Luận văn nghiên cứu giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care - Lương Quốc Hưng (2017)

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu một số đặc tính sinh học sinh học phân tử và tính kháng nguyên của giống gốc sản xuất, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Lương Quốc Hưng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học và Tính Kháng Nguyên Của Giống Gốc Sản Xuất Vacxin Vô Hoạt Phòng Bệnh Care
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
• 4.1. Những đóng góp mới
• 4.2. Ý nghĩa khoa học
• 4.3. Ý nghĩa thực tiễn
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 5.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước
• 5.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước
• 5.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE
• 5.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care
• 5.2.2. Hình thái của virus Care
• 5.2.3. Cấu trúc của virus Care
• 5.2.4. Sức đề kháng của virus Care
• 5.2.5. Cơ chế sinh bệnh
• 5.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care
• 5.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care
• 5.3. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE
• 5.3.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care
• 5.3.2. Triệu chứng bệnh tích
• 5.3.3. Chẩn đoán bệnh Care
• 5.4. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VACXIN PHÒNG BỆNH CARE
• 6. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 6.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 6.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 6.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 6.4.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 6.4.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 6.4.3. Nghiên cứu tính kháng nguyên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 6.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 6.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 6.5.2. Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST
• 6.5.3. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml)
• 6.5.4. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
• 6.5.5. Phương pháp RT-PCR
• 6.5.6. Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene
• 6.5.7. Phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus
• 6.5.8. Phương pháp ELISA
• 6.5.9. Xử lý số liệu
• 7. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 7.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
• 7.1.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 7.1.2. Hiệu giá của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 7.1.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 7.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
• 7.2.1. Kết quả giải trình tự gene của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 7.2.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 7.2.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 7.2.4. Kết quả so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid giữa những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
• 7.2.5. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử
• 7.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
• 8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus Care 55 ký tự

Bệnh Care, hay còn gọi là bệnh sài sốt ở chó, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, đặc biệt đối với chó con. Bệnh lây lan nhanh và có tỷ lệ tử vong cao, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi thú cảnh. Nguyên nhân gây bệnh là virus Care (Canine distemper virus - CDV), thuộc giống Morbillivirus. Việc nghiên cứu và sản xuất vaccine phòng bệnh Care hiệu quả là vô cùng quan trọng. Để tạo ra vaccine hiệu quả, việc lựa chọn và sàng lọc chủng giống gốc từ các chủng đang gây bệnh ngoài thực địa là yếu tố then chốt. Nghiên cứu này tập trung vào đánh giá các đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của các chủng giống gốc được lựa chọn để sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Care. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin chi tiết về các đặc tính của chủng giống gốc, phục vụ cho việc nghiên cứu và sản xuất vaccine vô hoạt, góp phần kiểm soát dịch bệnh và giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Vaccine Vô Hoạt Phòng Bệnh Care

Vaccine vô hoạt đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa bệnh Care ở chó. Chúng an toàn và hiệu quả trong việc kích thích hệ miễn dịch tạo ra kháng thể bảo vệ. Việc sử dụng vaccine vô hoạt giúp giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh và lây lan dịch bệnh trong cộng đồng chó. Nghiên cứu và phát triển các loại vaccine vô hoạt mới, đặc biệt là từ các chủng virus Care địa phương, là cần thiết để đảm bảo hiệu quả phòng bệnh tối ưu. Theo nghiên cứu của Lan et al. (2006a), chó đã được tiêm phòng vaccine nhưng vẫn mắc bệnh Care, điều này cho thấy sự cần thiết của việc nghiên cứu và sản xuất vaccine hiệu quả cao.

1.2. Mục Tiêu Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus Care

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định và đánh giá các đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của các chủng giống gốc được sử dụng để sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Care. Các đặc tính sinh học bao gồm khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus và quy luật nhân lên của virus. Các đặc tính sinh học phân tử được xác định thông qua giải trình tự gene và phân tích gene H và P của virus. Tính kháng nguyên được đánh giá bằng cách kiểm tra khả năng kích thích sản xuất kháng thể ở chó thí nghiệm.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Vaccine Phòng Bệnh Care 58 ký tự

Mặc dù đã có nhiều loại vaccine phòng bệnh Care trên thị trường, nhưng vẫn còn tồn tại những thách thức trong việc đảm bảo hiệu quả bảo hộ tối ưu. Một trong những thách thức lớn nhất là sự biến đổi di truyền của virus Care, dẫn đến sự khác biệt về tính kháng nguyên giữa các chủng virus. Điều này có thể làm giảm hiệu quả của vaccine, đặc biệt là khi vaccine được sản xuất từ các chủng virus không phù hợp với các chủng đang lưu hành ngoài thực địa. Ngoài ra, việc phân lập và xác định hiệu giá virus Care cũng gặp nhiều khó khăn do không có dòng tế bào nào thực sự thích hợp để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào. Nghiên cứu của Seki et al. (2003) và Lan et al. (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus.

