Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học và Sinh Học Phân Tử của Virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu một số đặc tính sinh học sinh học phân tử của chủng virus kty prrs 01 và kty prrs 02, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học và Sinh Học Phân Tử của Virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 2.1. Mục tiêu chung
• 2.2. Mục tiêu cụ thể
• 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Phạm vi nghiên cứu
• 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
• 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 6. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 6.1. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 6.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới
• 6.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam
• 6.2. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS
• 6.2.1. Cấu trúc virus PRRS
• 6.2.2. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS
• 6.2.3. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS
• 7. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 7.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 7.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 7.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 7.4.1. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 7.4.2. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 7.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 7.5.2. Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào
• 7.5.3. Phương pháp xác định TCID50
• 7.5.4. Phương pháp xác định sự nhân lên của virus
• 7.5.5. Phương pháp RT – PCR
• 7.5.6. Phương pháp giải trình tự gene
• 7.5.7. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein
• 7.5.8. Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ
• 7.5.9. Phương pháp IPMA
• 7.5.10. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm
• 8. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 8.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM
• 8.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 8.1.2. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 8.1.3. Kết quả nghiên cứu xác định sự nhân lên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• 8.1.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• 8.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 8.2.1. Kết quả phản ứng RT-PCR
• 8.2.2. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu
• 8.2.3. Kết quả truy cập ngân hàng gene
• 8.2.4. So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu
• 8.2.5. So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu
• 8.2.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu
• 9. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Virus PRRS KTY PRRS 01 và KTY PRRS 02

Trong bối cảnh ngành chăn nuôi lợn Việt Nam ngày càng phát triển, dịch bệnh PRRS (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn), hay còn gọi là bệnh tai xanh, nổi lên như một thách thức lớn. Bệnh gây ra những tổn thất kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi. Virus PRRS (PRRSV) thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirale, có hệ gene RNA đơn dương. Sự đa dạng di truyền và kháng nguyên của các chủng PRRSV khiến việc sử dụng vaccine trở nên kém hiệu quả, thậm chí gây ra các ổ dịch lớn. Nghiên cứu về đặc tính sinh học virus và sinh học phân tử virus của các chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 phân lập tại Việt Nam là vô cùng cần thiết để hiểu rõ hơn về dịch tễ học và phát triển các biện pháp phòng chống hiệu quả. Theo Keffaber (1989), bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 và nhanh chóng lan rộng ra toàn cầu.

1.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu biến chủng virus PRRS

Nghiên cứu về biến chủng virus PRRS là vô cùng quan trọng để hiểu rõ sự tiến hóa và thay đổi của virus. Điều này giúp chúng ta dự đoán được các nguy cơ tiềm ẩn và phát triển các biện pháp phòng chống dịch bệnh hiệu quả hơn. Việc xác định các genotype virus PRRS khác nhau cũng giúp chúng ta theo dõi sự lây lan của bệnh và đánh giá hiệu quả của các chương trình kiểm soát dịch bệnh.

1.2. Mục tiêu của nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xác định đặc tính sinh học và sinh học phân tử của hai chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam, cụ thể là KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào khả năng gây bệnh, tốc độ nhân lên, cấu trúc gene và các đặc điểm kháng nguyên của virus. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển vaccine và các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

II. Thách Thức Trong Kiểm Soát Dịch Tễ Học PRRS ở Việt Nam

Mặc dù đã có nhiều nỗ lực trong việc kiểm soát dịch tễ học PRRS ở Việt Nam, nhưng dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra, gây ra những thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn. Một trong những nguyên nhân chính là sự thiếu hụt thông tin về các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam, cũng như đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chúng. Việc sử dụng vaccine không phù hợp hoặc không hiệu quả cũng là một vấn đề lớn. Các chiến lược phòng chống dịch bệnh hiện tại chưa đủ mạnh để ngăn chặn sự lây lan của virus. Do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây bệnh PRRS và miễn dịch học PRRS để phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

2.1. Sự đa dạng di truyền của virus PRRSV và ảnh hưởng đến vaccine

Sự đa dạng di truyền của virus PRRSV là một thách thức lớn trong việc phát triển vaccine hiệu quả. Các chủng virus khác nhau có thể có các đặc điểm kháng nguyên khác nhau, khiến cho vaccine được thiết kế dựa trên một chủng virus có thể không bảo vệ được chống lại các chủng virus khác. Do đó, cần có những nghiên cứu để xác định các chủng virus phổ biến nhất tại Việt Nam và phát triển vaccine đa giá có thể bảo vệ chống lại nhiều chủng virus khác nhau.

