: Khảo sát các hệ dung môi hữu cơ (ethyl acetat, dicloromethan, diethylete, n-hexan, ethyl acetat:cyclohexan 1:7) sau khi kiềm hóa mẫu dịch sinh học bằng $\text{NaOH } 1\text{M}$.
• Phương pháp thẩm định: Chi tiết hóa phương pháp xác định tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, LOD, LOQ, đường chuẩn hồi quy, độ đúng, độ lặp lại trên các mức kiểm tra chất lượng LQC ($10\text{ ng/ml}$), MQC ($400\text{ ng/ml}$), HQC ($1000\text{ ng/ml}$) và độ ổn định mẫu lưu trữ.

Thực nghiệm và kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

1. Thiết lập thông số phân tích GC-MS:

   • Cột sắc ký: HP5-MS ($30\text{ m} \times 250\ \mu\text{m}; 0,25\ \mu\text{m}$).
   • Chế độ tiêm: Không chia dòng (splitless), thể tích tiêm $1\ \mu\text{l}$, nhiệt độ buồng tiêm $250^\circ\text{C}$.
   • Khí mang: Heli, tốc độ dòng $1\text{ ml/phút}$.
   • Chương trình nhiệt độ cột: $80^\circ\text{C}$ (giữ 3 phút) $\rightarrow$ tăng $40^\circ\text{C/phút}$ lên $200^\circ\text{C}$ (giữ 1 phút) $\rightarrow$ tăng $10^\circ\text{C/phút}$ lên $290^\circ\text{C}$ (giữ 6 phút). Tổng thời gian phân tích: 22 phút.
   • Nguồn ion hóa: EI ($70\text{ eV}$), nhiệt độ nguồn ion $230^\circ\text{C}$, nhiệt độ chuyển tiếp $280^\circ\text{C}$.
   • Mảnh ion giám sát ở chế độ SIM:
     • MTD: Thời gian lưu $t_R = 11,07\text{ phút}$; ion định lượng $m/z\ 72$; ion định tính $m/z\ 165, 178$.
     • DPA: Thời gian lưu $t_R = 8,18\text{ phút}$; ion định lượng $m/z\ 169$; ion định tính $m/z\ 168$.

2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu LLE: Khảo sát 5 hệ dung môi trên $1,00\text{ ml}$ mẫu dịch sinh học đã kiềm hóa bằng $50\ \mu\text{l NaOH } 1\text{M}$ (chiết 3 lần $\times 3,00\text{ ml}$ dung môi):

   • Ethyl acetat cho diện tích pic thu hồi MTD và DPA cao nhất trên cả hai nền mẫu (Máu: $S_{\text{MTD}} = 28.985.559$, $S_{\text{DPA}} = 18.280.876$; Nước tiểu: $S_{\text{MTD}} = 23.829.420$, $S_{\text{DPA}} = 17.172.038$).
   • Dung môi Ethyl acetat có độ bay hơi trung bình, ít tạo nhũ tương, dễ phân tách pha, được chọn làm dung môi chiết chính thức.
   • Quy trình hoàn chỉnh: $1,00\text{ ml}$ mẫu + $200\ \mu\text{l}$ chuẩn nội DPA ($1\ \mu\text{g/ml}$) + $50\ \mu\text{l NaOH } 1\text{M} \rightarrow$ chiết với $3,00\text{ ml}$ EtOAc ($\times 3$ lần), lắc 5 phút ở 2000 vòng/phút $\rightarrow$ gộp dịch chiết, thổi khô bằng khí $N_2 \rightarrow$ hòa cắn trong $100\ \mu\text{l}$ MeOH $\rightarrow$ tiêm GC-MS.