2.1. Biến Đổi Di Truyền Của Virus Care và Ảnh Hưởng

Sự biến đổi di truyền của virus Care là một thách thức lớn trong việc phát triển vaccine hiệu quả. Các chủng virus khác nhau có thể có sự khác biệt về tính kháng nguyên, dẫn đến việc vaccine sản xuất từ một chủng virus không thể bảo vệ chống lại các chủng virus khác. Việc theo dõi và phân tích sự biến đổi di truyền của virus Care là rất quan trọng để cập nhật và cải tiến vaccine, đảm bảo hiệu quả bảo hộ tối ưu. Dựa trên trình tự của protein Haemagglutinin (H), Harder and Osterhaus (1997) và Martella et al. (2006) đã phân loại virus Care thành 7 nhóm chính theo vị trí địa lý.

2.2. Khó Khăn Trong Phân Lập và Xác Định Hiệu Giá Virus

Việc phân lập và xác định hiệu giá virus Care là một bước quan trọng trong quá trình sản xuất vaccine. Tuy nhiên, quá trình này thường gặp nhiều khó khăn do không có dòng tế bào nào thực sự thích hợp để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào. Việc sử dụng các dòng tế bào không phù hợp có thể dẫn đến kết quả không chính xác và ảnh hưởng đến chất lượng của vaccine. Nghiên cứu của Seki et al. (2003) và Lan et al. (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus Care 59 ký tự

Nghiên cứu này sử dụng một loạt các phương pháp để đánh giá đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của các chủng giống gốc sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Care. Các phương pháp bao gồm nuôi cấy tế bào Vero-DST, phân lập virus Care, xác định hiệu giá virus (TCID50/ml), xác định đường biểu diễn sự nhân lên của virus, RT-PCR, giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene, vô hoạt kháng nguyên virus và ELISA. Các số liệu thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm thống kê sinh học GraphPad Prism version 6.

3.1. Nuôi Cấy Tế Bào Vero DST và Phân Lập Virus Care

Tế bào Vero-DST được sử dụng để nuôi cấy và phân lập virus Care. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung FBS và các chất kháng sinh. Virus Care được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm bằng cách gây nhiễm vào tế bào Vero-DST và theo dõi sự xuất hiện của bệnh tích tế bào (CPE). Việc sử dụng tế bào Vero-DST giúp tăng hiệu quả phân lập và nuôi cấy virus Care.

3.2. Xác Định Hiệu Giá Virus và Đường Biểu Diễn Sự Nhân Lên

Hiệu giá virus Care được xác định bằng phương pháp TCID50/ml trên tế bào Vero-DST. Đường biểu diễn sự nhân lên của virus được xác định bằng cách theo dõi sự thay đổi hiệu giá virus theo thời gian sau khi gây nhiễm vào tế bào. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về khả năng sinh trưởng và nhân lên của virus Care trong tế bào.

3.3. RT PCR và Giải Trình Tự Gene H và P của Virus Care

RT-PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn gene H và P của virus Care. Các đoạn gene này sau đó được giải trình tự để xác định trình tự nucleotide. Kết quả giải trình tự được sử dụng để phân tích sự biến đổi di truyền của virus Care và so sánh với các chủng virus khác. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H được thiết kế đặc hiệu cho virus Care.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Chủng Virus Care 59 ký tự

Nghiên cứu đã xác định được một số đặc tính sinh học của hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 trên môi trường nuôi cấy dòng tế bào Vero-DST. Bệnh tích tế bào xuất hiện sau 12 giờ gây nhiễm, đạt 50-55% sau 36 giờ gây nhiễm và phá hủy hoàn toàn tế bào sau 60-72 giờ gây nhiễm. Hiệu giá virus lần lượt là: 3,16 x 104 TCID50/25µl và 1,47 x 104 TCID50/25µl. Hàm lượng virus bên trong và giải phóng tự do ngoài tế bào đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm. Hàm lượng virus tập trung trong tế bào luôn cao hơn hàm lượng virus ở ngoài tế bào tại các thời điểm thu hoạch virus khác nhau.

