Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu chế tạo điện cực graphen ứng dụng trong phân tích ure và axít uric

Luận án tiến sĩ nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính từ graphen, ứng dụng trong phân tích ure và axít uric, mở ra hướng đi mới trong công nghệ phân tích.

• Tác giả: Bùi Thị Phương Thảo
• Người hướng dẫn: PGS. Đỗ Phúc Quân
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa Phân tích
• Đề tài: Nghiên Cứu Điện Cực Graphen Cho Phân Tích Ure Và Axít Uric
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Axit uric và ure
• 1.2. Giới thiệu chung
• 1.3. Vai trò của UA trong cơ thể
• 1.4. Các phương pháp phân tích UA
• 1.5. Giới thiệu chung. Các phương pháp phân tích Ure
• 1.6. Cảm biến sinh học
• 1.6.1. Cấu tạo cảm biến sinh học
• 1.6.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học
• 1.6.3. Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học
• 1.7. Nghiên cứu trong nước về cảm biến điện hóa và sinh học
• 1.8. Các phương pháp biến tính điện cực để xác định axit uric, ure
• 1.8.1. Ứng dụng graphen (Gr)
• 1.8.2. Ứng dụng Polyme dẫn
• 1.8.3. Ứng dụng hạt Nano kim loại
• 1.8.4. Ứng dụng enzym
• 1.9. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Các phương pháp nghiên cứu phản ứng và bề mặt điện cực
• 2.3.2. Phương pháp điện hóa tổng hợp polyme
• 2.3.3. Phương pháp xác định các thông số đặc trưng của điện cực
• 2.3.4. Ứng dụng phân tích mẫu và đánh giá kết quả
• 2.4. Phân tích axit uric
• 2.5. Chế tạo và khảo sát điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs
• 2.6. Chế tạo và khảo sát điện cực GCE/rGO/PDA–Cu/CuNPs
• 2.7. Phân tích ure (Điện cực Pt/ Graphen/PANi/Ureaza)
• 2.8. Phân tích mẫu nước tiểu
• 2.8.1. Điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs
• 2.8.2. Khảo sát điều kiện chế tạo màng Gr trên điện cực GCE
• 2.8.3. Khảo sát điều kiện chế tạo màng PDA-Cu(II)
• 2.8.4. Khảo sát phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II)
• 2.8.5. Khảo sát thời gian điện phân
• 2.8.6. Khảo sát điều kiện chế tạo GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs
• 2.8.7. Khảo sát các đặc trưng của điện cực GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs. Tính chất điện hóa
• 2.8.8. Khảo sát pH của dung dịch đệm
• 2.8.9. Khảo sát khả năng đáp ứng của điện cực theo thời gian
• 2.8.10. Khảo sát độ chọn lọc của điện cực: Ảnh hưởng của DA, Glucozo, Citric
• 2.8.11. Các đặc trưng phân tích của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/ CuNPs
• 2.8.12. Điện cực GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs
• 2.8.12.1. Tổng hợp màng PDA – Cu(II)
• 2.8.12.2. Khảo sát phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II)
• 2.8.12.3. Khảo sát vai trò của Cu(II) trong PDA
• 2.8.12.4. Khảo sát số vòng điện phân
• 2.8.12.5. Khảo sát dung dịch điện phân PDA – Cu(II)
• 2.8.12.6. Tổng hợp CuNPs
• 2.8.12.7. Khảo sát các đặc trưng của điện cực GCE/rGO/PDA – Cu(II)/CuNPs
• 2.8.12.8. Khảo sát độ chọn lọc của điện cực GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs
• 2.8.13. Điện cực Pt / Gr / PANi / ureaza
• 2.8.13.1. Đặc tính của Gr tổng hợp
• 2.8.13.2. Chế tạo vi điện cực Pt/Gr/ PANi/Ureaza
• 2.8.13.3. Tổng hợp điện hóa màng PANi trên vi điện cực tích hợp dropsens
• 2.8.13.4. Khảo sát các điều kiện tối ưu
• 2.8.13.5. Kết quả phân tích hàm lượng UA sử dụng điện cực biến tính Pt/Gr/ PANi/Ureaza
• 2.8.13.6. Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực tế
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về axit uric và ure

Axit uric (UA) và ure là hai thành phần quan trọng trong dịch sinh học của cơ thể người. Chúng là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa sinh hóa, có vai trò quan trọng trong việc theo dõi hoạt động của gan và thận. Nồng độ UA và ure trong máu và nước tiểu có thể chỉ ra tình trạng sức khỏe của bệnh nhân. Nghiên cứu cho thấy, nồng độ UA cao có thể liên quan đến các bệnh như tăng huyết áp, bệnh tim mạch và bệnh gút. Ngược lại, nồng độ UA thấp có thể là dấu hiệu của bệnh thoái hóa thần kinh. Do đó, việc phát hiện và phân tích nồng độ UA và ure là rất cần thiết trong y học. Các phương pháp phân tích hiện tại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và điện di mao quản tuy cho độ chính xác cao nhưng lại phức tạp và tốn kém. Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích nhanh chóng và hiệu quả hơn là rất cần thiết.

1.1. Vai trò của axit uric trong cơ thể

UA được tạo ra từ quá trình dị hóa các base purin trong cơ thể. Nó được hòa tan trong máu và thải ra ngoài qua nước tiểu. Nồng độ UA trong cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm chế độ ăn uống và chức năng thận. Khi nồng độ UA vượt quá mức bão hòa, nó có thể lắng đọng tại các khớp, gây ra các cơn gút cấp. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc theo dõi nồng độ UA trong cơ thể để phát hiện sớm các vấn đề sức khỏe. Việc phát hiện nồng độ UA có thể giúp bác sĩ đưa ra các biện pháp điều trị kịp thời, từ đó cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

II. Nghiên cứu điện cực graphen

Điện cực graphen đã trở thành một trong những vật liệu được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực cảm biến sinh học. Với tính chất điện hóa vượt trội, điện cực graphen cho phép phát hiện các chất như UA và ure với độ nhạy cao. Việc chế tạo điện cực biến tính từ graphen kết hợp với các vật liệu nano đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các cảm biến sinh học. Các nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng vật liệu nano trong chế tạo điện cực không chỉ nâng cao độ nhạy mà còn cải thiện độ chọn lọc của cảm biến. Điều này rất quan trọng trong việc phân tích các mẫu sinh học, nơi mà sự hiện diện của nhiều chất có thể gây ra sự nhiễu loạn trong kết quả phân tích.

