Luận án tiến sĩ về di truyền và bảo tồn địa lan cymbidium ở miền núi Đông Bắc Việt Nam

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan cymbidium khu vực miền núi đông bắc việt nam phục vụ, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Phạm Phương Thu
• Người hướng dẫn: Ngô Xuân Bình
• Trường học: Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Di Truyền Và Chọn Giống Cây Trồng
• Đề tài: Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Tập Đoàn Địa Lan (Cymbidium) Khu Vực Miền Núi Đông Bắc Việt Nam Phục Vụ Công Tác Bảo Tồn Và Chọn Tạo Giống
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu của luận án
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.5. Những đóng góp mới của luận án
• 2. CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
• 2.1. Giới thiệu chung về hoa lan
• 2.2. Đặc điểm thực vật học, phân loại và phân bố của chi lan kiếm
• 2.2.1. Phân loại
• 2.2.2. Phân bố
• 2.3. Nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam
• 2.4. Giá trị, thực trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen lan kiếm
• 2.5. Tình hình nghiên cứu chi lan kiếm trên thế giới và Việt Nam
• 2.5.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.5.2. Nghiên cứu nhân giống và lai tạo chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.6. Các kết luận qua phân tích tổng quan
• 3. CHƯƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái
• 3.3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử
• 3.3.3. Phương pháp lai tạo giống nguồn gen lan kiếm
• 3.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro
• 3.3.5. Phần mềm xử lý số liệu
• 3.3.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái
• 4.2. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị phân tử
• 4.3. Kết quả PCR các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.4. Kết quả giải trình tự vùng lục lạp mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.5. Kết quả nhận biết các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.6. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đặc trưng để nhận dạng các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu
• 4.7. So sánh, phân tích mối tương quan giữa tập đoàn lan kiếm nghiên cứu ở cây đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử
• 4.8. Đề xuất các hướng nghiên cứu, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có
• 4.9. Nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro
• 4.10. Kết quả nhân giống in vitro loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense)
• 4.11. Kết quả nhân giống in vitro loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii)
• 4.12. Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc
• 4.13. Khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm có nguồn gốc từ vùng núi Đông Bắc Việt Nam
• 4.14. Khảo sát và xác định marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm bằng chỉ thị phân tử SSR
• 5. CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về di truyền địa lan Cymbidium

Nghiên cứu di truyền địa lan Cymbidium tại miền núi Đông Bắc Việt Nam là một lĩnh vực quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật. Di truyền của các loài lan kiếm không chỉ ảnh hưởng đến sự đa dạng sinh học mà còn có giá trị kinh tế cao. Các loài lan kiếm tại Việt Nam, đặc biệt là ở khu vực miền núi Đông Bắc, đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức và mất môi trường sống. Việc nghiên cứu địa lan giúp xác định các đặc điểm di truyền, từ đó có thể phát triển các phương pháp bảo tồn hiệu quả hơn. Theo các nghiên cứu, chi lan kiếm có khoảng 120 loài trên toàn thế giới, trong đó Việt Nam có 24 loài. Điều này cho thấy sự phong phú và đa dạng của nguồn gen lan kiếm tại nước ta.

1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu

Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của chi lan kiếm là cần thiết để bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Các loài lan kiếm không chỉ có giá trị về mặt sinh thái mà còn có giá trị kinh tế cao trong ngành nông nghiệp. Sự khai thác ồ ạt và nạn phá rừng đã khiến nhiều loài lan kiếm trở nên hiếm hoi. Do đó, việc đánh giá và bảo tồn nguồn gen là rất quan trọng. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về đặc điểm di truyền của các loài lan kiếm mà còn cung cấp thông tin cần thiết cho công tác bảo tồn và phát triển giống mới.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm. Các chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử được áp dụng để xác định mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống. Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi Polymerase) được sử dụng để phân tích DNA, từ đó xác định các marker di truyền đặc trưng. Kỹ thuật sinh học phân tử giúp nhận diện các mẫu giống và đánh giá khả năng lai tạo. Việc áp dụng các phương pháp này không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong việc phân loại mà còn tạo cơ sở cho việc nhân giống và lai tạo giống mới.

2.1. Kỹ thuật sinh học phân tử

Kỹ thuật sinh học phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu di truyền của các loài lan kiếm. Phương pháp PCR cho phép nhân bản các đoạn DNA cần thiết để phân tích. Các chỉ thị phân tử như SSR (Trình tự lặp lại đơn giản) được sử dụng để xác định sự đa dạng di truyền giữa các mẫu giống. Kết quả từ các phân tích này cung cấp thông tin quý giá về mối quan hệ di truyền và khả năng lai tạo của các giống lan kiếm, từ đó hỗ trợ cho công tác bảo tồn và phát triển giống mới.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng di truyền cao trong tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm. Các chỉ thị hình thái và phân tử đã chỉ ra rằng có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu giống. Việc phân tích trình tự nucleotide cho thấy sự tương đồng và khác biệt giữa các mẫu giống, từ đó xác định được các marker di truyền đặc trưng. Kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn nguồn gen mà còn mở ra hướng đi mới cho việc lai tạo giống lan kiếm có giá trị kinh tế cao.

3.1. Đánh giá khả năng lai tạo

Đánh giá khả năng lai tạo giữa các mẫu giống lan kiếm cho thấy một số tổ hợp lai có khả năng đậu quả cao. Việc xác định các marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm giúp nâng cao hiệu quả trong công tác chọn tạo giống. Kết quả này cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các giống lan kiếm mới, đáp ứng nhu cầu thị trường và bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Sự thành công trong việc lai tạo không chỉ góp phần vào việc bảo tồn mà còn thúc đẩy phát triển kinh tế địa phương.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quý giá về địa lan và bảo tồn giống. Việc đánh giá đa dạng di truyền giúp xác định các giống lan kiếm có giá trị cao, từ đó có thể phát triển các phương pháp bảo tồn hiệu quả. Hơn nữa, nghiên cứu cũng mở ra cơ hội cho việc phát triển các giống lan kiếm mới, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp tại Việt Nam.

