Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong chăn nuôi gia súc, đặc biệt là chăn nuôi lợn, thức ăn là yếu tố chiếm tỷ trọng chi phí lớn nhất, lên tới 70% tổng chi phí sản xuất và giữ vai trò quyết định đến giá thành cũng như chất lượng thương phẩm. Tại Việt Nam, nguồn thức ăn chăn nuôi phụ thuộc rất lớn vào thị trường quốc tế; theo số liệu từ Tổng cục Thống kê và Cục Chăn nuôi năm 2014, lượng nguyên liệu thức ăn nhập khẩu chiếm tới 71,21%, tương đương khoảng 11,7 triệu tấn với tổng giá trị xấp xỉ 4,9 tỷ USD. Thực trạng này khiến ngành chăn nuôi trong nước phụ thuộc vào các doanh nghiệp ngoại, đẩy giá thành sản phẩm thịt lên cao và làm suy giảm năng lực cạnh tranh khi các hiệp định thương mại tự do như Hiệp định Đối tác xuyên Thái Bình Dương (TPP) được triển khai.

Mặt khác, nguồn thức ăn thô xanh trong nước tuy dồi dào về chủng loại nhưng mang tính thời vụ rõ rệt, thường thiếu hụt nghiêm trọng vào mùa đông do thời tiết khô hanh khiến cây cỏ kém phát triển. Trước đây, công nghệ chế biến thức ăn thô xanh chủ yếu là ủ chua truyền thống phục vụ gia súc nhai lại (trâu, bò), hoặc dùng chế phẩm vi sinh (EM, Viprotics, EVP) xử lý các nguồn phụ phẩm giàu tinh bột (ngô, cám gạo, bã bia, bã rượu, phụ phẩm cồn sắn) nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae và Bacillus spp. Để khắc phục sự phụ thuộc vào thức ăn công nghiệp nhập khẩu, một định hướng công nghệ được đặt ra là sử dụng chế phẩm sinh học có hoạt tính phân giải cellulose để lên men thức ăn thô xanh kết hợp với các phụ phẩm giàu protein (khô dầu đậu tương, vỏ và thân cây họ đậu) tạo thành thức ăn thô xanh dạng lỏng (Fermented Liquid Feed - FLF) cân đối dinh dưỡng cho lợn.

Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp tập trung vào đề tài: "Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lên men thức ăn thô xanh phục vụ chăn nuôi".

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài bao gồm:

  1. Sàng lọc các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào thủy phân cellulose và các hợp chất hữu cơ khác.
  2. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn được lựa chọn.
  3. Phân loại và định danh chủng vi khuẩn ưu tú dựa trên phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA.

Nhiệm vụ nghiên cứu được cụ thể hóa thành 3 nội dung:

  1. Nội dung 1: Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh.
  2. Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn đã tuyển chọn.
  3. Nội dung 3: Khuếch đại và phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng đã được tuyển chọn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 24 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose thuộc chi Bacillus và 3 chủng vi sinh vật kiểm định gồm Salmonella enterica ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 11105 và Bacillus cereus ATCC 11778, được cung cấp từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Không gian nghiên cứu: Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2016 đến tháng 06/2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên hệ thống lý thuyết về sinh học vi sinh vật, trọng tâm là các đặc tính sinh học của chi Bacillus theo khóa phân loại của Bergey (giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus). Các nghiên cứu trước đây chứng minh rằng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có những ưu điểm vượt trội khi sử dụng làm probiotic trong thức ăn chăn nuôi so với vi khuẩn lactic thông thường (Lactobacillus, Bifidobacterium). Cụ thể, Bacillus có khả năng sinh nội bào tử hình oval hoặc hình trụ, giúp vi khuẩn sống sót qua các điều kiện khắc nghiệt như sốc nhiệt độ (bào tử B. subtilis chịu được nhiệt độ 100°C trong 180 phút), khô hạn, nồng độ muối cao và độ acid của dịch vị dạ dày. Đồng thời, nhóm vi khuẩn này sản sinh hệ enzyme ngoại bào phong phú bao gồm amylase, protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase để cắt mạch các đại phân tử khó tiêu (tinh bột, protein, chất xơ) thành dạng hòa tan dễ hấp thu, cũng như sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn tự nhiên (subtilin, bacitracin, bacilomycin...) giúp ức chế vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa.

