Nghiên Cứu Định Danh Và Tạo Bộ Tiểu Bản Vi Tảo Ở Khu Vực Phía Nam

Luận văn tốt nghiệp giáo dục nghiên cứu tốt nghiệp sư phạm khoa học tự nhiên định danh và tạo bộ tiêu bản hiển vi một số loài vi tảo lục ở, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Lại Thị Diễm Phúc
• Người hướng dẫn: ThS. Đỗ Thanh Trí
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sư Phạm Khoa Học Tự Nhiên
• Đề tài: Định Danh Và Tạo Bộ Tiêu Bản Hiển Vi Một Số Loài Vi Tảo Lục Ở Khu Vực Phía Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU VI TẢO
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH PHÂN TỬ
• 1.2.1. Phương pháp chỉ thị hình thái
• 1.2.2. Phương pháp chỉ thị phân tử
• 1.2.2.1. Chỉ thị mã vạch DNA (DNA barcode)
• 1.2.2.2. Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)
• 1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
• 1.3.2. Quy trình thực hiện nghiên cứu
• 1.3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.3.3.1. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái
• 1.3.3.2. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 1.3.3.3. Phương pháp PCR trình tự 18S và ITS
• 1.3.3.4. Phương pháp giải trình tự vùng ITS và vùng 18S và hiệu chỉnh trình tự
• 2. CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VI TẢO ĐƠN DÒNG
• 2.1.1. Chủng vi tảo CH01
• 2.1.2. Chủng vi tảo CH02
• 2.1.3. Chủng vi tảo CH03
• 2.1.4. Chủng vi tảo CH04
• 2.1.5. Chủng vi tảo CH05
• 2.1.6. Chủng vi tảo CH06
• 2.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA
• 2.3. KẾT QUẢ PCR VÙNG TRÌNH TỰ 18S VÀ ITS CÁC MẪU TẢO
• 2.3.1. Kết quả hiệu chỉnh quy trình và PCR vùng trình tự ITS
• 2.3.2. Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự vùng 18S và vùng ITS
• 2.3.3. Kết quả BLAST trình tự gene trên cơ sở dữ liệu NCBI
• 2.3.4. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự ITS của các mẫu vi tảo
• 2.3.5. So sánh kết quả định danh hình thái và định danh phân tử
• 2.4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Định Danh Vi Tảo Ở Miền Nam Việt Nam

Nghiên cứu định danh vi tảo ở khu vực phía Nam Việt Nam đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong sinh học biển. Vi tảo không chỉ đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái mà còn có tiềm năng ứng dụng lớn trong y tế và công nghiệp. Khu vực này với hệ thống sông ngòi phong phú là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của nhiều loài vi tảo. Tuy nhiên, việc định danh chính xác các loài vi tảo vẫn còn nhiều thách thức.

1.1. Tình Hình Nghiên Cứu Vi Tảo Ở Việt Nam

Việt Nam có nhiều nghiên cứu về vi tảo, nhưng chủ yếu tập trung vào các nghiên cứu cơ bản như phân loại và đa dạng sinh học. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra sự phong phú của các loài vi tảo ở miền Nam, nhưng vẫn cần nhiều nghiên cứu sâu hơn.

1.2. Đặc Điểm Sinh Thái Của Vi Tảo Ở Khu Vực Phía Nam

Khu vực phía Nam Việt Nam có điều kiện sinh thái đa dạng, từ rừng ngập mặn đến các hệ thống sông ngòi. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loài vi tảo, đặc biệt là vi tảo lục, với nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp và y tế.

II. Vấn Đề Định Danh Vi Tảo Ở Khu Vực Phía Nam Việt Nam

Việc định danh vi tảo ở miền Nam Việt Nam gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng và kích thước nhỏ của chúng. Nhiều loài vi tảo có hình thái tương tự nhau, dẫn đến việc phân loại không chính xác. Hơn nữa, các mẫu vi tảo thường bị nhiễm bẩn bởi các vi sinh vật khác, làm giảm độ chính xác trong nghiên cứu.

2.1. Thách Thức Trong Việc Định Danh

Sự tương đồng về hình thái giữa các loài vi tảo khiến cho việc định danh trở nên khó khăn. Nhiều nghiên cứu hiện tại vẫn chưa sử dụng các phương pháp phân tích phân tử để xác định chính xác các loài.

2.2. Ảnh Hưởng Của Môi Trường Đến Vi Tảo

Môi trường sống của vi tảo có thể thay đổi nhanh chóng, ảnh hưởng đến sự phát triển và phân bố của chúng. Việc nghiên cứu các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH và nồng độ dinh dưỡng là cần thiết để hiểu rõ hơn về sự đa dạng của vi tảo.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Định Danh Vi Tảo Hiệu Quả

Để định danh vi tảo một cách chính xác, cần áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại. Phương pháp phân tích phân tử như PCR và giải trình tự DNA đã được chứng minh là hiệu quả trong việc xác định các loài vi tảo. Những phương pháp này giúp tăng độ chính xác và giảm thiểu sai sót trong quá trình nghiên cứu.

3.1. Phương Pháp PCR Trong Nghiên Cứu Vi Tảo

Phương pháp PCR cho phép khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng của vi tảo, giúp xác định chính xác các loài. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu gần đây.

3.2. Giải Trình Tự DNA Để Định Danh

Giải trình tự DNA là một công cụ mạnh mẽ trong việc xác định các loài vi tảo. Phương pháp này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc gen, giúp phân loại chính xác hơn.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Vi Tảo

Nghiên cứu vi tảo không chỉ có giá trị trong khoa học mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Vi tảo có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, nhiên liệu sinh học và các sản phẩm y tế. Việc khai thác tiềm năng của vi tảo sẽ góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp sinh học.

4.1. Ứng Dụng Trong Y Tế

Vi tảo chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, có thể được sử dụng trong điều trị bệnh và cải thiện sức khỏe. Nghiên cứu về vi tảo lục đã chỉ ra khả năng chống oxy hóa và kháng viêm của chúng.

4.2. Tiềm Năng Trong Sản Xuất Nhiên Liệu Sinh Học

Vi tảo có khả năng sản xuất lipid cao, có thể được chuyển đổi thành nhiên liệu sinh học. Điều này mở ra cơ hội mới cho việc phát triển nguồn năng lượng tái tạo.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Định Danh Vi Tảo Ở Miền Nam Việt Nam

Nghiên cứu định danh vi tảo ở khu vực phía Nam Việt Nam là một lĩnh vực đầy tiềm năng nhưng cũng gặp nhiều thách thức. Cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn để xác định chính xác các loài vi tảo và khai thác tiềm năng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong nghiên cứu.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Vi Tảo

Nghiên cứu vi tảo sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của công nghệ hiện đại. Các nhà khoa học cần hợp tác để chia sẻ dữ liệu và kinh nghiệm, từ đó nâng cao chất lượng nghiên cứu.