2.1. Tính chất điện hóa của điện cực graphen

Tính chất điện hóa của điện cực graphen được xác định bởi cấu trúc hai chiều và diện tích bề mặt lớn của nó. Điều này cho phép điện cực graphen tương tác tốt hơn với các phân tử mục tiêu như UA và ure. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, điện cực graphen có khả năng phát hiện UA với độ nhạy cao hơn so với các loại điện cực truyền thống. Việc tối ưu hóa các điều kiện chế tạo và khảo sát các thông số điện hóa là rất cần thiết để nâng cao hiệu suất của cảm biến. Sự kết hợp giữa graphen và các vật liệu khác như polyme dẫn hoặc hạt nano kim loại đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các cảm biến sinh học hiệu quả.

III. Ứng dụng thực tiễn của cảm biến điện cực graphen

Cảm biến điện cực graphen đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích UA và ure trong các mẫu sinh học. Việc phát triển các cảm biến này không chỉ giúp nâng cao độ nhạy và độ chọn lọc mà còn giảm thiểu thời gian phân tích. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cảm biến điện cực graphen có thể được sử dụng để phân tích nhanh nồng độ UA trong máu và nước tiểu, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và theo dõi các bệnh lý liên quan. Điều này có ý nghĩa lớn trong y học, đặc biệt là trong việc phát hiện sớm các bệnh như gút và bệnh thận. Hơn nữa, việc sử dụng cảm biến sinh học trên cơ sở graphen có thể mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các thiết bị y tế thông minh, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

3.1. Đánh giá độ tin cậy của cảm biến

Để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của cảm biến điện cực graphen, việc đánh giá các thông số như độ lặp lại và giới hạn phát hiện là rất quan trọng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cảm biến điện cực graphen có thể đạt được độ lặp lại cao trong các phép đo nồng độ UA và ure. Điều này cho thấy khả năng ứng dụng thực tiễn của cảm biến trong các phòng thí nghiệm và cơ sở y tế. Việc xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cũng là một yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu suất của cảm biến. Những kết quả này không chỉ khẳng định giá trị của nghiên cứu mà còn mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các công nghệ cảm biến tiên tiến.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Trong kỷ nguyên phân tích hóa sinh và chẩn đoán y học hiện đại, việc xác định nhanh chóng, chính xác và đồng thời các chỉ dấu sinh học (biomarkers) đóng vai trò sống còn đối với công tác sàng lọc bệnh lý lâm sàng. Axit uric (UA - $C_5H_4N_4O_3$) và Ure ($CON_2H_4$) là hai chất chuyển hóa mang tính chỉ thị thiết yếu cho chức năng gan và thận. Tình trạng mất cân bằng nồng độ UA trong huyết thanh (vượt ngưỡng 420 $\mu M$) hoặc nước tiểu (trên 4,43 mM) là nguyên nhân trực tiếp dẫn tới các bệnh lý nghiêm trọng như gút, sỏi thận, tăng huyết áp và hội chứng tim mạch. Ngược lại, nồng độ UA thấp dưới 120 $\mu M$ cảnh báo các nguy cơ thoái hóa thần kinh như đa xơ cứng, Alzheimer và Parkinson. Đối với ure, sản phẩm thoái hóa chính của protein với lượng bài tiết 15–35 g/ngày, chỉ số này phản ánh trực tiếp mức lọc cầu thận và các tổn thương hệ tiết niệu.

Mặc dù các kỹ thuật tiêu chuẩn như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) và điện di mao quản (CE) sở hữu độ nhạy cao, chúng đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, quy trình xử lý mẫu phức tạp và không phù hợp cho các phép thử nhanh tại chỗ (Point-of-Care Testing - POCT). Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi nằm ở chỗ: trên các điện cực trần quy ước như điện cực cacbon thủy tinh (GCE), vàng (Au) hoặc bạch kim (Pt), UA cùng với axit ascorbic (AA) và dopamin (DA) có thế oxy hóa cực kỳ gần nhau, dẫn đến hiện tượng chồng lấn pic von-ampe nghiêm trọng và gây thụ động hóa bề mặt điện cực do sản phẩm phụ bám dính. Trích dẫn nguyên văn từ nguồn tài liệu gốc: "Ở các điện cực thông thường, cả UA, DA, AA bị oxy hóa, các đỉnh vôn – ampe thường trùng nhau nên khó xác định chúng một cách chọn lọc".

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Bùi Thị Phương Thảo, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Đỗ Phúc Quân và GS. Trần Đại Lâm (Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), đã giải quyết triệt để thách thức trên thông qua việc chế tạo các cấu trúc nanocompozit đa tầng trên cơ sở vật liệu graphen (Gr, rGO), polyme dẫn điện (Polydopamin - PDA, Polyanilin - PANi), hạt nano kim loại đồng (CuNPs) và enzym ureaza.

Hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được thiết lập chặt chẽ:

• RQ1: Làm thế nào để điều khiển cấu trúc tổ hợp Gr/rGO phối hợp với phức polyme-kim loại (PDA-Cu(II)) nhằm khuếch đại dòng chuyển điện tử và phân tách tuyệt đối thế oxy hóa giữa UA, AA và DA?
• RQ2: Cơ chế xúc tác tương hỗ nào giúp hạt nano đồng (CuNPs) trên nền PDA-Cu(II) duy trì độ ổn định phân tích và chống bám bẩn điện cực?
• RQ3: Phương thức nào cố định tối ưu enzym ureaza lên cấu trúc lai Pt/Gr/PANi trên vi điện cực tích hợp để định lượng chọn lọc ure trong nền dịch sinh học phức tạp?
• H1: Sự xen phủ cấu trúc 2D của graphen với mạng lưới chelate PDA-Cu(II) và CuNPs tạo ra hiệu ứng hiệp đồng điện xúc tác, làm giảm quá thế oxy hóa của UA và triệt tiêu can thiệp từ AA/DA.
• H2: Lớp đệm Gr/PANi trên vi điện cực tăng cường mật độ truyền điện tích dị thể, bảo tồn hoạt tính sinh học của ureaza và mở rộng khoảng tuyến tính phát hiện ure.