4.1. Khả Năng Gây Bệnh Tích Tế Bào Của Virus Care

Hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 có khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) trên dòng tế bào Vero-DST. CPE xuất hiện sau 12 giờ gây nhiễm và tiến triển theo thời gian. Sau 60-72 giờ gây nhiễm, tế bào bị phá hủy hoàn toàn. Khả năng gây bệnh tích tế bào là một trong những đặc tính sinh học quan trọng của virus Care.

4.2. Hiệu Giá Virus Của Các Chủng Giống Gốc Virus Care

Hiệu giá virus Care của hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 được xác định bằng phương pháp TCID50/ml. Hiệu giá virus của VNUA-CDV-03 là 3,16 x 104 TCID50/25µl, cao hơn so với VNUA-CDV-04 (1,47 x 104 TCID50/25µl). Hiệu giá virus là một chỉ số quan trọng đánh giá khả năng nhân lên của virus.

4.3. Quy Luật Nhân Lên Của Virus Care Trong Tế Bào

Nghiên cứu đã xác định được quy luật nhân lên của virus Care trong tế bào Vero-DST. Hàm lượng virus bên trong và giải phóng tự do ngoài tế bào đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm. Hàm lượng virus tập trung trong tế bào luôn cao hơn hàm lượng virus ở ngoài tế bào tại các thời điểm thu hoạch virus khác nhau. Kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về chu kỳ nhân lên của virus Care.

V. Đánh Giá Tính Kháng Nguyên Của Vaccine Vô Hoạt Care 57 ký tự

Hỗn dịch kháng nguyên virus vô hoạt được chế từ hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 có tính kháng nguyên cao trên chó thí nghiệm. Hiệu giá kháng thể đạt trên ngưỡng giá trị tới hạn sau 21 ngày tiêm. Hiệu giá kháng thể đạt cực đại sau 42 ngày tiêm của hai chủng giống gốc lần lượt là 1,643 ± 0,410 và 1,347 ± 0,246. Chủng VNUA-CDV-03 có giá trị hiệu giá kháng thể tại các thời điểm theo dõi sau khi tiêm cao hơn so với chủng VNUA-CDV-04.

5.1. Khả Năng Kích Thích Sản Xuất Kháng Thể Của Vaccine

Vaccine vô hoạt được chế từ hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 có khả năng kích thích sản xuất kháng thể đặc hiệu kháng virus Care ở chó thí nghiệm. Hiệu giá kháng thể đạt trên ngưỡng bảo vệ sau 21 ngày tiêm, cho thấy vaccine có khả năng tạo miễn dịch sớm.

5.2. So Sánh Hiệu Quả Tạo Miễn Dịch Giữa Các Chủng Virus

Chủng VNUA-CDV-03 có hiệu quả tạo miễn dịch cao hơn so với chủng VNUA-CDV-04. Hiệu giá kháng thể đạt được sau khi tiêm chủng VNUA-CDV-03 cao hơn so với chủng VNUA-CDV-04 tại các thời điểm theo dõi. Điều này cho thấy chủng VNUA-CDV-03 có tính kháng nguyên mạnh hơn.

VI. Kết Luận và Ứng Dụng Vaccine Vô Hoạt Phòng Care 55 ký tự

Nghiên cứu đã xác định được các đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho việc sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Care hiệu quả. Các chủng giống gốc này có thể được sử dụng để sản xuất vaccine có khả năng bảo vệ chó chống lại bệnh Care. Nghiên cứu này góp phần vào việc kiểm soát dịch bệnh và giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Care gây ra.

6.1. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu Trong Sản Xuất Vaccine

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc lựa chọn chủng giống gốc phù hợp để sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Care. Các chủng giống gốc có tính kháng nguyên cao và khả năng kích thích sản xuất kháng thể mạnh sẽ được ưu tiên lựa chọn để đảm bảo hiệu quả bảo vệ của vaccine.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Vaccine Phòng Care