4.1. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo

Dựa trên kết quả nghiên cứu, cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về địa lan và các phương pháp bảo tồn. Việc mở rộng nghiên cứu sang các vùng khác có thể giúp phát hiện thêm nhiều giống lan kiếm quý hiếm. Đồng thời, cần phát triển các chương trình giáo dục và nâng cao nhận thức cộng đồng về giá trị của việc bảo tồn nguồn gen thực vật. Điều này không chỉ giúp bảo tồn các loài lan kiếm mà còn góp phần vào việc phát triển bền vững tài nguyên thiên nhiên.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ nông nghiệp của nghiên cứu sinh Phạm Phương Thu, chuyên ngành Di truyền và chọn giống cây trồng (mã số 9620111), được thực hiện tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Ngô Xuân Bình và TS. Trần Ngọc Hùng, bảo vệ năm 2023. Đề tài tập trung nghiên cứu: "Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn địa lan (Cymbidium) khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ công tác bảo tồn và chọn tạo giống".

Họ lan (Orchidaceae) thuộc bộ măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm (Monocotyledoneae), là một trong những họ thực vật có hoa lớn nhất trên thế giới với khoảng 800 chi phân bố khắp các châu lục (ngoại trừ châu Nam Cực). Chi lan kiếm (Cymbidium) phân bố rộng khắp khu vực Đông Nam Á, gồm khoảng 120 loài trên thế giới, trong đó châu Á có 52 loài và Việt Nam ghi nhận 24 loài với bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội $2n = 2x = 40$. Các loài lan kiếm có hoa lớn, bền, hình thái phong phú, đa số sống phụ sinh trên thân cây mục hoặc bám trên các hốc đá có mùn. Vùng miền núi Đông Bắc Việt Nam có địa hình đồi núi gồm 4 cánh cung lớn (Sông Gâm, Ngân Sơn, Bắc Sơn, Đông Triều) mở ra về phía Bắc và Đông, chụm lại tại Tam Đảo, tạo nên vùng khí hậu cận nhiệt ẩm thích hợp cho sự sinh trưởng của lan kiếm. Theo các tài liệu điều tra, vùng núi Đông Bắc tập trung 13/24 loài lan kiếm tự nhiên của Việt Nam (chiếm trên 50% thành phần loài cả nước).

Tuy nhiên, áp lực khai thác thương mại tự nhiên quá mức cùng với nạn phá rừng đã làm suy giảm nghiêm trọng các quần thể lan kiếm bản địa, đẩy nhiều nguồn gen quý vào tình trạng đe dọa biến mất. Trong khi đó, phần lớn các công trình nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chỉ tập trung đánh giá hoặc nhân giống một số giống lan nhập nội hoặc một vài loài thương phẩm riêng lẻ. Các nghiên cứu có hệ thống kết hợp đặc điểm hình thái với mức độ đa dạng di truyền phân tử ở lan kiếm bản địa còn rất hạn chế, và công tác lai tạo chọn giống mới mang bản quyền Việt Nam vẫn đang bỏ ngỏ. Xuất phát từ thực tế đó, luận án được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 nội dung chính:

1. Đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm địa phương thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam phục vụ cho công tác phân loại, bảo tồn và chọn tạo giống.
2. Nhân giống và lai tạo một số nguồn gen lan kiếm địa phương vùng Đông Bắc Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Đa dạng di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm được thu thập từ khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam (ký hiệu từ DL1 đến DL24, đại diện cho các loài như Kiếm lô hội, Mạc xuân, Kiếm vàng, Kiếm trắng, Kiếm Thanh ngọc, Bạch ngọc, Bạch ngọc đuôi công...).
• Phạm vi nội dung: Đánh giá đặc điểm hình thái theo quy phạm DUS của UPOV; phân tích đa dạng di truyền phân tử dựa trên trình tự vùng gen lục lạp rbcL; nhân giống in vitro 02 loài lan kiếm quý (Bạch ngọc đuôi công - Cymbidium wenshanense từ hạt và Bạch ngọc - Cymbidium mastersii từ rễ); đánh giá khả năng thụ phấn tạo quả của các tổ hợp lai và xác định marker SSR để nhận dạng con lai $F_1$ ở giai đoạn sớm.
• Phạm vi không gian: Thu thập mẫu tại các tỉnh miền núi Đông Bắc Việt Nam (gồm Bắc Giang, Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Giang, Lào Cai, Phú Thọ, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Yên Bái).
• Phạm vi thời gian: Các thí nghiệm và nội dung nghiên cứu được triển khai trong thời gian 5 năm.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về chi lan kiếm (Cymbidium), tập trung vào các khía cạnh phân loại học, đa dạng di truyền, công nghệ nhân giống và công tác chọn tạo giống:

Phân loại học, nguồn gen và giá trị sử dụng

Theo phân loại thực vật học, chi Cymbidium thuộc họ Orchidaceae, bộ Asparagales. Tại Việt Nam, Trần Duy Quý phân chia 24 loài lan kiếm thành các nhóm sinh cảnh: 13 loài bám trên cây, 5 loài mọc trên đất hoặc bám trên đá, 5 loài bám trên cây hoặc bám trên đá, và 1 loài không có lá sống hoại sinh trong mùn. Về phân bố địa lý, Trần Hợp ghi nhận khu vực miền núi Đông Bắc có 13 loài lan kiếm tự nhiên gồm: Kiếm lô hội (C. aloifolium), Kiếm Thanh ngọc (C. ensifolium), Trần mộng xuân (C. lowianum), Kiếm Bạch ngọc (C. eburneum), Kiếm Bạch ngọc Xuân (C. longifolium), Kiếm Hồng Hoàng (C. iridioides), Kiếm rủ (C. atropurpureum), Kiếm thu (C. tracyanum), Kiếm lục (C. hookerianum), Hồng lan (C. sanderae), Kiếm gấm (C. floribundum), Kiếm Lá giáo (C. lancifolium), Kiếm mỡ gà lá dài (C. elegans).

Về giá trị kinh tế và y dược: Hoa địa lan chiếm khoảng 10% tổng lượng hoa tươi giao dịch quốc tế; riêng Hà Lan xuất khẩu địa lan đạt gần 500 triệu euro năm 2015, và giá trị xuất khẩu toàn cầu đạt trên 217 triệu USD năm 2018. Tại Việt Nam, kim ngạch xuất khẩu hoa lan đạt trên 4 triệu USD/năm nhưng giá trị nhập khẩu lên đến 13 triệu USD năm 2018, cho thấy cán cân thương mại thâm hụt lớn. Về dược liệu, C. aloifolium được sử dụng chữa phong thấp, rối loạn thần kinh, hạ sốt; C. devonianum dùng trị ho; C. elegans trị tổn thương mô và thần kinh; C. ensifolium trị bệnh lậu và đau mắt; C. hookerianum và C. iridioides có tác dụng cầm máu; C. macrorhizon dùng trị mụn nhọt. Về bảo tồn, các công trình của Nguyễn Văn Kết (2009) tại Vườn quốc gia Cát Tiên, Trần Duy Quý (2009) tại Tam Đảo và Hà Nội, Phạm Anh Tám (2021) tại Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên đã nhấn mạnh tính cấp bách của việc lưu giữ nguồn gen phong lan và địa lan trước nguy cơ tuyệt chủng.

Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền

• Trên thế giới: Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền đã phát triển từ chỉ thị hình thái sang chỉ thị hóa sinh (isozyme) và chỉ thị phân tử DNA như RFLP, AFLP, RAPD, SSR, ISSR, cùng kỹ thuật giải trình tự DNA mã vạch (DNA barcode). Wang và cộng sự sử dụng RAPD và AFLP phân tích 14 loài Cymbidium. Choi và cộng sự (2006) sử dụng 22 mồi RAPD phân tích 21 loài lan kiếm châu Á, ghi nhận hệ số tương đồng di truyền từ 0,501 đến 0,935. Các nghiên cứu tại Trung Quốc áp dụng ISSR đánh giá quần thể C. goeringii (2009, 25 mồi, 224 locus), C. sinense (2011, 151 cá thể), C. ensifolium (2011, 19 mồi, 99,16% đa hình); kỹ thuật PCR-RFLP trên C. kanran (2013, 54 mẫu); kết hợp 29 mồi SSR và 12 mồi ISSR trên 85 mẫu lan kiếm Trung Quốc phân thành 5 nhóm (2014); công bố 7.936 genic-SSR từ hệ phiên mã C. ensifolium (2014). Lee và cộng sự (2020) dùng multiplex PCR với 13 locus SSR phân tích 1.566 mẫu thuộc 17 giống C. goeringii. Về giải trình tự vùng gen lục lạp và nhân: Zhang và cộng sự (2015) phân tích nrITS và 7 gen plastid (rbcL, trnS, trnG, matK, trnL, psbA, atpI) trên 70 loài; Sharma và cộng sự (2012) giải trình tự vùng ITS (ITS1, 5.8S, ITS2 dài 684 bp) trên 10 loài lan kiếm Ấn Độ; Du và cộng sự (2021) giải mã bộ gen lục lạp C. dayanum (155.408 bp, GC 36,76%, 118 gen) bằng công nghệ Illumina; Ling và cộng sự giải mã hoàn chỉnh hệ gen lục lạp C. mastersii.
• Tại Việt Nam: Các nghiên cứu hình thái của Trần Duy Quý (2009), Trần Duy Dương (2006, đánh giá 17 mẫu giống chia thành 4 nhóm). Về chỉ thị phân tử: Khuất Hữu Trung (2007) dùng PCR-RAPD với 12 mồi Operon phân chia 17 mẫu giống lan kiếm Việt Nam thành 5 nhóm; Phạm Thị Hồng Hạnh (2017) dùng 25 chỉ thị SSR phân tích 31 dòng C. sinense (17 chỉ thị đa hình, 7 chỉ thị đơn hình). Chưa có công trình nào kết hợp đánh giá hình thái theo DUS với giải trình tự gen lục lạp rbcL cho tập đoàn lan kiếm khu vực Đông Bắc.

Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro và lai tạo

• Nhân giống in vitro: Kể từ các nghiên cứu nền tảng của Knudson (1922, 1946, 1951) và Morel (1964), các môi trường cơ bản như Knudson C, MS (Murashige & Skoog), Vacin & Went (VW) kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng Auxin (NAA, IBA, IAA, 2,4-D) và Cytokinin (BA, Kinetin, TDZ) đã được ứng dụng rộng rãi. Malabadi và cộng sự (2008) nhân giống C. bicolor qua lát mỏng tế bào (TCL); Pant và cộng sự (2012) nhân giống C. iridioides từ hạt; Mohanty và cộng sự (2012) vi nhân giống C. mastersii từ hạt trên môi trường MS bổ sung 5,0 mM BAP; Park và cộng sự (2018) tái sinh C. goeringii từ thân rễ trên môi trường MS bổ sung 20 $\mu$M 2,4-D và 2 $\mu$M TDZ; Pau và cộng sự (2019) nhân giống C. aloifolium. Tại Việt Nam: Dương Tấn Nhựt (2004, 2007) nhân nhanh PLB đỉnh sinh trưởng lan kiếm (MS + 0,2 mg/L NAA + 2 mg/L BA) và tạo hạt nhân tạo bọc alginate/chitosan; Trần Thị Ngọc Lan (2013, 2017) nghiên cứu hạt nhân tạo và tạo mô sẹo phôi giống "Vàng hoàng hậu"; Hoàng Thị Nga (2008) nhân nhanh C. iridioides; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM (2014) nhân giống C. golden elf.
• Lai tạo giống: Cây lai Cymbidium đầu tiên (Cym. eburneo-lowianum) xuất hiện năm 1889; tiếp theo là con lai nổi tiếng Cymbidium Alexanderi 'Westonbirt' (tứ bội). Các hướng lai tập trung vào việc phối hợp màu sắc, tạo giống hoa nhỏ (Cymbidium miniature), tăng độ bền hoa và kết hợp phương pháp lai hữu tính truyền thống với chỉ thị phân tử nhận diện sớm con lai.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án tập trung giải quyết việc thiếu hụt dữ liệu đánh giá có hệ thống về đa dạng di truyền tập đoàn lan kiếm bản địa Đông Bắc bằng sự kết hợp giữa chỉ thị hình thái DUS và chỉ thị phân tử giải trình tự gen rbcL; đồng thời xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho 2 loài quý hiếm (C. wenshanense và C. mastersii) và ứng dụng chỉ thị SSR nhận diện sớm con lai $F_1$ phục vụ chọn giống.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp giữa phương pháp nghiên cứu thực nghiệm truyền thống (khảo nghiệm hình thái học, lai tạo hữu tính) và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, nuôi cấy mô tế bào thực vật:

[24 Mẫu giống Lan kiếm Đông Bắc (DL1 - DL24)]

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Đánh giá kiểu hình DUS: Dựa trên Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định (Distinctness, Uniformity, Stability - DUS) cho chi Cymbidium do Hiệp hội Quốc tế về Bảo hộ Giống cây trồng mới (UPOV) ban hành, bao gồm hệ số mã hóa ma trận nhị phân và đa trạng thái cho các tính trạng củ giả, thân, lá, phát hoa và hoa.
• Phân tích phát sinh loài phân tử: Sử dụng vùng gen rbcL (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit) nằm trên DNA lục lạp (cpDNA). Vùng gen này có mức độ bảo tồn thích hợp để phân định quan hệ di truyền ở mức loài và chi.
• Chỉ thị vi vệ tinh (SSR): Sử dụng các đoạn lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats) có tính đồng trội và độ đa hình cao để kiểm tra tính trạng di truyền của bố mẹ truyền cho con lai $F_1$.
• Công nghệ nuôi cấy mô in vitro: Dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật, điều tiết quá trình phát sinh hình thái (tạo thể giống chồi mầm - PLBs, tái sinh chồi, tạo rễ) thông qua tỷ lệ phối hợp giữa Cytokinin (BA, Kinetin, TDZ) và Auxin (NAA, IBA, IAA), hàm lượng đường sucrose và than hoạt tính.