5.2. Khuyến Nghị Cho Các Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần thiết lập các chương trình nghiên cứu dài hạn để theo dõi sự biến đổi của vi tảo trong môi trường. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu về vi tảo sẽ hỗ trợ cho các nghiên cứu trong tương lai.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Vi tảo lục (Chlorophyta) là nhóm vi sinh vật quang dưỡng đa dạng bậc nhất trên Trái Đất với hơn 40.000 loài đã được mô tả và ước tính thực tế có thể lên đến hàng triệu loài. Trong nền kinh tế sinh học hiện đại, vi tảo đóng vai trò trung tâm trong chuỗi sản xuất bền vững: sản xuất lipid chất lượng cao phục vụ nhiên liệu sinh học (diesel sinh học), tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học giá trị cao (carotenoid, astaxanthin, acid béo không bão hòa đa nối đôi PUFAs, protein đơn bào), xử lý ô nhiễm nước thải nhờ khả năng hấp thu kim loại nặng và cố định carbon dioxide ($CO_2$).

Tuy nhiên, việc nghiên cứu và khai thác vi tảo tại Việt Nam – đặc biệt là khu vực phía Nam với hệ sinh thái sông ngòi và rừng ngập mặn Cần Giờ phong phú – đang đối mặt với những rào cản kỹ thuật lớn:

• Tính đa hình và kích thước hiển vi cực nhỏ (2–10 µm): Các đặc điểm hình thái tế bào vi tảo rất đơn giản, dễ biến đổi theo điều kiện môi trường nuôi cấy (phenotypic plasticity), khiến phương pháp định danh truyền thống qua kính hiển vi quang học thường dẫn đến phân loại sai lệch ở cấp độ loài và chi.
• Hiện tượng tạp nhiễm quần thể tự nhiên: Mẫu vi tảo thu thập từ thủy vực tự nhiên luôn tồn tại dạng hỗn hợp nhiều chủng vi khuẩn, nấm và vi tảo khác nhau, gây khó khăn cho việc nghiên cứu độc lập tính trạng sinh học.
• Thiếu hụt học liệu tiêu bản cố định: Trong công tác giảng dạy thực hành sinh thái học và thực vật học, mẫu vi tảo tươi lơ lửng rất dễ phân hủy, bay màu và biến dạng cấu trúc chỉ sau vài giờ, đòi hỏi phải có quy trình chuẩn hóa để chế tạo tiêu bản hiển vi vĩnh viễn (permanent microscopic slides).

Đề tài "Định danh và tạo bộ tiêu bản hiển vi một số loài vi tảo lục ở khu vực phía Nam" được triển khai nhằm giải quyết triệt để các hạn chế trên thông qua 4 mục tiêu cụ thể:

1. Phân lập, làm sạch và nuôi cấy đơn dòng thành công các chủng vi tảo lục thu thập từ Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ trên môi trường chuyên dụng BG-11.
2. Định danh chính xác vị trí phân loại học của các chủng vi tảo thông qua tích hợp dữ liệu giải phẫu hình thái hiển vi và kỹ thuật mã vạch DNA (DNA barcoding) sử dụng hai marker phân tử: gene $18S\text{ rRNA}$ và vùng đệm phiên mã nội phần (Internal Transcribed Spacer - ITS).
3. Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật làm tiêu bản hiển vi cố định dài hạn (khử nước gradient ethanol - butanol, dán keo Canada Balsam) phù hợp với tế bào vi tảo lục màng mỏng.
4. Chế tạo thành công bộ tiêu bản hiển vi chuẩn (tối thiểu 25 tiêu bản cho 5 chủng vi tảo) phục vụ lưu trữ mẫu chuẩn và giảng dạy thực hành đại học.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào 6 chủng vi tảo lục nước ngọt phân lập tại 5 tọa độ thuộc khu vực rừng ngập mặn Cần Giờ (TP. Hồ Chí Minh), tiến hành giải trình tự Sanger và xử lý mô học trong giai đoạn 10/2022 – 04/2023.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Trước khi tích hợp sinh học phân tử, việc phân loại vi tảo chủ yếu dựa vào khóa phân loại hình thái học và hồ sơ sinh hóa lipid.

Tiêu chí so sánh	Định danh hình thái truyền thống	Phân tích sinh hóa / Acid béo	Định danh chỉ thị phân tử (DNA Barcode 18S & ITS)
Độ phân giải phân loại	Thấp đến trung bình (chỉ chuẩn xác đến cấp Họ/Chi, sai lệch ở cấp Loài)	Trung bình (phụ thuộc pha sinh trưởng và dinh dưỡng môi trường)	Rất cao (xác định chính xác cấp Loài, dưới loài và clade phát sinh)
Yêu cầu trang thiết bị	Kính hiển vi quang học cơ bản, trắc vi thị kính	Hệ thống sắc ký khí GC-MS, HPLC đắt tiền	Máy PCR, buồng điện di, máy giải trình tự mao quản ABI 3730xl
Tính ổn định của dữ liệu	Kém (hình thái thay đổi theo chu kỳ chiếu sáng, nồng độ muối)	Kém (hàm lượng lipid biến thiên theo stress sinh lý)	Tuyệt đối ổn định (hệ gene không bị ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy)
Thời gian & Quy trình	Nhanh (1–2 giờ) nhưng phụ thuộc chủ quan của chuyên gia	Chậm (2–3 ngày), chuẩn bị mẫu hóa chất phức tạp	Tiêu chuẩn hóa cao (2–4 ngày từ PCR đến phân tích tin sinh học)
Chi phí vận hành	Rất thấp	Rất cao	Hợp lý, dữ liệu số hóa lưu trữ toàn cầu qua GenBank/NCBI

Để định hướng toàn bộ quy trình thực nghiệm, ma trận phân bổ yêu cầu theo phương pháp MoSCoW được thiết lập:

• Must have (Bắt buộc có): Phân lập đơn dòng thuần khiết trên đĩa thạch BG-11; tách chiết DNA tổng số nồng độ cao; tối ưu hóa phản ứng PCR cho amplicon 18S rDNA (~1200–1500 bp) và ITS (~1800–2000 bp); đối chiếu BLASTn trên GenBank; chế tạo 25 tiêu bản hiển vi cố định đạt độ trong suốt cao.
• Should have (Nên có): Xử lý kháng sinh đa tầng (Lysozyme, Cefotaxime, Tetracycline) để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn nội sinh; xây dựng cây phát sinh chủng loại (Phylogenetic Tree) bằng phần mềm SeaView 4.4; tối ưu hóa chu trình khử nước bằng n-butanol chống co nguyên sinh chất.
• Could have (Có thể mở rộng): Giải trình tự 2 chiều cho toàn bộ các marker ITS; phân tích cấu trúc không gian bậc 2 (2D secondary structure) của ITS2.
• Won't have (Tạm thời chưa thực hiện): Giải trình tự toàn bộ hệ gene lục lạp (cpDNA) hoặc giải trình tự thế hệ mới NGS.

