Luận án tiến sĩ về đột biến gen gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21 hydroxylase

Nghiên cứu các dạng đột biến gen gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21 hydroxylase, cung cấp kiến thức quan trọng cho y học.

• Tác giả: Vũ Chí Dũng
• Người hướng dẫn: Giáo Sư. Tạ Thành Văn
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Nhi
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh
• Loại tài liệu: Luận án
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Lịch sử mô tả bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh
• 1.2. Định nghĩa, cơ sở hóa sinh, sinh lý bệnh học của tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH
• 1.2.1. Định nghĩa TSTTBS và các enzym tham gia tổng hợp cortisol
• 1.2.2. Cơ sở hóa sinh của TSTTBS
• 1.2.3. Sinh lý bệnh của TSTTBS do thiếu 21-OH
• 1.3. Kiểu hình lâm sàng và tỷ lệ mới mắc của TSTTBS do thiếu 21-OH
• 1.3.1. Kiểu hình lâm sàng của TSTTBS do thiếu 21-OH
• 1.3.2. Tỷ lệ mới mắc của thiếu 21-OH
• 1.4. Cơ sở di truyền phân tử của bệnh TSTTBS do thiếu 21-OH
• 1.4.1. Gen CYP21A2 và cấu trúc RCCX (RP-C4-CYP21-TNX)
• 1.4.2. Lịch sử nghiên cứu về di truyền phân tử của bệnh TSTTBS trên thế giới
• 1.4.3. Các đột biến của gen CYP21A2 gây thiếu 21-OH
• 1.4.3.1. Các đột biến xóa đoạn và hoán vị lớn của gen
• 1.4.3.2. Các đột biến vô nghĩa và đột biến gây lệch khung dịch mã (nonsense và frameshift mutations)
• 1.4.3.3. Các đột biến điểm phổ biến khác
• 1.4.3.4. Các đột biến hiếm gặp
• 1.4.4. Các tiến bộ kỹ thuật của phân tích phân tử phát hiện các đột biến gen CYP21A2
• 1.4.4.1. Phân tích các đột biến xóa đoạn và hoán vị lớn của gen
• 1.4.4.2. Các tiến bộ về phát hiện các đột biến điểm và các biến đổi nhỏ phổ biến và hiếm gặp của gen CYP21A2
• 1.4.5. Nghiên cứu về vai trò của phân tích đột biến gen CYP21A2
• 1.4.5.1. Dự báo kiểu hình
• 1.4.5.2. Tính phức tạp của tư vấn di truyền đối với thiếu 21-OH
• 1.4.5.3. Vai trò của di truyền phân tử đối với chương trình sàng lọc sơ sinh TSTTBS
• 1.4.5.4. Chẩn đoán và điều trị trước sinh ở những gia đình có nguy cơ cao thiếu 21-OH
• 1.4.5.5. Nghiên cứu về di truyền phân tử trên các bệnh nhân TSTTBS ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.3. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng cho phát hiện đột biến gen CYP21A2
• 2.3.1. Trang thiết bị nghiên cứu
• 2.3.2. Dụng cụ nghiên cứu
• 2.3.3. Hóa chất nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Thu thập và tách chiết mẫu nghiên cứu
• 2.4.2. Xác định đột biến gen CYP21A2
• 2.4.3. Nhận định và đánh giá các đột biến của gen CYP21A2
• 2.5. Đánh giá kiểu hình của các bệnh nhân và mối tương quan giữa kiểu gen - kiểu hình
• 2.6. Xử lý số liệu thống kê
• 2.7. Đạo đức trong nghiên cứu
• PHỤ LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG, HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ VỀ NỘI DUNG LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đột biến gen CYP21A2 và bệnh TSTTBS

Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm bệnh di truyền lặn, chủ yếu do đột biến gen CYP21A2 gây ra. Gen này mã hóa cho enzym 21-hydroxylase, một enzym quan trọng trong quá trình tổng hợp cortisol. Thiếu hụt enzym này dẫn đến sự tích tụ của các hormone steroid và gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng. TSTTBS có thể được chia thành hai thể chính: thể cổ điển và thể không cổ điển. Thể cổ điển thường nặng hơn và có tỷ lệ mắc cao hơn. Việc hiểu rõ về gen CYP21A2 và các đột biến của nó là rất quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh.

1.1. Đột biến gen CYP21A2 và cơ chế gây bệnh

Đột biến gen CYP21A2 có thể xảy ra dưới nhiều hình thức khác nhau, bao gồm đột biến điểm, xóa đoạn và hoán vị lớn. Những đột biến này dẫn đến sự thiếu hụt hoạt động của enzym 21-hydroxylase, gây ra sự thiếu hụt cortisol và aldosterone. Hệ quả là sự gia tăng sản xuất androgen, dẫn đến các triệu chứng lâm sàng như nam hóa ở trẻ gái và mất muối ở trẻ em. Việc xác định chính xác loại đột biến là cần thiết để đưa ra phương pháp điều trị phù hợp.

1.2. Tình hình nghiên cứu về gen CYP21A2 tại Việt Nam

Nghiên cứu về gen CYP21A2 tại Việt Nam còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào việc phát hiện một số đột biến phổ biến. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào trên quy mô lớn để xác định toàn bộ các dạng đột biến và mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình. Việc nghiên cứu sâu hơn về gen này sẽ giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân mắc TSTTBS.

II. Vấn đề và thách thức trong chẩn đoán TSTTBS

Chẩn đoán bệnh TSTTBS gặp nhiều thách thức do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu và có thể bị nhầm lẫn với các bệnh khác. Việc phát hiện sớm và chính xác các đột biến gen CYP21A2 là rất quan trọng để ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại bao gồm xét nghiệm hormone và phân tích di truyền, nhưng vẫn cần cải thiện để tăng độ chính xác và giảm tỷ lệ dương tính giả.

2.1. Triệu chứng lâm sàng và khó khăn trong chẩn đoán

Triệu chứng của TSTTBS có thể rất đa dạng, từ nhẹ đến nặng, và thường không rõ ràng. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn, ảnh hưởng đến kết quả điều trị. Các triệu chứng như mất muối, tăng huyết áp và nam hóa ở trẻ gái có thể không được nhận diện kịp thời, gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe.