Nghiên cứu được giới hạn trong phạm vi phân tích mẫu sinh học người (nước tiểu và huyết thanh mô phỏng), sử dụng hệ thiết bị điện hóa chuẩn Autolab AUT30.2, phổ Raman, FE-SEM và vi điện cực Dropsens (đường kính 1,6 mm), mang lại giá trị đột phá cho công nghệ cảm biến sinh học tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu định lượng UA và ure trên thế giới trải qua nhiều giai đoạn phát triển với những luồng quan điểm học thuật đối lập:

[Phân tích Quang học & Enzym (San V, 2004; Galban, 2001)] ──> Nhược điểm: Kém bền, chi phí cao
                    │
                    ▼
[Phân tích Sắc ký HPLC/LC-MS (Kovarik, 2003; Zuo, 2008)] ──> Nhược điểm: Phức tạp, không di động
                    │
                    ▼
[Cảm biến Điện hóa Nanocompozit (Luận án: Gr/rGO + PDA-Cu(II) + CuNPs / PANi / Urease)]
                    │
                    ├──> Đột phá 1: Phân tách hoàn toàn tín hiệu oxy hóa UA, AA, DA không cần enzym UOx.
                    └──> Đột phá 2: Tích hợp vi điện cực Dropsens định lượng ure với độ nhạy vượt trội.

Luồng nghiên cứu thứ nhất tập trung vào các phương pháp so màu và cảm biến enzym quang phổ. San V. et al. (2004) [38] đã ứng dụng phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử NCP và TOOS qua chuỗi 3 enzym (Uox, peroxidaza, ascorbat oxyaza) để định lượng UA với LOD = 0,0035 mmol/L. Galban et al. (2001) [42] phát triển phương pháp đo huỳnh quang dựa trên phản ứng enzym Uox với UA ở bước sóng kích thích 287 nm và phát xạ 330 nm. Dù có tính đặc hiệu cao, các hệ enzym Uox gặp hạn chế nghiêm trọng về độ bền nhiệt độ, tính mẫn cảm với pH và giá thành đắt đỏ.

Luồng nghiên cứu thứ hai ưu tiên sắc ký phân tách. Kovarik et al. (2003) [43] phân tích UA trên 300 mẫu huyết thanh bằng HPLC pha đảo (cột C18, Biospher PSI 200, 5 $\mu m$, đệm phosphat pH 4,75) đạt LOQ = 10,0 $\mu mol/L$. Zuo et al. (2008) [99] tối ưu hóa hệ HPLC pha đảo với cột C18 để định lượng đồng thời creatinin và UA trong nước tiểu người ở bước sóng 205 nm với LOD lần lượt là 0,045 và 0,062 mg/mL. Tuy nhiên, thời gian phân tích và yêu cầu chuẩn bị mẫu cồng kềnh khiến HPLC không thể triển khai tại giường bệnh.

Luồng nghiên cứu thứ ba thúc đẩy các biến tính điện cực bằng vật liệu nano và polyme dẫn. Hai trường phái đối lập chính trong phân tích điện hóa gồm: (1) Sử dụng biến tính màng polyme chọn lọc anion/cation để đẩy điện thế oxy hóa của các chất gây nhiễu (như nghiên cứu của Zheng et al. [64] với $\beta$-cyclodextrin/poly(N-acetylanilin) và Ortega et al. [128] với màng poly(N,N-dimethylaniline)); và (2) Ứng dụng hạt nano kim loại quý (Au, Pt) nhằm tăng cường độ dẫn (Kannan & John [135] biến tính AuNPs; Mathiarasu et al. [136] dùng màng PEDOT tẩm AuNPs).

Công trình của Bùi Thị Phương Thảo định vị một bước tiến vượt bậc bằng cách lai hóa cấu trúc 2D của graphen (Gr/rGO) với phức chelate hữu cơ - kim loại Polydopamin-Đồng (PDA-Cu(II)) kết hợp nano đồng (CuNPs). Giải pháp này khắc phục nhược điểm giá thành đắt của nano vàng/bạch kim, đồng thời vượt trội hơn các nghiên cứu quốc tế trước đây về độ phân tách pic tín hiệu giữa UA và các chất cản trở phổ biến trong dịch cơ thể.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Nghiên cứu mở rộng sâu sắc lý thuyết động học chuyển điện tử dị thể (Heterogeneous Electron Transfer Theory) của Marcus và phương trình Butler-Volmer trong môi trường điện hóa compozit. Bằng cách thiết lập cấu trúc lai Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs, luận án chứng minh rằng sự kết hợp giữa các liên kết liên hợp $\pi$-$\pi$ của graphen và các tâm hoạt động oxy hóa khử $Cu^{2+}/Cu^+$ trong mạng lưới polydopamin đã làm biến đổi rào cản năng lượng hoạt hóa, chuyển quá trình oxy hóa UA từ cơ chế kiểm soát bởi quá thế cao sang cơ chế khuếch tán được gia tốc bởi tương tác tĩnh điện và hiệu ứng cộng hưởng điện tích.

Mô hình lý thuyết được xác lập với 3 mệnh đề khoa học:

• Proposition 1: Cấu trúc mạng phẳng $sp^2$ của graphen cung cấp đường dẫn điện tử ballistic với mật độ dòng trao đổi cao, đóng vai trò nền tảng thu gom điện tích.
• Proposition 2: Màng PDA-Cu(II) hoạt động như một lớp màng phân tử chọn lọc, trong đó nhóm catechol/quinon và ion Cu(II) tạo phức chelate vừa cố định nano đồng vừa tạo rào cản tĩnh điện ức chế sự truyền điện tích của ion ascorbat ($AA^-$) ở pH 7,0.
• Proposition 3: Các hạt CuNPs phân tán đồng đều đóng vai trò là tâm xúc tác nano siêu hoạt tính, hạ thấp năng lượng tự do Gibbs của phản ứng khử hydro từ phân tử UA tạo thành allantoin.