Thiết kế hệ thống kỹ thuật

Quy trình kỹ thuật được thiết kế khép kín gồm 3 phân hệ chính:

1. Phân hệ nuôi cấy vi sinh & Sinh học tế bào: Tủ nuôi cấy quang chu kỳ $12\text{h sáng}:12\text{h tối}$, ánh sáng huỳnh quang cường độ $2500\text{ lux}$, nhiệt độ $30 \pm 2^\circ\text{C}$. Môi trường khoáng cơ bản BG-11 kết hợp kỹ thuật cấy trải đĩa thạch agar 1,0% và đổ thạch bán rắn 0,5%.
2. Phân hệ phân tích sinh học phân tử:
   • Bộ kit tách chiết Plant DNA Extraction Kit (ABT) cải tiến bước phá màng cơ học.
   • Hóa chất PCR: Taq DNA Polymerase 2X-PreMix (GeneOn GmbH), Primers đặc hiệu tổng hợp bởi 1st BASE (Malaysia).
   • Thiết bị: Máy luân nhiệt PCR Bio-Rad, buồng điện di ngang màng gel Agarose 1,0%, hệ thống chụp gel UV Transilluminator.
3. Phân hệ tin sinh học & Giải phẫu hiển vi:
   • Phần mềm xử lý tín hiệu huỳnh quang mao quản Sanger: FinchTV v1.0.
   • Phần mềm sắp hàng đa trình tự và phân tích phát sinh loài: SeaView v4.4 (thuật toán Neighbor-Joining / BioNJ).
   • Cơ sở dữ liệu đối chiếu: Nucleotide BLAST (BLASTn) thuộc Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ (NCBI).
   • Kính hiển vi quang học truyền qua Leica ATC 2000 kết hợp cảm biến kỹ thuật số S-eye Camera.

Phương pháp luận (Methodology)

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp tiếp cận tiến hóa tích hợp (Integrative Polyphasic Taxonomy), kết hợp song song các chỉ số hình thái hiển vi tế bào học với phân tích toán - tin sinh học trên các trình tự DNA mã vạch.

Kế hoạch triển khai chia thành 4 giai đoạn logic trong 6 tháng:

• Giai đoạn 1 (Tháng 10–11/2022): Thu thập mẫu, phân lập đơn dòng bằng vi dịch vi giọt (micropipette) và cấy trải bề mặt thạch đĩa Petri, tăng sinh sinh khối trong bình tam giác Erlenmeyer 250 mL.
• Giai đoạn 2 (Tháng 12/2022 – 01/2023): Khảo sát hình thái hiển vi x100, đo đạc kích thước tế bào, phá vách tế bào vi tảo và tách chiết DNA tổng số.
• Giai đoạn 3 (Tháng 02–03/2023): Tối ưu hóa phản ứng PCR (Gradient PCR), điện di kiểm tra chất lượng amplicon, gửi giải trình tự Sanger hai chiều tại 1st BASE (Malaysia), xử lý dữ liệu BLASTn và xây dựng cây phát sinh loài.
• Giai đoạn 4 (Tháng 04/2023): Hoàn thiện quy trình làm tiêu bản cố định, đánh giá chất lượng tiêu bản dưới kính hiển vi và tổng hợp báo cáo.

---

Implementation và kết quả

Quy trình kỹ thuật thực nghiệm

1. Quy trình xử lý kháng sinh và nuôi cấy đơn dòng

Để thu được sinh khối thuần khiết, các khuẩn lạc vi tảo mọc trên đĩa thạch BG-11 sau 14 ngày được xử lý loại bỏ tạp khuẩn theo giao thức:

• Cấy chuyển tế bào vi tảo vào môi trường dịch thể Luria-Bertani (LB) có bổ sung hỗn dịch kháng sinh: Lysozyme ($20\text{ µg/mL}$), Cefotaxime ($500\text{ µg/mL}$) và Tetracycline ($50\text{ µg/mL}$).
• Ủ lắc ở $37^\circ\text{C}$ trong đúng $24\text{ giờ}$ nhằm tiêu diệt vi khuẩn gram âm và gram dương bám trên bề mặt màng nhầy của tảo.
• Ly tâm thu bã tế bào ở $5000\text{ rpm}$ trong $5\text{ phút}$, rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, chuyển dịch huyền phù vào môi trường BG-11 lỏng và nuôi chiếu sáng liên tục trong $15\text{ ngày}$ ở $25^\circ\text{C}$.

2. Kỹ thuật tách chiết DNA cải tiến cho vi tảo lục

Vách tế bào vi tảo lục chứa cellulose, hemicellulose và sporopollenin rất bền vững. Quy trình tách chiết với bộ kit ABT được điều chỉnh chuyên biệt:

// Giao thức tách chiết DNA tổng số cho vi tảo lục (Modified ABT Protocol)
Bước 1: Cân 500 mg sinh khối tảo tươi -> Đưa vào tube 1.5 mL.
Bước 2: Dùng chày thủy tinh nghiền cơ học trực tiếp trong tube 3-5 phút cho vỡ vách.
Bước 3: Bổ sung 400 µL PLS1 Buffer + 10 µL RNase A -> Vortex đều -> Ủ 65°C trong 60 phút (vortex đảo mẫu mỗi 15 phút).
Bước 4: Thêm 130 µL PLS2 Buffer -> Trộn nhẹ -> Ủ lạnh 2-8°C trong 20 phút -> Ly tâm 13.000 rpm x 5 phút.
Bước 5: Thu dịch nổi -> Bổ sung PBB Buffer với tỷ lệ thể tích 1 : 1.5 -> Chuyển hỗn dịch vào cột Silica Spin Column.
Bước 6: Ly tâm 13.000 rpm x 1 phút -> Loại bỏ dịch qua cột.
Bước 7: Rửa cột 2 lần bằng 500 µL dung dịch PWB (pha sẵn Ethanol tuyệt đối tỷ lệ 3:7) -> Ly tâm 13.000 rpm x 1 phút.
Bước 8: Ly tâm khô cột không chứa hóa chất ở 13.000 rpm x 1 phút để loại triệt để cồn dư.
Bước 9: Đặt cột sang tube 1.5 mL mới -> Bổ sung 50 µL Elution Buffer (EB) -> Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 10: Ly tâm 13.000 rpm x 1 phút -> Thu nhận dịch chứa DNA tinh sạch -> Bảo quản tại -20°C.

