Tổng quan luận án
Axit uric (UA) và ure là các sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa sinh hóa trong cơ thể người, đóng vai trò là các chỉ số sinh hóa quan trọng phản ánh chức năng hoạt động của gan và thận. Theo các số liệu sinh lý học được tác giả trình bày, nồng độ UA tăng cao trong huyết thanh (khoảng 420 $\mu\text{M}$) và nước tiểu (khoảng 4,43 mM) có liên quan trực tiếp đến các bệnh lý như gút, tăng huyết áp, sỏi thận và bệnh tim mạch; ngược lại, nồng độ UA thấp hơn 120 $\mu\text{M}$ trong huyết thanh và 1,48 mM trong nước tiểu là dấu hiệu cảnh báo các bệnh thoái hóa thần kinh. Đối với ure, nồng độ trong huyết thanh dao động bình thường từ 0,15 đến 0,45 g/L (hàm lượng trong máu là 16–54 mg/mL ở nam và 12–47 mg/mL ở nữ); sự tích tụ ure ở nồng độ cao trong máu phản ánh tình trạng suy giảm chức năng lọc cầu thận và các hội chứng nhiễm độc niệu.
Mặc dù các phương pháp phân tích tiêu chuẩn như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), điện di mao quản và quang phổ hấp thụ phân tử có độ chính xác cao, chúng tồn tại nhược điểm là quy trình xử lý mẫu phức tạp, chi phí thiết bị đắt đỏ và thời gian phân tích kéo dài. Phương pháp điện hóa nổi lên như một hướng tiếp cận có nhiều ưu thế nhờ thời gian đáp ứng nhanh, thiết bị gọn nhẹ, độ nhạy cao và chi phí thấp. Tuy nhiên, khoảng trống nghiên cứu chính nằm ở việc các chất chuyển hóa trong dịch sinh học (đặc biệt là axit ascorbic - AA, dopamin - DA và axit uric - UA) có điện thế oxy hóa rất gần nhau trên các điện cực thông thường (như điện cực cacbon thủy tinh GCE, điện cực đĩa bạch kim Pt, điện cực vàng Au), dẫn đến sự chồng lấn pic von-ampe và hiện tượng bám bẩn bề mặt làm mất hoạt tính điện cực. Nhằm khắc phục hạn chế này, luận án tập trung nghiên cứu biến tính bề mặt điện cực bằng vật liệu nanocompozit trên cơ sở graphen (Gr), graphen oxit khử (rGO), polyme dẫn điện (polydopamin - PDA, polyanilin - PANi), hạt nano kim loại (CuNPs) và enzym ureaza.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai nội dung chính:
- Nghiên cứu chế tạo điện cực cảm biến xác định hàm lượng ure, UA với độ nhạy và độ chọn lọc đáp ứng yêu cầu phân tích mẫu sinh học.
- Đánh giá khả năng áp dụng thực tế của cảm biến chế tạo được trên cơ sở xác định hàm lượng ure, UA trong mẫu sinh học.
Để hiện thực hóa các mục tiêu trên, luận án giải quyết bốn nội dung khoa học cụ thể:
- Nghiên cứu vật liệu dùng biến tính điện cực để xác định UA bằng phương pháp điện hóa.
- Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học xác định ure theo nguyên tắc đo điện thế và đo von-ampe.
- Khảo sát các điều kiện tối ưu cho các điện cực biến tính đã chế tạo.
