ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (Congenital adrenal hyperplasia - CAH) là một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do thiếu một trong các enzym cần thiết cho quá trình tổng hợp cortisol từ cholesterol của vỏ thượng thận. Khoảng 95% các trường hợp là do thiếu hụt 21-hydroxylase (21-OH) dẫn đến thiếu cortisol kèm theo (hoặc không) thiếu hụt aldosterone và tăng tiết androgen thượng thận. Biểu hiện lâm sàng của bệnh được chia ra thành hai thể là thể nặng (thể cổ điển) và thể nhẹ hơn (không cổ điển). Thể cổ điển có tỷ lệ mới mắc là 1:10 000 ÷ 1:16 000 trẻ đẻ sống đối với hầu hết các chủng tộc và bao gồm thể mất muối (MM) và thể nam hóa đơn thuần (NHĐT) 1,2,3.
Những tiến bộ của khoa học đã giúp chúng ta hiểu biết và đạt được những thành tựu quan trọng về chẩn đoán và điều trị TSTTBS. Từ mô tả lâm sàng đầu tiên của De Crecchio về một bệnh nhân nữ mắc TSTTBS (1865), tiếp theo là các mốc quan trọng bao gồm điều trị nội khoa đầu tiên được tiến hành bởi Wilkins và cộng sự (1950). Các phân tích di truyền đầu tiên được tiến hành bởi Levine và cộng sự bằng phân tích liên kết HLA halotype (1978), tới việc xác định hầu hết các gen mã hóa cho các enzym tổng hợp steroid vào những năm 1980 2,4,5,6. Phân tích di truyền gen CYP21A2 mã hóa cho 21-OH là phương pháp chuẩn mực để góp phần chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh.
Các tiến bộ về phân tích di truyền không những giúp cải thiện khả năng chẩn đoán các thể nhẹ nhất của bệnh mà còn cho phép hiểu biết rõ hơn về tương quan kiểu gen - kiểu hình trong bệnh TSTTBS. Tiến bộ hơn nữa là việc phân tích gen CYP21A2 sử dụng bệnh phẩm là các giọt máu thấm khô từ các đĩa của giấy thấm trong chương trình sàng lọc sơ sinh, như là xét nghiệm bước 2 để tăng tính tin cậy và giảm tỷ lệ dương tính giả. Chẩn đoán và điều trị LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 trước sinh cho các gia đình có nguy cơ mắc thể cổ điển của bệnh cần được tiến hành chủ động mang ý nghĩa dự phòng. Những khía cạnh nêu trên được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới từ hơn 30 năm nay 7,8,9,10,11.
Ở Việt Nam, tỷ lệ mới mắc của TSTTBS chưa được xác định do tỷ lệ thấp các trẻ được sàng lọc sơ sinh. Những bệnh nhân đầu tiên mắc TSTTBS được chẩn đoán từ đầu những năm 1980, và số lượng bệnh nhân tăng lên rõ rệt do mỗi năm có khoảng từ 40 - 60 bệnh nhân mới được chẩn đoán tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Đây cũng là một trong các trung tâm hiện đang quản lý số lượng lớn nhất các bệnh nhân mắc TSTTBS trên thế giới. Trong số 842 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị trong 17 năm (1999-2016) thì thể thiếu 21-OH chiếm 98,3% (828 bệnh nhân); thiếu 11β-hydroxylase chiếm 1,3% (11 bệnh nhân) và thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase chiếm 0,4% (3 bệnh nhân) (Vũ Chí Dũng và cộng sự).