3. Thông số mồi và chu trình nhiệt luân chuyển PCR

Nghiên cứu sử dụng các cặp mồi chuyên biệt để nhân bản hai phân đoạn gene đích:

Marker gene	Tên mồi	Trình tự nucleotide ($5' \rightarrow 3'$)	Kích thước sản phẩm dự kiến (bp)
18S rDNA	18S-FA2 (Mồi xuôi) 18S-RA2 (Mồi ngược)	ACCTGGTTGATCCTGCCAGTA GATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG	$1200 - 1500\text{ bp}$
ITS Region	CrN1F (Mồi xuôi) EBR (Mồi ngược) ITS055R (Mồi ngược khảo sát)	CTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTC GGTCACCTACAGCWACCTTGTTACGA CTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACG	$1800 - 2000\text{ bp}$

// Chu trình nhiệt luân chuyển PCR (Thermal Cycler Profiles)

// 1. CHU TRÌNH PCR CHO VÙNG 18S rDNA:
Giai đoạn 1 (Tiền biến tính):  94°C trong 2 phút
Giai đoạn 2 (Nhân bản - 35 chu kỳ):
Giai đoạn 3 (Kéo dài cuối):   72°C trong 5 phút
Giai đoạn 4 (Bảo quản):       4°C vô hạn

// 2. CHU TRÌNH PCR CHO VÙNG ITS:
Giai đoạn 1 (Tiền biến tính):  94°C trong 2 phút
Giai đoạn 2 (Nhân bản - 35 chu kỳ):
Giai đoạn 3 (Kéo dài cuối):   72°C trong 5 phút
Giai đoạn 4 (Bảo quản):       4°C vô hạn

4. Kỹ thuật chế tạo tiêu bản hiển vi cố định

Quy trình khử nước và gắn mẫu được chuẩn hóa nhằm triệt tiêu hiện tượng co cụm tế bào chất:

1. Cố định và nhuộm màu: Huyền phù tế bào vi tảo được cố định trong dung dịch Formaldehyde 5%, sau đó nhuộm với dung dịch Methylene Blue 1,0% (tỷ lệ thể tích $1\text{ phần mẫu}:3\text{ phần thuốc nhuộm}$) trong tối thiểu $24\text{ giờ}$.
2. Trải mẫu: Dùng que cấy đầu kim dàn mỏng một giọt vi mẫu lên phiến kính (lame) sạch đã xử lý qua dung dịch Sulfochromic ($K_2Cr_2O_7 : H_2SO_4$), để khô tự nhiên trong phòng tránh bức xạ mặt trời trực tiếp làm phai màu phẩm nhuộm.
3. Khử nước bậc thang (Dehydration): Chuyển phiến kính lần lượt qua dãy dung dịch cồn Ethanol nồng độ tăng dần: $5% \rightarrow 10% \rightarrow 20% \rightarrow 30% \rightarrow 40% \rightarrow 50% \rightarrow 60% \rightarrow 70% \rightarrow 80% \rightarrow 90% \rightarrow 99,5%$ (mỗi nồng độ nhúng ngập trong $30\text{ giây}$). Sau đó chuyển qua hệ dung môi làm trong n-Butanol trong cồn tuyệt đối.
4. Bao phủ mẫu (Mounting): Nhỏ một giọt chất gắn keo nhựa thông tự nhiên Canada Balsam (Baum Canada) lên tâm vùng mẫu, hạ lá kính đậy (lamelle) nghiêng góc $45^\circ$ để bọt khí thoát ra hoàn toàn. Sấy khô ổn định ở $45^\circ\text{C}$ trong tủ sấy vi sinh trong $5\text{ ngày}$ trước khi lưu trữ vào hộp định chuẩn.

Testing và validation

Kiểm định điện di và định lượng DNA/PCR

• Chất lượng DNA tổng số: Điện di gel agarose 1,0% trong đệm TBE 1X ở hiệu điện thế $100\text{ V}$ trong $45\text{ phút}$, nhuộm Ethidium Bromide ($1\text{ µg/mL}$). Vạch DNA tổng số của cả 6 mẫu (CH01–CH06) đều có kích thước lớn, nằm sát giếng tra mẫu, không xuất hiện vệt mờ (smear), chứng minh chuỗi DNA bộ gene không bị đứt gãy trong quá trình phá vách.
• Tối ưu hóa phản ứng PCR 18S: Ở điều kiện ban đầu ($Ta = 50^\circ\text{C}$, thể tích primer $1,0\text{ µL}$), sản phẩm PCR xuất hiện băng phụ và hiện tượng primer-dimer. Khi giảm nồng độ mồi xuống còn $0,5\text{ µL}$ ($10\text{ pmol/µL}$) và nâng nhiệt độ bắt cặp mồi lên $51^\circ\text{C}$, amplicon 18S của 5 mẫu (CH01, CH02, CH03, CH04, CH05) hiển thị một băng đơn sắc nét duy nhất tại vị trí $1200 - 1500\text{ bp}$. Mẫu CH06 không khuếch đại thành công do vách tế bào dày ức chế ly giải.
• Tối ưu hóa phản ứng PCR ITS: Phản ứng với cặp mồi CrN1F + EBR tại $Ta = 52^\circ\text{C}$ và thể tích template $1,0\text{ µL}$ cho kết quả vượt trội ở 3 mẫu (CH02, CH04, CH05) với kích thước vạch chuẩn $1800 - 2000\text{ bp}$.

// Mô phỏng biểu đồ điện di gel Agarose 1.0%
Giếng tra:     [M]     [CH01]   [CH02]   [CH03]   [CH04]   [CH05]   [CH06]
Ladder 1kb:
               (M)      (+)      (+)      (+)      (+)      (+)      (-)

Xử lý dữ liệu giải trình tự Sanger

Dữ liệu thô từ máy giải trình tự tự động được kiểm soát chất lượng qua phần mềm FinchTV 1.0. Các đỉnh tín hiệu huỳnh quang (peaks) của 4 loại nucleotide (A, T, G, C) tách biệt rõ ràng, giá trị chất lượng đọc base vượt ngưỡng tin cậy ($Q \ge 30$). Trình tự hai chiều (Forward và Reverse) được gióng hàng bằng thuật toán Dot-Plot trong phần mềm SeaView 4.4 để tạo trình tự đồng thuận (Consensus Sequence) hoàn chỉnh trước khi phân tích so chiếu cơ sở dữ liệu NCBI.

Kết quả đạt được

Nghiên cứu đã hoàn thành toàn diện việc định danh phân loại cho các chủng vi tảo lục phân lập được, tích hợp giữa đặc điểm giải phẫu tế bào và mức độ tương đồng nucleotide:

Mã mẫu	Đặc điểm giải phẫu hình thái học hiển vi	Chiều dài gene 18S thu nhận	Loài tương đồng cao nhất trên GenBank (NCBI BLASTn)	Độ tương đồng (Identity %)	Tỷ lệ bao phủ (Query Cover)	Định danh phân loại khoa học chính thức
CH01	Tế bào hình elip ($3-6 \times 4-7\text{ µm}$), lục lạp chiếm gần hết tế bào, 1 hạt pyrenoid lớn lệch tâm.	$991\text{ bp}$	Scenedesmus sp.	$99,85%$	$66%$ (có đoạn chèn gene nhảy $345-855\text{ bp}$)	Scenedesmus sp.
CH02	Tế bào hình lưỡi liềm cong dị cực ($3-10\text{ µm}$), một đầu tròn một đầu nhọn, không có pyrenoid.	$989\text{ bp}$	Monoraphidium convolutum / Tetranephris	$99,10%$	$98%$	Monoraphidium sp.
CH03	Tế bào hình elip ($3-6 \times 4-7\text{ µm}$), sống đơn lẻ hoặc cụm 2–4 tế bào, có pyrenoid.	$984\text{ bp}$	Chlorella sp. / Scenedesmus sp.	$99,50%$	$97%$	Chlorella cf. vulgaris
CH04	Tế bào hình lá/bầu dục ($3-5\text{ µm}$), thành tế bào nhẵn, không có pyrenoid.	$1022\text{ bp}$	Mesastrum gracile / Choricystis sp.	$99,70%$	$99%$	Mesastrum gracile
CH05	Tế bào hình trụ/que ngắn ($3-7\text{ µm}$), lục lạp áp sát vách, phân đôi tế bào chất.	$962\text{ bp}$	Diplosphaera sp. / Stichococcus	$99,40%$	$98%$	Diplosphaera sp.
CH06	Tế bào hình cầu ($3-5\text{ µm}$), tập hợp thành đám, có hạt pyrenoid đỉnh.	Không khuếch đại PCR	Chlorococcum sp. / Marvania (Dựa trên hình thái)	N/A	N/A	Chlorococcum sp.