- Sử dụng điện cực và quy trình đã xây dựng để xác định hàm lượng ure, UA trong mẫu nước tiểu; đánh giá độ tin cậy của quy trình qua độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các hệ vật liệu biến tính bề mặt (Gr, rGO, PDA, PANi, CuNPs, enzym ureaza) và hai chất phân tích mục tiêu là axit uric và ure. Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện trên hệ đo điện hóa đa năng Autolab với các dung dịch chuẩn trong môi trường đệm phosphat (PBS 0,1 M, pH 7,0), khảo sát ảnh hưởng của các chất gây nhiễu phổ biến (AA, DA, glucose, axit citric, paracetamol, ion nitrite) và ứng dụng kiểm chứng trên đối tượng mẫu nước tiểu người thực tế, so sánh đối chứng với kết quả từ cơ sở phân tích y tế chuyên nghiệp.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Trong phần tổng quan tài liệu, tác giả đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp phân tích UA và ure:
Đối với phân tích axit uric:
- Phương pháp enzym quang phổ: Tác giả San V dựa trên phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử NCP và TOOS với hệ 3 enzym (Uox, peroxidaza và ascorbat oxyaza), đạt độ nhạy 0,71 đơn vị độ hấp thụ/mmol/L, LOD = 0,0035 mmol/L, LOQ = 0,015 mmol/L. Galban và cộng sự sử dụng enzym UOx đo huỳnh quang (kích thích ở 287 nm, phát xạ ở 330 nm), dải nồng độ $3 \cdot 10^{-4}\text{ M}$, độ tái lập 4%.
- Phương pháp sắc ký: Kovarik và đồng nghiệp dùng HPLC pha đảo C18 (MAG 1; 4,6 x 150 mm, $5,\mu\text{m}$), rửa giải bằng 5% metanol trong 25 mmol/L $\text{NaH}_2\text{PO}_4$ (pH 4,75), độ thu hồi 90,0–103,4%, LOQ = 10,0 $\mu\text{mol/L}$. Hai Fang Li và đồng nghiệp dùng RP-HPLC-UV phân tích đồng thời creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu với cột ODS-BP, LOD của UA đạt 0,025 mg/L.
- Phương pháp điện hóa biến tính bề mặt: Tác giả Zheng chế tạo điện cực $\beta\text{-cyclodextrin/poly(N-acetylanilin)}$ trên GCE đo SWV tại pH 5 để loại trừ ảnh hưởng của AA. Kannan và John biến tính điện cực vàng bằng hạt nano vàng (AuNPs) qua cầu nối 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole, tách pic oxy hóa UA và AA với độ phân tách thế 200 mV, LOD đạt $2 \cdot 10^{-6}\text{ M}$. Mathiarasu và cộng sự nghiên cứu màng compozit PEDOT/AuNPs để phân tích đồng thời DA (ở 115 mV) và UA (ở 246 mV) khi dư lượng AA.
| STT |
Phương pháp biến tính điện cực |
Khoảng tuyến tính ($\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}$) |
Giới hạn phát hiện ($\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}$) |
Tài liệu trích dẫn |
| 1 |
$\text{Poly(N-acetylamin)}/\beta\text{-cyclodextrin}$ |
$10 - 200 \cdot 10^{-6}$ |
— |
Zheng et al. [64] |
| 2 |
Poly(3-acetyl thiophen) |
$12,5 - 175 \cdot 10^{-9}$ |
— |
[66] |
| 3 |
Poly(N,N-dimethyl anilin) |
$1,25 - 68,8 \cdot 10^{-6}$ |
— |
[67] |
| 4 |
PEDOT |
$1,0 - 20 \cdot 10^{-8}$ |
— |
[69] |
| 5 |
Polyanilin nano-network |
$50 - 250 \cdot 10^{-7}$ |
— |
[70] |
| 6 |
Nafion/ruthenium oxide pyrochlore |
$0,5 - 75 \cdot 10^{-7}$ |
— |
[72] |
| 7 |
Poly(glycin) |
$0,05 - 4 \cdot 10^{-9}$ |
— |
[74] |
| 8 |
Thionin-SWNTs nanostructure |
$0,002 - 2 \cdot 10^{-6}$ |
— |
[77] |
| 9 |
Au / rGO |
$8,8 - 53 \cdot 10^{-6}$ |
— |
[89] |
| 10 |
AuNPs-GO |
$20 - 260 \cdot 10^{-6}$ |
— |
[90] |
| 11 |
TCPP-rGO |
$20 - 5000 \cdot 10^{-6}$ |
— |
[91] |
| 12 |
rGO-ZnO |
$3 - 330 \cdot 10^{-6}$ |
— |
[92] |
Đối với phân tích ure:
- Phương pháp đo màu Diacetyl-monoxim (DAM) kết hợp Thiosemicarbazid (TSC) đo quang tại bước sóng 540 nm với giới hạn phát hiện 0,14 $\mu\text{g}$ và 1,2 nmol.