2.2. Vai trò của tế bào đích của virus PRRS trong quá trình nhiễm bệnh

Hiểu rõ về tế bào đích của virus PRRS là rất quan trọng để hiểu rõ cơ chế gây bệnh PRRS. Virus PRRSV chủ yếu tấn công các đại thực bào phế nang lợn (PAMs), nhưng cũng có thể lây nhiễm sang các loại tế bào khác. Việc xác định các thụ thể trên tế bào mà virus sử dụng để xâm nhập và lây nhiễm sẽ giúp chúng ta phát triển các biện pháp ngăn chặn sự xâm nhập của virus và giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra.

2.3. Nghiên cứu tương tác virus vật chủ trong bệnh PRRS

Nghiên cứu tương tác virus-vật chủ là rất quan trọng để hiểu rõ cách virus PRRSV tương tác với hệ miễn dịch của lợn. Virus có thể sử dụng nhiều cơ chế khác nhau để trốn tránh hệ miễn dịch và duy trì sự nhiễm trùng. Việc xác định các cơ chế này sẽ giúp chúng ta phát triển các biện pháp tăng cường hệ miễn dịch của lợn và giúp chúng chống lại sự nhiễm trùng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Phân Tử Virus PRRS

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân tích đặc tính sinh học phân tử virus PRRS, bao gồm phân lập virus PRRS, nuôi cấy tế bào, xác định hiệu giá virus (TCID50), nghiên cứu sự nhân lên của virus, RT-PCR, giải trình tự gene và phân tích cây phả hệ. Các phương pháp này cho phép chúng ta xác định cấu trúc gene, mức độ tương đồng giữa các chủng virus, và mối quan hệ tiến hóa giữa chúng. Kết quả phân tích sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của virus PRRS và phát triển các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

3.1. Quy trình giải trình tự gen virus và phân tích dữ liệu

Quy trình giải trình tự gen virus bao gồm các bước: tách chiết RNA từ mẫu virus, phiên mã ngược RNA thành cDNA, khuếch đại các đoạn gene mục tiêu bằng PCR, làm sạch sản phẩm PCR, giải trình tự DNA bằng phương pháp Sanger hoặc giải trình tự thế hệ mới (NGS), và phân tích dữ liệu bằng các phần mềm tin sinh học. Phân tích dữ liệu bao gồm việc xác định trình tự nucleotide, so sánh trình tự với các chủng virus khác, và xác định các đột biến hoặc đa hình di truyền.

3.2. Ứng dụng RT PCR trong chẩn đoán và nghiên cứu virus PRRS

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán và nghiên cứu virus PRRS. Kỹ thuật này cho phép phát hiện và định lượng RNA của virus trong mẫu bệnh phẩm. RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, và có thể được sử dụng để chẩn đoán bệnh sớm, theo dõi sự lây lan của virus, và đánh giá hiệu quả của vaccine.

3.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào và xác định hiệu giá virus

Phương pháp nuôi cấy tế bào được sử dụng để nhân giống virus trong phòng thí nghiệm. Tế bào Marc-145 thường được sử dụng để nuôi cấy virus PRRS. Hiệu giá virus (TCID50) được xác định bằng cách pha loãng virus và gây nhiễm cho các tế bào nuôi cấy. Hiệu giá virus là nồng độ virus cần thiết để gây nhiễm cho 50% số tế bào nuôi cấy.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của KTY PRRS 01 KTY PRRS 02

Nghiên cứu đã xác định được đặc tính sinh học của hai chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam, KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus đều có khả năng gây bệnh tích tế bào trên tế bào Marc-145, với KTY-PRRS-02 có độc lực cao hơn KTY-PRRS-01. Cả hai chủng virus đều có khả năng nhân lên nhanh chóng trong tế bào nuôi cấy, với hiệu giá virus đạt đỉnh điểm sau 60-84 giờ gây nhiễm. Nghiên cứu cũng cho thấy cả hai chủng virus đều có khả năng gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm.

