Chương 1.1 So lược về enzyme lipase 1.1 Dinh nghia Enzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.3) la enzyme xúc tac thủy phân và tong hop các ester được hình thành từ triglycerol và các acid béo. Chúng có bản chất là protein. Đặc tính kỹ thuật của lipase là hoạt động tại liên pha dầu — nước [11].2 Khối lượng phân tử và cấu trúc không gian Khối lượng phân tử: Bang 1.1 Khối lượng phân tử của một số lipase (Fadiloglu, 1996) [15] Vị sinh vật MW (kDa) Phuong phap P.0 Gel filtration Bacillus spp.0 Gel filtration SDS-PAGE A.6 SDS-PAGE H lanuginosa 39.0 Gel filtration SDS-PAGE P.5 Gel filtration SDS-PAGE C.0 Gel filtration Trang 3 Luận văn Thạc sĩ GVHD: TS. Phan Ngoc Hòa Nhu các loại enzyme khác, các lipase đều có những tinh chất chung, song chúng cũng khác nhau về một số tính chất như: tính đặc hiệu cơ chất, mức độ phân giải cơ chất, khối lượng phân tử, thành phần acid amin và điều kiện hoạt động.
Sự khác nhau này không những giữa các loài mà ngay cả giữa các chủng trong cùng một loài. Khối lượng phân tử của lipase dao động khá nhiều giữa các chủng vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn gốc sinh tổng hop ra chúng, khối lượng phân tử của chúng phân bố từ khoảng 12 đến hơn 1.000 kDa: lipase từ Bacillus Subtilis có khôi lượng phân tử khá thấp 19.348 Da (18 amino acid) [39], lipase từ Geotrichum candidum có khối lượng phân tử khoảng 60 kDa, Aspergillus niger 97 kDa, Candida rugosa sinh tong hợp ra 2 đồng phân là LipA (58 kDa) và LipB (62 kDa); lipase từ Penicillium crustosum 29. Bang sau cho biết sự khác biệt về khối lượng phân tử của lipase có nguồn gốc khác nhau được xác định bằng các phương pháp cụ thê. Cấu trúc không gian: Hình 1.1 Cau trúc không gian của lipase Candida rugosa [15] Cũng như các loại enzyme khác, lipase cũng là một lưỡng cau tử bao gồm hai thành phan: protein (apoenzyme), phi protein (coenzyme, ion kim loại, vitamine) được gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic khi nó liên kết chặt chẽ với phan protein của enzyme bằng liên kết đồng hóa trị.1 Lipase Candida rugosa là một enzyme có cau trúc không gian bậc ba với phan nap có khả năng đóng mo.
Dai L ở trung tâm có màu xanh nhạt va Trang 4 Luận văn Thạc sĩ GVHD: TS. Phan Ngoc Hòa phân cuối của dải L có kích thước nhỏ hơn là dai N mau xanh đậm. Chuỗi xoắn ốc đậm tựa vào dải L có màu xanh lá đậm. Cấu trúc đóng của nắp có màu vàng và cầu tric mở có màu đỏ [15].
Trung tâm hoạt động của hau hết lipase bao gồm serine, một phân tử histidine va một amino acid (Asp hoặc Glu). Serine đóng vai trò như nhân cua lipase, nam giữa một dai B và một xoắn a. Trong khi đó histidine và acid amine nằm ở bề mặt của serine. Liên kết giữa ba cau tử trên có tính bền vững cao trong suốt quá trình lipase tham gia xúc tác kế cá sự có mặt của protease phân giải serine.
Hoạt động của lipase thủy phân triglyceride chủ yếu tập trung vào vị trí hoạt động của serine. Oxy có trong nhân của serine kết hợp với triglyceride tạo thành khối tứ diện hemiacetal ở trạng thái trung gian. Khung ester của hemiacetal bị thủy phân và giải phóng diglyceride. Phần còn lại của cấu trúc trung gian, serine acyl ester phản ứng với nước va tạo thành acid béo tự do (Petersen và cộng sự, 2001) [15].3 Cơ chất, chất hoạt hóa và chất ức chế a) Cơ chất: Triglyceride hay mỡ động vật và dau thực vật là những nguồn cơ chất chính của enzyme lipase.
Để phân tích hoạt tính của lipase người ta thường dùng cơ chất là triglyceride được tinh sạch hoặc tong hợp. Chang hạn như triolein tributyrin. Các dạng triglyceride dễ dàng phân cắt bởi enzyme lipase hơn khi nó được nhũ hóa kĩ và tạo thể nhũ tương với nước hoặc bơ. b) Chất hoạt hóa: Là chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme.
Các chất này có bản chất hoá học khác nhau, có thé là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ có cầu tao phức tạp hơn. Tuy nhiên mỗi chất hoạt hóa lại tác động hoạt hóa ở từng mức độ khác nhau, có khi chất hoạt hóa cho loại lipase từ nguồn gốc này lại không hoạt hóa lipase từ nguồn gốc khác. Ví dụ như hoạt tính enzyme lipase từ Pseudomonas aeruginosa KKA-5 giảm 20-30% khi có sự xuất hiện của ion Na”, K*, Cu”, tuy nhiên khi có sự xuất hiện của Ca”” ủ trong 72 giờ thì hoạt tính enzyme lipase lúc này tăng 56% [12]. c) Chất ức chế: Là chất làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme, hoặc trong một số trường hợp nó làm ngăn chặn sự xúc tác.