- Phương pháp HPLC: Xác định ure kết hợp xanthydrol đo huỳnh quang ($\lambda_{\text{ex}} = 213\text{ nm}, \lambda_{\text{em}} = 308\text{ nm}$); Tsutomu phân tích ure trong mỹ phẩm bằng cột trao đổi cation mạnh ở 40 °C, phát hiện UV tại 200 nm; Zuo tách đồng thời creatinin và UA trong nước tiểu tại 205 nm với LOD của UA là 0,062 mg/mL.
- Phương pháp điện hóa: Cảm biến nanocompozit PPy-graphen oxit đo ure từ 0,5 đến 3,0 $\mu\text{M}$ (LOD 0,27 $\mu\text{M}$); màng $O_{17}\text{-ethyl cellulose (EC)}$ gắn enzym ureaza đo dải nồng độ 0,01–0,1 M (LOD 0,027 mM) và 0,1–1,0 M (LOD 0,224 mM).
Vị trí của luận án: Kế thừa các nghiên cứu về compozit polyme dẫn và vật liệu cacbon nano, luận án giải quyết khoảng trống về việc chế tạo hệ cảm biến điện hóa không enzym có độ chọn lọc cao với UA dựa trên sự kết hợp giữa khung dẫn Gr/rGO, màng polydopamin phối trí Cu(II) và các hạt nano đồng (CuNPs); đồng thời phát triển vi điện cực tích hợp Pt/Gr/PANi/Ureaza để định lượng chọn lọc ure, ứng dụng trực tiếp trên mẫu sinh học thực tế.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và cơ chế phản ứng
- Tính chất của Axit Uric: UA ($\text{C}_5\text{H}_4\text{N}_4\text{O}_3$, danh pháp: 7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion, $\text{p}K_a = 5,75 - 10,3$). Trong môi trường sinh lý huyết tương ($\text{pH} = 7,4$), 98% UA tồn tại dưới dạng muối monosodium urat. Quá trình oxy hóa điện hóa của UA trên bề mặt điện cực tạo ra sản phẩm chính là allantoin và giải phóng 2 electron, 2 proton.
- Cơ chế nhận biết ure: Cảm biến sinh học sử dụng enzym ureaza xúc tác cho phản ứng thủy phân ure theo chuỗi phản ứng:
$$\text{(NH}_2\text{)}_2\text{CO} + \text{H}_2\text{O} \xrightarrow{\text{ureaza}} \text{H}_2\text{NCOO}^- + \text{NH}_4^+$$
$$\text{H}_2\text{NCOO}^- + \text{H}^+ \rightarrow \text{NH}_3 + \text{CO}_2$$
$$\text{CO}_2 + \text{H}_2\text{O} \rightarrow \text{H}_2\text{CO}_3$$
Các sản phẩm tiếp tục phân ly trong dung dịch tạo thành các ion tích điện ($\text{NH}_4^+, \text{OH}^-, \text{HCO}_3^-, \text{CO}_3^{2-}$), làm thay đổi độ dẫn điện và tín hiệu điện hóa tại lớp ranh giới tiếp xúc của màng cảm biến.
- Lý thuyết vật liệu: Graphen có cấu trúc mạng lục giác đơn lớp nguyên tử cacbon lai hóa $sp^2$ với khoảng cách liên kết C–C xấp xỉ 0,142 nm, diện tích bề mặt riêng lớn và độ dẫn điện cao, đóng vai trò chất nền dẫn truyền điện tử; màng polyme dẫn (PDA, PANi) và hạt nano đồng (CuNPs) cung cấp các tâm xúc tác và nhóm chức hỗ trợ liên kết phối trí.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp Von-ampe vòng (CV): Thực hiện trên hệ thiết bị điện hóa đa năng Autolab (AUT302N, Eco Chemie B.V.) để khảo sát cơ chế phản ứng oxy hóa khử, động học truyền điện tử của cặp chỉ thị $\text{Fe(CN)}_6^{3-/4-}$ và của chất phân tích tại bề mặt điện cực ở các tốc độ quét khác nhau.