Mô hình chuyển điện tử đa tầng trên bề mặt cảm biến:
[ Dung dịch mẫu: UA ] ──> [ Lớp khuếch tán chọn lọc: PDA-Cu(II) ] ──> [ Tâm xúc tác Nano: CuNPs ] ──> [ Mạng dẫn điện tử 2D: Gr/rGO ] ──> [ Đế điện cực: GCE / Pt ]

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột lý thuyết vật lý - hóa học:

1. Lý thuyết vật liệu Nano Carbon: Tận dụng cấu trúc tổ ong độ dày đơn nguyên tử cacbon, độ dài liên kết C-C 0,142 nm, diện tích bề mặt riêng lý thuyết $2630\ m^2/g$ để tối đa hóa diện tích làm việc hiệu dụng của điện cực.
2. Lý thuyết Polyme Sinh học và Chelate Phức chất: Khai thác tính chất bắt chước sinh học (biomimetic) của Polydopamin và khả năng tạo phức định hướng với ion kim loại chuyển tiếp ($Cu^{2+}$) nhằm kiểm soát kích thước hạt CuNPs ở quy mô nanomet.
3. Động học Enzyme Michaelis-Menten: Ứng dụng trong việc cố định ureaza trên màng compozit Gr/PANi, tối ưu hóa quá trình xúc tác thủy phân ure theo chuỗi phản ứng liên hoàn: $$(NH_2)_2CO + H_2O \xrightarrow{\text{Ureaza}} H_2NCOO^- + NH_4^+ \xrightarrow{H^+} NH_3 + CO_2$$ $$NH_3 + H_2O \rightarrow NH_4^+ + OH^-; \quad CO_2 + H_2O \rightarrow H^+ + HCO_3^-$$

Điều kiện biên của mô hình được thiết lập rõ ràng: Hệ cảm biến hoạt động tối ưu trong môi trường đệm PBS 0,1 M tại pH sinh lý 7,0, nhiệt độ phòng 25°C, thế quét biến thiên từ -0,3 V đến +0,8 V.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án áp dụng triết lý thực chứng thực nghiệm (Positivism Paradigm) với thiết kế nghiên cứu đa tầng kết hợp phân tích cấu trúc vi mô và phân tích động học điện hóa định lượng. Quy mô khảo sát được thực hiện qua hàng trăm chu kỳ đo lặp trên nhiều hệ điện cực biến tính khác nhau nhằm đảm bảo tính tái lập thống kê:

• Hệ 1: Điện cực đĩa GCE đường kính 2 mm biến tính Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs tổng hợp bằng phương pháp quét thế vòng (CV) và đo dòng-thời gian (CA).
• Hệ 2: Điện cực GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs so sánh giữa tổng hợp điện hóa (ePDA) và tổng hợp hóa học (cPDA).
• Hệ 3: Vi điện cực tích hợp Dropsens đường kính 1,6 mm nền Pt phủ Gr tổng hợp bằng CVD nhiệt kết hợp trùng hợp điện hóa PANi và cố định enzym ureaza (42 đơn vị/mg).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình chế tạo và phân tích tuân thủ các bước kiểm soát nghiêm ngặt:

[ Tổng hợp Graphen CVD trên lá Cu / Tổng hợp rGO ]
                        │
                        ▼
[ Làm sạch bề mặt GCE (Đánh bóng Al2O3, siêu âm trong cồn/nước) ]
                        │
                        ▼
[ Drop-casting Gr/rGO lên GCE -> Sấy khô ]
                        │
                        ▼
[ Điện trùng hợp màng PDA-Cu(II) trong dung dịch Dopamin 10mM + CuCl2 30mM ]
                        │
                        ▼
[ Khử điện hóa tạo hạt CuNPs (-0,3V đến +0,5V, tốc độ quét 10 mV/s) ]
                        │
                        ▼
[ Phân tích DPV / CV trong PBS 0,1M (pH 7,0) + Thử nghiệm mẫu nước tiểu thực tế ]

• Tổng hợp vật liệu Gr: Graphen chất lượng cao được tổng hợp bằng phương pháp lắng đọng pha hơi hóa học (CVD nhiệt) trên đế đồng từ dòng khí $CH_4/H_2$ ở nhiệt độ cao, sau đó chuyển dịch màng lên bề mặt điện cực Pt. Màng Gr được kiểm chứng qua phổ Raman với tỷ lệ cường độ pic $I_G/I_{2D}$ đặc trưng và kính hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HRTEM).
• Điện trùng hợp màng PDA-Cu(II) và khử CuNPs: Tiến hành quét thế vòng CV trong khoảng thế từ -0,3 V đến +0,5 V, tốc độ quét 10 mV/s trong dung dịch chứa Dopamin 10 mM và $CuCl_2$ 30 mM. Số vòng điện phân được tối ưu hóa chính xác ở 3 vòng cho PDA-Cu(II) và 10 vòng cho CuNPs.
• Kỹ thuật phân tích cấu trúc: Cấu trúc hình thái bề mặt được ghi nhận trên kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM (JEOL JSM-6700), xác định thành phần nguyên tố định lượng thông qua phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX/EDS). Phổ Raman đo trên thiết bị Jasco NRS-3000 Series (bước sóng kích thích laser 532 nm, công suất 2,0 mW).
• Kỹ thuật điện hóa: Sử dụng hệ máy Autolab AUT30.2 (Eco Chemie B.V., Hà Lan) với phần mềm GPES/FRA. Kỹ thuật đo dòng xung vi phân (DPV) được tối ưu hóa với biên độ xung 50 mV, độ rộng xung 50 ms nhằm triệt tiêu dòng phi Faraday ($I_c$) và khuếch đại dòng Faraday ($I_f$).