Hệ thống phương pháp thực nghiệm được triển khai đồng bộ:

  • Phương pháp giữ giống và nhân giống: Vi khuẩn được duy trì trên môi trường thạch nghiêng MPA ở 30°C trong 48 giờ, bảo quản định kỳ ở 2-4°C hoặc lưu giữ dài hạn trong glycerol 70% ở nhiệt độ -80°C. Quá trình nhân giống được thực hiện trên môi trường lỏng, nuôi lắc ở tốc độ 220 vòng/phút tại 30°C trong 24 giờ nhằm đạt mật độ tế bào 10^8 CFU/ml.
  • Phương pháp xác định hoạt tính catalase: Nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên bề mặt khuẩn lạc phát triển trên đĩa thạch và quan sát hiện tượng sủi bọt khí oxy.
  • Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào: Sử dụng kỹ thuật cấy chấm điểm trên đĩa thạch MPA bổ sung các cơ chất chuyên biệt:
    • Tinh bột tan 1% (w/v) để xác định amylase, hiện màu bằng dung dịch Lugol.
    • Casein 1% (w/v) để xác định protease, hiện màu bằng dung dịch acid trichloroacetic (TCA) 10% (w/v).
    • Carboxymethyl cellulose (CMC) để xác định cellulase, hiện màu bằng dung dịch Lugol.
    • Esculin 3 g/L kết hợp ferric ammonium citrate 0,2 g/L để xác định β-glucosidase.
    • Xylan 1% (w/v) để xác định xylanase, làm kết tủa nền cơ chất bằng ethanol trong 2-3 giờ. Đánh giá định tính thông qua sự xuất hiện và kích thước đường kính vòng phân giải (D-d, tính bằng cm).
  • Phương pháp khảo sát hoạt tính đối kháng: Ứng dụng kỹ thuật đục lỗ thạch với đường kính lỗ d = 0,9 cm trên môi trường cấy trang vi khuẩn kiểm định (S. enterica, E. coli, B. cereus). Bổ sung 0,1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus đã loại bỏ sinh khối bằng ly tâm (5000 vòng/phút trong 10 phút), giữ ở nhiệt độ lạnh từ 4-8 giờ cho chất ức chế khuếch tán, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ và đo đường kính vòng ức chế sinh trưởng.
  • Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa:
    • Quan sát hình thái khuẩn lạc trên môi trường MPA sau 24 và 48 giờ nuôi cấy; nhuộm Gram theo phương pháp nhuộm phức hợp (tím gentian, lugol, cồn 95%, fucsin) để quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quang học.
    • Xác định khả năng đồng hóa carbon trên môi trường khoáng cơ bản MK bổ sung 1% (w/v) từng nguồn đường riêng biệt (Myo-Inositol, Cellobiose, Maltose, Lactose, Arabinose, Glucose, Saccharose, Galactose, Mannose).
    • Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh: nuôi cấy ở các dải nhiệt độ (20, 30, 37, 40, 45, 50°C), dải pH ban đầu (từ 3,0 đến 10,0) và dải nồng độ muối NaCl (từ 1% đến 10%), xác định mật độ quang OD600nm trên máy quang phổ S-300 nano.
  • Phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp biến tính bằng lysozyme, proteinase K, SDS kết hợp CTAB và tinh sạch qua hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1 v/v). Khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi phổ biến 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1429R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′). Chu trình nhiệt phản ứng gồm: biến tính ban đầu 94°C trong 5 phút; 30 chu kỳ gồm biến tính 94°C trong 1,5 phút, gắn mồi 55°C trong 1,5 phút, kéo dài 72°C trong 2 phút; kéo dài kết thúc ở 72°C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLink™ DNA Purification và giải trình tự tự động trên máy ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer, sau đó so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank thông qua công cụ BLAST.

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu là các chỉ số thực nghiệm gốc thu nhận tại phòng thí nghiệm: đường kính vòng phân giải enzyme, đường kính vòng vô khuẩn, giá trị mật độ quang học OD600nm, ảnh chụp điện di gel agarose 1% và kết quả giải trình tự nucleotide.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần này làm rõ tính cấp thiết của đề tài trong bối cảnh chăn nuôi trong nước đang chịu sức ép chi phí thức ăn cao và sự cạnh tranh gay gắt từ sản phẩm thịt nhập khẩu khi gia nhập TPP. Tác giả phân tích tính thời vụ của thức ăn thô xanh tại Việt Nam, sự hạn chế của công nghệ ủ chua truyền thống chỉ dùng cho gia súc nhai lại, và sự phụ thuộc vào các nguồn thức ăn công nghiệp nhập khẩu. Luận văn đặt ra hướng tiếp cận sử dụng vi sinh vật tuyển chọn có hoạt tính phân giải cellulose để chế biến thức ăn thô xanh thành dạng lỏng cho lợn, từ đó xác lập các mục tiêu khoa học, đối tượng, phạm vi nghiên cứu và ý nghĩa ứng dụng thực tiễn của đề tài.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa toàn bộ các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến việc sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng (FLF) và ứng dụng chế phẩm probiotic chi Bacillus. Tác giả phân tích cơ sở phân loại học, cấu tạo hình thái, khả năng sinh nội bào tử và đặc tính dinh dưỡng của các loài phổ biến thuộc chi này như B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. pumilus, B. megaterium, B. polymyxa, B. cereus. Nội dung chương làm nổi bật các luận điểm khoa học chứng minh Bacillus là đối tượng thích hợp để sản xuất probiotic: hệ enzyme ngoại bào hoạt lực cao (protease, amylase, cellulase), khả năng chịu nhiệt của bào tử, khả năng tổng hợp kháng sinh polypeptide tự nhiên và khả năng chịu muối, chịu acid tốt. Tác giả dẫn chứng các kết quả ứng dụng thực tế của chế phẩm EM (Nhật Bản), probiotic LSP 122 trên heo con ở nước ngoài, cũng như các nghiên cứu tại Việt Nam của Đào Trọng Đạt (1962), Lã Văn Kính (1998), Nguyễn Thị Minh Chiến (2002), Tạ Thị Vịnh (2002) và đề tài cấp nhà nước của Trần Quốc Việt và cộng sự (2006-2009) về việc nâng cao tỷ lệ sinh trưởng từ 5-16% và giảm tỷ lệ tiêu chảy ở lợn.