- Phương pháp Von-ampe xung vi phân (DPV): Áp thế biến thiên kết hợp xung thế (10–100 mV), đo hiệu dòng tại hai thời điểm để loại trừ dòng tụ điện (dòng phi Faraday), nâng cao tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu và hạ thấp giới hạn phát hiện khi xác định UA.
- Phương pháp hình thái học và quang phổ cấu trúc:
- Hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM, JSM-6700, JEOL Ltd., Nhật Bản) quan sát hình thái bề mặt màng biến tính.
- Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS/EDX) phân tích thành phần nguyên tố định tính và bán định lượng.
- Thiết bị quang phổ Raman (Jasco NRS-3000 Series, bước sóng kích thích laser 532 nm, công suất 2 mW) và kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HRTEM) kiểm tra cấu trúc tinh thể của màng graphen tổng hợp bằng phương pháp CVD nhiệt.
- Phương pháp tổng hợp điện hóa: Trùng hợp điện hóa màng PDA-Cu(II) từ dung dịch monomer dopamin (DA 10 mM) và $\text{CuCl}_2$ (30 mM) bằng kỹ thuật quét thế vòng (CV, khoảng thế -0,3 V đến +0,5 V, tốc độ 10 mV/s) hoặc đo dòng thời gian (CA); lắng đọng điện hóa hạt nano đồng (CuNPs); trùng hợp điện hóa màng polyanilin (PANi) trên vi điện cực Pt.
Nguồn tư liệu và hóa chất
- Hóa chất chính: Graphen, graphit, UA, ure, DA, AA (Sigma-Aldrich, Đức); enzym ureaza (loại U1500-100KU, độ hoạt động 42 đơn vị/mg, Sigma-Aldrich); $\text{Na}_2\text{HPO}_4\cdot2\text{H}_2\text{O}$ (Prolabo, Pháp); $\text{NaH}_2\text{PO}_4\cdot\text{H}_2\text{O}, \text{CuCl}_2, \text{H}_2\text{SO}_4, \text{HCl}, \text{NH}_4\text{OH}, \text{H}_2\text{O}_2, \text{NaNO}_2$ (Merck, Đức); pyrol (Fluka, Thụy Sĩ); nước khử ion (deionized water).
- Hệ điện cực: Điện cực làm việc GCE đường kính 2 mm (Metrohm, Thụy Sỹ), vi điện cực tích hợp đĩa bạch kim Dropsens đường kính 1,6 mm (Hà Lan), điện cực so sánh $\text{Ag/AgCl (KCl 3M)}$, điện cực đối diện Pt.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 trình bày hệ thống cơ sở lý thuyết về cấu tạo, chuyển hóa sinh hóa và ý nghĩa bệnh học của axit uric và ure trong cơ thể người. Phân tích chi tiết các phương pháp định lượng truyền thống bao gồm quang phổ hấp thụ phân tử, phương pháp enzym đo màu, sắc ký lỏng HPLC và chỉ ra các hạn chế về mặt thiết bị và quy trình. Tác giả tổng quan cấu tạo cảm biến sinh học (gồm 4 thành phần: đầu thu sinh học, tác nhân cố định, bộ phận chuyển đổi tín hiệu và bộ phận xử lý tín hiệu) cùng các nguyên lý chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa (đo thế, đo dòng, đo độ dẫn), chuyển đổi quang học, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi áp điện theo phương trình Sauerbrey ($\Delta f = -2,3 \cdot \Delta m / A$) và cảm biến vi cơ. Chương này cũng phân tích tổng quan các công trình biến tính điện cực trên thế giới sử dụng graphen, polyme dẫn điện (PANI, PPy, PEDOT), hạt nano kim loại (AuNPs, CuNPs) và enzym, từ đó xác lập mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án.
Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hệ thống hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu. Tác giả trình bày các bước chế tạo ba hệ điện cực biến tính:
- Quy trình chế tạo điện cực $\text{GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs}$: Phủ màng graphen lên bề mặt GCE, tiếp tục tổng hợp điện hóa màng compozit polydopamin tạo phức với ion đồng $\text{PDA-Cu(II)}$, sau đó điện phân khử để tạo các hạt nano đồng CuNPs phân tán trên bề mặt.