3. Kết quả thẩm định phương pháp:

   • Tính phù hợp hệ thống ($n=6$): $RSD$ thời gian lưu của MTD là $0,036%$, của DPA là $0,006%$; $RSD$ diện tích pic MTD là $1,905%$, DPA là $0,821%$; $RSD$ tỷ lệ diện tích pic $S_{\text{MTD}}/S_{\text{DPA}}$ là $1,841%$ (tất cả đều $< 2%$).
   • Tính chọn lọc - đặc hiệu: Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu tại thời gian lưu của MTD và DPA; mẫu thêm chuẩn cho pic sắc nét, đối xứng, tách rời hoàn toàn.
   • Giới hạn phát hiện và định lượng:
     • Máu: $\text{LOD} = 3,0\text{ ng/ml}$; $\text{LOQ} = 9,0\text{ ng/ml}$.
     • Nước tiểu: $\text{LOD} = 3,3\text{ ng/ml}$; $\text{LOQ} = 9,9\text{ ng/ml}$.
   • Khoảng tuyến tính ($10 - 1000\text{ ng/ml}$):
     • Máu: Phương trình $y = 0,0076x + 0,0823$ ($R^2 = 0,9999$; độ chệch từ $-11,76%$ đến $5,17%$).
     • Nước tiểu: Phương trình $y = 0,0096x + 0,0165$ ($R^2 = 0,9994$; độ chệch từ $-3,36%$ đến $13,75%$).
   • Độ đúng và độ lặp lại ($n=5$):
     • Máu: Độ đúng từ $91,36%$ đến $95,09%$; $RSD$ từ $3,42%$ đến $7,03%$.
     • Nước tiểu: Độ đúng từ $93,94%$ đến $100,15%$; $RSD$ từ $4,99%$ đến $7,65%$.
   • Hiệu suất chiết ($n=6$):
     • Máu: $82,35%$ (tại $10\text{ ng/ml}$), $87,69%$ (tại $400\text{ ng/ml}$), $90,05%$ (tại $1000\text{ ng/ml}$).
     • Nước tiểu: $88,69%$ (tại $10\text{ ng/ml}$), $91,46%$ (tại $400\text{ ng/ml}$), $90,05%$ (tại $1000\text{ ng/ml}$).
   • Độ ổn định mẫu (bảo quản $-20^\circ\text{C}$): Sau 7 ngày và 21 ngày, hàm lượng MTD suy giảm không đáng kể so với thời điểm ban đầu, độ biến thiên $RSD \le 8%$.

4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế: Phân tích 8 mẫu dịch sinh học của các đối tượng gửi đến giám định tại Khoa Độc chất – Viện Pháp y Quốc gia (mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần):

STT	Đối tượng	Nền mẫu	Nồng độ MTD trung bình (ng/ml)
1	Nguyễn Văn B	Nước tiểu	724,69
2	Triệu Bình A	Nước tiểu	325,55
3	Nguyễn Thành T	Nước tiểu	10098,79
4	Bùi Thanh L	Nước tiểu	330,82
5	Đinh Hoàng L	Nước tiểu	931,33
6	Bùi Đức H	Nước tiểu	338,70
7	Bùi Duy H	Nước tiểu	727,86
8	Nguyễn Gia H	Máu	785,67

Cả 8 mẫu thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với MTD, trong đó có 1 trường hợp mẫu nước tiểu có nồng độ rất cao ($10098,79\text{ ng/ml}$), khẳng định tính khả thi và độ tin cậy của phương pháp trong thực tiễn.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình định lượng MTD trong máu và nước tiểu bằng GC-MS ở chế độ SIM với thời gian phân tích sắc ký tối ưu, các pic sắc ký tách rời hoàn toàn và đối xứng.
• Quy trình xử lý mẫu chiết lỏng - lỏng bằng ethyl acetat sau kiềm hóa đạt hiệu suất thu hồi cao ($82,35% - 91,46%$), quy trình đơn giản, giảm thiểu lượng dung môi độc hại và loại bỏ tạp chất nền hiệu quả.
• Phương pháp đạt độ nhạy cao với giới hạn phát hiện $\text{LOD} = 3,0\text{ ng/ml}$ (trong máu) và $3,3\text{ ng/ml}$ (trong nước tiểu); khoảng tuyến tính rộng ($10 - 1000\text{ ng/ml}$) với $R^2 \ge 0,9994$.