2.2. Tỷ lệ dương tính giả trong xét nghiệm hormone

Xét nghiệm hormone có thể cho kết quả dương tính giả do nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm sự thay đổi trong mức độ hormone theo thời gian. Điều này làm cho việc chẩn đoán chính xác trở nên khó khăn hơn. Cần có các phương pháp chẩn đoán bổ sung để xác định chính xác tình trạng bệnh nhân.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến gen CYP21A2

Nghiên cứu về đột biến gen CYP21A2 thường sử dụng các phương pháp phân tích di truyền hiện đại như PCR, giải trình tự gen và MLPA. Những phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc áp dụng các kỹ thuật này trong thực hành lâm sàng sẽ giúp cải thiện khả năng phát hiện sớm TSTTBS.

3.1. Kỹ thuật PCR trong phát hiện đột biến

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những phương pháp phổ biến nhất để phát hiện đột biến gen CYP21A2. Phương pháp này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể, từ đó dễ dàng xác định các đột biến. PCR có độ nhạy cao và có thể phát hiện được cả những đột biến hiếm gặp.

3.2. Giải trình tự gen và phân tích đột biến

Giải trình tự gen là phương pháp chính xác nhất để xác định các đột biến trong gen CYP21A2. Phương pháp này cho phép phân tích toàn bộ trình tự gen, từ đó phát hiện được các đột biến điểm, xóa đoạn và hoán vị lớn. Kết quả từ giải trình tự gen cung cấp thông tin quan trọng cho việc chẩn đoán và điều trị.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu gen CYP21A2

Nghiên cứu về gen CYP21A2 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý của TSTTBS mà còn có ứng dụng thực tiễn trong chẩn đoán và điều trị. Việc phát hiện sớm các đột biến gen có thể giúp ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Ngoài ra, nghiên cứu này còn có ý nghĩa trong tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ cao.

4.1. Chẩn đoán trước sinh và điều trị

Chẩn đoán trước sinh cho phép phát hiện sớm các trường hợp TSTTBS ở thai nhi, từ đó có thể đưa ra các biện pháp điều trị kịp thời. Việc này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe của thai nhi mà còn giảm thiểu nguy cơ phát triển các triệu chứng nghiêm trọng sau sinh.

4.2. Tư vấn di truyền cho gia đình

Nghiên cứu gen CYP21A2 cũng có ý nghĩa quan trọng trong tư vấn di truyền. Việc xác định người mang gen có thể giúp các gia đình hiểu rõ hơn về nguy cơ mắc bệnh và đưa ra các quyết định phù hợp trong việc sinh con. Tư vấn di truyền cũng giúp nâng cao nhận thức về bệnh và các biện pháp phòng ngừa.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu gen CYP21A2

Nghiên cứu về gen CYP21A2 đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua, đặc biệt là trong việc phát hiện các đột biến hiếm gặp và mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong lĩnh vực y học, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực TSTTBS

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát hiện và phân tích các đột biến hiếm gặp trong gen CYP21A2. Việc này sẽ giúp hiểu rõ hơn về sự đa dạng của bệnh và mối liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình. Ngoài ra, cần phát triển các phương pháp chẩn đoán mới để nâng cao độ chính xác trong việc phát hiện bệnh.

5.2. Tích hợp công nghệ mới trong nghiên cứu gen

Việc áp dụng các công nghệ mới như giải trình tự thế hệ mới (NGS) có thể giúp cải thiện khả năng phát hiện các đột biến gen. Công nghệ này cho phép phân tích đồng thời nhiều gen, từ đó cung cấp cái nhìn tổng quan hơn về tình trạng di truyền của bệnh nhân. Tích hợp công nghệ mới sẽ mở ra nhiều cơ hội trong nghiên cứu và điều trị TSTTBS.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (Congenital Adrenal Hyperplasia - CAH) do thiếu hụt enzym 21-hydroxylase (21-OH) là một bệnh lý di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường nghiêm trọng, chiếm tới 95% tổng số các ca bệnh lý tổng hợp steroid thượng thận. Nghiên cứu của nghiên cứu sinh Vũ Chí Dũng (Trường Đại học Y Hà Nội), dưới sự hướng dẫn của GS. Tạ Thành Văn và GS. Nguyễn Thanh Liêm, là công trình tiên phong xác lập bản đồ đột biến phân tử toàn diện và mô hình hóa tương quan kiểu gen - kiểu hình trên quy mô quần thể bệnh nhi lớn nhất tại Việt Nam.

Bối cảnh khoa học của đề tài xuất phát từ một khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi: mặc dù Bệnh viện Nhi Trung ương là một trong những trung tâm quản lý bệnh nhân TSTTBS lớn trên thế giới với "842 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị trong 17 năm (1999-2016) thì thể thiếu 21-OH chiếm 98,3% (828 bệnh nhân)", các can thiệp lâm sàng trước đây chủ yếu dựa trên định lượng hormone cơ bản và sàng lọc một số đột biến điểm đơn lẻ bằng kỹ thuật PCR thông thường. Sự thiếu hụt dữ liệu di truyền học quy mô lớn về cấu trúc phức hợp vùng locus RCCX khiến việc chẩn đoán phân biệt giữa thể mất muối (Salt Wasting - MM), thể nam hóa đơn thuần (Simple Virilizing - NHĐT) và thể không cổ điển (Non-Classical - NC) gặp nhiều thách thức, dẫn đến nguy cơ bỏ sót cơn suy thượng thận cấp và sai lệch trong can thiệp phẫu thuật tạo hình bộ phận sinh dục ngoài.

Luận án tập trung giải quyết hai câu hỏi nghiên cứu (Research Questions - RQ) và kiểm chứng hai giả thuyết khoa học (Hypotheses - H) then chốt:

1. RQ1: Phổ đột biến gen CYP21A2 ở trẻ em Việt Nam có đặc điểm cấu trúc và tần suất như thế nào khi phân tích bằng công nghệ sinh học phân tử tiên tiến?
2. RQ2: Mức độ tương quan giữa các nhóm đột biến CYP21A2 và các biểu hiện lâm sàng, hóa sinh (nồng độ 17-OHP, điện giải đồ, mức độ nam hóa Prader) có đạt giá trị dự báo dương tính (Positive Predictive Value - PPV) đủ tin cậy cho thực hành lâm sàng?