Cơ chế hoạt động của các chất ức chế này có thé được giải thích theo hai hướng: Trang 5 Luận văn Thạc sĩ GVHD: TS. Phan Ngoc Hòa (1) Chất kìm hãm protein được hấp phụ lên bề mặt và gây ra sự thay đối các tính chất của bề mặt đó. (2) Sự tác động qua lại trực tiếp của chất kìm hãm với lipase và cạnh tranh với cơ chất. Các chất ức chế này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, hoặc là các protein.
Khi tham gia phản ứng nó có thé làm thay đổi vi trí trung tâm hoạt động của enzyme hoặc nó có thé tác động vào tính chất của bề mặt phân pha dau nước [1].2 Anh hưởng của các ion kim loại đến lipase [20] Nguồn gốc Chất hoạt hóa Chất ức chế Vi khuẩn Bacillus thermoleovorans ID-I Ca” ,Zn** Bacillus natto Na”, PO,° Ca” Staphylococcus aureus 226 Ca**,Mg* Mn** Staphylococcus aureus Ca**, Mn** Coban, Kẽm Fe", Ni**, Cu”, Hg Serratia marcescens 345 Mg” ,Zn” Bacillus sp. FHS Mg””, Ba”? Cu**, Co”*, Na*/Zn”? Acinetobacter sp. CR9 Cu”,Mo”,Mg”,Zn”” Ca” Acinetobacter baumannii BD5_ Mn**, Ca**, MgTM* Cu**, Zn** Nam moc Rhizopus oryzae Fe**, Cu**, Hg”” Aspergillus terreus Ca**,Mg* Fe**, Ni**, Cu”, Co” 1.4 Hoat tinh lipase Đại lượng đặc trưng cho kha năng hoạt động xúc tác của enzyme là hoạt tính. Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không Trang 6 Luận văn Thạc sĩ GVHD: TS.
Phan Ngoc Hòa định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (gọi là hoạt tính) cua enzyme. Trong phan ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biéu hiện bang cach lam thay đổi các tinh chất vật ly, hóa ly cũng như tính chất hóa hoc của hỗn hợp phản ứng. Theo những biến đôi đó có thé biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mat di hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Để xác định hoạt tính của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học.
Các phương pháp so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ. được dùng pho bién trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme. Có thé chia ra ba nhóm phương pháp sau: 1) Do lượng cơ chất bị mat đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nông độ enzyme xác định. 2) Do thời gian cần thiết dé thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
3) Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. s*_ Đơn vị hoạt tinh enzyme Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc đơn vi enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961. Don vi hoạt tính enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mieromole (1mmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U= Iumol sản phẩm = Iumol co chất (10° mol)/ phút.
Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat). Katal là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 Kat = 6x10”U Và 1U=1/60x 10° Kat = 16,67 nKat (nanokatal) Don vị tự đặt: đơn vi hoạt tinh dựa vào su thay đối đặc tính hỗn hợp phan ứng, ví dụ sự thay đôi độ đục, độ nhớt, điều kiện phan ứng.frong một đơn vi thời gian. Trường hop cơ chất và sản phâm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này.
Trang 7 Luận văn Thạc sĩ GVHD: TS. Phan Ngoc Hòa Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động cần phải đánh giá độ sạch của nó. Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là hoạt tính riêng. - Hoạt tính riêng: của một ché pham enzyme là số đơn vị enzyme/ Img protein (U/mg) cũng có thé 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dich enzyme.
Thông thường ham lượng protein được xác định băng phương pháp Lowry. Khi biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt tính phân tử. - Hoạt tinh phân tử: là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian. Hoạt tính phân tử lớn có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất nhanh.
Như vậy, hoạt tính phân tử chính là khả năng xúc tác: hoạt tính phân tử càng cao thi khả năng xúc tác càng lớn. Vi dụ người ta xác định được hoạt tính phân tử cao của một sỐ enzyme tinh khiét nhu catalase 5,6 x10°, acetyl - cholinesterase 3,0 x 10°, B-amylase 1,2 x 10°. Xác định hoạt tinh enzyme lipase: Enzyme lipase có thé được xác định hoạt tinh thông qua phương pháp chuẩn độ, quang học, hoặc dùng bộ Kit.5 Các nguồn thu nhận enzyme lipase 1.1 Từ động vật Ở người và động vật có xương sống, nhiều lipase kiểm soát sự thuỷ phân, sự hấp thụ, sự tạo thành chất béo và chuyển hoá lipoprotein. Ngay từ năm 1923, Willstatter và Klemmen đã thu nhận enzyme từ tụy tạng heo nhưng đến 1996 Vergen mới tinh sạch hoàn toàn enzyme lipase nay.
Enzyme lipase từ tụy tạng là enzyme lipase tốt nhất từ nguồn động vat. Enzyme này hiện diện trong tụy tạng và dịch tụy tạng. Enzyme thu được khối lượng phân tử là 45 - 50 kDa. Khoảng pH tối ưu cho enzyme nay là 7,0 - 9,3.
Enzyme lipase nay hoạt động mạnh hơn khi có sự hiện diện của muối canxi. Các acid mật và muối mật cũng có tác dụng làm tăng hoạt tính cua enzyme lipase từ tụy tang do vay mà nó có khả năng nhũ hoa cơ chất. Nhờ đó tăng cơ hội tương tác giữa enzyme và cơ chất [1]. Lipase từ động vật ưu tiên xúc tác thủy phân tạo ra các acid béo với hơn 12 nguyên tử carbon và chủ yếu tan công vao vi trí C-1 của glycerol.