Các nghiên cứu về di truyền phân tử trong đó có xác định các đột biến của gen CYP21A2 ở các bệnh nhân Việt Nam cũng được bắt đầu từ những năm 2000, tuy nhiên hạn chế chỉ ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc một số đột biến phổ biến. Các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến đã bắt đầu được nghiên cứu ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh và sau sinh TSTTBS. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào trên số lượng đủ lớn các bệnh nhân Việt Nam mắc TSTTBS để phát hiện các dạng đột biến gen và phân bố của các đột biến trên gen CYP21A2, và cũng chưa có nghiên cứu nào về kiểu gen và tương quan giữa kiểu gen - kiểu hình của các bệnh nhân TSTTBS với số lượng bệnh nhân đủ lớn. Hơn nữa, việc phân tích đột biến gen gây bệnh TSTTBS là cần thiết trong thực hành lâm sàng để: i) khẳng định chẩn đoán và cho phép điều trị sớm, phòng tránh được cơn suy thượng thận cấp trong các trường hợp xét nghiệm về hormon không rõ ràng; ii) chẩn đoán trước sinh và điều trị trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng và làm giảm nam hóa gây mơ hồ giới LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 tính sau sinh; iii) xác định người lành mang gen, phục vụ tư vấn di truyền; iv) áp dụng các liệu pháp mới để tối ưu hóa điều trị bao gồm việc quyết định liều lượng steroid thay thế trên cơ sở mối tương quan kiểu gen - kiểu hình, do đó giúp giảm được hậu quả ức chế tăng trưởng do quá liều streroid.
Xuất phát từ các lý do trên đây, nghiên cứu này được tiến hành với các mục tiêu sau đây: Mục tiêu 1: Phát hiện các đột biến của gen CYP21A2 và mô tả bản đồ đột biến gen CYP21A2 ở các bệnh nhân mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-OH. Mục tiêu 2: Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-OH. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1. Lịch sử mô tả bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh Bệnh nhân đầu tiên có các triệu chứng lâm sàng của TSTTBS được mô tả trong y văn vào năm 1865 bởi nhà giải phẫu người Ý là Luigi de Crecchio; ông đã đề cập đến một bệnh nhân ngoại hình nam, tử vong lúc 44 tuổi với các biểu hiện đợt cấp suy thượng thận Addison.
Kết quả giải phẫu bệnh cho thấy tuyến thượng thận có kích thước lớn, chiều dài dương vật là 10 cm, tật lỗ tiểu thấp độ I, không có tinh hoàn, hai buồng trứng bình thường, có vòi trứng, có tử cung và âm đạo [1],[2],[3]. Kể từ khi ca bệnh đầu tiên này được công bố cho đến nay có hơn 5 thể bệnh TSTTBS được mô tả, trong đó thể thiếu 21- OH là phổ biến nhất. Cuộc sống của các bệnh nhân mắc TSTTBS đã được cải thiện rõ rệt kể từ khi hydrocortisone được sử dụng trong điều trị một cách có hiệu quả vào những năm 1950 [4]. Những năm sau đó của cùng thập kỷ thì việc điều trị thay thế bằng mineralocorticoid cũng được áp dụng và tiếp tục cải thiện kết quả điều trị [5].
Việc làm sáng tỏ cơ sở phân tử của bệnh lý di truyền đơn gen này vào những năm 1980 và 1990, cũng như phát triển các kỹ thuật và quy trình xác định các đột biến gây bệnh đã là công cụ trong chẩn đoán cũng như giúp hiểu biết về sinh lý bệnh học của bệnh. Các phân tích di truyền của bệnh được tiến hành lần đầu vào những năm 1980 và dựa trên cơ sở về mặt liên kết các gen HLA [6]. Trong những năm 1990 thì việc xác định nhanh kiểu gen của bệnh đối với các đột biến phổ biến và giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 đã được nghiên cứu rộng rãi [7],[8]. Việc chẩn đoán bệnh đi từ mô tả, thăm khám lâm sàng đến xét nghiệm các dấu ấn sinh học và phân tích phân tử.
Như vậy, trải qua hơn 60 năm, đến nay khoa học đã có những bước tiến nổi bật về hiểu biết TSTTBS, đặc biệt về di truyền, sinh lý bệnh, lâm sàng, điều trị và phòng bệnh. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Định nghĩa, cơ sở hóa sinh, sinh lý bệnh học của tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu 21-OH 1. Định nghĩa TSTTBS và các enzym tham gia tổng hợp cortisol Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (congenital adrenal hyperplasia - CAH) bao gồm một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, do khiếm khuyết một phần hoặc hoàn toàn của một trong số các enzym tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận.