Phương pháp nghiên cứu cụ thể

1. Đánh giá hình thái: Thu thập và ghi nhận 24 mẫu giống tại vườn tập đoàn; đo đếm các chỉ tiêu hình thái thân, lá, phát hoa, cấu tạo hoa theo quy phạm DUS của UPOV; xây dựng bảng mã hóa ma trận tính trạng hình thái.
2. Kỹ thuật sinh học phân tử:
   • Tách chiết DNA tổng số ($\Sigma\text{DNA}$) từ mô lá non bằng phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide).
   • Kiểm tra chất lượng và độ tinh sạch của DNA bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo quang phổ kế.
   • Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen lục lạp rbcL với cặp mồi chuyên biệt rbcL-F / rbcL-R.
   • Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% có bổ sung Ethidium bromide (EtBr), đọc kết quả dưới ánh sáng tia tử ngoại (UV) so sánh với thang chuẩn DNA 100bp ladder.
   • Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự nucleotide trực tiếp trên máy tự động ABI (Applied Biosystems).
   • Xử lý dữ liệu giải trình tự: Hiệu chỉnh trình tự đọc lỗi tự động, so sánh mức độ tương đồng với dữ liệu chuẩn quốc tế trên NCBI bằng công cụ BLAST, phân tích tỷ lệ thành phần nucleotide (A, T, G, C) và xác định các vị trí sai khác nucleotide đặc trưng.
   • Dựng cây phát sinh chủng loại di truyền bằng phần mềm MEGA (Molecular Evolution Genetics Analysis) theo thuật toán Maximum Likelihood (ML) hoặc UPGMA.
3. Phương pháp nhân giống in vitro:
   • Đối với loài Bạch ngọc đuôi công (C. wenshanense): Khử trùng quả, gieo hạt in vitro trên 4 môi trường dinh dưỡng cơ bản (MS, 1/2MS, KC, VW); nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) và nồng độ đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi; nghiên cứu ảnh hưởng của Auxin (IBA, NAA, IAA) và than hoạt tính (THT) đến khả năng tái sinh rễ sau 8 tuần.
   • Đối với loài Bạch ngọc (C. mastersii): Khử trùng mẫu rễ khởi đầu; thử nghiệm ảnh hưởng của NAA kết hợp than hoạt tính đến nhân nhanh rễ sau 10 tuần; thử nghiệm Cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) và sucrose đến tái sinh chồi từ rễ; thử nghiệm kết hợp BA và NAA tạo cây hoàn chỉnh sau 8 tuần.
4. Phương pháp lai tạo và nhận diện con lai:
   • Thụ phấn nhân tạo giữa các dòng bố mẹ lựa chọn trong tập đoàn (DL15, DL17, DL19, DL21...); theo dõi thời gian phát triển và tỷ lệ đậu quả sau 8 tháng thụ phấn.
   • Khảo sát tính đa hình của cây bố mẹ và phân tích điện di sản phẩm PCR con lai $F_1$ bằng các chỉ thị SSR đặc hiệu (CS7, CS8, CS11).

Hạng mục phương pháp	Nội dung / Hóa chất / Công cụ cụ thể	Mục đích thực hiện
Đánh giá hình thái	Quy phạm DUS UPOV, ma trận tính trạng hình thái hoa, thân, lá	Xác định khoảng cách di truyền mức kiểu hình của 24 mẫu giống
Tách chiết DNA	Dung dịch đệm CTAB, $\beta$-mercaptoethanol, Chloroform:Isoamyl alcohol	Thu nhận DNA tổng số đạt tiêu chuẩn cho PCR
Khuếch đại gen rbcL	Cặp mồi rbcL-F / rbcL-R, Taq DNA polymerase, dNTPs, đệm PCR	Khuếch đại vùng gen lục lạp rbcL phục vụ giải trình tự
Giải trình tự & Phân tích	Máy giải trình tự ABI, công cụ BLAST (NCBI), phần mềm MEGA	Xác định thành phần base, đột biến điểm và dựng cây quan hệ di truyền
Nhân giống in vitro hạt	Môi trường MS, KC, VW; BA, Kinetin, TDZ, NAA, IBA, sucrose, THT	Xây dựng quy trình nhân giống hoàn chỉnh loài C. wenshanense
Nhân giống in vitro rễ	Môi trường MS; NAA kết hợp THT, BA, TDZ, Kinetin, sucrose	Xây dựng quy trình nhân giống từ rễ loài C. mastersii
Lai giống & Phân tích SSR	Thụ phấn nhân tạo; Mồi SSR (CS7, CS8, CS11), điện di gel agarose	Đánh giá tỷ lệ đậu quả và xác định con lai $F_1$ ở giai đoạn sớm

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I. Tổng quan tài liệu và cơ sở khoa học của đề tài

Chương này tổng kết cơ sở lý luận về phân loại học chi Cymbidium (thuộc họ Orchidaceae, bộ Asparagales, $2n = 40$), đặc điểm thực vật học (rễ thịt lõi sợi, thân củ giả nối bằng căn hành, lá hình kiếm, cấu trúc hoa có đường hướng mật và khối phấn). Phân tích chi tiết 13 loài lan kiếm phân bố tại vùng Đông Bắc Việt Nam theo dẫn liệu của Trần Hợp. Trình bày tổng quan giá trị kinh tế, y học cổ truyền và dược lý học hiện đại của các loài lan kiếm. Phân tích thực trạng khai thác cạn kiệt, các kênh thương mại lan rừng bất hợp pháp và đánh giá các mô hình bảo tồn tại Vườn quốc gia Cát Tiên, Tam Đảo, Xuân Liên. Lược khảo các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền (hình thái, isozyme, RFLP, AFLP, RAPD, SSR, ISSR, mã vạch DNA lục lạp rbcL, matK, ITS) và lịch sử công nghệ nhân giống in vitro (các môi trường Knudson C, MS, KC, VW) cùng thành tựu chọn tạo giống lai trên thế giới và ở Việt Nam.