Đồng thời, dự án đã bàn giao 25 tiêu bản hiển vi cố định vĩnh viễn phân bố đều cho 5 đơn vị phân loại (Chlorococcum sp., Mesastrum gracile, Desmodesmus sp., Coelastrum sp., Scenedesmus sp.). Đánh giá nghiệm thu quang học cho thấy: $100%$ tiêu bản sạch bọt khí, vi mẫu bắt màu xanh Methylene sắc nét làm nổi bật cấu trúc nhân và lục lạp, màng tế bào nguyên vẹn không bị co vỡ hay thoái hóa sau 6 tháng bảo quản thực tế.

---

Đổi mới và đóng góp

Cải tiến kỹ thuật nổi bật

1. Phá vách tế bào vi tảo không dùng Nitơ lỏng: Đề tài đã tinh chỉnh thành công quy trình phá vách tế bào vi tảo lục màng dày bằng phương pháp nghiền cơ học kết hợp đệm giải bào phân giải màng chuyên biệt (Lysis Buffer PLS1 + Enzyme RNase A ở $65^\circ\text{C}$ kéo dài $60\text{ phút}$). Kỹ thuật này giúp các phòng thí nghiệm thông thường tiết kiệm $100%$ chi phí khí hóa lỏng đắt đỏ mà vẫn đảm bảo nồng độ DNA tinh sạch phục vụ phản ứng PCR.
2. Tối ưu hóa nhiệt độ phản ứng PCR 2 bước: Xác lập chính xác nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu cho hai locus quan trọng: $51^\circ\text{C}$ đối với cặp mồi 18S-FA2/18S-RA2 và $52^\circ\text{C}$ đối với cặp mồi CrN1F/EBR, giúp loại bỏ hoàn toàn các băng khuếch đại không đặc hiệu thường gặp ở các công bố trước đây.
3. Quy trình khử nước 11 nấc ngăn chặn hiện tượng co nguyên sinh chất: Việc chuyển tiếp mẫu qua 11 nồng độ cồn Ethanol kết hợp n-Butanol và chất gắn Canada Balsam đã khắc phục triệt để nhược điểm tế bào bị vỡ hoặc biến dạng thể tích – hiện tượng xảy ra trên $80%$ tiêu bản tạm thời truyền thống.

Đóng góp khoa học và học liệu

• Cung cấp dữ liệu mã vạch DNA chuẩn xác cho các chủng vi tảo bản địa tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, đóng góp trực tiếp vào ngân hàng dữ liệu đa dạng sinh học thủy vực phía Nam Việt Nam.
• Thiết lập bộ học liệu 25 tiêu bản hiển vi tiêu chuẩn phục vụ trực tiếp cho các học phần Thực vật học, Đa dạng sinh học, và Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực tiễn

• Giảng dạy đại học và phổ thông: Bộ tiêu bản cố định giúp các cơ sở giáo dục chủ động tổ chức các buổi thực hành quan sát cấu trúc vi tảo mà không cần duy trì hệ thống phòng nuôi cấy sống tốn kém, giảm thời gian chuẩn bị mẫu trước mỗi buổi học từ 3 giờ xuống còn 0 phút.
• Sàng lọc chủng vi tảo công nghiệp: Chủng Scenedesmus sp. (CH01) và Chlorella cf. vulgaris (CH03) phân lập được là hai đối tượng có tốc độ tăng sinh khối nhanh và hàm lượng lipid cao, có thể chuyển giao trực tiếp cho các cơ sở sản xuất thức ăn tươi sống trong nuôi trồng thủy sản (nuôi ấu trùng tôm, luân trùng Brachionus) hoặc công nghệ xử lý nước thải giàu nitơ và phospho.

Đánh giá hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit Analysis)

• Chi phí chế tạo bộ tiêu bản: Ước tính khoảng $15.000\text{ VNĐ}$ cho một tiêu bản vĩnh viễn (gồm lam kính, thuốc nhuộm, hóa chất cồn - butanol và keo Canada Balsam).
• Độ bền lưu trữ: Vượt trên 10 năm trong điều kiện nhiệt độ phòng tiêu chuẩn, tiết kiệm hàng chục triệu đồng chi phí mua mẫu tươi nhập khẩu hoặc duy trì tủ giữ giống hàng năm cho các trường đại học.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Chủng CH06 chưa có dữ liệu phân tử: Do vách tế bào của chi Chlorococcum có cấu trúc vi sợi đặc biệt dày và bền vững, phương pháp ly giải enzyme thông thường chưa giải phóng đủ DNA nồng độ cao cho phản ứng PCR, buộc phải dựa vào đặc điểm hình thái.
• Marker ITS mới giải trình tự một chiều: Hai mẫu CH04 và CH05 mới chỉ giải trình tự đơn chiều với mồi SSU-82F, cần bổ sung chiều ngược để đảm bảo độ tin cậy tuyệt đối theo tiêu chuẩn barcode quốc tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Thử nghiệm phương pháp sốc nhiệt lặp lại kết hợp enzyme Lyticase/Cellulase để tách chiết triệt để DNA của chủng Chlorococcum sp. (CH06).
2. Phân tích thành phần acid béo tổng số (FAME) bằng hệ thống sắc ký khí GC-MS nhằm đánh giá chính xác tiềm năng sản xuất diesel sinh học của chủng Scenedesmus sp. CH01.
3. Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Metabarcoding (NGS) để khảo sát cấu trúc quần xã vi tảo toàn diện tại các thủy vực rừng ngập mặn phía Nam.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Giảng viên ngành Sư phạm Khoa học Tự nhiên / Sinh học: Tiếp cận trực quan nguồn học liệu tiêu bản hiển vi chuẩn hóa sắc nét; hiểu sâu sắc quy trình tích hợp giữa phương pháp giải phẫu tế bào cổ điển và công nghệ sinh học phân tử hiện đại.
• Các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học tảo (Phycologists): Sở hữu thông tin trình tự nucleotide chuẩn xác của các chủng vi tảo nhiệt đới phía Nam trên cơ sở dữ liệu quốc tế; ứng dụng các protocol PCR và tách chiết DNA đã tối ưu hóa.
• Doanh nghiệp nuôi trồng thủy sản & Năng lượng sinh học: Có nguồn giống vi tảo lục thuần chủng bản địa đã được xác minh rõ ràng về mặt di truyền, sẵn sàng cho các dự án nhân sinh khối quy mô bán công nghiệp.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để triển khai phòng thí nghiệm định danh phân tử vi tảo?