4.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào của KTY PRRS 01 và KTY PRRS 02

Nghiên cứu cho thấy cả hai chủng virus PRRS, KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02, đều có khả năng gây bệnh tích tế bào trên tế bào Marc-145. Bệnh tích tế bào được biểu hiện bằng sự co cụm, phồng to và bong tróc của tế bào. KTY-PRRS-02 có khả năng gây bệnh tích tế bào nhanh hơn và mạnh hơn so với KTY-PRRS-01, cho thấy KTY-PRRS-02 có độc lực cao hơn.

4.2. Đường cong sinh trưởng của virus PRRS trong tế bào nuôi cấy

Nghiên cứu đã xác định được đường cong sinh trưởng của virus PRRS trong tế bào nuôi cấy. Kết quả cho thấy cả hai chủng virus, KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02, đều có khả năng nhân lên nhanh chóng trong tế bào nuôi cấy. Hiệu giá virus đạt đỉnh điểm sau 60-84 giờ gây nhiễm, sau đó giảm dần. Đường cong sinh trưởng của hai chủng virus tương tự nhau, cho thấy chúng có tốc độ nhân lên tương đương.

4.3. Đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với virus PRRS

Nghiên cứu cho thấy cả hai chủng virus PRRS, KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02, đều có khả năng gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm. Chuột và thỏ được tiêm chủng với virus đã phát triển kháng thể kháng PRRSV. Kết quả này cho thấy cả hai chủng virus đều có thể được sử dụng để phát triển vaccine phòng bệnh PRRS.

V. Phân Tích Sinh Học Phân Tử Chủng Virus KTY PRRS 01 và KTY PRRS 02

Phân tích sinh học phân tử của hai chủng virus PRRS, KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02, cho thấy chúng có mức độ tương đồng cao về trình tự nucleotide ở gene ORF5 và ORF7. Tuy nhiên, cũng có một số khác biệt nhỏ về trình tự nucleotide và amino acid giữa hai chủng virus và so với các chủng virus tham chiếu. Phân tích cây phả hệ cho thấy cả hai chủng virus thuộc nhóm PRRS type 2 (Bắc Mỹ) và có cùng nhánh với chủng độc lực cao của Trung Quốc.

5.1. So sánh trình tự gene ORF5 và ORF7 giữa các chủng virus

So sánh trình tự gene ORF5 và ORF7 giữa KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 và các chủng virus tham chiếu cho thấy có sự tương đồng cao, nhưng cũng có một số khác biệt nhỏ. Những khác biệt này có thể ảnh hưởng đến độc lực và khả năng gây miễn dịch của virus. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để xác định vai trò của những khác biệt này.

5.2. Xây dựng cây sinh học phân tử của virus PRRS

Cây sinh học phân tử được xây dựng dựa trên trình tự nucleotide của gene ORF5 và ORF7. Cây phả hệ cho thấy KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 thuộc nhóm PRRS type 2 (Bắc Mỹ) và có cùng nhánh với chủng độc lực cao của Trung Quốc. Điều này cho thấy hai chủng virus này có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và có thể có độc lực cao.

5.3. Mức độ tương đồng về amino acid giữa các chủng virus PRRS

Mức độ tương đồng về amino acid giữa KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 và các chủng virus tham chiếu là khá cao. Tuy nhiên, cũng có một số khác biệt về amino acid ở một số vị trí quan trọng. Những khác biệt này có thể ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein, và do đó ảnh hưởng đến độc lực và khả năng gây miễn dịch của virus.

VI. Ứng Dụng Nghiên Cứu Phát Triển Vaccine PRRS Hiệu Quả

Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vaccine PRRS hiệu quả cho Việt Nam. Việc hiểu rõ đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam là rất quan trọng để thiết kế vaccine phù hợp và có khả năng bảo vệ cao. Nghiên cứu này cũng cung cấp thông tin quan trọng cho việc đánh giá hiệu quả của các vaccine hiện có và phát triển các chiến lược kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

6.1. Lựa chọn chủng virus để phát triển vaccine PRRS

Việc lựa chọn chủng virus để phát triển vaccine PRRS là rất quan trọng. Chủng virus được lựa chọn nên có độc lực vừa phải, có khả năng gây miễn dịch tốt, và có trình tự gene tương đồng với các chủng virus đang lưu hành tại Việt Nam. KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 có thể là những ứng cử viên tiềm năng để phát triển vaccine.