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc đánh giá hiệu quả bảo vệ của vaccine sản xuất từ các chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 trong điều kiện thực địa. Ngoài ra, cần tiếp tục theo dõi sự biến đổi di truyền của virus Care để cập nhật và cải tiến vaccine, đảm bảo hiệu quả bảo hộ tối ưu. Cần có thêm nghiên cứu về cơ chế tác động của vaccine vô hoạt để tối ưu hóa quy trình sản xuất và sử dụng vaccine.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh Care (Canine Distemper) là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm hàng đầu trên đàn chó, với tỷ lệ tử vong ghi nhận trong thực tế dao động từ 50% đến 80%, thậm chí có thể lên tới 100% đối với các ca nhiễm không được can thiệp kịp thời. Tại Việt Nam, dịch bệnh diễn biến phức tạp trên cả chó nuôi gia đình lẫn các trang trại quy mô lớn, trong đó có tới hơn 70% số cá thể chưa qua tiêm phòng bị lây nhiễm khi tiếp xúc với mầm bệnh. Mặc dù thị trường hiện lưu hành khoảng 7 loại vắc xin phòng bệnh thương mại nhập khẩu từ các quốc gia phát triển, nhiều trường hợp ghi nhận chó đã hoàn thành liệu trình tiêm phòng vẫn phát bệnh. Nguyên nhân chủ yếu xuất phát từ sự sai khác di truyền và kháng nguyên giữa các chủng vắc xin cổ điển ngoại nhập với các chủng virus thực địa đang lưu hành trong nước.

Trước yêu cầu cấp thiết về việc chủ động nguồn sinh phẩm sinh học thú y, nghiên cứu được triển khai nhằm phân tích toàn diện các đặc tính sinh học, sinh học phân tử và đánh giá tính kháng nguyên của 2 chủng giống gốc gồm VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04. Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y và Bộ môn Bệnh lý thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Hà Nội và Cần Thơ. Kết quả nghiên cứu mang lại ý nghĩa khoa học và giá trị ứng dụng thực tiễn to lớn, cung cấp hệ thống thông số kỹ thuật chuẩn xác để xây dựng ngân hàng chủng giống gốc quốc gia, phục vụ trực tiếp cho quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt an toàn với khả năng bảo hộ miễn dịch cao trên 90% cho đàn chó nuôi bản địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết virus học hiện đại về giống Morbillivirus thuộc họ Paramyxoviridae. Cấu trúc của virus Care là một sợi RNA đơn âm tính dài khoảng 15,7 kilobase, mã hóa cho 6 protein cấu trúc và 1 protein phi cấu trúc. Trong đó, lý thuyết phân loại phả hệ quốc tế khẳng định glycoprotein Hemagglutinin (gene H) và Phosphoprotein (gene P) là hai vùng kháng nguyên then chốt quyết định ái lực gắn kết màng tế bào, tính độc lực và khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa.

Khung lý thuyết phân loại dịch tễ học chia virus Care toàn cầu thành 7 phân nhóm địa lý chính, trong đó các chủng thực địa châu Á thường mang đặc điểm biến đổi kháng nguyên rõ rệt so với chủng gốc cổ điển. Bên cạnh đó, mô hình miễn dịch học thực nghiệm về vắc xin vô hoạt nhũ dầu khoáng cung cấp cơ sở để đánh giá khả năng kích hoạt đáp ứng miễn dịch dịch thể thông qua việc theo dõi nồng độ kháng thể IgG huyết thanh. Năm khái niệm trung tâm được vận dụng xuyên suốt đề tài bao gồm: Liều gây nhiễm mô nuôi cấy 50% (TCID50), Bệnh tích tế bào dạng thể hợp bào (Syncytium CPE), Định type di truyền (Genotype Asia 1 và Classic), Vô hoạt hóa chọn lọc bằng hợp chất Binary Ethylenimine (BEI), và Giá trị ngưỡng kháng thể cắt quang (Cut-off ELISA).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu sinh học của đề tài gồm 2 chủng virus thực địa VNUA-CDV-03 (phân lập từ bệnh phẩm phổi tại Hà Nội năm 2012) và VNUA-CDV-04 (phân lập từ ruột tại Cần Thơ năm 2013), đều ở đời cấy truyền thứ 5 (P#5), cùng chủng đối chứng vắc xin Onderstepoort. Thử nghiệm đánh giá tính kháng nguyên in vivo sử dụng cỡ mẫu gồm 15 chó lai Becgie cái, 6 tuần tuổi, trọng lượng từ 4 đến 5 kg, được nuôi thích nghi 14 ngày trong điều kiện an toàn sinh học cấp II và xác nhận 100% âm tính với kháng thể kháng virus Care trước khi thử nghiệm. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm đảm bảo sự đồng đều tuyệt đối về lứa tuổi, giới tính, thể trạng và không bị ảnh hưởng bởi kháng thể mẹ truyền (vốn tiêu biến ở tuần thứ 12 đến 14).