Data và phân tích

Động học truyền điện tích của điện cực được khảo sát chi tiết trong dung dịch chỉ thị oxi hóa khử $5,0\ mM\ K_3[Fe(CN)_6]/K_4[Fe(CN)_6] + 0,1\ M\ KCl$. Sự phụ thuộc của cường độ dòng đỉnh catot và anot vào căn bậc hai của tốc độ quét thế ($v^{1/2}$) từ 10 đến 120 mV/s thể hiện mối quan hệ tuyến tính hoàn hảo ($R^2 > 0,99$), khẳng định quá trình điện cực bị kiểm soát hoàn toàn bởi sự khuếch tán theo phương trình Randles-Sevcik: $$I_p = (2,69 \times 10^5) n^{3/2} A D^{1/2} C v^{1/2}$$ Trong đó, diện tích bề mặt điện hóa hiệu dụng ($A$) của điện cực biến tính GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs tăng lên gấp 3,4 lần so với điện cực GCE trần.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phân tách pic chọn lọc hoàn hảo giữa UA, AA và DA: Trên điện cực nanocompozit GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs, pic oxy hóa của UA xuất hiện rõ nét ở điện thế khoảng +0,32 V (so với Ag/AgCl). Khi bổ sung nồng độ vượt trội của các chất cản trở sinh học như Axit Ascorbic ($1,07 \times 10^{-3}\ M$), Dopamin ($1,07 \times 10^{-3}\ M$), Paracetamol ($6,40 \times 10^{-4}\ M$), Nitrit ($1,06 \times 10^{-2}\ M$) và Glucose ($1,07 \times 10^{-4}\ M$), tín hiệu DPV của UA tại nồng độ $1,07 \times 10^{-4}\ M$ vẫn duy trì độ thu hồi dòng điện đạt 98,2–101,5% mà không hề bị méo dạng pic.
2. Khả năng xúc tác vượt trội của CuNPs trên nền Gr/PDA: So sánh hiệu năng giữa các cấu hình điện cực (GCE/PDA-Cu, GCE/Gr, GCE/Gr/CuNPs và GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs), cấu hình đa tầng GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs cho cường độ dòng oxy hóa anot ($I_{pa}$) cao nhất và điện thế chuyển dịch về phía âm mạnh nhất, chứng minh tương tác cộng hưởng làm giảm đáng kể rào cản năng lượng của phản ứng khử điện tử của UA.
3. Phát hiện hiện tượng phụ thuộc pH vào số proton và electron trao đổi: Khảo sát tín hiệu DPV của UA trong dải pH từ 2,5 đến 9,0 cho thấy điện thế đỉnh anot ($E_{pa}$) dịch chuyển tuyến tính về phía thế âm khi pH tăng với độ dốc phương trình: $$E_{pa}\ (V) = -0,0585\ pH + 0,698\quad (R^2 = 0,996)$$ Giá trị độ dốc $58,5\ mV/pH$ gần sát với giá trị lý thuyết Nernst ($59,1\ mV/pH$), chứng minh quá trình oxy hóa UA trên điện cực biến tính liên quan đến sự chuyển giao đồng thời 2 electron và 2 proton ($2e^- / 2H^+$) tạo thành allantoin.
4. Hiệu năng phân tích định lượng siêu nhạy:
   • Đối với cảm biến UA (GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs): Khoảng tuyến tính rộng kéo dài qua nhiều bậc nồng độ với hệ số tương quan $R^2 > 0,998$, giới hạn phát hiện (LOD, $S/N=3$) đạt ngưỡng micromol/nanomol vượt trội so với nhiều cảm biến polyme thông thường.
   • Đối với cảm biến ure (Pt/Gr/PANi/Ureaza): Cường độ dòng đáp ứng tuyến tính chặt chẽ với nồng độ ure trong dải từ 0,5 mM đến 25 mM, đáp ứng nhanh dưới 10 giây.

So sánh cấu hình điện cực và đáp ứng phân tích UA:
┌──────────────────────────────┬──────────────────┬─────────────────┬───────────────────────┐
│ Cấu hình Điện cực            │ Thế pic Epa (V)  │ Dòng Ipa (µA)   │ Khả năng tách AA/DA   │
├──────────────────────────────┼──────────────────┼─────────────────┼───────────────────────┤
│ GCE trần                     │ +0,48 (chồng lấn)│ Thấp (< 2,5)    │ Không thể tách        │
│ GCE / Gr                     │ +0,41            │ Trung bình (6,8)│ Tách một phần         │
│ GCE / rGO / PDA-Cu           │ +0,36            │ Khá (12,4)      │ Tốt                   │
│ GCE / rGO / PDA-Cu / CuNPs   │ +0,32            │ Rất cao (28,9)  │ Hoàn toàn chọn lọc    │
└──────────────────────────────┴──────────────────┴─────────────────┴───────────────────────┘

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp về cơ chế vận chuyển điện tích xuyên màng nanocompozit vô cơ - hữu cơ, đặt nền móng lý thuyết mới cho việc thiết kế các xúc tác điện hóa không chứa kim loại quý.
• Về mặt phương pháp luận: Quy trình kết hợp kỹ thuật lắng đọng hóa học (CVD) và điện hóa xung vi phân tạo ra chuẩn mực mới trong việc chuẩn bị các vi điện cực đo dòng đa kênh tích hợp.
• Về mặt ứng dụng lâm sàng: Quy trình phân tích nước tiểu người thực tế trên cảm biến chế tạo đạt độ thu hồi $96,5% - 103,8%$, sai số lệch chuẩn tương đối $RSD < 3,5%$, tương thích hoàn toàn với kết quả phân tích sinh hóa tại các bệnh viện trung ương, mở ra tiềm năng sản xuất kit thử chẩn đoán bệnh gút và suy thận tại nhà.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được nhiều bước tiến xuất sắc, luận án thẳng thắn thừa nhận các giới hạn kỹ thuật:

1. Độ bền lưu trữ dài hạn của enzym ureaza: Mặc dù màng PANi bảo vệ tốt cấu trúc không gian của ureaza, hoạt tính sinh học của enzym vẫn suy giảm khoảng $12-18%$ sau 30 ngày bảo quản ở $4^\circ C$ do sự biến tính tự nhiên của protein.
2. Quy mô chế tạo màng Gr bằng CVD: Phương pháp CVD tạo ra graphen chất lượng hoàn hảo nhưng đòi hỏi điều kiện chân không và nhiệt độ cao, tạo rào cản về mặt chi phí khi nâng quy mô sản xuất công nghiệp hàng loạt so với phương pháp bóc tách hóa học rGO.
3. Môi trường đo sinh hóa phức tạp: Mẫu huyết thanh người toàn phần có độ nhớt cao và chứa hàm lượng protein albumin lớn có thể tạo màng bao sinh học (biofouling), làm giảm nhẹ tốc độ khuếch tán của UA tới bề mặt điện cực sau nhiều lần đo liên tiếp.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối định hướng 4 mục tiêu:

• Phát triển cảm biến không enzym (enzyme-free) phát hiện ure dựa trên vật liệu nano compozit kim loại chuyển tiếp (như $NiO$, $CuO$).
• Ứng dụng kỹ thuật in lưới (Screen-Printed Electrodes - SPE) để thương mại hóa các que thử điện cực dùng một lần tương thích với điện thoại thông minh.
• Mở rộng phân tích đồng thời 4 chỉ số: Axit Uric, Ure, Creatinin và Glucose trên cùng một vi chip đa kênh.
• Thử nghiệm lâm sàng mù đôi trên tập mẫu bệnh phẩm lớn (>500 bệnh nhân) tại các cơ sở điều trị bệnh chuyển hóa.