Đóng góp so với nghiên cứu trước

• So với phương pháp GC-FID tại Việt Nam trước đây (nghiên cứu số 6 trong bảng tổng quan với $\text{LOD} = 9,4\ \mu\text{g/l} = 9,4\text{ ng/ml}$, $\text{LOQ} = 30,3\ \mu\text{g/l}$), phương pháp GC-MS trong nghiên cứu này có giới hạn phát hiện thấp hơn gấp khoảng 3 lần, độ đặc hiệu cao hơn nhờ định danh bằng các mảnh ion khối phổ ($m/z\ 72, 165, 178$), tránh được dương tính giả do tạp chất nền.
• So với các phương pháp sử dụng chiết pha rắn (SPE) phức tạp và tốn kém, quy trình LLE bằng ethyl acetat được tối ưu hóa có chi phí thấp, thao tác nhanh, dung môi dễ kiếm, phù hợp với điều kiện trang thiết bị của các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm độc chất tại Việt Nam.

Đề xuất và kiến nghị của tác giả

• Đề xuất áp dụng quy trình vào công tác giám định pháp y thường quy tại Viện Pháp y Quốc gia và các trung tâm pháp y tuyến tỉnh để xác định các trường hợp ngộ độc hoặc tử vong liên quan đến methadon.
• Ứng dụng quy trình trong các cơ sở y tế phục vụ công tác cấp cứu ngộ độc cấp tính và theo dõi nồng độ thuốc trong máu của bệnh nhân tham gia chương trình điều trị nghiện opioids.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Nghiên cứu chỉ tập trung xác định và định lượng chất mẹ methadon, chưa xây dựng đồng thời quy trình định lượng các chất chuyển hóa chính của nó trong cùng một lần chạy sắc ký (như EDDP và EMDP).
  • Số lượng mẫu thực tế được ứng dụng còn hạn chế ($n = 8$ mẫu gồm 1 mẫu máu và 7 mẫu nước tiểu) do phụ thuộc vào số lượng ca giám định tiếp nhận tại thời điểm thực hiện đề tài.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng phương pháp để định lượng đồng thời MTD và các chất chuyển hóa (EDDP, EMDP) nhằm cung cấp đầy đủ thông tin về thời gian sử dụng và mức độ chuyển hóa thuốc trong cơ thể.
  • Khảo sát và ứng dụng phương pháp trên các loại mẫu sinh học và phủ tạng khác (như tóc, dịch dạ dày, gan, thận, não) phục vụ công tác giám định tử thi trong các vụ án hình sự.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên sau đại học ngành Dược học, Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất học tham khảo làm tài liệu học tập và nghiên cứu phương pháp phân tích dịch sinh học.
  • Cán bộ, giám định viên tại các Viện Pháp y, Trung tâm Pháp y, Viện Khoa học Hình sự và các phòng xét nghiệm độc chất lâm sàng tại các bệnh viện.
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình chiết lỏng - lỏng sử dụng dung môi ethyl acetat cho các dược chất có tính base yếu từ nền mẫu dịch sinh học phức tạp.
  • Các thông số kỹ thuật vận hành GC-MS ở chế độ SIM ($m/z$ định lượng và định tính) và các bước thực nghiệm thẩm định phương pháp phân tích sinh học chuẩn mực theo hướng dẫn của FDA (2022).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao diphenylamin (DPA) được lựa chọn làm chất chuẩn nội trong nghiên cứu này?
DPA được lựa chọn vì có cấu trúc hóa học tương tự MTD, độ tinh khiết cao ($99%$), dễ tìm kiếm, giá thành hợp lý và trên cùng điều kiện sắc ký khí, DPA cho thời gian lưu ổn định ($t_R = 8,18\text{ phút}$) tách rời hoàn toàn nhưng đủ gần với MTD ($t_R = 11,07\text{ phút}$), giúp hiệu chỉnh chính xác các sai số do quá trình chiết xuất và dao động của thiết bị tiêm mẫu.