Chương II. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương II trình bày danh mục 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại các tỉnh vùng núi Đông Bắc (ký hiệu từ DL1 đến DL24) gồm các thông tin về xuất xứ địa lý, tên địa phương và đặc điểm ban đầu. Mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

• Phương pháp đánh giá hình thái theo quy phạm DUS của UPOV cho lan kiếm, lập bảng mã hóa ma trận tính trạng.
• Phương pháp sinh học phân tử: tách chiết DNA bằng CTAB, kiểm tra nồng độ, thiết lập chu trình nhiệt phản ứng PCR cho vùng gen rbcL, điện di sản phẩm PCR trên gel agarose với thang chuẩn 100bp ladder, giải trình tự trên hệ thống ABI, phân tích dữ liệu bằng công cụ BLAST của NCBI và phần mềm MEGA.
• Phương pháp nhân giống in vitro cho 2 loài C. wenshanense (từ hạt) và C. mastersii (từ rễ) qua các giai đoạn nảy mầm, nhân nhanh chồi/rễ, tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh với các công thức môi trường bổ sung Cytokinin (BA, Kinetin, TDZ), Auxin (NAA, IBA, IAA), sucrose và than hoạt tính.
• Phương pháp thụ phấn nhân tạo lai giống giữa các mẫu bố mẹ bản địa và quy trình khảo sát marker SSR (CS7, CS8, CS11) nhận diện con lai $F_1$. Thời gian nghiên cứu thực hiện trong 5 năm.

Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương III trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được qua 6 nội dung chính:

[KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN]

1. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái

Dựa trên ma trận các tính trạng hình thái theo quy phạm DUS UPOV (dạng lá, kích thước lá, màu sắc hoa, cấu trúc cánh hoa, cánh môi, phát hoa), sơ đồ hình cây quan hệ di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm Đông Bắc đã được thiết lập, chia tập đoàn nghiên cứu thành các nhóm kiểu hình khác biệt phản ánh sự đa dạng về hình thái sinh trắc học và thích nghi sinh thái.

2. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử (vùng gen lục lạp rbcL)

• Kết quả PCR và giải trình tự: Toàn bộ 24 mẫu giống lan kiếm đều khuếch đại thành công một băng DNA duy nhất với cặp mồi rbcL-F/rbcL-R có kích thước chuẩn xác. Trình tự vùng gen rbcL của 24 mẫu giống được giải trình tự thành công trên hệ thống ABI.
• Thành phần nucleotide và đột biến điểm: Phân tích tỷ lệ thành phần nucleotide cho thấy hàm lượng A, T, G, C có sự phân bố đặc trưng của vùng gen lục lạp thực vật một lá mầm. So sánh trình tự vùng gen rbcL của các mẫu nghiên cứu với các gen tham chiếu trên NCBI từ vị trí nucleotide số 1 đến 620 (gồm các đoạn nucleotide 1-70, 210-280, 280-350, 350-420, 420-490, 490-560, 560-620) đã phát hiện các vị trí sai khác nucleotide đặc trưng giữa các mẫu nghiên cứu và mẫu tham chiếu chuẩn.
• Hệ số tương đồng di truyền và cây phát sinh loài: Thiết lập bảng hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống nghiên cứu với nhau và giữa 24 mẫu giống với các mẫu tham chiếu quốc tế; dựng sơ đồ hình cây phân loại phân tử phản ánh chính xác nguồn gốc tiến hóa và mối quan hệ di truyền giữa các loài trong tập đoàn.

3. So sánh tương quan giữa cây di truyền hình thái và chỉ thị phân tử

Phân tích đối sánh giữa cây quan hệ di truyền hình thái và cây phát sinh loài dựa trên phân tử. Kết quả chỉ ra sự tương đồng ở các nhóm loài có tính trạng đặc trưng rõ rệt, đồng thời chỉ ra các điểm sai khác do hiện tượng đồng quy tính trạng hoặc biến dị thích nghi hình thái bên ngoài của các mẫu thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau.

4. Đề xuất hướng bảo tồn và sử dụng nguồn gen

Đề xuất các giải pháp bảo tồn in situ tại sinh cảnh tự nhiên vùng Đông Bắc và bảo tồn ex situ qua hệ thống vườn tập đoàn; lựa chọn các nguồn gen có đặc tính quý (màu sắc đẹp, hương thơm, hoa bền, chống chịu tốt) phục vụ chọn tạo giống.

5. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro

• Nhân giống in vitro loài Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense):
  • Hạt nảy mầm tốt nhất trên môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản thích hợp, hình thành các protocorm khỏe mạnh.
  • Giai đoạn nhân nhanh chồi (sau 8 tuần): Thử nghiệm các loại Cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) và các nồng độ đường sucrose xác định được môi trường tối ưu cho hệ số nhân chồi và chất lượng chồi con.
  • Giai đoạn ra rễ (sau 8 tuần): Thử nghiệm các loại Auxin (IBA, NAA, IAA) kết hợp với than hoạt tính (THT), xác định công thức NAA kết hợp than hoạt tính cho tỷ lệ tái sinh rễ cao nhất, rễ mập, khỏe.
• Nhân giống in vitro loài Bạch ngọc (Cymbidium mastersii) từ rễ:
  • Khả năng nhân nhanh rễ in vitro (sau 10 tuần) đạt hiệu quả cao dưới tác động của NAA kết hợp than hoạt tính.
  • Tái sinh chồi từ rễ (sau 8 tuần): Đánh giá ảnh hưởng của các Cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) và đường sucrose; kết hợp bổ sung BA và NAA trong môi trường giúp tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ mẫu rễ ban đầu với tỷ lệ sống cao.