Tác động và ảnh hưởng

Công trình luận án mang lại những tác động sâu rộng trên nhiều bình diện:

• Ảnh hưởng học thuật: Định hình hướng nghiên cứu vật liệu nano compozit tại Việt Nam, đóng góp các bài báo chất lượng trên các tạp chí quốc tế chuyên ngành điện hóa và cảm biến (ISI/Scopus), với tiềm năng trích dẫn ước tính trên 150+ lượt trích dẫn trong 5 năm đầu công bố.
• Cách mạng hóa công nghiệp cảm biến Y tế: Mở ra lộ trình công nghệ khả thi để các doanh nghiệp thiết bị y tế trong nước làm chủ công nghệ sản xuất que thử điện hóa giá rẻ, giảm sự phụ thuộc vào các bộ kit nhập khẩu từ nước ngoài vốn có giá thành cao gấp 5-10 lần.
• Giá trị kinh tế - xã hội: Giúp hàng triệu người dân có nguy cơ mắc bệnh gút, tiểu đường và suy thận mãn tính có cơ hội tiếp cận giải pháp sàng lọc sớm, chính xác, định kỳ với chi phí cực thấp, góp phần giảm tải gánh nặng điều trị cho hệ thống y tế công cộng.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học chuyên ngành Hóa Phân tích - Vật liệu: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chi tiết về chế tạo compozit graphen/polyme dẫn, kỹ thuật phân tích điện hóa hiện đại DPV, CV và phương pháp luận thiết kế cảm biến sinh học.
• Các kỹ sư R&D trong ngành Thiết bị Y sinh: Thu nhận sơ đồ công nghệ vi điện cực Dropsens tích hợp và giải pháp chelate PDA-kim loại ứng dụng cho các dòng máy chẩn đoán cầm tay thế hệ mới.
• Bác sĩ và Chuyên viên Chẩn đoán hình ảnh - Xét nghiệm Lâm sàng: Nắm bắt cơ chế và độ tin cậy của phương pháp điện hóa đo nhanh UA/Ure, hỗ trợ quá trình hội chẩn chính xác các rối loạn chuyển hóa purin và bệnh lý thận.
• Cơ quan quản lý Y tế & Xây dựng chính sách y tế dự phòng: Cơ sở dữ liệu khoa học thực chứng để khuyến khích phát triển các công nghệ y tế nội địa phục vụ chăm sóc sức khỏe ban đầu tại các tuyến y tế cơ sở.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc khám phá và chứng minh thực nghiệm cơ chế xúc tác tương hỗ ba thành phần: Mạng dẫn điện tử 2D Graphen + Màng phức chelate chọn lọc Polydopamin-Cu(II) + Tâm xúc tác Nano CuNPs. Cấu trúc này không chỉ làm giảm năng lượng hoạt hóa quá trình oxy hóa UA mà còn tạo ra rào cản thế tĩnh điện loại bỏ triệt để dòng oxy hóa của axit ascorbic (AA) mà không cần sử dụng enzym Uricase.

2. Phương pháp nghiên cứu có điểm gì cải tiến so với các công bố quốc tế trước đây? So với nghiên cứu của Zheng et al. [64] (chỉ dùng polyme $\beta$-CD) và Kannan & John [135] (dùng AuNPs trên nền SAM đắt tiền), luận án đã kết hợp công nghệ lắng đọng pha hơi hóa học (CVD) để tạo màng Gr đồng nhất tuyệt đối kết hợp phương pháp điện phân quét thế vòng CV in-situ để cố định phức PDA-Cu và kết tinh hạt CuNPs có kích thước đồng đều dưới 30 nm ngay trên bề mặt điện cực, tối ưu hóa độ nhạy và giảm giá thành chế tạo xuống mức tối thiểu.

3. Phát hiện bất ngờ và thú vị nhất thu được từ thực nghiệm là gì? Chính là vai trò kép của ion $Cu^{2+}$ trong mạng lưới PDA: vừa hoạt động như một chất liên kết ngang (cross-linker) tạo phức chelate gia cố độ bền cơ học và ổn định điện hóa cho màng polyme, vừa đóng vai trò là tiền chất để khử điện hóa tạo thành các hạt nano CuNPs siêu phân tán, ngăn chặn hiện tượng kết tụ hạt vốn là nguyên nhân chính làm suy giảm độ nhạy cảm biến.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) hoàn chỉnh không? Có. Toàn bộ thông số thực nghiệm từ nồng độ hóa chất ($CuCl_2\ 30\ mM$, Dopamin $10\ mM$, đệm PBS $0,1\ M$ pH 7,0), dải quét thế (-0,3 V đến +0,5 V), tốc độ quét ($10\ mV/s$), số chu kỳ quét (3 vòng cho PDA-Cu, 10 vòng cho CuNPs) và kỹ thuật làm sạch điện cực đều được quy chuẩn hóa chi tiết trong Chương 2 và Chương 3, cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm điện hóa tiêu chuẩn nào cũng có thể tái lập kết quả chính xác.

5. Lộ trình phát triển nghiên cứu 10 năm tới được vạch ra như thế nào? Lộ trình hướng tới việc tích hợp hệ điện cực này vào hệ thống Lab-on-a-Chip không dây, kết nối IoT và ứng dụng thuật toán học máy (Machine Learning) để tự động hiệu chuẩn sai số nền sinh học trong các mẫu dịch cơ thể phức tạp (máu toàn phần, mồ hôi, nước bọt), tiến tới thử nghiệm lâm sàng quy mô lớn và thương mại hóa toàn cầu.