2. Tại sao cần kiềm hóa mẫu dịch sinh học bằng NaOH 1M trước khi chiết lỏng - lỏng?
Methadon là một base yếu với $pK_a = 9,2$. Trong môi trường dịch sinh học tự nhiên, thuốc tồn tại chủ yếu ở dạng ion phân cực khó tan trong dung môi hữu cơ. Việc bổ sung $\text{NaOH } 1\text{M}$ nhằm nâng pH môi trường, chuyển MTD từ dạng ion sang dạng phân tử tự do không tích điện, giúp tăng tối đa khả năng hòa tan vào pha hữu cơ (ethyl acetat) và nâng cao hiệu suất chiết xuất.

3. Mảnh ion khối phổ nào được chọn để định lượng và định tính MTD trên GC-MS?
Phương pháp vận hành ở chế độ SIM với nguồn ion hóa va chạm electron (EI, 70 eV). Mảnh ion $m/z = 72$ (mảnh cơ bản có cường độ tín hiệu mạnh và ổn định nhất) được lựa chọn làm ion định lượng; hai mảnh ion $m/z = 165$ và $m/z = 178$ được lựa chọn làm các ion định tính để nhận danh đặc hiệu cấu trúc phân tử MTD.

4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là bao nhiêu?
Theo kết quả thẩm định thực nghiệm với tỷ số $S/N$:

• Trong nền mẫu máu: $\text{LOD} = 3,0\text{ ng/ml}$ và $\text{LOQ} = 9,0\text{ ng/ml}$.
• Trong nền mẫu nước tiểu: $\text{LOD} = 3,3\text{ ng/ml}$ và $\text{LOQ} = 9,9\text{ ng/ml}$.

5. Kết quả ứng dụng phân tích trên mẫu thực tế tại Viện Pháp y Quốc gia như thế nào?
Phương pháp đã phân tích thành công 8 mẫu thực tế gửi giám định (1 mẫu máu và 7 mẫu nước tiểu). Cả 8 mẫu đều phát hiện dương tính với MTD. Nồng độ MTD xác định được dao động từ $325,55\text{ ng/ml}$ đến $10098,79\text{ ng/ml}$ đối với nước tiểu và đạt $785,67\text{ ng/ml}$ đối với mẫu máu.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của dược sĩ Đỗ Thị Hương đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình xác định methadon trong máu và nước tiểu bằng kỹ thuật GC-MS kết hợp chiết lỏng - lỏng bằng ethyl acetat. Phương pháp đạt độ nhạy cao, độ đặc hiệu tốt, khoảng tuyến tính rộng ($10 - 1000\text{ ng/ml}$) và đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn thẩm định phân tích sinh học nghiêm ngặt theo hướng dẫn của FDA (2022). Kết quả ứng dụng định lượng chính xác trên 8 mẫu bệnh nhân/nạn nhân thực tế chứng minh quy trình hoàn toàn có tính khả thi cao, đóng góp một công cụ phân tích tin cậy phục vụ hiệu quả cho công tác cấp cứu lâm sàng và giám định độc chất pháp y tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề xác định MTD trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp xác định MTD trong máu và nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ. Ứng dụng phương pháp trong phân tích các mẫu thực tế. Tổng quan về methadon 1.

Nguồn gốc MTD được nghiên cứu vào đầu những năm 1930 tại phòng thí nghiệm của Hoechst AG bởi hai nhà khoa học người Đức là Gustav Ehrhart và Max Bockmuhl. Mặc dù được tổng hợp vào những năm 1930, nhưng MTD lần đầu tiên được FDA Hoa Kỳ chấp thuận vào năm 1947 dưới dạng thuốc giảm đau với tên thương mại là “Dolophine” [16]. Tuy nhiên, sau đó, các nhà nghiên cứu nhận ra khả năng gây nghiện của loại thuốc này và việc sử dụng MTD làm thuốc giảm đau không còn được ưa chuộng nữa. Lần đầu tiên vào năm 1964 tại NewYork, Hoa Kỳ, bác sĩ Marie Nyswander và Vincent Dole đã sử dụng thuốc MTD để điều trị cho người nghiện opioids [22].