- Quy trình chế tạo điện cực $\text{GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs}$: Sử dụng graphen oxit khử (rGO) làm lớp dẫn truyền, tối ưu hóa các thông số quét thế điện hóa để đồng tổng hợp màng $\text{PDA-Cu}$ và tạo mầm hạt CuNPs.
- Quy trình chế tạo điện cực $\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$: Chuyển màng graphen tổng hợp bằng CVD nhiệt lên vi điện cực Pt (Dropsens), trùng hợp điện hóa màng polyanilin (PANi) bằng phương pháp CV và cố định enzym ureaza.
Chương này cũng thiết lập các phương pháp đánh giá hình thái học (SEM, EDS, Raman, HRTEM), quy trình đo đạc điện hóa (CV, DPV, CA) và phương pháp xác định các thông số thống kê phân tích như độ lặp lại, độ đúng, độ chụm, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 3 trình bày toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình khảo sát điều kiện chế tạo, đặc trưng hóa cấu trúc, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và ứng dụng phân tích mẫu thực tế:
-
Điện cực $\text{GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs}$:
- Khảo sát tối ưu lượng graphen biến tính trên bề mặt GCE (Bảng 3.1) cho thấy hàm lượng Gr thích hợp giúp tăng cường diện tích bề mặt hoạt động và tốc độ truyền điện tử.
- So sánh phương pháp tổng hợp màng $\text{PDA-Cu(II)}$ bằng kỹ thuật đo dòng thời gian (CA) và quét thế vòng (CV) (Hình 3.2), cùng việc khảo sát thời gian điện phân (Bảng 3.3).
- Kết quả chụp ảnh FE-SEM và phổ EDS (Hình 3.3) khẳng định sự hình thành đồng nhất của lớp polyme PDA phối trí ion Cu(II) và sự phân tán của các hạt nano đồng CuNPs trên nền mạng graphen.
- Đặc tính điện hóa qua tín hiệu CV với cặp chất chỉ thị $\text{Fe(CN)}_6^{3-/4-}$ (Hình 3.4 và 3.5) cho thấy dòng đỉnh oxy hóa khử tăng rõ rệt và phụ thuộc tuyến tính vào căn bậc hai của tốc độ quét ($v^{1/2}$ từ 10 đến 120 mV/s), chứng minh quá trình điện cực bị kiểm soát bởi sự khuếch tán.
- Tín hiệu DPV đối với UA trong đệm PBS 0,1 M (pH 7,0) trên các điện cực biến tính khác nhau (Hình 3.7) chứng minh điện cực hoàn chỉnh $\text{GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs}$ cho cường độ dòng anot cao nhất và tách biệt rõ rệt so với các điện cực thành phần ($\text{GCE/Gr}$, $\text{GCE/Gr/CuNPs}$, $\text{GCE/PDA-Cu(II)/CuNPs}$).
- Khảo sát ảnh hưởng của pH (từ 2,5 đến 9,0, Hình 3.8) cho thấy thế đỉnh oxy hóa $E_{pa}$ dịch chuyển về phía thế âm khi pH tăng; pH = 7,0 được lựa chọn làm môi trường đo tối ưu.
- Đánh giá độ chọn lọc: Tín hiệu DPV của UA không bị ảnh hưởng đáng kể khi có mặt các chất gây nhiễu như axit citric, glucose và dopamin (Hình 3.9).
- Đường chuẩn phân tích UA (Hình 3.10, Bảng 3.6 và Bảng 3.7) cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa cường độ dòng đỉnh và nồng độ UA, tín hiệu có độ ổn định và độ lặp lại cao qua nhiều lần đo (Hình 3.11, Bảng 3.8).
-
Điện cực $\text{GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs}$:
- Tác giả so sánh màng tổng hợp bằng phương pháp điện hóa (ePDA) và phương pháp hóa học (cPDA) (Hình 3.13, Bảng 3.9), khẳng định màng điện hóa cho độ nhạy và tính lặp lại tốt hơn.