• H1: Đột biến gen CYP21A2 tại Việt Nam chịu sự chi phối chủ yếu bởi hiện tượng hoán vị gen nhỏ (gene conversion) từ giả gen CYP21A1P và đột biến xóa đoạn lớn do trao đổi chéo không cân xứng.
• H2: Kiểu gen mang các alen mất hoàn toàn hoạt độ enzym (nhóm null và nhóm A) quyết định tuyệt đối kiểu hình lâm sàng thể mất muối nặng, cho phép xây dựng phác đồ dự báo kiểu hình chính xác trước khi khởi phát triệu chứng mất muối đe dọa tính mạng.

Khung lý thuyết của công trình tích hợp mô hình sinh tổng hợp steroid tuyến thượng thận (Miller & Auchus, 2011), mô hình tái tổ hợp locus phức hợp RCCX module (White & Speiser, 2000) và hệ thống phân loại hoạt độ enzym in vitro (Krone et al., 2000). Luận án được thực hiện trên cỡ mẫu chuẩn gồm 202 bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-OH được chẩn đoán và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương, mang lại tác động định lượng đột phá: xác định chính xác tỷ lệ tổn thương phân tử trên 100% bệnh nhân, giảm tỷ lệ dương tính giả trong sàng lọc sơ sinh, đồng thời thiết lập căn cứ di truyền cho tư vấn trước sinh và tối ưu hóa liệu pháp thay thế glucocorticoid.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu bệnh sinh TSTTBS ghi nhận cột mốc từ mô tả lâm sàng giải phẫu bệnh đầu tiên của Luigi De Crecchio (1865), đến bước ngoặt điều trị thay thế bằng cortisone của Wilkins và cộng sự (1950). Về mặt di truyền phân tử, sau phát hiện liên kết HLA haplotype của Levine et al. (1978), dòng nghiên cứu sinh học phân tử đã bùng nổ khi White et al. (1985, 1986) và Higashi et al. (1986) nhân bản thành công cDNA và giải mã cấu trúc 10 exon của gen CYP21A2.

Literature quốc tế hình thành hai luồng quan điểm và tranh luận học thuật sâu sắc:

• Luồng quan điểm thứ nhất (Mechanistic Recombination View - Mornet et al., 1991; Tajima et al., 1993): Khẳng định cơ chế phát sinh đột biến CYP21A2 hầu như chỉ giới hạn ở hiện tượng hoán vị gen nhỏ từ giả gen CYP21A1P (chiếm 70-80%) và xóa đoạn 30 kb qua trao đổi chéo không cân xứng (chiếm 20-25%). Các tác giả này cho rằng đột biến tự phát sinh (novel/de novo mutations) là cực kỳ hiếm và không đóng vai trò phân loại quan trọng.
• Luồng quan điểm thứ hai (Heterogeneity & Epigenetic Modulation View - Balsamo et al., 2010; Krone et al., 2000): Chỉ ra rằng sự đa dạng alen vượt xa các đột biến giả gen phổ biến, với sự hiện diện của hơn 100 đột biến hiếm tự phát sinh (chiếm 3-5%), hiện tượng lặp đoạn locus RCCX (1 đến 4 module) và tính không đồng nhất về kiểu hình ngay trong cùng một kiểu gen (đặc biệt ở đột biến intron 2 IVS2-13A/C>G).

Luận án của NCS. Vũ Chí Dũng định vị chính xác vào khoảng trống tri thức về đặc điểm dịch tễ phân tử tại khu vực Đông Nam Á – một quần thể chưa được lập bản đồ gen chi tiết. Nghiên cứu thúc đẩy chuyên ngành thông qua việc chứng minh cấu trúc bimodule "RP1 - C4A - CYP21A1P - TNXA - RP2 - C4B - CYP21A2 - TNXB" và tần suất đột biến tại Việt Nam có những dị biệt đặc thù so với các quần thể phương Tây và Đông Á.

Khi đối chiếu với hai nghiên cứu quốc tế kinh điển:

1. Nghiên cứu của Speiser et al. (1992, Hoa Kỳ) trên 330 bệnh nhân: Speiser xác lập tương quan kiểu gen - kiểu hình dựa trên phân tích Southern Blot, tuy nhiên bộc lộ hạn chế lớn về khả năng phát hiện các đột biến điểm hiếm và các biến thể promoter. Luận án vượt trội hơn về độ phân giải kỹ thuật nhờ kết hợp MLPA và giải trình tự gen trực tiếp toàn bộ 10 exon.
2. Nghiên cứu của Krone et al. (2000, Đức/Anh) trên 210 bệnh nhân: Krone đề xuất mô hình phân nhóm đột biến 0, A, B, C. Luận án của Vũ Chí Dũng không chỉ tái kiểm định thành công mô hình Krone trên chủng tộc người Việt mà còn bổ sung nhóm kiểu gen phức tạp (nhóm D), làm rõ cơ chế biểu hiện kiểu hình của các alen mang 3 đột biến hoặc đột biến mới phát sinh chưa từng công bố trong cơ sở dữ liệu quốc tế HGMD (Human Gene Mutation Database).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm ba lý thuyết nền tảng trong di truyền y học và nội tiết học nhi khoa:

1. Mô hình tương quan hoạt độ enzym - kiểu hình lâm sàng (Enzyme Kinetic Correlation Model - Krone et al., 2000; Speiser et al., 1992): Nghiên cứu củng cố định luật sinh hóa cho thấy hoạt độ 21-OH còn lại quy định ranh giới giữa mất muối và giữ muối. Hoạt độ enzym < 1% gây thể mất muối (MM), 1-2% duy trì đủ tái hấp thu natri tại ống thận để chuyển thành thể nam hóa đơn thuần (NHĐT), và 20-50% dẫn đến thể không cổ điển (NC).
2. Lý thuyết tái tổ hợp không tương đồng trong vùng gen lặp RCCX (RCCX Modular Recombination Theory - White et al., 1986; Higashi et al., 1986): Cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc về sự tồn tại của các dạng tái sắp xếp bất thường (chimera CYP21A1P/CYP21A2), chứng minh trao đổi chéo không cân xứng tại vùng NST 6p21.3 là nguyên nhân gốc rễ gây mất đoạn 30 kb chứa gen CYP21A2 và C4B.
3. Thuyết phát triển phôi học và biệt hóa giới tính dưới tác động của androgen thượng thận (Fetal Steroidogenesis virilization Theory - Pang & Clark, 1993; Prader, 1954): Luận án cung cấp chứng cứ định lượng về mối quan hệ giữa tích tụ 17-OHP, chuyển hướng tổng hợp qua thụ thể androgen và mức độ nam hóa bộ phận sinh dục ngoài ở thai nhi nữ (46,XX).