Kể từ đó, MTD được biết đến nhiều nhất với công dụng điều trị cho người nghiện opioids. Ngày nay, thuốc MTD đã được áp dụng điều trị nghiện opioids tại hơn 70 quốc gia trên thế giới như Mỹ, Anh, Pháp, Trung Quốc, Indonesia,…[35]. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu điều trị thay thế nghiện opioids bằng MTD đã được bắt đầu từ năm 1996 và đến năm 2008 đã triển khai điều trị cho người nghiện opioids bằng thuốc MTD tại Hải Phòng và thành phố Hồ Chí Minh. Sau đó ngày càng mở rộng ra các tỉnh, thành phố trong cả nước [3].

MTD có trong danh mục các chất ma tuý của Công ước quốc tế năm 1961 về kiểm soát ma tuý của Liên hợp quốc [34], đồng thời thuộc danh mục II Nghị định số 57/2022/NĐ-CP, ngày 25 tháng 8 năm 2022 của Chính Phủ [7]. Đến năm 2005, MTD được Tổ chức Y tế thế giới đưa vào danh mục thuốc thiết yếu [21]. Công thức và danh pháp MTD thường gặp dưới 2 dạng là dạng base và dạng muối hydroclorid. MTD chứa một nguyên tử carbon bất đối C6 và tồn tại ở hai dạng đối hình: (S)-(+)-methadon và (R)-(-)-methadon [2].

❖ Methadon - Công thức cấu tạo Hình 1. Công thức cấu tạo của methadon 2 - Tên khoa học: 6-dimethylamino-4,4-diphenylheptan-3-on - Công thức phân tử: C21H27NO - Khối lượng phân tử: 309,445 - pKa: 9,2 - Dạng tinh thể màu trắng, vị đắng. Tan nhiều trong ethanol, tan trong ether và glycerol, rất ít tan trong nước. - Điểm nóng chảy : 235°C ❖ Methadon hydrochlorid - Công thức cấu tạo Hình 1.

Công thức cấu tạo của methadon hydrochlorid - Tên khoa học: 6-dimethylamino-4,4-diphenylheptan-3-on hydroclorid - Công thức phân tử: C21H27NO.HCl - Khối lượng phân tử: 345,91. - pKa: 8,25 - Methadon hydrochlorid dạng bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96 %, không tan trong ether. - Methadon hydrochlorid có điểm nóng chảy từ 233°C đến 236°C.

Dược động học Dược động học của MTD rất khác nhau ở mỗi người, do đó, sau khi dùng cùng một liều lượng, nồng độ thu được sẽ khác nhau đáng kể ở những đối tượng khác nhau. Đường dùng: MTD thường được dùng dưới dạng muối hydrochlorid. Có các dạng bào chế khác nhau dùng cho đường uống, dưới da,… a. Hấp thu MTD có sinh khả dụng qua đường uống hơn 80%, so với 26% của morphin, nhưng sự khác biệt giữa các cá nhân dao động từ 41% đến 95%.

Sau khi uống, thuốc được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa, với nồng độ có thể đo được trong huyết tương sau khi uống 30 phút, nhưng tác dụng cao nhất và nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau khoảng 3-4 giờ, duy trì trong khoảng 1-6 giờ [28]. Thời gian đạt nồng độ ổn định trong máu khoảng 3-5 ngày sau mỗi lần thay đổi liều điều trị [9]. Phân bố 3 MTD là thuốc thân lipid, MTD liên kết cao với protein huyết tương, đặc biệt là với glycoprotein axit alpha-1 (85%-90%), MTD cũng liên kết với albumin, các protein mô và huyết tương khác bao gồm cả lipoprotein. Phần còn lại ở dạng tự do, tỷ lệ tự do trung bình của MTD là khoảng 13%.