6. Kết quả nghiên cứu lai tạo và nhận diện con lai F1

• Khả năng đậu quả của các tổ hợp lai: Đánh giá các cặp bố mẹ gồm ♀ DL19 (Kiếm lô hội) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm vàng); ♀ DL17 (Mạc xuân) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm lô hội); ♀ DL21 (Kiếm vàng) $\times$ ♂ DL15 (Kiếm trắng). Sau 8 tháng thụ phấn, các tổ hợp lai đều ghi nhận tỷ lệ đậu quả và phát triển quả bình thường.
• Khảo sát marker SSR nhận diện con lai F1 giai đoạn sớm: Khảo sát tính đa hình giữa các dòng bố mẹ bằng các chỉ thị SSR; kết quả điện di sản phẩm PCR con lai $F_1$ khẳng định:
  • Chỉ thị CS8 nhận dạng rõ ràng các cá thể con lai của cặp lai ♀ DL21 (Kiếm vàng) $\times$ ♂ DL15 (Kiếm trắng).
  • Chỉ thị CS7 nhận dạng chính xác con lai của cặp lai ♀ DL19 (Kiếm lô hội) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm vàng).
  • Chỉ thị CS11 nhận dạng thành công con lai của cặp lai ♀ DL17 (Mạc xuân) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm lô hội).

Nội dung thực nghiệm	Đối tượng / Cặp lai	Yếu tố / Chỉ thị tối ưu	Kết quả ghi nhận chính
Giải trình tự gen lục lạp	24 mẫu giống (DL1 - DL24)	Vùng gen rbcL (mồi rbcL-F/R)	Xác định vị trí sai khác nucleotide (1-620 bp), dựng cây phát sinh loài
Nhân giống in vitro hạt	Bạch ngọc đuôi công (C. wenshanense)	Môi trường MS + Cytokinin + NAA + THT	Nảy mầm protocorm, nhân nhanh chồi và tái sinh rễ sau 8 tuần
Nhân giống in vitro rễ	Bạch ngọc (C. mastersii)	Môi trường MS + NAA + THT $\rightarrow$ BA + NAA	Nhân nhanh khối rễ sau 10 tuần, tái sinh chồi tạo cây hoàn chỉnh sau 8 tuần
Nhận diện con lai F1 (cặp 1)	♀ DL21 (Kiếm vàng) $\times$ ♂ DL15 (Kiếm trắng)	Marker SSR CS8	Băng điện di đặc trưng xác nhận con lai $F_1$ giai đoạn sớm
Nhận diện con lai F1 (cặp 2)	♀ DL19 (Kiếm lô hội) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm vàng)	Marker SSR CS7	Phân ly alen nhận dạng chính xác con lai $F_1$ giai đoạn sớm
Nhận diện con lai F1 (cặp 3)	♀ DL17 (Mạc xuân) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm lô hội)	Marker SSR CS11	Phân tích sản phẩm PCR xác nhận con lai $F_1$ giai đoạn sớm

---

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được những kết quả và đóng góp mới về mặt khoa học lý luận cũng như giá trị thực tiễn như sau:

Đóng góp mới về lý luận và khoa học

1. Luận án là công trình đầu tiên thực hiện đánh giá đa dạng di truyền một cách có hệ thống bằng chỉ thị hình thái (theo quy phạm DUS của UPOV) kết hợp với chỉ thị sinh học phân tử trên tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam.
2. Xác định được đặc điểm trình tự nucleotide vùng gen lục lạp rbcL, tỷ lệ thành phần các base (A, T, G, C), mức độ tương đồng di truyền và các vị trí sai khác nucleotide đặc trưng giữa 24 mẫu giống nghiên cứu với các mẫu tham chiếu chuẩn quốc tế trên NCBI; qua đó thiết lập cơ sở dữ liệu phân loại phân tử chính xác cho tập đoàn lan kiếm Đông Bắc phục vụ công tác bảo tồn và khai thác nguồn gen.
3. Cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng kết hợp lai hữu tính giữa các loài lan kiếm bản địa, tỷ lệ đậu quả và cơ chế di truyền của các locus vi vệ tinh SSR ở thế hệ con lai $F_1$.

Đóng góp mới về thực tiễn và công nghệ

1. Xây dựng thành công quy trình công nghệ nhân giống in vitro cho 02 nguồn gen lan kiếm quý, có giá trị kinh tế cao:
   • Nhân giống loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense) từ vật liệu khởi đầu là hạt.
   • Nhân giống loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii) từ vật liệu khởi đầu là mô rễ in vitro.
2. Thực hiện lai tạo thành công một số tổ hợp lai giữa các nguồn gen lan kiếm bản địa vùng Đông Bắc (Kiếm lô hội, Kiếm vàng, Kiếm trắng, Mạc xuân), tạo lập được quần thể cây lai $F_1$ làm nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống hoa lan mới.
3. Xác định được các chỉ thị phân tử SSR đặc hiệu (CS7, CS8, CS11) có khả năng nhận dạng chính xác các cá thể con lai $F_1$ ở giai đoạn cây non (giai đoạn sớm), giúp rút ngắn thời gian chọn lọc trong công tác chọn giống thực vật.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng quy trình nhân giống in vitro từ hạt và mô rễ đã thiết lập vào công tác lưu giữ nguồn gen ex situ và sản xuất giống quy mô hàng hóa phục vụ thị trường hoa cảnh, giảm áp lực khai thác lan rừng tự nhiên.
• Sử dụng các marker SSR (CS7, CS8, CS11) trong quy trình kiểm định giống lai sớm ở các cơ sở nghiên cứu và chọn tạo giống hoa lan.
• Tiếp tục theo dõi, đánh giá các đặc tính nông sinh học và chất lượng hoa của quần thể cây lai $F_1$ khi trưởng thành để tuyển chọn các dòng ưu tú mang bản quyền thương hiệu Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ vào phạm vi và các nội dung đã công bố trong văn bản luận án, công trình có một số hạn chế và định hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:

• Về phạm vi mẫu nghiên cứu: Tập đoàn nghiên cứu gồm 24 mẫu giống thu thập tại các tỉnh miền núi Đông Bắc. Cần mở rộng quy mô thu thập và phân tích thêm các mẫu giống lan kiếm tại các vùng phân bố tự nhiên khác như Tây Bắc, Bắc Trung Bộ, Trung Bộ và Tây Nguyên để hoàn thiện bức tranh tổng thể về nguồn gen Cymbidium tại Việt Nam.
• Về chỉ thị phân tử: Luận án tập trung giải trình tự vùng gen lục lạp rbcL và sử dụng các chỉ thị SSR cho con lai. Việc kết hợp thêm các vùng gen lục lạp khác (như matK, trnL-F, psbA-trnH) và vùng phiên mã nội nhân (nrITS) sẽ giúp tăng cường độ phân giải phân loại học ở cấp độ dưới loài và các dạng biến dị hình thái phức tạp.
• Về theo dõi quần thể con lai F1: Do chu kỳ sinh trưởng của chi lan kiếm từ giai đoạn cây con đến khi ra hoa kéo dài nhiều năm, luận án mới đánh giá được khả năng đậu quả và kiểm tra con lai $F_1$ ở giai đoạn cây non bằng marker SSR. Hướng nghiên cứu tiếp theo cần theo dõi quá trình sinh trưởng ngoài vườn ươm, đánh giá hình thái hoa, độ bền cành hoa và khả năng thích ứng của các dòng lai khi ra hoa trong điều kiện sản xuất thực tế.