- Khảo sát vai trò của ion Cu(II) trong màng PDA đối với tín hiệu đáp ứng của UA (Bảng 3.10); tối ưu hóa số vòng quét điện phân $\text{PDA-Cu}$ (3 vòng, Hình 3.15, Bảng 3.12) và tỷ lệ dung dịch điện phân $\text{CuCl}_2$ 30 mM + DA 10 mM ở khoảng thế -0,3 V đến +0,5 V, tốc độ quét 10 mV/s (Hình 3.16 và 3.18A).
- Tối ưu hóa số vòng điện phân tạo hạt nano CuNPs (10 vòng, Hình 3.17, Bảng 3.15).
- Khảo sát CV với UA ở các tốc độ quét thế từ 20 mV/s đến 125 mV/s (Hình 3.21).
- Khảo sát độ chọn lọc phân tích UA trên điện cực $\text{GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs}$ đối với các chất gây nhiễu nồng độ cao:
- Dopamin (DA) ở nồng độ $1,07 \cdot 10^{-3}\text{ M}$ so với UA ở $1,07 \cdot 10^{-4}\text{ M}$ (Hình 3.23).
- Paracetamol ở nồng độ $6,40 \cdot 10^{-4}\text{ M}$ so với UA ở $9,60 \cdot 10^{-5}\text{ M}$ (Hình 3.24).
- Ion nitrit ($\text{NO}_2^-$) ở nồng độ $1,06 \cdot 10^{-2}\text{ M}$ so với UA ở $1,07 \cdot 10^{-4}\text{ M}$ (Hình 3.25).
- Đường glucose ở nồng độ $1,07 \cdot 10^{-4}\text{ M}$ so với UA ở $1,07 \cdot 10^{-4}\text{ M}$ (Hình 3.26).
- Kết quả đường chuẩn và độ lặp lại khi đo UA được thể hiện tại Hình 3.22, Hình 3.27, Bảng 3.17, 3.18, 3.19 và 3.20.
-
Điện cực $\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$:
- Màng graphen tổng hợp bằng phương pháp lắng đọng pha hơi hóa học (CVD) nhiệt trên đế đồng được đặc trưng qua ảnh SEM (Hình 3.28), phổ Raman với các pic đặc trưng D, G, 2D và ảnh HRTEM (Hình 3.29).
- Quá trình trùng hợp điện hóa màng polyanilin (PANi) bằng phương pháp CV trên điện cực đĩa Pt trần và trên điện cực Pt gắn màng Gr (Hình 3.30).
- Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm (Hình 3.31) và ảnh hưởng của chất đối chứng axit ascorbic (AA) đến tín hiệu đo (Hình 3.32).
- Khảo sát mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch ure và tín hiệu dòng đo được (Hình 3.33, Bảng 3.21 và Bảng 3.22).
-
Phân tích mẫu thực tế:
- Các điện cực cảm biến chế tạo được áp dụng để phân tích hàm lượng UA và ure trong các mẫu nước tiểu thực tế (Bảng 3.23). Kết quả phân tích được đánh giá độ thu hồi khi thêm chuẩn và đối chiếu với phương pháp phân tích tại bệnh viện, cho thấy sai số nằm trong giới hạn cho phép của phân tích hóa sinh lâm sàng.
Kết quả và những đóng góp mới
Dựa trên các nội dung công bố trong toàn văn luận án, những đóng góp mới của công trình bao gồm:
-
Đóng góp về mặt vật liệu và phương pháp chế tạo:
- Xây dựng thành công quy trình công nghệ tổng hợp điện hóa màng compozit nanocompozit đa thành phần gồm graphen/graphen oxit khử (Gr/rGO), polyme polydopamin phối trí ion đồng $\text{PDA-Cu(II)}$ và các hạt nano kim loại đồng (CuNPs) trên bề mặt điện cực cacbon thủy tinh (GCE).
- Chế tạo thành công vi điện cực tích hợp trên nền đĩa bạch kim Dropsens biến tính bởi màng graphen chất lượng cao (tổng hợp bằng CVD nhiệt), màng polyanilin dẫn điện (PANi) và lớp enzym ureaza cố định ($\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$).