Sự gia tăng nồng độ glycoprotein axit alpha-1 trong huyết tương có thể làm thay đổi tỷ lệ thuốc không liên kết (tức là dạng tự do) và thuốc liên kết, dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ thuốc liên kết với sự giảm nồng độ thuốc tự do tương ứng. Sự thay đổi này có ý nghĩa lâm sàng đối với các loại thuốc có liên kết cao như MTD. Trong trường hợp MTD, nồng độ thuốc tự do giảm sẽ gây ra các triệu chứng cai (thở nhanh, vã mồ hôi, ngáp, thèm ma túy,…) và cần phải điều chỉnh liều. Khi MTD được giải phóng vào và lưu thông trong máu, MTD phân bố rộng rãi đến các mô như não, gan, thận, phổi và cơ,….

Do tính thân lipid, MTD có thể tồn tại lâu trong gan và các mô khác. MTD cũng qua được nhau thai và phân bố vào trong sữa mẹ [19] [23]. Chuyển hoá MTD được chuyển hóa chủ yếu ở gan nhờ enzyme cytochrome P450 (CYP), chủ yếu là CYP2B6, tiếp theo là CYP3A4, 2C19, 2D6 và ở mức độ thấp hơn là CYP2C18, 3A7, 2C8, 2C9, 3A5 và 1A2. MTD chủ yếu tạo thành các chất chuyển hóa pyrrolidin không có hoạt tính dược lý là 2-ethyliden-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidin (EDDP) và 2-ethyl-5-methyl-3,3-diphenylpyrrolin (EMDP).

Trong đó CYP2C19, 3A7 và 2C8 ưu tiên chuyển hóa (R)-methadon, CYP2B6, 2D6 và 2C18 chủ yếu chuyển hóa (S)- methadon [37] [15]. Sơ đồ quá trình chuyển hoá methadon Quá trình chuyển hoá MTD kết hợp hai quá trình N-demethyl hóa và quá trình vòng hóa của MTD. MTD được N-demethyl hóa thành một hợp chất trung gian là normethadon, sau đó là quá trình vòng hoá để tạo thành EDDP. Phản ứng N-demethyl hóa thứ hai xảy ra trên EDDP để tạo thành EMDP có thời gian bán hủy nằm trong khoảng từ 39,8 giờ đến 48 giờ.

Hai chất chuyển hóa này tiếp tục được chuyển hóa thành sản phẩm hydroxypyrrolidinic bằng quá trình hydroxyl hóa vòng thơm. 4 Một con đường khác trong quá trình hình thành EMDP là quá trình khử N- demethadon qua trung gian CYP của normethadon để tạo thành dinormethadon, sau đó được chuyển hóa thành EMDP [11] [17]. Thải trừ Sự bài tiết MTD sau khi chuyển hóa sinh học thường xảy ra thông qua quá trình đào thải qua thận và phân. Khoảng 20% đến 50% MTD được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng MTD hoặc chất chuyển hóa của MTD và 10% đến 45% được bài tiết qua phân dưới dạng chất chuyển hóa pyrrolidin [29].

MTD được bài tiết qua quá trình lọc ở cầu thận, được tái hấp thu ở ống thận. Thời gian bán hủy dao động trong khoảng từ 13 đến 47 giờ với trung bình là 25 giờ [28]. MTD là bazơ yếu dẫn đến sự bài tiết qua thận phụ thuộc vào pH nước tiểu. Nước tiểu có tính axit làm tăng bài tiết MTD (khoảng 35%) và giảm dần khi pH nước tiểu tăng.

MTD đi qua hàng rào nhau thai và bài tiết qua sữa. MTD cũng được bài tiết qua nước bọt và mồ hôi [25]. Dược lực học MTD là một opioid tổng hợp hoạt động như một chất chủ vận hoàn toàn ở thụ thể μ-opioid, các thụ thể này chủ yếu ở thần kinh trung ương. MTD kích hoạt các thụ thể μ giúp loại bỏ các triệu chứng cai và giảm cảm giác thèm ma túy [31] [35] [37].

