Nghiên cứu đặc tính sinh học virus hoại tử thần kinh và ứng dụng tạo kháng nguyên tái tổ hợp sản xuất vắc xin cho cá mú

LỜI CAM ĐOAN

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú

1.2. Hệ thống phân loại cá mú

1.3. Đặc điểm phân bố

1.4. Đặc điểm sinh trưởng

1.5. Đặc điểm sinh sản

1.6. Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú

1.7. Ý nghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú

1.8. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam

1.8.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển

1.8.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới

1.8.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam

1.8.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá

1.9. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh

1.10. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

1.11. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá

1.11.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh

1.11.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới

1.11.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú

2.3.1.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu

2.3.1.2. Phương pháp mô bệnh học

2.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào

2.3.1.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

2.3.1.5. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

2.3.1.6. Điện di axit nucleic trên gel agarose

2.3.1.7. Phương pháp tách dòng gen

2.3.1.8. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV)

2.3.1.9. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1

2.3.1.10. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú

2.3.1.11. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1

2.3.1.12. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú

2.3.2. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp

2.3.2.1. Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen

2.3.2.2. Nối gen T4 vào vector pET32a+

2.3.2.3. Chuyển gen vào E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4

2.3.2.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn

2.3.2.5. Phương pháp điện di SDS-PAGE

2.3.2.6. Phương pháp Western blot

2.3.2.7. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp

2.3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam

3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học

3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR

3.1.3. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào

3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV

3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú

3.2.1. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào

3.2.2. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú

3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1

3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú

3.3. Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4

3.3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh

3.3.2.1. Tạo chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV

3.3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp

3.3.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh

3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp

3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp

3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ

3.3.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Đặc tính sinh học của virus hoại tử thần kinh

Nghiên cứu tập trung vào đặc tính sinh học của virus hoại tử thần kinh (NNV) trên cá mú. Virus này thuộc họ Betanodavirus, gây bệnh hoại tử thần kinh (VNN) với tỷ lệ tử vong cao từ 80-100%. Cá bị nhiễm bệnh thường có biểu hiện rối loạn thần kinh như bơi mất thăng bằng, đầu chúc xuống, hoặc nằm dưới đáy bể. Nghiên cứu đã xác định được virus hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam thông qua các phương pháp mô bệnh học và RT-PCR. Đặc biệt, virus này có khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và cá mú, đồng thời chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi trường.

1.1. Khả năng gây bệnh của virus

Virus NNV có khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và cá mú. Thí nghiệm cho thấy, virus gây hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) rõ rệt trên tế bào GS1. Trên cá mú, virus gây tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt ở nhiệt độ 28°C. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của virus, với nhiệt độ tối ưu từ 24-30°C.

1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của virus hoại tử thần kinh. Thí nghiệm cho thấy, virus hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 28°C, trong khi ở nhiệt độ thấp hơn (24°C), khả năng gây bệnh giảm đáng kể. Điều này phù hợp với tình hình dịch bệnh thường xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10 tại Việt Nam, khi nhiệt độ nước dao động từ 24-30°C.

II. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp

Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 từ virus hoại tử thần kinh. Kháng nguyên này được biểu hiện trong tế bào E. coli BL21(DE3) và tinh sạch bằng phương pháp SDS-PAGE. Protein T4 tái tổ hợp có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch trên cá mú, tạo tiền đề cho việc sản xuất vắc-xin cho cá mú. Đây là lần đầu tiên tại Việt Nam, một kháng nguyên tái tổ hợp từ virus NNV được tạo ra và đánh giá hiệu quả.

2.1. Quy trình tạo kháng nguyên

Quy trình tạo kháng nguyên tái tổ hợp bao gồm các bước: thiết kế vector pET32a+-T4, chuyển gen vào E. coli BL21(DE3), biểu hiện protein T4, và tinh sạch kháng nguyên. Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot cho thấy protein T4 tái tổ hợp có độ tinh khiết cao và khả năng kích thích miễn dịch mạnh.

2.2. Đánh giá hiệu quả miễn dịch

Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 được đánh giá khả năng kích thích miễn dịch trên cá mú. Kết quả cho thấy, cá được tiêm kháng nguyên tái tổ hợp có hiệu giá kháng thể trung hòa virus cao, đạt mức bảo hộ đến ngày thứ 90 sau tiêm. Điều này chứng minh tiềm năng của kháng nguyên tái tổ hợp trong việc sản xuất vắc-xin cho cá mú.

III. Ứng dụng trong sản xuất vắc xin

Nghiên cứu đã mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất vắc-xin cho cá mú từ kháng nguyên tái tổ hợp protein T4. Vắc-xin này có tiềm năng lớn trong việc phòng bệnh hoại tử thần kinh, giảm thiểu thiệt hại kinh tế trong ngành nuôi cá mú. Đây là bước đột phá trong nghiên cứu bệnh học thủy sản tại Việt Nam, góp phần phát triển bền vững nghề nuôi cá mú.

3.1. Tiềm năng của vắc xin

Vắc-xin từ kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 có khả năng kích thích miễn dịch mạnh, giúp cá mú chống lại virus hoại tử thần kinh. Nghiên cứu cho thấy, cá được tiêm vắc-xin có tỷ lệ sống sót cao hơn đáng kể so với cá không được tiêm. Điều này chứng minh tiềm năng lớn của vắc-xin trong việc kiểm soát dịch bệnh.

3.2. Ý nghĩa kinh tế

Việc sản xuất thành công vắc-xin cho cá mú từ kháng nguyên tái tổ hợp sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh hoại tử thần kinh gây ra, tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững ngành thủy sản. Đây là bước tiến quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất vắc-xin tại Việt Nam.

Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Virus Gây Hoại Tử Thần Kinh Và Ứng Dụng Tạo Kháng Nguyên Tái Tổ Hợp Sản Xuất Vắc Xin Phòng Bệnh Cho Cá Mú