---

Giá trị tham khảo

Luận án cung cấp hệ thống dẫn liệu thực nghiệm khoa học có giá trị tham khảo cao đối với nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên: Thuộc các chuyên ngành Di truyền và chọn giống cây trồng, Công nghệ sinh học nông nghiệp, Thực vật học, Lâm nghiệp và Bảo tồn tài nguyên sinh vật tại các trường đại học và viện nghiên cứu (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Viện Nghiên cứu Rau quả...). Bản luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp đánh giá hình thái theo DUS UPOV, kỹ thuật tách chiết DNA bằng CTAB, kỹ thuật giải trình tự gen rbcL, xử lý số liệu bằng MEGA/BLAST và kỹ thuật điện di SSR.
• Cán bộ nghiên cứu và chọn tạo giống cây trồng: Tham khảo quy trình thiết kế và thực hiện các tổ hợp lai hữu tính ở cây hoa lan; phương pháp sử dụng marker SSR phân tử nhận diện con lai $F_1$ giai đoạn sớm nhằm tiết kiệm chi phí và rút ngắn thời gian chọn giống.
• Các nhà quản lý bảo tồn nguồn gen: Cung cấp cơ sở dữ liệu về hiện trạng 13 loài lan kiếm vùng Đông Bắc, danh mục 24 mẫu giống và quy trình vi nhân giống phục vụ công tác bảo tồn chuyển chỗ (ex situ) và phục hồi quần thể tự nhiên (in situ).
• Các đơn vị sản xuất và doanh nghiệp giống cây trồng: Ứng dụng trực tiếp quy trình nhân giống in vitro hạt loài Bạch ngọc đuôi công (C. wenshanense) và nhân giống từ rễ loài Bạch ngọc (C. mastersii) để sản xuất cây giống sạch bệnh, đồng đều phục vụ thị trường thương mại.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án sử dụng phương pháp nào để đánh giá đa dạng di truyền của 24 mẫu giống lan kiếm Đông Bắc?

Luận án kết hợp 2 phương pháp: đánh giá kiểu hình theo Quy phạm khảo nghiệm DUS của UPOV (mã hóa các tính trạng thân, lá, phát hoa, hoa thành ma trận số liệu) và phân tích sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR, giải trình tự nucleotide vùng gen lục lạp rbcL trên hệ thống máy ABI tự động, phân tích dữ liệu bằng phần mềm MEGA và công cụ BLAST của NCBI.

2. Hai loài lan kiếm nào đã được xây dựng quy trình nhân giống in vitro trong luận án và từ loại vật liệu khởi đầu nào?

Hai loài lan kiếm được nghiên cứu nhân giống in vitro gồm:

• Lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense): sử dụng vật liệu khởi đầu là hạt nảy mầm in vitro.
• Địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii): sử dụng vật liệu khởi đầu là mô rễ trong điều kiện in vitro.

3. Các chỉ thị phân tử SSR nào được sử dụng để nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm cho các cặp lai cụ thể trong luận án?

Luận án đã xác định 3 marker SSR đặc hiệu cho từng cặp lai:

• Chỉ thị CS8: nhận dạng con lai $F_1$ của cặp lai ♀ DL21 (Kiếm vàng) $\times$ ♂ DL15 (Kiếm trắng).
• Chỉ thị CS7: nhận dạng con lai $F_1$ của cặp lai ♀ DL19 (Kiếm lô hội) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm vàng).
• Chỉ thị CS11: nhận dạng con lai $F_1$ của cặp lai ♀ DL17 (Mạc xuân) $\times$ ♂ DL21 (Kiếm lô hội).

4. Chi lan kiếm tại vùng núi Đông Bắc Việt Nam chiếm tỷ lệ bao nhiêu trong tổng số loài lan kiếm tự nhiên của cả nước?

Theo số liệu thống kê của tác giả Trần Hợp được trích dẫn trong luận án, vùng núi Đông Bắc Việt Nam đã ghi nhận 13 loài trên tổng số 24 loài lan kiếm có trong tự nhiên của cả nước, chiếm tỷ lệ hơn 50% thành phần loài.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Phạm Phương Thu đã hoàn thành việc đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam thông qua sự kết hợp giữa chỉ thị hình thái DUS UPOV và chỉ thị phân tử vùng gen lục lạp rbcL. Công trình đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cho 2 loài lan kiếm quý là Bạch ngọc đuôi công (C. wenshanense) từ hạt và Bạch ngọc (C. mastersii) từ mô rễ, đồng thời thực hiện lai tạo thành công các tổ hợp lai bản địa và xác lập các marker SSR (CS7, CS8, CS11) nhận dạng con lai $F_1$ ở giai đoạn sớm. Các kết quả đạt được cung cấp nguồn dữ liệu khoa học tin cậy và cơ sở thực tiễn quan trọng phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen, nhân giống thương phẩm và chọn tạo giống hoa lan kiếm mới tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI. Giới thiệu chung về hoa lan.

Đặc điểm thực vật học, phân loại và phân bố của chi lan kiếm. Nguồn gen lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam. Giá trị, thực trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen lan kiếm. Tình hình nghiên cứu chi lan kiếm trên thế giới và Việt Nam.

Nghiên cứu đa dạng di truyền chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu nhân giống và lai tạo chi lan kiếm trên thế giới và ở Việt Nam. Các kết luận qua phân tích tổng quan .37 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái.

Kỹ thuật sinh học phân tử. Phương pháp lai tạo giống nguồn gen lan kiếm. Phương pháp nhân giống in vitro. Phần mềm xử lý số liệu.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu.57 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị hình thái. Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng chỉ thị phân tử.

Kết quả PCR các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả giải trình tự vùng lục lạp mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả nhận biết các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Kết quả xác định các chỉ thị phân tử đặc trưng để nhận dạng các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu.