6.2. Phát triển phương pháp chẩn đoán PRRS nhanh chóng

Phát triển phương pháp chẩn đoán PRRS nhanh chóng là rất quan trọng để kiểm soát dịch bệnh. Các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng cho phép phát hiện bệnh sớm và thực hiện các biện pháp kiểm soát kịp thời. RT-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và hiệu quả, và có thể được sử dụng để phát hiện virus PRRS trong mẫu bệnh phẩm.

6.3. Kiểm soát dịch bệnh PRRS và giảm thiểu thiệt hại kinh tế

Mục tiêu cuối cùng của nghiên cứu này là kiểm soát dịch bệnh PRRS và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn. Việc phát triển vaccine hiệu quả, phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, và các chiến lược kiểm soát dịch bệnh hiệu quả là rất quan trọng để đạt được mục tiêu này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu, gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi toàn cầu với thiệt hại ước tính riêng tại Mỹ lên tới 560 triệu USD mỗi năm. Tại Việt Nam, từ ổ dịch đầu tiên được ghi nhận vào tháng 3/2007 tại Hải Dương, dịch PRRS liên tục bùng phát dữ dội; điển hình năm 2010 đã làm 717.830 con lợn mắc bệnh và buộc tiêu hủy 413.000 con tại 32 tỉnh thành. Đến năm 2013, dịch tái bùng phát phức tạp tại 6 tỉnh trọng điểm, khiến hơn 18.000 con lợn chết và bị tiêu hủy. Nguyên nhân chính khiến dịch bệnh dai dẳng và các loại vắc-xin hiện hành kém hiệu quả là do sự biến đổi di truyền nhanh chóng của virus PRRS thực địa.

Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Thú y của tác giả Nguyễn Thị Ngọc thực hiện nghiên cứu toàn diện nhằm xác định đặc tính sinh học và sinh học phân tử của hai chủng virus đại diện gồm KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Nghiên cứu tập trung giải quyết mục tiêu tuyển chọn nguồn virus chuẩn phục vụ chế tạo vắc-xin tương thích cao, sản xuất sinh phẩm chẩn đoán và làm chủng tham chiếu cho dịch tễ học phân tử.

Nghiên cứu được triển khai từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và Bộ môn Bệnh lý thuộc Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Đối tượng nghiên cứu là 02 chủng virus phân lập năm 2013 từ ổ dịch lợn nái mang thai tại Thái Bình và Nghệ An. Công trình mang ý nghĩa thực tiễn lớn khi cung cấp bộ dữ liệu di truyền với độ tương đồng nucleotide đạt từ 98,03% đến 98,58% so với chủng độc lực cao, tạo nền tảng nâng cao tỷ lệ bảo hộ của vắc-xin nội địa đạt trên 80%.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Virus PRRS (PRRSV) thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Hệ gen của virus là một phân tử RNA chuỗi đơn dương có kích thước xấp xỉ 15 kilobase (kb), bao gồm 9 khung đọc mở (ORF). Trong đó, ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 75% hệ gen, mã hóa cho ít nhất 13 protein phi cấu trúc (NSP) đảm nhiệm vai trò tổng hợp mRNA và nhân đôi hệ gen. Khung ORF2 đến ORF7 tại đầu 3' mã hóa các protein cấu trúc quan trọng.