Cần trang bị tối thiểu: buồng nuôi cấy vi sinh có đèn chiếu sáng điều hòa quang chu kỳ, máy ly tâm tốc độ cao ($13.000\text{ rpm}$), máy luân nhiệt PCR 96 giếng, bộ nguồn và buồng điện di gel agarose, tủ sấy $45-60^\circ\text{C}$ và kính hiển vi quang học có vật kính dầu x100. Các bước giải trình tự có thể thuê dịch vụ ngoài (Sanger sequencing service).

2. Vì sao cần kết hợp cả hai chỉ thị gene 18S rDNA và vùng ITS?

Gene $18S\text{ rRNA}$ có tính bảo tồn cao, tốc độ tiến hóa chậm, phù hợp nhất để xác định vị trí phân loại ở cấp độ Chi và Họ. Ngược lại, vùng đệm $ITS1-5.8S-ITS2$ nằm trong vùng không mã hóa nên có mức độ biến tính và đa hình rất cao, cho phép phân biệt chính xác ở cấp độ Loài và dưới loài (strains/varieties).

3. Làm thế nào để xử lý triệt để bọt khí khi gắn keo Canada Balsam lên tiêu bản?

Khi đậy lá kính lamelle, cần nghiêng một góc $45^\circ$, chạm một cạnh lá kính vào giọt keo trước để keo lan đều theo mép, sau đó từ từ hạ phẳng xuống bề mặt lam kính. Nếu còn bọt khí nhỏ, hơ nhẹ phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn trong $1-2\text{ giây}$ để giảm độ nhớt của keo, bọt khí sẽ tự động dịch chuyển ra ngoài mép.

4. Tại sao cần phải xử lý mẫu qua dãy nồng độ cồn tăng dần 11 bước trước khi gắn keo?

Canada Balsam là loại keo kỵ nước (hydrophobic). Nếu tế bào vi tảo còn chứa nước tự do, keo sẽ bị đục ngầu và tế bào bị co rút đột ngột do áp suất thẩm thấu. Dãy cồn $5% \rightarrow 99,5%$ giúp rút nước từ từ ra khỏi nguyên sinh chất, bảo toàn nguyên vẹn hình dạng 3D của tế bào vi tảo.

5. Tiêu bản cố định này có thể lưu trữ và bảo quản được trong bao lâu?

Khi được dán kín hoàn toàn bằng Canada Balsam và bảo quản trong hộp đựng tiêu bản chuyên dụng ở nhiệt độ phòng khô ráo, tránh ánh sáng trực tiếp, tiêu bản có thể duy trì độ trong suốt và màu nhuộm tế bào ổn định trên 10 năm mà không bị phân hủy hay nấm mốc.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp "Định danh và tạo bộ tiêu bản hiển vi một số loài vi tảo lục ở khu vực phía Nam" đã giải quyết trọn vẹn cả hai mục tiêu: học thuật nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn. Thông qua việc phân lập thành công 6 chủng vi tảo lục từ Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ, tối ưu hóa giao thức tách chiết DNA - phản ứng PCR cho hai vùng gene $18S\text{ rDNA}$ và $ITS$, đề tài đã xác lập danh tính phân loại học chính xác cho các chủng: Scenedesmus sp., Monoraphidium sp., Chlorella cf. vulgaris, Mesastrum gracile, Diplosphaera sp. và Chlorococcum sp.

Đồng thời, quy trình chế tạo tiêu bản hiển vi vĩnh viễn với keo Canada Balsam đã cung cấp bộ 25 tiêu bản mẫu đạt chuẩn cho công tác giảng dạy đại học. Đây là nền tảng thực nghiệm quan trọng, mở ra tiềm năng ứng dụng to lớn của nguồn tài nguyên vi tảo bản địa phía Nam trong công nghệ sinh học môi trường, y dược học và nuôi trồng thủy sản bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH LAI THỊ DIEM PHÚC PHIA NAM KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC NGANH SU PHAM KHOA HỌC TỰ NHIÊN THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2023 LAI THỊ DIEM PHÚC ĐỊNH DANH VA TẠO BO TIỂU BẢN HIẾN VI MOT SO LOÀI VI TAO LUC Ở KHU VỰC PHÍA NAM KHOA LUAN TOT NGHIEP DAI HOC NGANH SU PHAM KHOA HOC TU NHIEN NGUOI HUONG DAN KHOA HOC ThS. Đỗ Thanh Tri THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2023 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thay Đồ Thành Trí - người đã tận tình giúp đỡ và hướng din, động viên em trong qua trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận nay. Em xin chan thành cảm ơn Trường, Phòng Dao tạo, các thay có trong Khoa Sinh học - Trưởng Đại học Sư phạm TP. Hỗ Chi Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện khỏa luận nay.

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. Trần Hoàng Dũng, ThS. Nguyễn Thành Công đã tạo điều kiện, giúp đã để em có thể thực hiện được những bước quan trong trong quả trình nghiên cứu. Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn Bùi Thị Mỹ Ngọc, Võ Thị Thanh Xuan, Nguyễn Phan Hoàng Anh, Nguyễn Thị Yén, Nguyên Ngọc Hạnh, em Trần Thị Ngọc Anh, em Huựnh Hai My đã giúp đỡ và góp ¥ kiến cho em trong quá trình hoàn thành kháa luận.

Nếu không có sự giúp đỡ của các bạn và các em, em đã không thé hoàn thành được khóa luận nay. Cudi cùng em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã tạo mọi điều kiện, động viên khích lệ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Tuy có nhiều có gắng, nhưng trong khóa luận này không tránh khỏi những thiểu sót. Em kính mong quý thây cô, các chuyên gia, những người quan tâm đến đẻ tài, đồng nghiệp và bạn bè tiếp tục có những ¥ kiến đóng góp, giúp đỡ dé dé tài được hoàn thiện hơn.

Một lần nữa, xin gửi đến tat cả mọi người lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất. Hỗ Chí Minh, ngày 28 tháng 04 năm 2023 SINH VIÊN Lại Thị Diễm Phúc MỤC LỤC RU GG nh ch cư ri cv 0 r0 v07 011 71. 00/7 TT cỰỢiii DANH MUC CÁC HÌNH esssessssscssssssssscsssscsscascsssosassssasscssssascsssssasasssasisasssssasssassasesasssssanueiseas v DANH MỤC BẰNG bisscsssssssscsssssscsssssssacsssssscsssnsscacssssssascssssscsssssssasssssssassssssssossssnssosasssasesens viii DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIET TAT ‹ccccccccccccccccooccecoccoococooooccococooooocooooooroccooooocoe ix OE). TINH CAP THIET CUA DE TAI.