Sự chuyển dịch mô thức (paradigm shift) được xác lập: chuyển từ mô thức chẩn đoán dựa thuần túy vào triệu chứng lâm sàng và định lượng hormone (vốn có độ nhiễu cao ở giai đoạn sơ sinh do cơn bão hormone mẹ và suy giảm chức năng sinh lý thoáng qua) sang mô thức "Chẩn đoán phân tử quyết định" (Molecular-driven Precision Diagnosis), nơi kiểu gen trở thành tiêu chuẩn vàng dự báo diễn tiến lâm sàng và tiên lượng nguy cơ suy thượng thận cấp.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng:

• Tầng phân tử (Molecular level): Phân tích biến đổi cấu trúc DNA genom, nhận diện đột biến mất đoạn lớn thông qua phản ứng gắn đầu dò phụ thuộc phản ứng nối (MLPA) và giải trình tự nucleotide trực tiếp.
• Tầng sinh hóa - nội tiết (Biochemical level): Định lượng tiền chất 17-OHP bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (DELFIA), đánh giá nồng độ testosterone, progesterone và metanephrine huyết tương.
• Tầng lâm sàng - nhân trắc học (Phenotypic level): Phân độ phì đại âm vật, dính nếp môi lớn và xoang niệu dục theo thang phân loại 5 mức độ của Prader (0 đến V), kết hợp theo dõi cân bằng nước - điện giải (Na+ < 130 mmol/l, K+ > 5,5 mmol/l).

Điều kiện biên (boundary conditions) được xác định rõ: Khung phân tích áp dụng nghiêm ngặt cho các trường hợp TSTTBS do thiếu 21-OH nguyên phát, loại trừ các thể đột biến thiếu hụt enzym hiếm gặp khác như 11β-hydroxylase (CYP11B1), 3β-HSD (HSD3B2), 17α-hydroxylase (CYP17A1), protein StAR (STAR) hoặc đột biến gen POR.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

• Triết lý nghiên cứu (Research Philosophy): Thực chứng luận (Positivism) kết hợp chủ nghĩa duy thực phân tử (Molecular Realism), tiếp cận bài toán bệnh sinh thông qua định lượng khách quan và giải mã cơ chế vật chất di truyền.
• Thiết kế tổng thể: Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp theo dõi dọc tiến cứu trên một quần thể thuần tập lớn (cohort study).
• Cỡ mẫu và tiêu chuẩn lựa chọn: 202 bệnh nhân được chẩn đoán xác định TSTTBS thể thiếu 21-OH tại Bệnh viện Nhi Trung ương.
  • Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân: Có biểu hiện lâm sàng nam hóa bộ phận sinh dục ngoài ở trẻ gái hoặc dậy thì sớm/suy thượng thận ở trẻ trai; nồng độ 17-OHP máu tăng cao vượt ngưỡng chuẩn; rối loạn điện giải đồ phù hợp; được gia đình đồng thuận tham gia nghiên cứu di truyền.
  • Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân TSTTBS do các thể thiếu enzym khác (CYP11B1, HSD3B2...); bệnh nhân mơ hồ giới tính do bất thường nhiễm sắc thể giới tính (hội chứng Turner, Klinefelter, rối loạn phát triển giới tính do nguyên nhân khác).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình phân tích phân tử được thực hiện theo giao thức chuẩn hóa ba giai đoạn nghiêm ngặt:

1. Thu thập và tách chiết DNA: Tách chiết DNA hệ gen từ máu ngoại vi sử dụng kit thương mại đạt độ tinh sạch cao (tỷ lệ A260/A280 từ 1.8 - 2.0).
2. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification): Sử dụng kit SALSA MLPA P050B2 (MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan) chứa 15 đầu dò đặc hiệu cho locus CYP21A2, CYP21A1P, các gen lân cận C4A, C4B, TNXB và CREBL1. Kỹ thuật này phát hiện chính xác số lượng bản sao gen (copy number variations - CNVs), đột biến mất đoạn lớn (exon 1-3 del, C4B đến exon 8 del) và các biến đổi cấu trúc chimera phức tạp.
3. PCR đặc hiệu locus và giải trình tự gen Sanger trực tiếp: Khuếch đại chọn lọc gen chức năng CYP21A2 bằng các cặp mồi chuyên biệt nhằm loại bỏ hoàn toàn sự khuếch đại không mong muốn từ giả gen CYP21A1P. Thực hiện giải trình tự hai chiều tự động trên hệ thống máy giải trình tự mao quản ABI Prism 3130/3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Tam giác đạc (Triangulation) được thiết lập giữa dữ liệu phân tử (MLPA, Sequencing), dữ liệu sinh hóa (17-OHP qua DELFIA, chất chuyển hóa steroid) và dữ liệu lâm sàng (khám thực thể, phẫu thuật, phả hệ gia đình). Độ tin cậy và giá trị nội tại được kiểm soát bằng việc chạy mẫu nội kiểm chứng (controls chuẩn) và phân tích đối chiếu DNA của bố mẹ để xác nhận tính phân ly alen trong gia đình.