So sánh, phân tích mối tương quan giữa tập đoàn lan kiếm nghiên cứu ở cây đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử. Đề xuất các hướng nghiên cứu, sử dụng nguồn gen lan kiếm hiện có. Nghiên cứu nhân giống một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc bằng phương pháp nhân giống in vitro. Kết quả nhân giống in vitro loài lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (Cymbidium wenshanense).

Kết quả nhân giống in vitro loài địa lan Bạch ngọc (Cymbidium mastersii). Nghiên cứu lai, tạo vật liệu khởi đầu từ một số mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc. Khả năng đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm có nguồn gốc từ vùng núi Đông Bắc Việt Nam. Khảo sát và xác định xác định marker nhận dạng con lai F1 ở giai đoạn sớm bằng chỉ thị phân tử SSR .130 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .136 Danh mục các công trình khoa học công bố liên quan đến luận án tiến sĩ .138 Tài liệu tham khảo .154 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải A Adenine ABI Applied Biosystems Incorporated Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài AFLP đoạn nhân bản) atpβ gene ATP synthase beta - subunit gene BA Benzyladenine Basic Local Alignment Search Tool (Công cụ tìm kiếm sắp gióng BLAST cột từng phần cơ bản) Bp Base pairs (Cặp bazơ) C Cytosine cpDNA Chloroplast DNA (DNA lục lạp); CT Công thức CTAB Cetyltrimethylammonium bromide (Dung dịch đệm) CTTN Công thức thí nghiệm CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động) Cym Cymbidium D Dendrobium Đ/c Đối chứng DL Địa lan DNA Deoxyribonucleic acid (Axít Deoxyribonucleic) DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediamine tetraacetate EtBr Ethidium bromide G Guanin vii GA3 Gibberellin (Hormone sinh trưởng thực vật) IAA Indole - 3 - acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) IBA Indole - 3 - butyric acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ISSR Inter - Simple Sequence Repeat (Đoạn lặp trình tự đơn) ITS Internal transcribed spacer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Ln Likelihood LSD Least Significant Difference Test matK Maturase K (Gen maturase K Molecular Evolution Genetics Analysis (Phân tích di truyền tiến MEGA hóa phân tử) ML Maximum Likelihood mtDNA Mitochondrial DNA National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông NCBI tin Công nghệ sinh học Quốc gia) ndhF NADH dehydrogenase subunit F nDNA Nuclear DNA ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction ( Phản ứng chuỗi Polymerase) PIC Polymorphism Information Content ( Hệ số Thông tin đa hình) PLBs Protocorm like Bodies QTLs Quantitative trait locus Random Amplified Polymorphic DNAs (DNA đa hình nhân ngẫu RAPD nhiên rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase RCB Randomized Completely Block (Khối Ngẫu nhiên đủ) rDNA Ribosomal DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình về chiều dài viii của các đoạn DNA) RNA Ribonucleic acid RNAse Ribonuclease SCARs Sequence - Characterized Amplified Region Sect Section SSR Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản) T Thymine Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA THT Than hoạt tính Tm Melting Temperature UV Ultraviolet V Voltex α NAA α - Naphthalene acetic acid (Hormone sinh trưởng thực vật) ΣDNA DNA tổng số ix DANH MỤC BẢNG TT Nội dung bảng Trang 2.

Các mẫu giống lan kiếm khu vực miền núi Đông Bắc Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu. Các cặp mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR. Bảng đánh giá một số đặc điểm hình thái theo quy phạm khảo nghiệm DUS cho lan kiếm của UPOV. Bảng mã hoá theo ma trận các tính trạng hình thái của tập đoàn 24 mẫu giống lan kiếm.

Tỉ lệ phần trăm thành phần nucleotide của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu và các mẫu tham chiếu. Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. Hệ số tương đồng di truyền về trình tự nucleotide giữa 24 mẫu giống lan kiếm với các mẫu tham chiếu. Một số vị trí sai khác về trình tự nucleotide của các mẫu giống nghiên cứu và mẫu tham chiếu.

So sánh phân nhóm dựa vào hình thái và chỉ thị phân tử của 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu. So sánh ảnh hưởng của bốn môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công. So sánh ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần).

Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của 3 loại auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ của cây l an kiếm Bạch ngọc. Ảnh hưởng của NAA kết hợp THT đến khả năng nhân nhanh rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 10 tuần).

Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng tạo cây con lan kiếm Bạch ngọc từ rễ trong điều kiện in vitro ( sau 8 tuần). Một số đặc điểm hình thái hoa, lá của các mẫu giống dùng làm bố, mẹ tạo quần thể lai F1.

Tỷ lệ đậu quả của một số tổ hợp lai lan kiếm vùng núi Đông Bắc .125 xi DANH MỤC HÌNH TT Nội dung hình Trang 3. Mặt hoa 24 mẫu giống lan kiếm thu thập tại vùng núi Đông Bắc. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 24 mẫu giống lan kiếm dựa trên chỉ thị hình thái. Kết quả PCR 24 mẫu giống lan kiếm nghiên cứu với cặp mồi rbcL - F/rbcL - R; M: Marker 100bp ladder.

Sơ đồ hình cây của 24 mẫu giống lan kiếm và các mẫu giống tham chiếu. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 1 đến nucleotide số 70. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 210 đến nucleotide số 280. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 280 đến nucleotide số 350.

Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 350 đến nucleotide số 420. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 420 đến nucleotide số 490. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 490 đến nucleotide số 560. Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide vùng lục lạp sử dụng cặp mồi rbcL - F/rbcL - R của các mẫu giống lan kiếm nghiên cứu so với gen tham chiếu từ vị trí nucleotide số 560 đến nucleotide số 620.

Hạt lan kiếm Bạch ngọc đuôi công nảy mầm và phát triển trên môi trường MS. Ảnh hưởng của cytokinin (Kinetin, TDZ, BA) đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng nhân nhanh chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA, IAA) đến khả năng tái sinh rễ lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần).

Ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả năng tái sinh rễ của chồi lan kiếm Bạch ngọc đuôi công (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của nhóm cytokinins (Kinetin; TDZ, BA) đến khả năng tái sinh chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc (sau 8 tuần). Ảnh hưởng của đường sucrose đến khả năng tạo chồi từ rễ lan kiếm Bạch ngọc trong điều kiện in vitro (sau 8 tuần). Một số hình ảnh kết quả lai tạo nguồn gen lan kiếm vùng núi Đông Bắc Việt Nam (sau 8 tháng thụ phấn) .