Về phân loại phát sinh loài, PRRSV được chia thành hai kiểu gen chính: Genotype 1 (dòng Châu Âu, đại diện là chủng Lelystad) và Genotype 2 (dòng Bắc Mỹ, đại diện là chủng VR-2332). Hai dòng này chỉ tương đồng khoảng 55% đến 70% về nucleotide và 50% đến 80% về amino acid. Nghiên cứu tập trung vào 3 khái niệm cốt lõi:

• Khung gen ORF5: Kích thước 603 bp, mã hóa Glycoprotein 5 (GP5, 25 kDa), protein bề mặt đóng vai trò nhận diện thụ thể tế bào và kích thích sinh kháng thể trung hòa.
• Khung gen ORF7: Kích thước 372 bp, mã hóa protein vỏ nhân Nucleocapsid (N, 15 kDa), có tính kháng nguyên cao nhất, thường được ứng dụng trong chẩn đoán huyết thanh học.
• Bệnh tích tế bào (CPE) và liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy (TCID50): Các chỉ số định lượng năng lực phá hủy và mức độ nhân lên của virus trên tế bào cảm nhiễm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 02 chủng virus KTY-PRRS-01 (phân lập từ phổi lợn nái tại Thái Bình) và KTY-PRRS-02 (phân lập từ hạch phổi lợn nái tại Nghệ An) cùng 01 chủng virus vắc-xin đối chứng. Phương pháp chọn mẫu chủ đích được áp dụng trên các ca bệnh lâm sàng điển hình có tỷ lệ tử vong cao nhằm thu nhận các chủng virus có độc lực đại diện.

Về phương pháp nuôi cấy và phân tích sinh học, tế bào thận khỉ Marc-145 được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS ở điều kiện 37°C và 5% CO2. Virus được gây nhiễm với hệ số nhiễm tạp MOI = 0,1 để theo dõi CPE và MOI = 0,01 để xác định động học nhân lên qua các mốc thời gian từ 12 đến 96 giờ. Hiệu giá virus được xác định theo phương pháp pha loãng tới hạn và tính toán bằng công thức Spearman-Karber. Dòng tế bào Marc-145 được lựa chọn nhờ tính ổn định di truyền cao hơn đại thực bào phế nang sơ cấp.

Về sinh học phân tử, RNA tổng số được tách chiết bằng bộ kít chuyên dụng của Qiagen. Phản ứng RT-PCR thực hiện khuếch đại hai phân đoạn gen với cặp mồi đặc hiệu cho ORF5 (sản phẩm 720 bp) và ORF7 (sản phẩm 372 bp) qua 35 chu kỳ nhiệt. Sản phẩm được giải trình tự bằng máy Beckman Coulter CEQ 8000 theo nguyên lý Sanger. Dữ liệu trình tự được đối chiếu trên GenBank, xử lý bằng phần mềm Genetyx 5.4 và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA6 với thuật toán Neighbor-Joining (1.000 lần lặp bootstrap).

Đặc tính sinh kháng nguyên được đánh giá in vivo trên 25 cá thể chuột lang (gồm 2 lô thí nghiệm 10 con và 1 lô đối chứng 5 con) cùng 20 cá thể thỏ (2 lô thí nghiệm 8 con và 1 lô đối chứng 4 con) qua 2 lần tiêm 20 µg kháng nguyên tinh chế cách nhau 14 ngày, sau đó kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng kỹ thuật miễn dịch gắn men trên tế bào một lớp (IPMA).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã ghi nhận 4 phát hiện khoa học mang tính đột phá về đặc tính sinh học và di truyền của hai chủng virus nghiên cứu:

1. Khả năng gây bệnh tích tế bào nhanh và mạnh: Cả hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều bắt đầu làm biến đổi hình thái tế bào Marc-145 tại thời điểm 36 giờ sau gây nhiễm với mức độ phá hủy đạt 10%. Tuy nhiên, chủng KTY-PRRS-02 có tốc độ hủy hoại nhanh hơn, đạt 85% diện tích ở 60 giờ và phá hủy hoàn toàn 100% bề mặt đáy bình ở 72 giờ. Trong khi đó, chủng KTY-PRRS-01 đạt 80% ở 60 giờ và đến 84 giờ mới đạt 100% CPE trước khi tế bào bong tróc hoàn toàn ở 96 giờ.

2. Hiệu giá virus đạt mức rất cao: Hiệu giá TCID50/25µl của chủng KTY-PRRS-02 đạt 3,16 x 10^6, cao hơn đáng kể so với chủng KTY-PRRS-01 đạt 1,74 x 10^6. Động học nhân bản cho thấy hàm lượng virus giải phóng tự do ngoài môi trường tế bào luôn vượt trội lượng virus tồn tại bên trong tế bào. Lượng virus nội bào của chủng KTY-PRRS-02 đạt đỉnh ở 60 giờ và KTY-PRRS-01 đạt đỉnh ở 72 giờ với giá trị log TCID50 đạt mức 5,5.