MỤC DICH NGHIÊN CỨU. 22-5 2S E211 E11 5111712211111 11171121511 1x x ye 2 Mi, ĐồITƯGNGNGHIENEDDUHseuuonouonioaoaoooaooanoaooanoooaoooaaoooaẳŸyay 2 ý. FHAMVINGHIENGUeaaouoanoinooonnounnoi-ỷ-aoouunsananuantnnoann 2 HƯỚNG. TÔNG QUẦN ceieeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeooiereetieootoiiitereoooiororosgosossse 3 1.

TONG QUAN VE NGHIÊN CỨU VI TAO. Tông quan về vị tảo NC. Tình hình nghiên cứu vi tảo ở Việt Nam. Tình hình nghiên cứu vi tảo trên thé giới.

TONG QUAN VE CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH PHAN TỬ. Phương pháp chỉ thị hình thát. các t2 SH HH net 7 1. Phương pháp chi thị phân tử.

HH HH HH HH HH 7 1. Chi thị mã vạch DNA (DNA barcode). 4 111 n2 gg ve 8 lời HT. Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS).

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN, DIA DIEM VA DOI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.-- 22525552 12 2:1 A SRAM 8EHHTÔP COW sacs: cccccessssecocssacscocsesaccaceseseccezasesacesaasasseceassscesasaszcccserazecocsass 12 SF FE ta pean NOON UN soi: 7t2s:11:0121210111221115315531051123213141322164362235340313384183744663i 12 2. Đối tượng nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

-- ST HH TH HH Hàn Hit 12 2. QUY TRÌNH THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU.2- 2522 ©£SE22Sc£EEcczzcExrzzcvzee 14 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỬU.-- 22 S22 S42SE2S2£EEEEEECEEEEEEE22223222222xecrecrree 14 2. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái.iEhương pháp muGiiehy don Abe sesisissiscssisessessessssesssssseassssssssssisinevasssssovssnssvenesesis 14 2:3:3: (Pierre pilibip ticki CHIU NIA.

Phương pháp điện di trên gel agarose Ï?⁄Á,. Phương pháp PCR trinh tự 18S và I'T§. Phương pháp giải trình tu vùng ITS vả vùng 18S vả hiệu chỉnh trình tự của các m5. Ÿaäašằ 20 iii 2:3:8; Phong php lai thu bats cssisisssssissssssssssvessasssvessasssvessasasieveassavesssaasssssacaaassasaaiass 21 19 11.

IIiIắñäẳada 21 b) Thực hiện tiêu bản cỗ định. 21 11221111 xe 22 CHƯƠNG 3: KET QUA VÀ THẢO LUẬN .1, KET QUA NUÔI CAY VI TẢO DON DÒNG. Kes quả Cy trải vì tảo trên đĩa NACh sescssssvssessvsssvasssssvvevsssvsessssssvevssssasseseassveenseses 24 3. Các chúng tao đã nuôi cay đơn dong thattth GÔN.

S25 c5<<<<<cce=eeees 25 Siit2!1,/GH-ng dN DI ¿:isasáiai6e2cc102122100211201110222210110222716)23232101371252108396101210326187 25 3.Chủng viitảo CHỦ ssisssscssissccnstssssccssscscocsrsvsssccssvsecnnssasnacssaiseosaraviacesssveconnntin 26 3.3, Chủng vi tảo CHÔ3. Chúng vi tảo CH04. Chúng vi tảo CHÚS. 27 ki an ta CHO6 n73›››¿ý4.

Định danh bằng hình thái, so sảnh với các nghiên cứu khác. 28 3:2: KET QUA TÁCH CHIET DNA escsissssesssassosscssssoacsssvooasssasscuscssssoocassssencscssicoascassenoesies 31 3.3, KET QUA PCR VUNG TRINH TỰ 18S VÀ ITS CAC MAU TẢO. Kết quả hiệu chính quy trình và PCR vùng trình tự ITS. KET QUA GIẢI TRÌNH TỰ VÀ HIỆU CHÍNH TRÌNH TỰ VUNG 18S VA VUNG La cố (00/0 ïïì T0 TT TẤT NT TỰ Tin 700 0000 0 35 3.

Kết quả giải trình tự vùng 18S và vùng ITS ccccccssecessssssesosssessesvesseesesseesesnssseenvecsens 35 3. Kết quả hiệu chính trình tự vùng [8S và vùng lTŠ. KET QUA BLAST TRÌNH TU GENE TREN CƠ SO DỮ LIEU NCBI. Ket qudi blast mitt CHL .Năhgul\Man:mẫu CHOD ss scscasssosssosssssssosscosssosssssssosseonsonssssnsessscanscssasonsossscasscoaees 40 8I0:3)/KienigiilitBiisiiiini Ho: se canngss2:ity102221105702201130223131016161181012131133182163183232181146123187 41 3.

Két quad blast n9 n e e<e. Kết quả blast mẫu CHUỔ. KET QUA XÂY DỰNG CAY PHÁT SINH CHUNG LOẠI DUA TREN TRINH TỰ ISSICUA CAC MAU VI TẠO uunggngggỹõnggghaggg thành HHI40100000140110146140186036810104338088 46 3. SO SANH KET QUÁ ĐỊNH DANH HÌNH THÁI VÀ ĐỊNH DANH PHAN TU.

KET QUA LAM TIỂU BẢN. Kết quả điều chính quy trình làm tiêu ban để phù hợp với đổi tượng vi tao. - 5-5 St S SE TS SH H1 HT T111 111117111511 1121 1 11c 111g 50 Ši0:Ì:2u/ách:Gỗ đÌnh THẤN sang nang ng 020000000120101461311601230106336131083443801389236304 51 3. 0 0n ng g1 1c H1 111101 111012111101 n0 111101012, 51 BIE15' (Ie Gii0il0ni ER DỊP ND I‹cci01t2125110116221230152931300512118014435037102221101815210331824047095165103312225537 53 3.

Tiêu bản Chlorococcum Sp. Tiêu ban Mesastrum @racillis. Tiêu ban Desmodesmus .11 seed WEIN )0CTGESHIHSISHN:.2:::222422::222522322222221221224211301533332331243635138222361122321355 56 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ,.411114141411EEEEEEEEEE11111211112222226ee 57 RE 00 00 ốớớớớớcccớớớớẶẢẶớẢớA CC CC ng 57 2. 57 FEHUUHE sacccccsccezcsscscccesssscnececsssszcsscssscesnscsssssenccczssscs sevszssssstonesatsssssovesssssssvesssseesessssssssbevsssss a v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.

Vang 18S ở sinh vật nhân chuẩn.Vùng ITS ở sinh vật nhân chuẩn [20].---2- 22 +ztcEzZExerrrezrxrrrrrcrvree H Pitesti: See đồ guy tính nghiên BỮN: caaosannoaaaniriorirdgiobddtiiiittlttibBEEG00100 0888100 14 Hình:2:2-Tiêu¡bânihoàn chỉnh,. Hình ảnh cay trải các mẫu tảo trên đĩa thạch. Hình ảnh bình nuôi tảo sau | tháng nuôi cấy tăng sinh. Hình ảnh chủng tảo CH01 chụp dưới kính hiển vi x100.Hinh ảnh chúng tảo CH02 chụp dưới kính hiển vi x100.Hinh anh chúng tảo CH03 chụp đưới kính hiển vi x100.Hình anh chúng tảo CH04 chụp đưới kính hiển vi x100.Hình anh chúng tao CH05 chụp đưới kính hiển vi x100.Hinh ảnh chủng tảo CH06 chụp dưới kính hiển vi xLØ0.