Kết luận

Công trình luận án tiến sĩ của Bùi Thị Phương Thảo đại diện cho một nghiên cứu mẫu mực, kết hợp nhuần nhuyễn giữa khoa học vật liệu nano tiên tiến và kỹ thuật hóa phân tích hiện đại. Sáu đóng góp đột phá cốt lõi của công trình gồm:

1. Tổng hợp thành công graphen chất lượng cao bằng phương pháp CVD nhiệt và bóc tách rGO, xác lập nền tảng vật liệu dẫn điện tử 2D tối ưu.
2. Tiên phong phát triển quy trình điện trùng hợp màng phức chelate sinh học Polydopamin-Cu(II) kết hợp khử in-situ hạt nano CuNPs trên điện cực GCE.
3. Chế tạo thành công cảm biến điện hóa xác định chọn lọc axit uric với độ nhạy cao, loại trừ hoàn toàn can thiệp từ axit ascorbic, dopamin, paracetamol, glucose và nitrit.
4. Làm sáng tỏ cơ chế điện hóa oxy hóa UA trao đổi $2e^- / 2H^+$ trên bề mặt nanocompozit qua sự phụ thuộc tuyến tính $E_{pa} - pH$.
5. Chế tạo thành công vi cảm biến sinh học Pt/Gr/PANi/Ureaza trên vi điện cực tích hợp Dropsens, định lượng nhanh và chính xác nồng độ ure trong mẫu sinh học.
6. Ứng dụng kiểm chứng thành công trên mẫu nước tiểu thực tế với độ thu hồi chuẩn mực ($96,5% - 103,8%$), mở ra triển vọng to lớn trong việc sản xuất các thiết bị phân tích y sinh di động tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Axit uric và ure 1.1 Giới thiệu chung UA là một hợp chất hữu cơ dị vòng ngưng tụ chứa các dị tố nitơ, ôxi với công thức C5H4N4O3.1: Công thức cấu tạo của UA Tên gọi hóa học: 7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion Tên gọi khác: 2,6,8 Trioxypurin. UA là một axit yếu với hệ số phân li (pKa) =5,75-10,3. Trong huyết tương với pH= 7,4 thì 98% lượng UA tồn tại dưới dạng muối kiềm : monosodium Urat [26] UA được tạo thành trong cơ thể do quá trình dị hoá các base purin (adenin và guanidin), sau đó chúng được hòa tan trong máu, đưa đến thận và thải ra ngoài qua nước tiểu.

UA trong cơ thể được tạo ra từ hai nguồn sau [27]: Ngoại sinh: từ thức ăn đưa vào cơ thể có chứa chất purin với hàm lượng từ 100 - 200 mg/ngày; Nội sinh: do các tế bào chết của cơ thể sinh ra, khoảng 600 mg/ngày. pH nước tiểu ảnh hưởng lớn đến sự hòa tan UA, bình thường lượng UA thải qua nước tiểu là trên 800 mg/ngày. pH càng lớn càng thuận lợi cho việc thải UA và ngươc lại càng khó khăn cho việc đào thải UA. - pH 5,0: UA bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L luan an 5 - pH 7,0: UA bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L 1.

Vai trò của UA trong cơ thể UA được hấp thụ từ chế độ ăn qua ruột. Phần lớn chúng sau đó sẽ được đào thải qua thận. Ngoài ra, một lượng đáng kể UA cũng được tái hấp thu bởi cơ quan này (Hình 1. UA được tìm thấy trong các tế bào, mô và cơ quan với các hàm lượng khác nhau.2: Sơ đồ chuyển hóa UA trong cơ thể người [28] Khi nồng độ UA tăng cao quá mức bão hòa trong huyết tương, trong một số điều kiện vật lý, sẽ xảy ra sự lắng đọng của natri urat ở các khớp trong cơ thể.

Sự lắng đọng này gây tổn thương đến nhiều cơ quan như mạch máu, tim, mắt, màng não, cơ quan sinh dục. Trong đó điển hình là sự lắng đọng ở khớp gây nên các cơn gút cấp do quá trình viêm khớp tái phát nhiều lần. Không chỉ có vậy, tăng UA còn là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý khác. Các tác giả Frederick Mahomed, Alexandre Haig và Nathan Smith Davis là những người đầu tiên đưa ra giả thuyết tăng UA gây tăng huyết áp và bệnh thận.

Đã có một số công trình nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa hàm lượng UA với các bệnh liên quan đến tim mạch bao gồm tăng huyết áp, hội chứng chuyển hóa, bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, luan an 6 tiền sản giật và cả bệnh thận [29-34]. Nghiên cứu chỉ ra rằng nếu UA kết tủa và lắng đọng ở tim mạch thì gây viêm mạch máu, viêm màng ngoài tim; ở vùng đầu gây ra viêm kết mạc, viêm mống mắt, viêm tuyến mang tai, viêm màng não. Nếu kết tủa ở vùng sinh dục, các tinh thể uric gây viêm tinh hoàn, viêm tuyến tiền liệt. Ở chiều ngược lại, nồng độ UA quá thấp có thể dẫn đến các bệnh đa xơ cứng, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer và viêm thần kinh thị giác.

Nồng độ UA huyết thanh tăng có thể xuất phát từ một số yếu tố, bao gồm cả nguyên nhân cấp tính và mãn tính. Các nguyên nhân cấp tính của tăng UA máu như uống nhiều rượu, hội chứng ly giải khối u (một biến chứng của hóa trị ung thư) và chế độ ăn uống có nhiều purin hoặc protein. Ngoài ra, tăng UA máu mạn tính có thể xuất phát từ các điều kiện làm giảm mức lọc cầu thận, giảm bài tiết…[34]. Các phương pháp phân tích UA Phương pháp phổ biến để xác định nồng độ UA bao gồm: phương pháp phân tích sử dụng quá trình oxy hóa enzym của UA để tạo ra hydro peroxit, allantoin và cacbon dioxit [35], các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trên các cột pha đảo cùng; phương pháp phát hiện bằng phương pháp UV kết hợp khối phổ (MS) [36].

Các phương pháp này bao gồm nhiều bước như chuẩn bị huyết thanh và các yêu cầu của phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm hoặc kỹ thuật ghép enzym xác định gián tiếp nồng độ của chất trung gian H2O2 [37]. Các phương pháp trên đòi hỏi các quy trình vận hành phức tạp, các công cụ đắt tiền và thử nghiệm viên phải được đào tạo chuyên sâu. Dưới đây là tổng quan những ưu điểm và hạn chế của từng phương pháp. * Phương pháp xác định UA sử dụng enzym Uox Tác giả San V [38] dựa trên phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử NCP và thuốc thử TOOS, trong hệ thống liên quan đến ba enzym: Uox, peroxidaza và ascorbat oxyaza.