3. Đặc điểm phân tử gen ORF5 và ORF7: Đoạn gen ORF5 dài 603 bp mã hóa 200 amino acid của GP5, trong khi gen ORF7 dài 372 bp mã hóa 123 amino acid của protein N. Mức độ tương đồng nucleotide giữa hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đạt 98,58% ở gen ORF7 và 98,03% ở gen ORF5. Tương đồng về amino acid tương ứng lần lượt là 96,32% và 95,04%.

4. Quan hệ di truyền gần gũi với dòng độc lực cao Trung Quốc: So sánh với các chủng tham chiếu quốc tế, mức độ tương đồng nucleotide gen ORF5 dao động từ 85,12% đến 99,42% và amino acid từ 84,36% đến 98,80%. Cây sinh học phân tử khẳng định cả hai chủng phân lập đều thuộc PRRS Genotype 2 (Bắc Mỹ), nằm chung nhánh tiến hóa với các chủng PRRS độc lực cao của Trung Quốc (như JXA1, GD) với độ tương đồng nucleotide vượt trên 98,5%.

Thảo luận kết quả

Khi xem xét dữ liệu qua biểu đồ đường cong sinh trưởng, sự phân tách rõ nét giữa lượng virus ngoại bào và nội bào theo thời gian từ 12 đến 96 giờ giúp xác định chính xác thời điểm thu hoạch kháng nguyên tối ưu là từ 60 đến 84 giờ sau gây nhiễm. Đồng thời, bảng ma trận so sánh các vị trí đột biến amino acid trên protein GP5 cho thấy có sự thay đổi tại các vùng epitope trung hòa, giải thích sự khác biệt về độc lực và tính sinh miễn dịch giữa các chủng thực địa với chủng vắc-xin cổ điển VR-2332 (vốn có độ tương đồng nucleotide ORF5 chỉ đạt khoảng 88,2% đến 89,2%).

Tốc độ gây bệnh tích tế bào cực nhanh của chủng KTY-PRRS-02 (đạt 100% ở 72 giờ) hoàn toàn tương thích với bệnh cảnh lâm sàng nghiêm trọng tại Nghệ An năm 2011, nơi dịch bệnh làm chết và tiêu hủy 11.816 con lợn (chiếm 99,64% tổng số lợn mắc bệnh của tỉnh). Mức tương đồng di truyền trên 98% giữa KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 với chủng JXA1 cho thấy virus tai xanh lưu hành tại miền Bắc Việt Nam bắt nguồn từ các đợt xâm nhập của dòng virus độc lực cao từ các nước láng giềng trong khu vực.

Thí nghiệm gây tối miễn dịch trên động vật đã chứng minh các kháng nguyên tinh chế từ hai chủng virus đều kích thích cơ thể thỏ và chuột lang sản sinh hàm lượng kháng thể kháng PRRSV đặc hiệu cao, xác nhận qua phản ứng IPMA dương tính rõ rệt sau 14 ngày tiêm nhắc lại mũi 2 với liều 20 µg kháng nguyên.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học thu được, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp trọng tâm nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh tai xanh:

1. Ứng dụng chủng KTY-PRRS-02 sản xuất vắc-xin thế hệ mới: Đề nghị các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y tiếp nhận chủng KTY-PRRS-02 (có hiệu giá 3,16 x 10^6 TCID50/25µl) để tiến hành nhược độc hóa qua 80 đến 92 đời tiếp truyền trên tế bào Marc-145, hướng tới tạo ra dòng vắc-xin nhược độc đông khô có tỷ lệ tương đồng kháng nguyên trên 98% với các chủng thực địa trong giai đoạn 2026-2028.

2. Tiêu chuẩn hóa quy trình chẩn đoán phân tử bằng kỹ thuật RT-PCR: Cục Thú y và các Chi cục Thú y vùng cần áp dụng bộ mồi đặc hiệu khuếch đại gen ORF5 (kích thước 720 bp) và ORF7 (kích thước 372 bp) đã được tối ưu hóa trong nghiên cứu này để chẩn đoán phát hiện nhanh PRRSV trong vòng 4 đến 6 giờ với độ nhạy đạt trên 95%.

3. Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ: Đơn vị quản lý dịch tễ cần tổ chức lấy mẫu và giải trình tự gen ORF5 tối thiểu 100 mẫu bệnh phẩm mỗi năm tại các vùng chăn nuôi trọng điểm miền Bắc và miền Trung, nhằm kịp thời phát hiện các đột biến tái tổ hợp vượt ngưỡng 2% nucleotide so với các chủng chuẩn KTY-PRRS.

4. Sử dụng làm chủng chuẩn phục vụ kiểm nghiệm công cường độc: Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương cần đưa hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 vào danh mục chủng virus chuẩn quốc gia dùng để công cường độc đánh giá hiệu lực bảo hộ (yêu cầu đạt tỷ lệ sống trên 80%) đối với tất cả các loại vắc-xin PRRS nhập khẩu và sản xuất trong nước trước khi cấp phép lưu hành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Chuyên gia nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Bệnh lý học Thú y, Vi sinh vật học: Khai thác quy trình nuôi cấy, tách chiết kháng nguyên và dữ liệu phát sinh loài làm học liệu giảng dạy chuyên sâu bậc đại học và sau đại học.

2. Các nhà phát triển sản phẩm tại các công ty sản xuất vắc-xin và chế phẩm sinh học thú y: Ứng dụng thông số động học nhân bản (đạt đỉnh ở 60-84 giờ) và kỹ thuật tinh chế gradient đường nồng độ 10% đến 60% để tối ưu hóa quy trình lên men công nghiệp và bào chế kháng thể đạt chuẩn.

3. Cán bộ thú y, chuyên viên phòng chống dịch tại các cơ quan quản lý nhà nước: Tham khảo dữ liệu dịch tễ học phân tử và đặc tính biến dị của các chủng PRRSV type 2 Bắc Mỹ để xây dựng chiến lược phòng trừ dịch bệnh tai xanh cục bộ và liên vùng hiệu quả.

4. Học viên cao học và sinh viên ngành Chăn nuôi - Thú y, Công nghệ Sinh học: Sử dụng như một công trình mẫu mực về phương pháp luận kết hợp giữa vi sinh vật học cổ điển (TCID50, CPE, IPMA) và sinh học phân tử hiện đại (RT-PCR, Sanger sequencing, MEGA6).

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 thuộc kiểu gen nào và có nguồn gốc từ đâu? Hai chủng virus nghiên cứu thuộc Genotype 2 (dòng Bắc Mỹ), nằm chung nhánh phát sinh loài với các chủng virus PRRS độc lực cao tại Trung Quốc như JXA1. Mẫu được phân lập từ ổ dịch gây chết nhiều lợn nái mang thai tại Thái Bình và Nghệ An vào năm 2013.

2. Hiệu giá virus của hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đạt mức bao nhiêu trên tế bào Marc-145? Hiệu giá virus đo được của chủng KTY-PRRS-01 đạt 1,74 x 10^6 TCID50/25µl và chủng KTY-PRRS-02 đạt 3,16 x 10^6 TCID50/25µl. Cả hai chủng đều biểu hiện khả năng nhân lên mạnh mẽ trên tế bào nuôi cấy liên tục.

3. Thời điểm nào thích hợp nhất để thu hoạch virus PRRS đạt hiệu giá cao nhất trong nuôi cấy? Động học nhân bản chỉ ra hàm lượng virus giải phóng ngoài tế bào đạt đỉnh cao nhất trong khoảng từ 60 giờ đến 84 giờ sau khi gây nhiễm, tương ứng thời điểm bệnh tích tế bào (CPE) đạt từ 80% đến 100%.

4. Mức độ tương đồng về chuỗi gen ORF5 và ORF7 giữa hai chủng nghiên cứu là bao nhiêu? Mức độ tương đồng về nucleotide đạt 98,58% ở gen ORF7 và 98,03% ở gen ORF5. Về chuỗi amino acid tương ứng, độ tương đồng đạt 96,32% đối với protein N và 95,04% đối với protein GP5.