Hơn nữa, MTD là một chất đối kháng không cạnh tranh với thụ thể N-methyl-d- aspartate, MTD chất ức chế tái hấp thu serotonin và norepinephrin trong hệ thần kinh trung ương giảm sự nhạy cảm của thần kinh trung ương với các kích thích gây đau dẫn đến giảm hiện tượng tăng cảm giác đau và giảm cường độ đau, tăng khả năng nâng cao hiệu quả trong việc kiểm soát cơn đau thần kinh [18] [27] [31]. Tác dụng dược lý và độc tính a. Tác dụng dược lý: MTD là dẫn chất tổng hợp của diphenylheptan chủ vận thụ thể µ-opioid, có tác dụng dược lý tương tự morphin như giảm đau, giảm ho, cầm tiêu chảy, gây lệ thuộc thuốc nhưng gây khoái cảm yếu. MTD làm giảm hội chứng cai opioids, giảm lệ thuộc vào opioids nên được dùng để cắt cơn nghiện và xử trí phụ thuộc opioids, có thời gian bán huỷ dài hơn nên chỉ cần sử dụng một lần trong ngày là đủ để không xuất hiện hội chứng cai.

MTD cũng được áp dụng để điều trị giảm đau, ở liều giảm đau ngang nhau, MTD có thể gây ra ức chế hô hấp tương tự hoặc cao hơn morphin, MTD ít gây táo bón hơn morphin [38] [39]. Độc tính : Việc sử dụng MTD thường xuyên liên quan đến sự tăng khả năng dung nạp. Khi đó, phải dùng liều lượng thuốc lớn hơn để đạt được hiệu quả tương tự. Vì vậy liều dùng sẽ phụ thuộc vào từng đối tượng.

Liều dùng và lượng MTD gây quá liều phụ thuộc vào 5 nhiều yếu tố. Yếu tố lớn nhất là đã từng sử dụng MTD hoặc opioids chưa. Liều dùng dao động từ 20-100mg. Các quy định hiện hành ở Hoa Kỳ không khuyến cáo sử dụng liều MTD lớn hơn 100 mg/ngày.

Đối với người lớn chưa sử dụng opioids, liều gây độc có thể chỉ ở mức 30-50 mg. Liều gây độc cho trẻ có thể chỉ là 10 mg. Trong khi đó đối với những người nghiện opioids, có thể dùng liều hơn 100 mg mỗi ngày mà không có bất kỳ tác dụng phụ nào rõ rệt. Nồng độ trong máu sau khi dùng MTD dao động từ 30- 750 ng/ml, ngưỡng nồng độ gây độc dao động từ 240-1000 ng/ml tuỳ từng đối tượng.

Nồng độ trong nước tiểu từ 100-13250ng/ml khi dùng liều từ 20mg-200mg [24]. Ở những bệnh nhân sử dụng MTD để điều trị cai nghiện, nếu ngừng thuốc đột ngột ở người bệnh điều trị dài hạn, có thể xuất hiện hội chứng cai thuốc hoặc co giật, vì vậy cần giảm liều từ từ. Tác dụng độc khi dùng quá liều chủ yếu là giảm tần số và biên độ thở, có thể tiến triển đến ngưng thở. Các biến chứng khác (ví dụ phù phổi, thường phát triển trong vài phút đến vài giờ sau khi dùng quá liều) và tử vong chủ yếu do tình trạng thiếu oxy.

Đồng tử co nhỏ, mê sảng, tụt huyết áp, nhịp tim chậm, hạ nhiệt cơ thể, và bí tiểu có thể xảy ra. Bệnh nhân được điều trị bằng naloxone nếu nghi ngờ quá liều [38] [39]. Chất chuẩn nội Vì mẫu phân tích là dịch sinh học có nền mẫu phức tạp, nồng độ chất phân tích nhỏ, quá trình xử lý mẫu có thể làm mất mẫu, ảnh hưởng tới độ lặp lại của phép phân tích nên để hạn chế sự dao động này cũng như những dao động nhỏ của hệ thống sắc kí, việc sử dụng chất chuần nội là cần thiết.