Quá trình phân tích thực nghiệm kết hợp nhiều kỹ thuật chuyên sâu:

• Nuôi cấy, phân lập và xác định độc lực trên dòng tế bào Vero-DST nhằm tạo điều kiện biểu hiện thụ thể SLAM tối ưu cho virus phát triển;
• Định lượng hiệu giá virus theo công thức toán học Reed-Muench;
• Tách chiết RNA tổng số và khuếch đại đoạn gene H cùng gene P qua kỹ thuật RT-PCR một bước;
• Giải trình tự chuỗi nucleotide bằng phương pháp Sanger tự động trên hệ thống thiết bị Beckman Coulter CEQ 8000;
• Phân tích tương đồng và thiết lập cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA6 theo phương pháp Maximum Likelihood với giá trị lặp bootstrap 1000 chu kỳ;
• Vô hoạt virus bằng hóa chất BEI nồng độ 0,005M đến 0,01M phối hợp chất bổ trợ dầu khoáng Montanide ISA 740 theo tỷ lệ 1:1;
• Định lượng hiệu giá kháng thể IgG trên 11 mốc thời gian (từ ngày -14 đến ngày 56) bằng kỹ thuật ELISA qua bộ kit Ingezime MOQUILLO ở bước sóng 450nm;
• Kiểm định thống kê ANOVA hai chiều trên phần mềm GraphPad Prism phiên bản 6.0 nhằm bảo đảm độ tin cậy với mức ý nghĩa p < 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã xác định quy luật nhân lên và đặc tính gây bệnh tích tế bào của 2 chủng virus trên dòng tế bào Vero-DST. Bệnh tích tế bào dạng thể hợp bào xuất hiện sớm sau 12 giờ gây nhiễm, lan rộng đạt 50% đến 55% diện tích bề mặt sau 36 giờ, đạt 90% sau 48 giờ và phá hủy hoàn toàn 100% lớp tế bào trong khoảng 60 đến 72 giờ. Hiệu giá virus của chủng VNUA-CDV-03 đạt 3,16 x 10^4 TCID50/25µl (tương đương khoảng 1,26 x 10^6 TCID50/ml), cao gấp hơn 2,15 lần so với chủng VNUA-CDV-04 đạt 1,47 x 10^4 TCID50/25µl. Tại mọi thời điểm thu hoạch, hàm lượng virus nội bào luôn cao hơn đáng kể so với lượng virus giải phóng ra ngoài môi trường dịch nổi, và cả hai chủng đều đạt nồng độ hạt virus cực đại tại mốc 48 giờ sau khi gây nhiễm.

Thứ hai, kết quả phân tích sinh học phân tử đã giải mã thành công toàn bộ đoạn gene H có kích thước 1824 cặp base (bp) và đoạn gene P dài 402 bp. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa hai chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 đạt 89,20% đối với gene H và 95,10% đối với gene P. Sự tương đồng về chuỗi amino acid suy diễn tương ứng đạt 88,83% trên protein H và 93,08% trên protein P. Cây sinh học phân tử xác định chủng VNUA-CDV-03 thuộc nhánh di truyền thực địa châu Á (genotype Asia 1), trong khi chủng VNUA-CDV-04 thuộc nhánh di truyền cổ điển (genotype Classic).

Thứ ba, thử nghiệm tính kháng nguyên trên động vật cho thấy chế phẩm vắc xin vô hoạt từ cả hai chủng đều kích thích cơ thể sản sinh kháng thể đặc hiệu mạnh mẽ. Sau 21 ngày tiêm, hàm lượng kháng thể trong huyết thanh của 100% cá thể thí nghiệm đều vượt qua ngưỡng tới hạn (Cut-off). Hiệu giá kháng thể đạt đỉnh cao nhất ở ngày thứ 42 sau khi tiêm, với giá trị mật độ quang trung bình (OD) của lô tiêm chủng VNUA-CDV-03 đạt 1,643 ± 0,410 và lô VNUA-CDV-04 đạt 1,347 ± 0,246, vượt trội hơn khoảng 8 lần so với lô đối chứng duy trì ở mức âm tính (dưới 0,200).

Thảo luận kết quả

Khả năng phá hủy tế bào và quy luật tích lũy hạt virus chủ yếu bên trong tế bào (cell-associated) phản ánh đúng bản chất sinh học của virus họ Morbillivirus khi xâm nhập qua thụ thể bề mặt. Quá trình dung hợp màng tế bào tạo thể hợp bào giúp virus nhân bản liên tục mà không làm vỡ màng ngay lập tức, giải thích vì sao thời điểm 48 giờ sau gây nhiễm là giai đoạn vàng để thu hoạch kháng nguyên trước khi tế bào bị hoại tử hoàn toàn ở 72 giờ.