-
Đóng góp về mặt phân tích hóa học:
- Phát triển phương pháp điện hóa không sử dụng enzym để xác định chọn lọc axit uric trong môi trường đệm $\text{PBS pH } 7,0$. Hệ cảm biến loại trừ được sự cản trở của các chất chuyển hóa đồng tồn tại có điện thế oxy hóa gần nhau như dopamin (DA), paracetamol (PAR), ion nitrit ($\text{NO}_2^-$), đường glucose và axit citric.
- Tối ưu hóa toàn diện các điều kiện phân tích (nồng độ monomer, thế điện phân, số vòng quét, tốc độ quét, pH môi trường) giúp cảm biến đạt khoảng tuyến tính rộng, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và giới hạn phát hiện thấp.
- Ứng dụng thành công các điện cực biến tính vào việc định lượng trực tiếp UA và ure trong mẫu nước tiểu thực tế với độ tin cậy và độ thu hồi tương đương các phương pháp phân tích chuẩn tại các cơ sở xét nghiệm y tế.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu:
- Quy trình chế tạo điện cực biến tính gồm nhiều công đoạn phức tạp (chuyển màng Gr từ đế đồng CVD, trùng hợp điện hóa màng polyme và lắng đọng hạt nano kim loại), đòi hỏi sự kiểm soát nghiêm ngặt về điều kiện thực nghiệm để đảm bảo độ đồng đều giữa các mẻ chế tạo.
- Khả năng duy trì hoạt tính sinh học của màng enzym ureaza trên điện cực $\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$ theo thời gian bảo quản dài ngày cần được tiếp tục theo dõi và tối ưu hóa điều kiện lưu trữ.
- Đối tượng mẫu thực tế trong luận án chủ yếu tập trung vào mẫu nước tiểu; chưa mở rộng khảo sát trên các nền mẫu sinh học có nền phức tạp hơn như huyết thanh toàn phần hoặc máu toàn phần chưa qua xử lý.
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Hoàn thiện quy trình công nghệ chế tạo để nâng cao độ bền cơ học và tính ổn định lâu dài của các màng biến tính nano/enzym.
- Nghiên cứu tích hợp các hệ vi điện cực trên chip vi lưu (microfluidic) nhằm hướng tới việc phát triển các thiết bị phân tích tại chỗ (Point-of-Care Testing - POCT) có khả năng đo đồng thời cả UA, ure và creatinin trong cùng một giọt mẫu máu hoặc dịch sinh học.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn cao đối với các đối tượng và lĩnh vực sau:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa Phân tích, Hóa Lý thuyết và Hóa Lý, Khoa học Vật liệu và Kỹ thuật Hóa học: Có thể tham khảo chi tiết quy trình tổng hợp điện hóa polyme dẫn (PDA, PANi), kỹ thuật lắng đọng hạt nano kim loại (CuNPs) và phương pháp chuyển màng graphen CVD lên vi điện cực.
- Giảng viên và các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực cảm biến điện hóa và cảm biến sinh học (Biosensors): Có thể khai thác các dữ liệu thực nghiệm về cơ chế truyền điện tử khuếch tán của cặp chất chỉ thị $\text{Fe(CN)}6^{3-/4-}$, sự phụ thuộc của thế đỉnh $E{pa}$ vào pH và các giải pháp loại trừ chất gây nhiễu điện hóa (DA, AA, paracetamol).
- Kỹ sư y sinh và cán bộ xét nghiệm tại các phòng kiểm nghiệm hóa sinh lâm sàng: Tham khảo quy trình phân tích nhanh UA và ure bằng phương pháp von-ampe xung vi phân (DPV) và von-ampe vòng (CV) trên mẫu nước tiểu thực tế.
Câu hỏi thường gặp
1. Cảm biến $\text{GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs}$ loại trừ sự ảnh hưởng của các chất gây nhiễu nào khi phân tích axit uric?
Trong Chương 3, tác giả đã tiến hành khảo sát thực nghiệm và chứng minh điện cực $\text{GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs}$ có độ chọn lọc cao đối với UA ($1,07 \cdot 10^{-4}\text{ M}$ hoặc $9,60 \cdot 10^{-5}\text{ M}$) khi có mặt các chất cản trở ở nồng độ cao trong đệm PBS 0,1 M (pH 7,0), bao gồm: Dopamin ($1,07 \cdot 10^{-3}\text{ M}$), Paracetamol ($6,40 \cdot 10^{-4}\text{ M}$), ion Nitrit $\text{NO}_2^-$ ($1,06 \cdot 10^{-2}\text{ M}$) và đường Glucose ($1,07 \cdot 10^{-4}\text{ M}$).