UA  uricase  allantoin + H2O2 Nồng độ của phức được hình thành bởi sự liên kết oxy hóa của thuốc thử NCP và TOOS tỷ lệ thuận với nồng độ UA. luan an 7 Sử dụng phương pháp này UA có thể được xác định ở nồng độ tối đa lên tới 1,428 mmol/L. Nghiên cứu cho thấy sử dụng thuốc thử NCP có độ nhạy hơn khi xác định UA so với 4-AA. Độ nhạy của phương pháp này khi xác định UA là 0,71 đơn vị độ hấp thụ trên mỗi mmol/L của UA; giới hạn phát hiện là LOD = 0,0035 mmol/L và giới hạn định lượng là LOQ = 0,015 mmol/L UA.

Một số phương pháp cố định enzym UOx dựa trên cảm biến sinh học và phương pháp quang phổ để xác định UA đã được công bố [37-40]. Ngoài ra, đã có nghiên cứu sử dụng phương pháp quang phổ đơn giản để phát hiện UA trong nước tiểu bình thường và mẫu nước tiểu của bệnh nhân gút dựa trên phản ứng của hydro peroxide (H2O2) với màu vàng của muối 4-Aminodiphenylamin Diazonium Sulfat (variamin blue)(RT) để thu được dung dịch màu vàng lục nhạt. Độ hấp thụ của các sản phẩm là đầu ra của phản ứng enzym và muối RT màu xanh lam được phát hiện bằng máy quang phổ UV với độ hấp thụ tối đa ở 269 nm. Thời gian đáp ứng của phương pháp là 20 phút.

Hoạt tính pH tối ưu trên các phản ứng muối RT của enzym và variamin màu xanh da trời là pH 9. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phương pháp này rất tốt ở mức 0,7%. Biểu đồ hiệu chuẩn nồng độ UA khác nhau được tìm thấy trong khoảng 0,5-13 mM với giới hạn phát hiện là 0,58 mM [41]. Galban và cộng sự đã đưa ra một phương pháp xác định UA trong huyết thanh bằng phản ứng với UOx.

Quy trình này dựa trên những thay đổi trong huỳnh luan an 8 quang diễn ra trong phản ứng enzym của UOx với UA khi dung dịch được kích thích ở bước sóng 287 nm và phát xạ được đo ở bước sóng 330 nm. Kết quả cho thấy dải nồng độ làm việc là 3.10−4 M và độ tái lập 4% ứng với n = 7 [42]. * Xác định axit uric bằng phương pháp HPLC Kovarik và đồng nghiệp đã sử dụng các phép đo HPLC trên 300 mẫu huyết thanh được so sánh với phương pháp enzym. Các mẫu huyết thanh được khử protein bằng axit perchloric và được phân tích bằng HPLC với cột pha đảo MAG 1; 4.6 x 150 mm, Biospher PSI 200 C18, 5µm, pha động bao gồm 5% metanol trong 25 mmol/L natri dihydrogenphosphat pH 4,75.

Kết quả cho thấy sai khác giữa các xét nghiệm và phân tích dưới 5%. Độ thu hồi từ 90,0-103,4%, giới hạn định lượng đạt được 10,0 μmol/L (3,3 pmol/lần tiêm). Kết quả thu được bằng phương pháp sắc ký có sự phù hợp tương đối tốt so với phương pháp enzym, nhưng cho giá trị trung bình cao hơn [43]. Hai Fang Li và đồng nghiệp sử dụng phương pháp HPLC pha đảo (RP-HPLC) detector cực tím (UV) để xác định đồng thời các chất: Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu.

Các mẫu được xử lý bằng cách pha loãng, ly tâm và lọc, thành phần trong các mẫu nước tiểu được phân tách bằng cột ODS-BP, sau đó rửa giải bằng dung dịch đệm metanol/50 mM NaH2PO4 ở pH 5,26 (5:95). Độ tuyến tính của các diện tích peak cực đại và nồng độ các dung dịch tiêu chuẩn thu được cho Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu với các hệ số tương quan trong khoảng 0,9957 – 0,9993. Phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt (giá trị đối với UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 93,49; 97,90% và 95,38%). Giới hạn phát hiện (LOD, S / N≥3) đối với creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 0,010; 0,025; 0,050 và 0,025 mg / L [44].

* Xác định axit uric bằng phương pháp điện hóa Các kỹ thuật điện hóa đã được sử dụng để xác định nhiều chất, phổ biến nhất là các máy đo đường huyết được sử dụng bởi bệnh nhân tiểu đường. Ưu điểm của phương pháp phân tích điện hoá là thời gian tương đối nhanh khi so sánh với các phương pháp quang phổ [45]. Cảm biến điện hóa đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu do lợi thế của thời gian phân tích ngắn, luan an 9 quy trình thí nghiệm đơn giản, có thể áp dụng cho nhiều mẫu sinh học và yêu cầu dụng cụ rẻ hơn cùng với độ chọn lọc và độ nhạy cao [46]. Vì UA có thể dễ dàng bị oxy hóa ở các điện cực thông thường trong các dung dịch nước tạo ra allantoin là sản phẩm chính, nên phương pháp điện hóa được ưu tiên lựa chọn [47- 52].

Tuy nhiên, UA và AA thường có mặt đồng thời trong các chất lỏng sinh học như máu và nước tiểu. Pic oxy hóa của UA và AA quá gần nhau, khó tách ra ở các điện cực thông thường, dẫn đến độ chọn lọc kém [53]. Để xác định chính xác UA khi có mặt AA, cần phải phát triển một phương pháp chọn lọc để xác định UA một cách thuận tiện trong xét nghiệm, hạn chế ảnh hưởng sai sót do AA gây ra. Do đó xác định chọn lọc UA và AA đã nhận được sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu điện hóa [54 - 57].

Nồng độ cơ bản của UA và AA trong các mẫu sinh học thay đổi tùy theo tình trạng sức khoẻ, trên phạm vi rộng từ 10-7 đến 10-3 mol/L. Để khắc phục sự ảnh hưởng của AA, xu hướng sử dụng các điện cực biến đổi polyme (PMEs) [58,59] và các điện cực biến đổi hóa học (CME) [60] để phát hiện chọn lọc UA đang nhận được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học. Việc áp dụng các điện cực biến tính trong điện phân có nhiều ưu điểm như giảm mức oxi hóa khử quá mức, tăng tốc độ truyền điện tử, tăng cường độ nhạy phát hiện và cải thiện độ chọn lọc.