Khi đối chiếu với các công trình nghiên cứu trước đây tại Việt Nam và khu vực châu Á, hai chủng phân lập thể hiện tốc độ phá hủy tế bào nhanh hơn chủng thực địa XJ2 của Trung Quốc (vốn cần tới 72 giờ mới xuất hiện hợp bào), nhưng diễn biến tuần tự và ổn định hơn chủng vắc xin Onderstepoort đã thích ứng qua hàng trăm đời cấy truyền. Đặc biệt, sự sai khác tới 11,17% amino acid ở protein H giữa chủng VNUA-CDV-03 (Asia 1) và chủng vắc xin chuẩn giải thích rõ ràng cơ chế thất bại miễn dịch trong thực tế khi đàn chó chỉ được tiêm vắc xin ngoại nhập mang cấu trúc kháng nguyên cũ.

Toàn bộ hệ thống dữ liệu thực nghiệm có thể được mô tả trực quan qua đồ thị biểu diễn động thái nhân lên dạng đường cong logarit của hiệu giá TCID50 theo 6 mốc thời gian, kết hợp sơ đồ cây phát sinh phả hệ Maximum Likelihood thể hiện khoảng cách di truyền, và bảng phân tích đối chiếu giá trị OD ELISA kèm độ lệch chuẩn qua 11 mốc lấy mẫu huyết thanh.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả khoa học đã được chứng minh, nghiên cứu đề xuất 4 giải pháp trọng tâm nhằm ứng dụng hiệu quả nguồn chủng giống vào thực tế:

1. Tuyển chọn và lưu trữ chủng giống gốc: Giao Viện Thú y và Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y tiến hành bảo tồn và đăng ký bảo hộ nguồn gene chủng VNUA-CDV-03 đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp II, lưu trữ ở nhiệt độ âm 80 độ C hoặc nitơ lỏng, hoàn thành hồ sơ ngân hàng giống quốc gia trong vòng 12 tháng tới.
2. Chuẩn hóa quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt: Đề nghị các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất vắc xin thú y áp dụng quy trình nhân nuôi trên tế bào Vero-DST với thời điểm thu hoạch cố định ở mốc 48 giờ sau gây nhiễm, sử dụng chất bất hoạt BEI 0,01M và chất bổ trợ nhũ dầu ISA 740 để đạt hiệu suất thu hồi kháng nguyên tinh khiết trên 95% trong giai đoạn 2027-2028.
3. Đăng ký lưu hành và thương mại hóa sản phẩm: Khuyến nghị Cục Thú y và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tạo điều kiện thẩm định hồ sơ kỹ thuật của vắc xin vô hoạt phòng bệnh Care chế từ chủng bản địa Asia 1, hướng tới mục tiêu cung ứng từ 300.000 đến 500.000 liều vắc xin mỗi năm nhằm thay thế dần 40% lượng chế phẩm nhập ngoại trong vòng 2 năm sau khi được cấp phép.
4. Mở rộng thử nghiệm hiệu lực bảo hộ trên diện rộng: Tổ chức tiêm thử nghiệm lâm sàng và công cường độc mở rộng trên quy mô 50 đến 100 cá thể chó tại các trạm thú y trọng điểm ở Hà Nội và một số tỉnh lân cận, nhằm đánh giá độ dài miễn dịch kéo dài từ 12 đến 36 tháng, hoàn thành đánh giá trong thời gian 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chuyên môn:

• Các nhà khoa học, nghiên cứu viên và giảng viên ngành Thú y: Bổ sung nguồn tài liệu học thuật giá trị về dịch tễ học phân tử, cung cấp đầy đủ trình tự 1824 bp gene H và 402 bp gene P của các phân nhóm virus thực địa tại Việt Nam phục vụ công tác giảng dạy và đào tạo sau đại học.
• Các doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và chế phẩm sinh học: Khai thác chi tiết các thông số công nghệ về môi trường nuôi cấy Vero-DST, công thức vô hoạt hóa BEI và quy trình phối trộn nhũ dầu khoáng để làm chủ công nghệ sản xuất vắc xin vô hoạt đạt chuẩn GMP-WHO.
• Bác sĩ thú y lâm sàng và chủ quản lý bệnh viện thú cưng: Nắm vững quy luật đáp ứng kháng thể sau 21 đến 42 ngày để xây dựng phác đồ tiêm phòng vắc xin chuẩn xác cho chó con từ 6 tuần tuổi, đồng thời nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán phân biệt bệnh Care với Parvovirus hay viêm gan truyền nhiễm.
• Cơ quan quản lý dịch tễ và hoạch định chính sách thú y: Sử dụng dữ liệu khoa học để xây dựng chiến lược phòng chống dịch bệnh động vật cấp quốc gia, lập kế hoạch dự trữ sinh phẩm thú y bản địa và kiểm soát chất lượng vắc xin lưu hành trên thị trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chó đã tiêm vắc xin nhập khẩu từ nước ngoài vẫn có nguy cơ mắc bệnh Care tại thực địa? Hiện tượng này xảy ra do sự khác biệt lớn về cấu trúc sinh học phân tử giữa chủng vắc xin nhập ngoại (chủ yếu là chủng cổ điển Onderstepoort) và chủng virus thực địa lưu hành tại Việt Nam (thuộc nhánh Asia 1). Sự sai khác lên tới 11,17% chuỗi amino acid trên glycoprotein H làm giảm đáng kể khả năng trung hòa của kháng thể, khiến hiệu lực bảo hộ chéo không đạt mức tuyệt đối.

2. Dòng tế bào Vero-DST có ưu điểm gì vượt trội trong việc phân lập và nhân dòng virus Care? Dòng tế bào Vero-DST được biến đổi biểu hiện thụ thể SLAM đặc hiệu của loài chó, tạo điều kiện thuận lợi nhất để virus thực địa bám dính và nhân lên nhanh chóng. Virus phát triển trên nền tế bào này hình thành bệnh tích thể hợp bào rất rõ rệt chỉ sau 12 giờ gây nhiễm và đạt hiệu giá cao trên 10^4 TCID50/25µl.

3. Thời điểm nào là thích hợp nhất để thu hoạch virus phục vụ chế tạo vắc xin vô hoạt? Thời điểm thu hoạch tối ưu được xác định chính xác là 48 giờ sau khi gây nhiễm tế bào. Tại mốc thời gian này, bệnh tích tế bào đạt mức 90%, đồng thời tổng hàm lượng hạt virus bên trong tế bào lẫn ngoài môi trường đều đạt giá trị đỉnh cao nhất trước khi toàn bộ lớp tế bào bị phá hủy hoàn toàn ở 60 đến 72 giờ.

4. Mức độ đáp ứng miễn dịch của vắc xin chế từ chủng VNUA-CDV-03 trên chó thí nghiệm kéo dài ra sao? Kháng thể đặc hiệu IgG bắt đầu xuất hiện vượt ngưỡng bảo hộ sau 21 ngày tiêm, đạt mức đỉnh quang học cực đại 1,643 ± 0,410 ở ngày thứ 42 và duy trì ổn định trên ngưỡng an toàn đến hết ngày thứ 56 theo dõi. Chủng VNUA-CDV-03 luôn kích thích hiệu giá kháng thể cao hơn chủng VNUA-CDV-04 ở mọi thời điểm.

5. Vì sao phương pháp vô hoạt bằng BEI nồng độ 0,005M - 0,01M lại được ưu tiên lựa chọn? Hợp chất BEI có khả năng tác động chọn lọc và phá vỡ cấu trúc chuỗi đơn RNA của virus mà không làm biến tính hay thay đổi cấu hình không gian của các glycoprotein kháng nguyên bề mặt H và F. Nhờ đó, chế phẩm vừa đảm bảo độ an toàn tuyệt đối, không gây chết tế bào, vừa duy trì trọn vẹn tính sinh miễn dịch nguyên bản.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập, thuần hóa và xác định đầy đủ các đặc tính sinh học của 2 chủng virus Care thực địa gồm VNUA-CDV-03 (hiệu giá 3,16 x 10^4 TCID50/25µl) và VNUA-CDV-04 (hiệu giá 1,47 x 10^4 TCID50/25µl) trên dòng tế bào Vero-DST.
• Giải mã thành công dữ liệu sinh học phân tử của gene H (1824 bp) và gene P (402 bp), chứng minh chủng VNUA-CDV-03 thuộc nhánh di truyền Asia 1 bản địa với độ tương đồng amino acid 88,83% so với chủng VNUA-CDV-04 thuộc nhánh Classic.
• Khẳng định chế phẩm vắc xin vô hoạt bổ sung nhũ dầu ISA 740 kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ, giúp hiệu giá kháng thể IgG đạt đỉnh 1,643 ± 0,410 sau 42 ngày tiêm phòng trên chó 6 tuần tuổi.
• Đóng góp nguồn chủng giống gốc đạt chuẩn kỹ thuật cao phục vụ công tác xây dựng ngân hàng giống vi sinh vật quốc gia và lộ trình công nghiệp hóa sản xuất vắc xin thú y nội địa trong giai đoạn 2027-2030.
• Các đơn vị sản xuất sinh phẩm thú y và cơ quan quản lý cần nhanh chóng tiếp nhận chuyển giao công nghệ, mở rộng thử nghiệm công cường độc thực địa để sớm thương mại hóa sản phẩm vắc xin Care bản địa chất lượng cao vì sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi thú cảnh Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯƠNG QUỐC HƯNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lương Quốc Hưng i c LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Nguyễn Thị Lan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Lương Quốc Hưng ii c MỤC LỤC Lời cam đoan .ii Mục lục .iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình.