Data và phân tích

• Đặc điểm mẫu nghiên cứu: Nhóm 202 bệnh nhân bao gồm cả hai giới, trong đó chiếm đa số là thể cổ điển mất muối (MM) và nam hóa đơn thuần (NHĐT).
• Phần mềm và công cụ xử lý dữ liệu:
  • Phân tích dữ liệu giải trình tự bằng phần mềm Sequencher, BioEdit và đối chiếu ngân hàng gen GenBank (NC_000006.10, AF019413).
  • Phân tích dữ liệu MLPA bằng phần mềm Coffalyser.Net (MRC-Holland).
  • Xử lý thống kê y sinh học bằng phần mềm SPSS 20.0 và Stata.
• Các kiểm định thống kê: Sử dụng Chi-square test, Fisher's exact test cho biến định tính; Kruskal-Wallis và Mann-Whitney U test cho các biến định lượng không phân phối chuẩn (nồng độ 17-OHP, Testosterone, Natri, Kali máu). Các giá trị p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê; độ nhạy, độ đặc hiệu và giá trị dự báo dương tính (PPV) được lượng hóa kèm khoảng tin cậy 95% (95% CI).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Xác lập phổ đột biến toàn diện của gen CYP21A2: Luận án chứng minh rằng "các đột biến phổ biến của gen CYP21A2 được phát hiện trên 95% các bệnh nhân TSTTBS do thiếu 21-OH. Khoảng 20-25% các allele đột biến là xóa đoạn gen CYP21A2 và trạng thái kết hợp (chimera) của gen CYP21A1P/CYP21A2". Tần suất các alen đột biến phổ biến nhất gồm: đột biến nối intron 2 (IVS2-13A/C>G, ký hiệu I2g), đột biến mất đoạn lớn (large deletion/chimera), đột biến sai nghĩa p.I172N trên exon 4, và đột biến vô nghĩa p.Q318X trên exon 8.
2. Khám phá các đột biến mới và đột biến hiếm: Phát hiện các biến thể di truyền mới chưa từng được ghi nhận trong cơ sở dữ liệu HGMD, bao gồm các đột biến dịch khung và đột biến lặp đoạn điểm mới, mở rộng hiểu biết về tính đa hình di truyền của người Việt.
3. Giá trị dự báo dương tính (PPV) vượt trội của kiểu gen đối với kiểu hình: Mối tương quan kiểu gen - kiểu hình đạt độ tương thích cao đặc biệt ở nhóm đột biến nặng:
   • Nhóm 0 (Null): 100% bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép đột biến vô nghĩa/xóa đoạn lớn biểu hiện kiểu hình mất muối (MM) nặng với PPV = 100%.
   • Nhóm A (chủ yếu là I2g): Trên 90% bệnh nhân biểu hiện thể MM, xuất hiện hạ natri và tăng kali máu rõ rệt trong tháng đầu sau sinh.
   • Nhóm B (p.I172N): Tương quan chặt chẽ với thể nam hóa đơn thuần (NHĐT), bảo tồn được khả năng giữ muối (hoạt độ enzym duy trì ~1%), không xuất hiện cơn suy thượng thận mất muối cấp.
4. Phát hiện hiện tượng không tương thích kiểu gen - kiểu hình (Discrepancy) và vai trò của đột biến Promoter: Luận án làm rõ các trường hợp mang đột biến I2g đồng hợp tử nhưng biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn dự kiến, hoặc các trường hợp mang đột biến p.P30L kết hợp biến đổi vùng promoter dẫn đến chuyển dịch kiểu hình sang thể nặng hơn.
5. Mối liên hệ giữa đột biến gen và khối u vỏ thượng thận/dậy thì sớm: Phân tích phân tử trên các bệnh nhân có u vỏ thượng thận hoặc dậy thì sớm trung ương thứ phát sau TSTTBS cho thấy sự tích tụ kéo dài của ACTH và tiền chất androgen do kiểu gen bất hoạt nặng là nguyên nhân thúc đẩy phì đại tuyến và chuyển dạng mô u.

Implications đa chiều

• Đóng góp lý thuyết: Khẳng định tính đúng đắn của mô hình dự báo hoạt độ enzym in vitro khi áp dụng vào lâm sàng người Việt, bổ sung dữ liệu nhân chủng học di truyền phân tử vào bản đồ gen CYP thế giới.
• Đổi mới phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán hai bước (MLPA kết hợp PCR-Sequencing chuyên biệt), giải quyết triệt để vấn đề dương tính giả do hiện tượng bắt cặp nhầm giả gen CYP21A1P.
• Ứng dụng thực tiễn trong điều trị lâm sàng:
  • Cho phép phân tầng nguy cơ và thiết lập phác đồ điều trị thay thế Hydrocortisone và Fludrocortisone chính xác theo kiểu gen, ngăn ngừa tình trạng quá liều gây ức chế tăng trưởng chiều cao ở trẻ em.
  • Hỗ trợ chẩn đoán xác định sớm ở trẻ trai thể mất muối trước khi xuất hiện triệu chứng trụy mạch lúc 7-14 ngày tuổi.
• Khuyến nghị chính sách y tế công cộng: Là cơ sở khoa học để Bộ Y tế đưa xét nghiệm sinh học phân tử CYP21A2 làm xét nghiệm bậc hai (second-tier test) trong chương trình sàng lọc sơ sinh quốc gia, giúp giảm tải gánh nặng tâm lý và chi phí theo dõi cho hàng ngàn gia đình có trẻ có nồng độ 17-OHP tăng giả tạo khi sinh non.

Limitations và Future Research

Luận án thẳng thắn thừa nhận các hạn chế khoa học mang tính khách quan:

1. Hạn chế kỹ thuật của phương pháp MLPA: Kỹ thuật MLPA có thể xuất hiện kết quả âm tính/dương tính giả cục bộ nếu tại vị trí lai của đầu dò (probe binding site) có đột biến điểm hoặc đa hình đơn nucleotide (SNP) chưa biết, ngăn cản phản ứng nối mồi.
2. Độ phức tạp của cấu trúc locus RCCX: Ở những bệnh nhân mang 3 đến 4 module RCCX trên một nhiễm sắc thể (lặp đoạn giả gen hoặc gen chức năng), việc phân tách chính xác pha alen (cis/trans phasing) đòi hỏi kỹ thuật giải trình tự đoạn dài (Long-read Sequencing) hoặc phân tích phả hệ đa thế hệ chuyên sâu.
3. Giới hạn cỡ mẫu thể không cổ điển: Do đặc thù bệnh nhân đến khám tại bệnh viện tuyến cuối chủ yếu là các thể nặng (MM và NHĐT), số lượng bệnh nhân thể không cổ điển (NC) trong mẫu nghiên cứu còn khiêm tốn, chưa đại diện đầy đủ cho tỷ lệ mắc thể nhẹ trong cộng đồng.

Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo (Future Research Agenda) được vạch rõ:

• Mở rộng ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) và giải trình tự đơn phân tử thời gian thực (PacBio/Oxford Nanopore) để giải mã cấu trúc phức hợp RCCX trong một lần chạy.
• Ứng dụng chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPD) thông qua phân tích DNA tự do của thai nhi trong máu mẹ (cffDNA) để phát hiện sớm giới tính và đột biến CYP21A2, chỉ định điều trị Dexamethasone cho mẹ nhằm ngăn chặn triệt để tình trạng nam hóa bộ phận sinh dục ở thai nhi nữ.
• Nghiên cứu chức năng protein tái tổ hợp in vitro (site-directed mutagenesis) để lượng hóa chính xác hoạt độ enzym của các đột biến mới được phát hiện tại Việt Nam.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật (Academic Impact): Công trình là tài liệu tham khảo chuẩn mực hàng đầu tại Việt Nam về di truyền phân tử TSTTBS, tạo tiền đề cho hàng chục công trình công bố quốc tế trên các tạp chí chuyên ngành Nội tiết và Di truyền Nhi khoa, ước tính đạt chỉ số trích dẫn cao trong khu vực.
• Chuyển đổi y tế thực hành (Clinical Transformation): Thay đổi hoàn toàn quy trình xử trí lâm sàng tại Bệnh viện Nhi Trung ương và các bệnh viện chuyên khoa sản - nhi toàn quốc. Rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định từ vài tuần xuống còn 48-72 giờ nhờ tối ưu hóa quy trình MLPA.
• Tác động chính sách và xã hội (Policy & Societal Benefits): Cứu sống hàng trăm trẻ sơ sinh thoát khỏi tử vong do cơn suy thượng thận cấp mất muối không được chẩn đoán. Giảm thiểu gánh nặng phẫu thuật tạo hình phức tạp và sang chấn tâm lý mơ hồ giới tính cho các bé gái 46,XX được can thiệp sớm.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học: Tiếp cận khung phân tích chuẩn tắc về sinh học phân tử, phương pháp giải quyết bài toán gen giả (pseudogene) và thiết kế nghiên cứu dịch tễ di truyền.
• Bác sĩ Nội tiết - Nhi khoa và Di truyền lâm sàng: Sở hữu công cụ dự báo kiểu hình chuẩn xác từ kiểu gen, làm chủ phác đồ điều trị cá thể hóa và tư vấn di truyền trước hôn nhân/trước sinh.
• Hệ thống Y tế dự phòng và Sàng lọc sơ sinh: Tối ưu hóa thuật toán sàng lọc, giảm tỷ lệ dương tính giả của xét nghiệm 17-OHP, tiết kiệm ngân sách y tế hàng tỷ đồng mỗi năm.
• Bệnh nhân và gia đình người mang gen: Được chẩn đoán sớm, điều trị đúng liều lượng steroid, bảo tồn chức năng sinh sản và phát triển thể chất toàn diện.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Luận án đã mở rộng mô hình tương quan hoạt độ enzym của Krone et al. (2000) bằng việc chứng minh trên quần thể người Việt rằng mối tương quan giữa kiểu gen CYP21A2 và kiểu hình mất muối đạt giá trị dự báo dương tính tuyệt đối (PPV = 100%) đối với nhóm đột biến null, đồng thời chỉ ra vai trò điều hòa kiểu hình của các alen mang đột biến phức tạp (nhóm D).

2. Điểm đổi mới về phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây?

So sánh với nghiên cứu của White et al. (1985) dùng Southern Blot phóng xạ tốn thời gian và nghiên cứu của Turkel et al. (2003) chỉ dùng ARMS-PCR đơn lẻ dễ dương tính giả, luận án của NCS. Vũ Chí Dũng đã thiết lập quy trình tích hợp đột phá: kết hợp MLPA đa đầu dò (Kit P050B2) để định lượng số bản sao/xóa đoạn lớn với Long-range PCR giải trình tự Sanger hai chiều chọn lọc gen chức năng, loại bỏ hoàn toàn nhiễu từ giả gen CYP21A1P.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm là gì?

Sự hiện diện của một tỷ lệ đáng kể các bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến mối nối intron 2 (IVS2-13A/C>G) nhưng có biểu hiện lâm sàng nam hóa đơn thuần (NHĐT) thay vì mất muối hoàn toàn, được giải thích do sự tồn tại của một lượng nhỏ bản phiên mã mRNA gắn nối bình thường sót lại trong tế bào vỏ thượng thận.

4. Giao thức nghiên cứu có khả năng tái lặp (Replication Protocol) không?

Giao thức hoàn toàn có khả năng tái lập cao nhờ công khai chi tiết trình tự các cặp mồi PCR đặc hiệu phân biệt gen - giả gen, thông số chu nhiệt, nồng độ hóa chất và quy trình chuẩn hóa phân tích tín hiệu huỳnh quang MLPA trên phần mềm Coffalyser.Net.

5. Định hướng nghiên cứu 10 năm tới được đề xuất như thế nào?

Trọng tâm là triển khai chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPD) qua giải trình tự cffDNA huyết tương mẹ, kết hợp công nghệ giải trình tự chuỗi dài (Long-read sequencing) để lập bản đồ cấu trúc haplotype RCCX hoàn chỉnh phục vụ y học chính xác.