2. Điều kiện tối ưu để tổng hợp điện hóa màng $\text{PDA-Cu(II)}$ trên điện cực $\text{GCE/rGO}$ là gì?
Theo nội dung khảo sát tại Chương 3, màng $\text{PDA-Cu(II)}$ được tổng hợp điện hóa tối ưu từ dung dịch chứa $\text{CuCl}_2$ 30 mM và Dopamin (DA) 10 mM bằng phương pháp quét thế vòng (CV) trong khoảng thế từ -0,3 V đến +0,5 V với tốc độ quét 10 mV/s và số vòng điện phân tối ưu là 3 vòng.
3. Cơ chế hoạt động của cảm biến sinh học $\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$ khi phát hiện ure được mô tả như thế nào?
Khi nhúng cảm biến vào dung dịch chứa ure, enzym ureaza cố định trên màng $\text{PANi/Gr}$ xúc tác phản ứng thủy phân ure tạo thành amoni cacbamat ($\text{H}_2\text{NCOO}^-$ và $\text{NH}_4^+$). Sau đó, cacbamat chuyển hóa thành $\text{NH}_3$ và $\text{CO}_2$, tiếp tục tạo ra các ion $\text{NH}_4^+, \text{OH}^-, \text{HCO}_3^-, \text{CO}_3^{2-}$ trong dung dịch. Sự gia tăng nồng độ các ion này làm thay đổi độ dẫn điện và tín hiệu dòng điện tại bề mặt tiếp xúc của điện cực, cho phép định lượng ure qua tín hiệu đo von-ampe vòng (CV).
4. Màng graphen trong cấu trúc vi điện cực $\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$ được tổng hợp và đánh giá cấu trúc bằng các kỹ thuật nào?
Màng graphen được tổng hợp bằng phương pháp lắng đọng pha hơi hóa học (CVD) nhiệt trên đế đồng từ hơi hydro và metan. Cấu trúc và hình thái của màng được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM), kính hiển vi điện tử truyền qua độ phân giải cao (HRTEM) và quang phổ Raman (với bước sóng kích thích laser 532 nm, công suất 2 mW) để đánh giá các pic dao động đặc trưng D, G và 2D.
5. Vì sao kỹ thuật Von-ampe xung vi phân (DPV) được lựa chọn để phân tích định lượng axit uric trong luận án?
Kỹ thuật DPV được áp dụng do có khả năng kiểm soát thế và đo dòng Faraday sinh ra từ phản ứng oxy hóa khử tại hai thời điểm (ngay trước khi áp xung và trước khi kết thúc xung thế 10–100 mV). Phương pháp này giúp loại trừ triệt để thành phần dòng tụ điện (dòng phi Faraday sinh ra từ lớp điện kép), làm tăng tỷ lệ dòng Faraday trên dòng nền, từ đó nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phép đo xuống vùng nồng độ vết.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Bùi Thị Phương Thảo đã hoàn thành việc nghiên cứu chế tạo các hệ điện cực biến tính nanocompozit trên cơ sở graphen gồm $\text{GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs}$, $\text{GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs}$ và vi điện cực sinh học $\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$. Các điều kiện chế tạo màng, thông số điện hóa và yếu tố môi trường (pH, chất cản trở, tốc độ quét) đã được khảo sát và tối ưu hóa đầy đủ bằng các kỹ thuật phân tích hiện đại như CV, DPV, SEM, EDS, HRTEM và Raman. Hệ điện cực biến tính thể hiện khả năng phân tích chọn lọc axit uric và ure với độ nhạy cao, độ lặp lại ổn định và đã được kiểm chứng thành công trên mẫu nước tiểu thực tế. Công trình đóng góp các dữ liệu thực nghiệm quan trọng vào sự phát triển của chuyên ngành Hóa Phân tích và lĩnh vực cảm biến điện hóa tại Việt Nam.
