MỞ ĐẦU Meloxicam là dẫn xuất của oxicam và là thuốc thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid tác dụng giảm đau, kháng viêm thường được sử dụng ở nước ta. Cho đến nay đã có hơn 240 chế phẩm có chứa meloxicam có số đăng ký lưu hành trong nước [37], ngoài ra hoạt chất này cũng có tên trong Danh mục thuốc thiết yếu do Bộ Y tế ban hành theo thông tư số 19/2018/TT-BYT ngày 30/8/2018. Điều đó cho thấy được sự phổ biến và quan trọng của các chế phẩm có chứa meloxicam trên thị trường dược phẩm trong nước. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa meloxicam là một việc rất cần thiết và nhu cầu sử dụng các tạp chuẩn của meloxicam phục vụ cho việc kiểm tra chất lượng của các thuốc chứa meloxicam cũng sẽ tăng dần theo độ phổ biến của các thuốc này trên thị trường.
Trong chuyên luận nguyên liệu và thành phẩm meloxicam của Dược điển Việt Nam V và các Dược điển tham chiếu (BP 2020, USP 43 và EP 10.0) có quy định kiểm nghiệm các tạp liên quan A, B, C, D của meloxicam. Trong đó, tạp chuẩn B và D đã có tác giả trong nước nghiên cứu về điều chế cũng như thiết lập tạp đối chiếu [22], [4] nhưng cho đến nay vẫn chưa có tài liệu cũng như nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn A và C của meloxicam. Vì tạp A là một trong các nguyên liệu để điều chế các thuốc thuộc dẫn xuất oxicam như meloxicam, piroxicam… nên trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp hợp chất này với quy trình ổn định [15], [26], [27]. Đối với tạp C, cho đến nay chỉ tìm được 1 tài liệu nghiên cứu có đề cập đến quy trình tổng hợp [24] ở ngoài nước.
Ngoài ra, trong danh mục 369 chất chuẩn tân dược của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương [44], cũng như danh mục 359 chất chuẩn tân dược của Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh [43] hiện vẫn chưa có tạp chuẩn A và tạp chuẩn C của meloxicam. Vì thế, các cơ sở sản xuất khi kiểm tra các tạp chất này của meloxicam trong nguyên liệu và thành phẩm phải nhập từ nước ngoài với giá khá cao (khoảng 6 triệu đồng/5 mg đối với tạp A và 5 triệu đồng/10 mg đối với tạp C từ nhà cung cấp Sigma-Aldrich [40], [41]) và thời gian nhập khẩu từ vài tuần đến vài tháng. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Điều chế và thiết lập tạp chất đối chiếu A và C của meloxicam” được thực hiện để phục vụ cho mục đích kiểm nghiệm tạp chất liên quan của meloxicam, góp phần phục vụ cho nhu cầu sử dụng tạp chuẩn ngày càng nhiều trong nước và có thể được xem như là một phần trong lời giải của bài toán về vấn đề tăng cường khả năng quản lý và nâng cao chất lượng thuốc trong nước.
Mục tiêu của đề tài là: - Điều chế hợp chất ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat 1,1-dioxid (tạp A) và tổng hợp N-[(2Z)-3,5-dimethylthiazol-2(3H)-yliden]-4- hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid 1,1-dioxid (tạp C) ở quy mô phòng thí nghiệm. - Thiết lập chất đối chiếu hai tạp đã điều chế. - Kiểm tra tạp chất liên quan A và C trong nguyên liệu và thành phẩm meloxicam theo chuyên luận của Dược điển Anh 2020, sử dụng tạp chất đối chiếu đã được thiết lập. Tổng quan về meloxicam - Tên hóa học: 4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methylthiazol-2-yl)-2H-1,2-benzothiazin- 3-carboxamid-1,1-dioxid [1].
- Tên khác: Meloxicam [1]. - Công thức phân tử: C14H13N3O4S2[1]. - Phân tử lượng: 351,4 g/mol [1]. - Công thức cấu tạo [1]: 1.