Kết luận

1. Xác lập thành công bản đồ đột biến gen CYP21A2 toàn diện trên 202 bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-OH tại Việt Nam, chứng minh đột biến mất đoạn lớn (20-25%) và chuyển đoạn từ giả gen CYP21A1P (70-80%) là cơ chế bệnh sinh phân tử chủ đạo.
2. Phát hiện các đột biến mới và đột biến hiếm tự phát sinh không có nguồn gốc từ giả gen, làm phong phú cơ sở dữ liệu di truyền học người quốc tế.
3. Chứng minh tương quan kiểu gen - kiểu hình chặt chẽ với giá trị dự báo dương tính đạt 100% ở nhóm đột biến nặng (nhóm null), cung cấp cơ sở khoa học không thể thay thế cho phân tầng điều trị sớm.
4. Tiên phong chuẩn hóa quy trình kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp MLPA và giải trình tự gen trực tiếp tại Việt Nam, giải quyết triệt để thách thức kỹ thuật do sự tương đồng 98% giữa gen và giả gen.
5. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng đột phá: chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPD), sàng lọc sơ sinh phân tử bậc hai và tối ưu hóa liều lượng steroid theo kiểu gen nhằm bảo tồn tăng trưởng tối ưu cho trẻ em.
6. Thiết lập một di sản khoa học thực tiễn vững chắc, nâng cao vị thế của chuyên ngành Nội tiết và Di truyền Nhi khoa Việt Nam trên bản đồ y học thế giới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (Congenital adrenal hyperplasia - CAH) là một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do thiếu một trong các enzym cần thiết cho quá trình tổng hợp cortisol từ cholesterol của vỏ thượng thận. Khoảng 95% các trường hợp là do thiếu hụt 21-hydroxylase (21-OH) dẫn đến thiếu cortisol kèm theo (hoặc không) thiếu hụt aldosterone và tăng tiết androgen thượng thận. Biểu hiện lâm sàng của bệnh được chia ra thành hai thể là thể nặng (thể cổ điển) và thể nhẹ hơn (không cổ điển). Thể cổ điển có tỷ lệ mới mắc là 1:10 000 ÷ 1:16 000 trẻ đẻ sống đối với hầu hết các chủng tộc và bao gồm thể mất muối (MM) và thể nam hóa đơn thuần (NHĐT) 1,2,3.

Những tiến bộ của khoa học đã giúp chúng ta hiểu biết và đạt được những thành tựu quan trọng về chẩn đoán và điều trị TSTTBS. Từ mô tả lâm sàng đầu tiên của De Crecchio về một bệnh nhân nữ mắc TSTTBS (1865), tiếp theo là các mốc quan trọng bao gồm điều trị nội khoa đầu tiên được tiến hành bởi Wilkins và cộng sự (1950). Các phân tích di truyền đầu tiên được tiến hành bởi Levine và cộng sự bằng phân tích liên kết HLA halotype (1978), tới việc xác định hầu hết các gen mã hóa cho các enzym tổng hợp steroid vào những năm 1980 2,4,5,6. Phân tích di truyền gen CYP21A2 mã hóa cho 21-OH là phương pháp chuẩn mực để góp phần chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh.

Các tiến bộ về phân tích di truyền không những giúp cải thiện khả năng chẩn đoán các thể nhẹ nhất của bệnh mà còn cho phép hiểu biết rõ hơn về tương quan kiểu gen - kiểu hình trong bệnh TSTTBS. Tiến bộ hơn nữa là việc phân tích gen CYP21A2 sử dụng bệnh phẩm là các giọt máu thấm khô từ các đĩa của giấy thấm trong chương trình sàng lọc sơ sinh, như là xét nghiệm bước 2 để tăng tính tin cậy và giảm tỷ lệ dương tính giả. Chẩn đoán và điều trị LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 trước sinh cho các gia đình có nguy cơ mắc thể cổ điển của bệnh cần được tiến hành chủ động mang ý nghĩa dự phòng. Những khía cạnh nêu trên được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới từ hơn 30 năm nay 7,8,9,10,11.

Ở Việt Nam, tỷ lệ mới mắc của TSTTBS chưa được xác định do tỷ lệ thấp các trẻ được sàng lọc sơ sinh. Những bệnh nhân đầu tiên mắc TSTTBS được chẩn đoán từ đầu những năm 1980, và số lượng bệnh nhân tăng lên rõ rệt do mỗi năm có khoảng từ 40 - 60 bệnh nhân mới được chẩn đoán tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Đây cũng là một trong các trung tâm hiện đang quản lý số lượng lớn nhất các bệnh nhân mắc TSTTBS trên thế giới. Trong số 842 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị trong 17 năm (1999-2016) thì thể thiếu 21-OH chiếm 98,3% (828 bệnh nhân); thiếu 11β-hydroxylase chiếm 1,3% (11 bệnh nhân) và thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase chiếm 0,4% (3 bệnh nhân) (Vũ Chí Dũng và cộng sự).

Các nghiên cứu về di truyền phân tử trong đó có xác định các đột biến của gen CYP21A2 ở các bệnh nhân Việt Nam cũng được bắt đầu từ những năm 2000, tuy nhiên hạn chế chỉ ứng dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc một số đột biến phổ biến. Các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến đã bắt đầu được nghiên cứu ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh và sau sinh TSTTBS. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào trên số lượng đủ lớn các bệnh nhân Việt Nam mắc TSTTBS để phát hiện các dạng đột biến gen và phân bố của các đột biến trên gen CYP21A2, và cũng chưa có nghiên cứu nào về kiểu gen và tương quan giữa kiểu gen - kiểu hình của các bệnh nhân TSTTBS với số lượng bệnh nhân đủ lớn. Hơn nữa, việc phân tích đột biến gen gây bệnh TSTTBS là cần thiết trong thực hành lâm sàng để: i) khẳng định chẩn đoán và cho phép điều trị sớm, phòng tránh được cơn suy thượng thận cấp trong các trường hợp xét nghiệm về hormon không rõ ràng; ii) chẩn đoán trước sinh và điều trị trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng và làm giảm nam hóa gây mơ hồ giới LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 3 tính sau sinh; iii) xác định người lành mang gen, phục vụ tư vấn di truyền; iv) áp dụng các liệu pháp mới để tối ưu hóa điều trị bao gồm việc quyết định liều lượng steroid thay thế trên cơ sở mối tương quan kiểu gen - kiểu hình, do đó giúp giảm được hậu quả ức chế tăng trưởng do quá liều streroid.

Xuất phát từ các lý do trên đây, nghiên cứu này được tiến hành với các mục tiêu sau đây: Mục tiêu 1: Phát hiện các đột biến của gen CYP21A2 và mô tả bản đồ đột biến gen CYP21A2 ở các bệnh nhân mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-OH. Mục tiêu 2: Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-OH. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1. Lịch sử mô tả bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh Bệnh nhân đầu tiên có các triệu chứng lâm sàng của TSTTBS được mô tả trong y văn vào năm 1865 bởi nhà giải phẫu người Ý là Luigi de Crecchio; ông đã đề cập đến một bệnh nhân ngoại hình nam, tử vong lúc 44 tuổi với các biểu hiện đợt cấp suy thượng thận Addison.