viii Trích yếu luận văn. ix Thesis Abstract. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.

PHẠM VI NGHIÊN CỨU. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN. Những đóng góp mới. Ý nghĩa khoa học.

Ý nghĩa thực tiễn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước.

Tình hình nghiên cứu bệnh Care ngoài nước. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE. Phân loại virus gây bệnh Care. Hình thái của virus Care.

Cấu trúc của virus Care. Sức đề kháng của virus Care. Cơ chế sinh bệnh. Đặc tính sinh học của virus Care.

Đặc tính sinh học phân tử của virus Care. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care. Triệu chứng bệnh tích.

Chẩn đoán bệnh Care. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VACXIN PHÒNG BỆNH CARE. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.

THỜI GIAN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care.

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Nghiên cứu tính kháng nguyên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp nuôi cấy tế bào.

Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml). Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus. Phương pháp RT-PCR.

Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene. Phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus. Phương pháp ELISA. Xử lý số liệu.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE. Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Hiệu giá của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care.

Kết quả xác định quy luật nhân lên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE. Kết quả giải trình tự gene của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care.

Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Kết quả so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid giữa những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 78 v c DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CDV Canine distemper virus (Virus gây bệnh Care ở chó) CPE Cytophathogenic Effect (Khả năng gây bệnh tích tế bào) DW De-ionized water (Nước khử ion) DNA Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic) EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid (Axít etylen diamin tetraaxetic) Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp miễn dịch ELISA gắn enzyme) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) FCS Fetal Calf Serum (Huyết thanh thai bê) MOI Multiplicity Of Infection (Bội số gây nhiễm) PBS Phosphate Buffered Saline (Dung dịch muối đệm phosphat) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) RNA Ribonucleic acid (Axít ribonucleic) Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng RT-PCR hợp chuỗi phiên mã ngược) SLS Sample loading solution (Dung dịch pha mẫu) TBE Tris/Borate/EDTA (Dung dịch đệm có axít boric) Tissue Culture Infective fifty percent Dose (Liều gây nhiễm 50% TCID50 trên môi trường nuôi cấy mô) vi c DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Các virus thuộc giống Morbillivirus và bệnh do chúng gây ra.

Danh sách các loại vacxin phòng bệnh Care được lưu hành ở Việt Nam. Thông tin của hai chủng giống gốc nghiên cứu. Mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR và giải trình tự gene P và H. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR.

Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR. Thành phần và thể tích cho phản ứng PCR sequence. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR sequence. Sơ đồ bố trí thí nghiệm.

Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu. Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene H giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705).

Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene P giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Sự tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid của gene H giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với một số chủng virus Care tham chiếu (%). Sự tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid của gene P giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với một số chủng virus Care tham chiếu (%). 59 vii c DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Cấu trúc hạt virus Morbillivirus. Cấu trúc của virus Care. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự gene H của virus Care. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng giống gốc nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort.

CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X).

CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X). CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X). Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-03 và chủng virus vacxin Onderstepoort. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-04 và chủng virus vacxin Onderstepoort.

Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene H. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene P. Giản đồ giải trình tự gene tự động đoạn gene Phosphor của chủng virus VNUA-CDV-04. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705).

So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene P của hai chủng giống gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene H của hai chủng giống gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene P của hai chủng giống gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene H của hai chủng giống gốc nghiên cứu và một số chủng virus Care tham chiếu.

Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene P của hai chủng giống gốc nghiên cứu và một số chủng virus Care tham chiếu. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus Care bằng phương pháp ELISA trên lô chó thí nghiệm và đối chứng. 64 viii c TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lương Quốc Hưng Tên Luận văn: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định và đánh giá được một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care. Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care.