Tính chất lý hóa Meloxicam là chất có dạng bột kết tinh, màu vàng nhạt, dễ tan trong dimethyl formamid và tetrahydrofuran; ít tan trong methanol và nước; rất ít tan trong ethanol 96% [20]. Meloxicam có nhiệt độ nóng chảy 254 °C [25]. Trong dung môi phân cực, meloxicam có hai giá trị pKa là 1,09 và 4,18 [21] ứng với sự ion hóa của nitơ vòng thiazol và nhóm OH enolic. Độ tan của meloxicam trong các dung môi phụ thuộc nhiều vào pH, độ tăng theo sự gia tăng của pH môi trường [21].
Trong dung môi khác nhau, meloxicam có các dạng cấu tạo khác nhau. Trong dung môi hữu cơ không phân cực như hexan hoặc phân cực không cung cấp proton (dung môi aprotic) như tetrahydrofuran, meloxicam tồn tại chủ yếu ở dạng enol. Trong dung môi phân cực cung cấp proton (dung môi protic), ở pH sinh lý (pH 7,4) hoặc cao hơn, dạng anion của meloxicam chiếm ưu thế. Ngoài ra, meloxicam có thể tồn tại ở dạng anion, lưỡng tính hoặc cation tùy thuộc vào pH của môi trường [12], [14], [21], [31].
Cấu tạo của meloxicam dạng enol Meloxicam Meloxicam Meloxicam dạng lưỡng tính Hình 1. Dạng cấu tạo của meloxicam trong dung môi phân cực 1. Tổng hợp Theo một số tài liệu [12], [23], [24], [28], [32], [36] meloxicam được tổng hợp theo phản ứng giữa 4-hydroxyl-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1- dioxid ester và 2-amino-5-methylthiazol trong môi trường dung môi hữu cơ. Ngoài ra, meloxicam còn có thể được tổng hợp bằng cách cho 4-hydroxy-N-(5-methyl-1,3- thiazol-2-yl)-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxid tác dụng với methyl iodid với sự hiện diện của một tác nhân base [23].
Trong trường hợp tổng hợp meloxicam theo Hình 1.3 qua con đường (A), nếu nguyên liệu tổng hợp là ethyl 4- hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat-1,1-dioxid còn tồn dư trong sản phẩm cuối cùng thì sẽ tạo thành tạp A của meloxicam. Trong khi đó, tạp C của meloxicam là sản phẩm phụ của phản ứng tổng hợp theo cả 2 con đường (A) và (B). Sơ đồ tổng hợp meloxicam [24] (1): 4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methylthiazol-2-yl)-2H-1,2-benzothiazin-3- carboxamid 1,1-dioxid (meloxicam) (3a): Methyl-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat 1,1-dioxid (tạp E) (3b): Ethyl 4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxylat 1,1-dioxid (tạp A) (4): 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B) (5): 4-hydroxy-N-(5-methyl-1,3-thiazol-2-yl)-2H-1,2-benzothiazin-3-carboxamid- 1,1-dioxid (6a): N-[(2Z)-3,5-dimethylthiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2- benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxid (tạp C) (6b): N-[(2Z)-3-ethyl-5-methylthiazol-2(3H)-yliden]-4-hydroxy-2-methyl-2H-1,2- benzothiazin-3-carboxamid-1,1-dioxid (tạp D). Nguyên liệu Bảng 1.
Định tính meloxicam trong nguyên liệu DĐVN V BP 2020 EP 10.0 USP 43 [34] [1] [39] [13] Phổ hấp thụ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng IR ngoại của meloxicam chuẩn Sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic chính có thời gian lưu tương ứng pic HPLC meloxicam trên sắc ký đồ của chuẩn ở mục định lượng. Các đỉnh đặc trưng trong phổ IR của meloxicam [6] max (cm-1) Nhóm chức max (cm-1) Nhóm chức 3286 N-H bậc 2 co dãn 1620 N-H biến dạng 3091 C-H vòng thơm co dãn 1536 C=N co dãn 2911 C-H co dãn 1150 S=O co dãn 1. Thành phẩm viên nén Theo Dược điển Việt Nam V [1], Dược điển Anh 2020 [38] - Phương pháp sắc ký lớp mỏng. Bản mỏng: Silica gel F254.
Dung môi khai triển: Amoniac 13,5 M - methanol - dicloromethan (1:20:80) Dung dịch thử: Cân lượng bột viên tương ứng với 50 mg meloxicam, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,1 M trong methanol và 20 ml methanol, lắc 15 phút và lọc. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 50 mg meloxicam chuẩn trong 5 ml dung dịch NaOH 0,1 M trong methanol, pha loãng dung dịch thu được thành 25 ml bằng methanol. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch. Sau khi triển khai, quan sát ở bước sóng 254 nm.
Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp về hình dạng, màu sắc và Rf với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. - Trong mục định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic meloxicam trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Theo Dược điển Mỹ 43 [34] - Trong mục định lượng, phổ hấp thụ UV của pic meloxicam ở dung dịch thử có các cực đại và cực tiểu tương ứng với dung dịch chuẩn. - Trong mục định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
Nguyên liệu Theo Dược điển Việt Nam V [1], BP 2020 [39], EP 10.0 [13] Hòa tan 0,25 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 5 ml acid formic khan và 50 ml acid acetic khan. Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N, xác định điểm tương đương bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế. 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N tương đương với 35,14 mg C14H13N3O4S2. Theo Dược điển Mỹ 43 [34] Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng.
- Dung dịch A: Amoni acetat 0,1% (kl/tt) được điều chỉnh đến pH 9,1 bằng dung dịch amoniac 10%. - Dung môi pha loãng: Methanol - NaOH 1 N (250:1) - Dung dịch kiểm tra tính phù hợp hệ thống: Hòa tan meloxicam chuẩn và tạp A chuẩn trong bình định mức chứa 50% thể tích dung môi pha loãng và định mức đến vạch bằng nước để thu được dung dịch có nồng meloxicam và tạp A khoảng 0,08 mg/ml. - Dung dịch chuẩn: Hòa tan meloxicam chuẩn trong bình định mức chứa 50% thể tích dung môi pha loãng và định mức đến vạch bằng nước cất để thu được dung dịch meloxicam khoảng 0,2 mg/ml. - Dung dịch thử: Hòa tan mẫu thử meloxicam trong bình định mức chứa 50% thể tích dung môi pha loãng và định mức đến vạch bằng nước cất để thu được dung dịch thử có nồng độ meloxicam khoảng 0,2 mg/ml.
- Điều kiện sắc ký: + Pha động gồm methanol và dung dịch A (21:29) + Cột sắc ký C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm). + Đầu dò UV đặt ở bước sóng 360 nm; nhiệt độ cột 45 °C + Tốc độ dòng 1 ml/phút; thể tích tiêm 10 µl. - Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: + Dung dịch kiểm tra tính phù hợp hệ thống: Độ phân giải giữa pic meloxicam và pic tạp A không nhỏ hơn 3,0 và hệ số bất đối của pic meloxicam không lớn hơn 2,0. + Dung dịch chuẩn: RSD của diện tích pic meloxicam không lớn hơn 0,73%.
Thành phẩm viên nén Bảng 1. Định lượng meloxicam trong thành phẩm viên nén BP 2020 [38] DĐVN V [1] USP 43 [34] Pha động A KH2PO4 0,1% pH 6,0 (NH4)2HPO4 0,20% pH 7 Pha động B Methanol Methanol - isopropanol (65:10) 0’ - 2,5’: 40% B A - B (63:37) 2,5’ - 12’: 40 → 70% B Chương trình 12’ - 25’: 70% B pha động 25’ - 26’: 70 → 40% B 26’ - 30’: 40% B Cột C18 (15 cm × 4,0 mm; 5 µm) C18 (10 cm × 4,0 mm; 10 µm) Nhiệt độ cột 25 °C 40 °C Đầu dò UV 350 nm 254 nm Tốc độ dòng 1,0 ml/phút 0,8 ml/phút Thể tích tiêm 10 µl 20 µl 25 µl Cân một lượng bột viên tương ứng với khoảng 30 Cho 10 viên vào bình mg meloxicam, thêm 10 ml dung dịch NaOH 1 M, định mức 1000 ml, thêm thêm 40 ml methanol, siêu âm 5 phút. Thêm 40 100 ml dung dịch NaOH ml methanol, khuấy từ trong 3 giờ và siêu âm 5 1 N, thêm 800 ml phút, để nguội, thêm methanol vừa đủ 100,0 ml, methanol, siêu âm 15 lắc đều và lọc. phút, khuấy 30 phút, Dung dịch thêm methanol vừa đủ thử thể tích, lắc đều và lọc.