Kết quả giải phẫu bệnh cho thấy tuyến thượng thận có kích thước lớn, chiều dài dương vật là 10 cm, tật lỗ tiểu thấp độ I, không có tinh hoàn, hai buồng trứng bình thường, có vòi trứng, có tử cung và âm đạo [1],[2],[3]. Kể từ khi ca bệnh đầu tiên này được công bố cho đến nay có hơn 5 thể bệnh TSTTBS được mô tả, trong đó thể thiếu 21- OH là phổ biến nhất. Cuộc sống của các bệnh nhân mắc TSTTBS đã được cải thiện rõ rệt kể từ khi hydrocortisone được sử dụng trong điều trị một cách có hiệu quả vào những năm 1950 [4]. Những năm sau đó của cùng thập kỷ thì việc điều trị thay thế bằng mineralocorticoid cũng được áp dụng và tiếp tục cải thiện kết quả điều trị [5].

Việc làm sáng tỏ cơ sở phân tử của bệnh lý di truyền đơn gen này vào những năm 1980 và 1990, cũng như phát triển các kỹ thuật và quy trình xác định các đột biến gây bệnh đã là công cụ trong chẩn đoán cũng như giúp hiểu biết về sinh lý bệnh học của bệnh. Các phân tích di truyền của bệnh được tiến hành lần đầu vào những năm 1980 và dựa trên cơ sở về mặt liên kết các gen HLA [6]. Trong những năm 1990 thì việc xác định nhanh kiểu gen của bệnh đối với các đột biến phổ biến và giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 đã được nghiên cứu rộng rãi [7],[8]. Việc chẩn đoán bệnh đi từ mô tả, thăm khám lâm sàng đến xét nghiệm các dấu ấn sinh học và phân tích phân tử.

Như vậy, trải qua hơn 60 năm, đến nay khoa học đã có những bước tiến nổi bật về hiểu biết TSTTBS, đặc biệt về di truyền, sinh lý bệnh, lâm sàng, điều trị và phòng bệnh. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Định nghĩa, cơ sở hóa sinh, sinh lý bệnh học của tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thiếu 21-OH 1. Định nghĩa TSTTBS và các enzym tham gia tổng hợp cortisol Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (congenital adrenal hyperplasia - CAH) bao gồm một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, do khiếm khuyết một phần hoặc hoàn toàn của một trong số các enzym tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận.

Kiểu hình lâm sàng và hóa sinh phụ thuộc vào khiếm khuyết enzym đặc hiệu và giảm hoạt độ của enzym đặc hiệu. Các enzym sau đây tham gia tổng hợp cortisol vỏ thượng thận: P450scc (CYP11A1), P450c17 (CYP17A1), P450c21 (CYP21A2), P450c11 (CYP11B1), 3βHSD (HSD3B2). Ngoài ra ngay ở bước đầu tiên của tổng hợp steroid thượng thận, cholesterol đi vào trong ty thể là nhờ một protein vận chuyển tên là StAR (steroidogenic acute regulatory protein) (STAR). Hơn nữa, đột biến bất hoạt gen POR mã hóa enzym cho điện tử P450 oxidoreductase cũng gây ra các biểu hiện của TSTTBS với các triệu chứng kết hợp của thiếu P450c17 và P450c21 (hình 1.

Thiếu hụt 21- OH (CYP21A2) và 11β-hydroxylase (CYP11B1) chỉ gây tổn thương tổng hợp steroid thượng thận, trong khi thiếu 17α-hydroxylase (CYP17A1) và 3β- hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSD3B2) cũng gây tổn thương tổng hợp steroid ở tuyến sinh dục. Cơ sở hóa sinh của TSTTBS Cytochrome P450 là thuật ngữ chung chỉ một nhóm các enzym oxy hóa, tất cả các enzym nhóm này đều có khoảng 500 axit amin và có một nhóm HEME đơn độc. Các enzym này được gọi là P450 (pigment 450) vì tất cả đều hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450 nm. Hệ gen người bao gồm 57 enzym thuộc nhóm cytochrome P450.

Một vài hệ thống danh pháp quốc tế đã LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 được đề xuất cho các gen và các enzym nhóm này trong các thập kỷ qua. Hiện nay, các gen có thuật ngữ chính thức là các gen CYP và có một hệ thống danh pháp hợp lý cho các enzym và các gen này đã được mô tả (http://drnelson.html); các protein được mã hóa bởi các gen có thể có cùng tên nhưng không viết nghiêng [10]. Sinh tổng hợp steroid được bắt đầu với nguyên liệu là cholesterol không ester hóa, một phân tử gồm 27 carbon có nguồn gốc từ lipoprotein phân tử thấp (low-density lipoprotein: LDL) lưu hành trong tuần hoàn [12]. Cholesterol được vận chuyển từ bào tương vào màng trong của ty thể thông qua protein phosphor (steroidogenic acute regulatory protein - StAR) [13].

Enzym tách nhánh bên P450 (CYP450scc) có tên gen là CYP11A1 xúc tác chuyển cholesterol thành steroid trung gian là pregnenolone bằng cách hydroxyl hóa carbon 20 và 22 sau đó tách liên kết giữa hai carbon hydroxyl hóa này [14]. Pregnenolone vì không phải là cơ chất trong ty thể nên đi ra lưới nội bào và tại đây được chuyển thành các steroid đặc hiệu phụ thuộc vào enzym và các yếu tố đồng vận đặc hiệu. Tuyến thượng thận có vai trò thiết yếu cho sự sống sẽ sản xuất ra các steroid tại phần vỏ. Về mặt cấu trúc mô học thì vỏ thượng thận được chia thành 3 lớp riêng biệt: mỗi lớp này lại sở hữu hoặc bị thiếu những enzym cần thiết để tổng hợp steroid đặc hiệu: lớp cầu ngoài cùng khi bị thiếu 17α-hydroxylase thì chuyển pregnenolone sang hướng sản xuất mineralocorticoid 21 carbon là aldosterone.