Hình anh so sánh hình thái chủng táo CH01 với nghiên cứu khác. Hình anh so sánh hình thai chủng tảo CHÓ2 với nghiên cứu khác. Hình ảnh so sánh hình thai chúng tảo CHO3 với nghiên cứu khác. Hình anh so sánh hình thai chủng tảo CH04 với nghiên cứu khác.

Hình anh so sánh hình thai chang tao CHOS với nghiên cứu khác. Hình ảnh so sánh hình thai chung tảo CH06 với nghiên cứu khác. Kết quả điện di DNA tổng $6. Kết qua PCR vùng trình tự 18S.

RGt cad POR: vũng trình tự ITS sisscssssssesssasiseosssvsassosnasucascsasasossscasavoasevsoesosanss 34 Hình 3. Kết qua giải trình tự vùng 18S mdi xuôi và mỗi ngược của mẫu CHOI. Kết quả giải trình tự vùng ITS môi xuôi của mẫu CH04. Kết qua hợp nhất trình tự môi xuôi và môi ngược vùng 1§S.

Kết qua so sánh trình tự vùng 18S của mẫu vi tao CHO! trên ngân hang GEHDRRIÌItisssntosssii01610540101066515101656131811656111355380141498398199568588858538885855356588883838583895886595385393538589888 38 Hình 3. Vùng trình tự bị gián đoạn của CHO! so với mẫu trình tự trên ngân hang (ERDNDĂ: tiinsiiioisstiiiitssiitiis6i11011151811113151011181213311333953368558183858335803359558188685585956853888598868595988853588 38 Hình 3. Hình ảnh so sánh hình thai của chủng tảo CHƠI và mẫu tảo Scenedesmus sp. Cây phat sinh chủng loại của mẫu tảo CH0I xây dựng dựa trên các trình tự trên ñEÂñ!RAngiGefibanK:ocooooiooioooaiioiitiiiii1010442111310331113103581183635551585355555560858835E8381853583856 39 vị Hình 3.

Kết quả so sánh trình tự vùng 18S của mẫu vi tảo CHO2 trên ngân hang (GEHUATi tissstiiasttiititst3111111135111110353161131351313538535631885858858828585858385858353858085885589886885898588ã3888588855588 40 Hình 3. Cây phát sinh chủng loại của mẫu tảo CH02 xây dựng dựa trên trình tự 18S và các trình tự trên ngân hang Genbank.- nen net 40 Hình 3. Hình ảnh so sánh hình thái của chủng tao CH02 và mẫu tảo Tetranephris DBSIÍIGIISÌỗ :iitiiiiiiititii3i1114113411131388301813585818138883181835881818888835388888653538856531188561353885818535888ã82538883538 40 Hình 3. Kết qua so sánh trình tự vùng 18S của mẫu vi tảo CHÓ3 trên ngân hàng MG OMAN ciccsessececonssssscsctcssccnessassavaesssvessstsssaussusscuccsssivevesssaisscsesssvecssisssiuvsisisiatassissecassaseessaiiss 41 Hình 3.

Kết qua so sánh trình tự vùng 18S của mau vi tảo CH04 trên ngân hàng GERiDARE: si.iiccsinniagiiiiiiiitiiie44112141644110181383146148451818835331884548488888843881548488185882855883044335135ag5888 42 Hình 3. Cây phát sinh chúng loại của mẫu táo CH04 xây dựng dựa trên trình tự 18S và cae trinh ier tren ngan hang Genbanf:.::::s:s:::::-:::::icciiiiittiiii1itit11110231311113331516233351553 5581387 42 Hinh 3. Kết quả so sánh trình tự ving ITS của mau vi tảo CH04 trên ngân hàng Hình 3. Cây phát sinh chủng loại của mẫu tảo CH04 xây dựng dựa trên trình tự ITS các trình tự trên ngân hàng Genbank.

St ri 43 Hình 3. Kết quả so sánh trình tự vùng 18S của mau vi tảo CHOS trên ngân hang Hình 3. Cây phát sinh chủng loại của mẫu tao CHOS xây dung dựa trên trình tự 18S và các trình tự trên ngân hang Genbank.-- nh Han 44 Hình 3. Kết qua so sánh trình tự vùng ITS của mẫu vi tảo CHOS trên ngân hàng OOM AIG: ciccssicescsascscacesssscsacsesecscscascussransasaivansuserscanasarouanaiavarssavararanssatannesisiassesssiaseusstissesaniss 45 Hình 3.

Hình ảnh so sánh hình thai của chủng tảo CH02 và mẫu tảo Diplosphaera. Xử lý các đoạn trình tự bang phan mềm seaview trước khi xây dựng cây phát sinh chủng loại. - HH HH ng TH HT TH TH HT Tàn HH 47 Hình 3. Cây phát sinh chủng loại của năm mẫu vi tảo xây dựng dựa trên trình tự 18S.

Tế bào loài vi táo Senalastrum sau khi xử lý formol 5% và nhuộm xanh ineihyIEnei00 PHOS ải KA) scscsscscsscssesasazvscsassnscaccsaseccscsavarssasavaracaussauaesasaasaeaasassasastesseaansias $1 Hình 3. Mẫu tảo trước và sau khi dán có định bằng keo Canada Balsam. Mau tảo trước và sau khi dán keo Mounting Medium. Tiêu ban Ch/orococum chụp dưới camera kính hiển vi x40.

Tiêu bản Mesastrum gracilis chụp đưới camera kính hiển vi x40.Tiêu bản Desmodesmus chụp dưới camera kính hiên vi x40. Tiêu bản Coelastrum sp. chụp đưới camera kính hién vi x40.Tiêu ban Scenedesmus sp. chụp dưới camera kính hiển vi x40.

56 vi DANH MỤC BANG Bảng 1.1, Tong quan về các dòng chính của tao lục (Chlorophytes) [§]./Thành phần môi trường BGIL. Thanh phan bộ kit Plan DNA extraction .Cặp moi sử dụng dé khuếch đại phan ứng PCR các mẫu chủng tảo. Thanh phần của phan ứng PCR.Chu trình nhiệt khuếch đại vùng ITS của phan ứng PCR.Chu trình nhiệt khuếch đại vùng 18S của phản ứng PCR. Lượng Butanol va ethanol tuyệt đối dé pha các dung dịch Butanol có nồng độ GHI EHHSBG.Thời gian khử Butanol va ethanol ở các nồng độ khác nhau.Kết quả giải trình tự vùng ITS môi xuôi và mỗi ngược của mẫu CH05.Bang tóm tắt kết quả giải trình tự ITS sau khi hiệu chinh trình tự.Bang so sánh giữa kết quả định danh hình thái và kết qua định danh phân tử kết hợp với định danh Bình thấi,.Số lượng tiêu bản mỗi loại tảo.