Kiểu hình lâm sàng và hóa sinh phụ thuộc vào khiếm khuyết enzym đặc hiệu và giảm hoạt độ của enzym đặc hiệu. Các enzym sau đây tham gia tổng hợp cortisol vỏ thượng thận: P450scc (CYP11A1), P450c17 (CYP17A1), P450c21 (CYP21A2), P450c11 (CYP11B1), 3βHSD (HSD3B2). Ngoài ra ngay ở bước đầu tiên của tổng hợp steroid thượng thận, cholesterol đi vào trong ty thể là nhờ một protein vận chuyển tên là StAR (steroidogenic acute regulatory protein) (STAR). Hơn nữa, đột biến bất hoạt gen POR mã hóa enzym cho điện tử P450 oxidoreductase cũng gây ra các biểu hiện của TSTTBS với các triệu chứng kết hợp của thiếu P450c17 và P450c21 (hình 1.
Thiếu hụt 21- OH (CYP21A2) và 11β-hydroxylase (CYP11B1) chỉ gây tổn thương tổng hợp steroid thượng thận, trong khi thiếu 17α-hydroxylase (CYP17A1) và 3β- hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSD3B2) cũng gây tổn thương tổng hợp steroid ở tuyến sinh dục. Cơ sở hóa sinh của TSTTBS Cytochrome P450 là thuật ngữ chung chỉ một nhóm các enzym oxy hóa, tất cả các enzym nhóm này đều có khoảng 500 axit amin và có một nhóm HEME đơn độc. Các enzym này được gọi là P450 (pigment 450) vì tất cả đều hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450 nm. Hệ gen người bao gồm 57 enzym thuộc nhóm cytochrome P450.
Một vài hệ thống danh pháp quốc tế đã LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 được đề xuất cho các gen và các enzym nhóm này trong các thập kỷ qua. Hiện nay, các gen có thuật ngữ chính thức là các gen CYP và có một hệ thống danh pháp hợp lý cho các enzym và các gen này đã được mô tả (http://drnelson.html); các protein được mã hóa bởi các gen có thể có cùng tên nhưng không viết nghiêng [10]. Sinh tổng hợp steroid được bắt đầu với nguyên liệu là cholesterol không ester hóa, một phân tử gồm 27 carbon có nguồn gốc từ lipoprotein phân tử thấp (low-density lipoprotein: LDL) lưu hành trong tuần hoàn [12]. Cholesterol được vận chuyển từ bào tương vào màng trong của ty thể thông qua protein phosphor (steroidogenic acute regulatory protein - StAR) [13].
Enzym tách nhánh bên P450 (CYP450scc) có tên gen là CYP11A1 xúc tác chuyển cholesterol thành steroid trung gian là pregnenolone bằng cách hydroxyl hóa carbon 20 và 22 sau đó tách liên kết giữa hai carbon hydroxyl hóa này [14]. Pregnenolone vì không phải là cơ chất trong ty thể nên đi ra lưới nội bào và tại đây được chuyển thành các steroid đặc hiệu phụ thuộc vào enzym và các yếu tố đồng vận đặc hiệu. Tuyến thượng thận có vai trò thiết yếu cho sự sống sẽ sản xuất ra các steroid tại phần vỏ. Về mặt cấu trúc mô học thì vỏ thượng thận được chia thành 3 lớp riêng biệt: mỗi lớp này lại sở hữu hoặc bị thiếu những enzym cần thiết để tổng hợp steroid đặc hiệu: lớp cầu ngoài cùng khi bị thiếu 17α-hydroxylase thì chuyển pregnenolone sang hướng sản xuất mineralocorticoid 21 carbon là aldosterone.