5. Vì sao các vắc-xin cổ điển như chủng VR-2332 lại giảm hiệu quả bảo hộ trước các chủng PRRS thực địa hiện nay? Do mức độ tương đồng nucleotide ở gen ORF5 giữa các chủng thực địa KTY-PRRS với chủng cổ điển VR-2332 chỉ đạt khoảng 85,12% đến 89,20%, dẫn đến sự sai khác cấu trúc kháng nguyên bề mặt GP5 làm giảm khả năng nhận diện của kháng thể trung hòa.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã cung cấp những luận cứ khoa học xác thực và toàn diện về hai chủng virus tai xanh KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 với 5 kết luận chính:

• Phân lập thành công và xác định hai chủng virus gây bệnh tích tế bào đặc trưng trên tế bào Marc-145 từ 36 giờ, đạt 100% CPE ở 72 đến 84 giờ.
• Xác định hiệu giá virus ở mức cao đạt từ 1,74 x 10^6 đến 3,16 x 10^6 TCID50/25µl, với lượng virus ngoại bào chiếm ưu thế.
• Giải mã thành công đoạn gen ORF5 (603 bp mã hóa 200 aa) và ORF7 (372 bp mã hóa 123 aa), xác định độ tương đồng nucleotide nội bộ đạt trên 98%.
• Khẳng định 02 chủng virus thuộc Genotype 2 (Bắc Mỹ), có quan hệ di truyền rất gần gũi với nhóm virus PRRS độc lực cao Trung Quốc.
• Chứng minh khả năng sinh kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên virus trên động vật thí nghiệm qua kỹ thuật IPMA sau 2 lần gây miễn dịch liều 20 µg.

Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới, các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung nhược độc hóa chủng KTY-PRRS-02 để thử nghiệm sản xuất vắc-xin quy mô thử nghiệm. Hãy kết nối với các cơ sở nghiên cứu thú y uy tín để tiếp cận nguồn dữ liệu gen chuẩn và tối ưu hóa giải pháp phòng chống dịch PRRS ngay hôm nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01 VÀ KTY-PRRS-02 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc i c LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Thị Lan người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của cô mà luận văn của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc ii c MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục…. iii Danh mục chữ viết tắt.

v Danh mục bảng. vi Danh mục hình .vii Trích yếu luận văn .viii Thesis Abstract. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI.

Mục tiêu chung. Mục tiêu cụ thể. PHẠM VI NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI. Ý nghĩa khoa học của đề tài.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới.

Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS. Cấu trúc virus PRRS. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS.

Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01, KTY-PRRS-02. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01, KTY-PRRS-02.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp nuôi cấy tế bào. Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào. Phương pháp xác định TCID50.

Phương pháp xác định sự nhân lên của virus. Phương pháp RT – PCR. Phương pháp giải trình tự gene. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein.

Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ. Phương pháp IPMA. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả nghiên cứu xác định sự nhân lên của 02 chủng virus KTY- PRRS-01 và KTY-PRRS-02.

Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả phản ứng RT-PCR. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu.

Kết quả truy cập ngân hàng gene. So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu. So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 73 iv c DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào một lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ giữa số lượng virus và số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở trong hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) v c DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Protein cấu trúc của PRRSV.

Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02 và chủng virus vắc-xin. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS.

Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS lần 2. Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của chuột và thỏ thí nghiệm. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 giữa các chủngvirus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu.

Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%). Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%).

Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%). Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%). 60 vi c DANH MỤC HÌNH Hình 2. Hình thái virus PRRS.

Hình ảnh cấu trúc hệ gene của virus PRRS. Tế bào Marc 145 không gây nhiễm virus. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01.

Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02. Bệnh tích tế bào sau 84 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-01.

Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-02. Đối chứng tế bào. Phản ứng IPMA dương tính. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) và ORF5 (hình B).

Kết quả so sánh trình tự gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả so sánh trình tự gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu.

Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. 64 vii c TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Tên Luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02”. Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Mục đích của luận văn nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu như:sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu quả bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử.

Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Máy PCR, thiết bị điện di, máy giải trình tự gene. Môi trường nuôi cấy tế bào, tế bào Marc 145, bộ kít tách chiết RNA, bộ kít RT-PCR, bộ kít giải trình tự gene, kit BCA.