Phần 3: Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc của 24 chủng vi khuẩn nghiên cứu mang ký hiệu từ TX1 đến TX24 và 3 chủng kiểm định nguồn gốc chuẩn ATCC từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Lên men. Tác giả lập danh mục cụ thể các hóa chất chính có xuất xứ từ Nhật Bản, Đức, Mỹ, Việt Nam và các trang thiết bị phân tích chuyên dụng (máy PCR Applied Biosystems, máy ly tâm Eppendorf, máy đo OD S-300 nano Optima, máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100-Avant). Toàn bộ quy trình thực nghiệm được trình bày chuẩn hóa từng bước, từ thao tác giữ giống, phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học, quy trình phản ứng nhuộm Gram, kỹ thuật đục lỗ thạch đánh giá khả năng đối kháng, các công thức môi trường khảo sát sinh lý (môi trường khoáng MK, môi trường bổ sung muối NaCl từ 1-10%), đến các bước thao tác tách chiết DNA bằng phenol:chloroform và thông số chu trình luân nhiệt PCR 16S rRNA.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận trình bày đầy đủ các số liệu thực nghiệm được xử lý logic qua ba nội dung nghiên cứu:

  • Sàng lọc ban đầu: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và phản ứng sinh hóa của 24 chủng vi khuẩn. Kết quả ghi nhận 20/24 chủng bắt màu Gram dương (+), 19/24 chủng có phản ứng catalase dương tính (+). Đối chiếu khóa phân loại xác định 19 chủng thuộc chi Bacillus.
  • Hoạt tính enzyme ngoại bào: Thử nghiệm định tính trên 5 loại cơ chất cho thấy hầu hết các chủng sinh enzyme ngoại bào. Tác giả lựa chọn 16 chủng có hoạt tính tương đối cao (TX1, TX3, TX4, TX6, TX9, TX12, TX13, TX14, TX15, TX16, TX17, TX18, TX21, TX22, TX23, TX24).
  • Hoạt tính đối kháng: Trong 16 chủng được khảo sát, có 14 chủng kháng ít nhất một chủng kiểm định và có 5 chủng kháng đồng thời cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh (S. enterica, E. coli, B. cereus). Kết hợp hai tiêu chí về hoạt lực enzyme và phổ đối kháng rộng, hai chủng TX4 và TX9 được chọn để nghiên cứu chuyên sâu.
  • Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của TX4 và TX9: Cả hai chủng đều là trực khuẩn Gram dương, tế bào đứng riêng rẽ; đồng hóa tốt Myo-Inositol, Cellobiose, Lactose, Arabinose, Galactose, Mannose và đồng hóa kém Maltose, Glucose, Saccharose. Hai chủng sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 37°C, pH ban đầu 6,0 và nồng độ muối NaCl 2%.
  • Định danh phân tử chủng TX9: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA thu được vạch kích thước chuẩn khoảng 1500 bp. Trình tự nucleotide sau khi giải mã có độ tương đồng 99% với loài Bacillus amyloliquefaciens trên GenBank, qua đó định danh chính thức chủng là Bacillus amyloliquefaciens TX9.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã định lượng cụ thể các chỉ tiêu sinh học và sinh hóa của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn qua hệ thống bảng số liệu thực nghiệm:

Ký hiệu chủng β-glucosidase (cm) Xylanase (cm) Cellulase (cm) Amylase (cm) Protease (cm) Đối kháng S. enterica Đối kháng B. cereus Đối kháng E. coli
TX4 2,2 - 3,5 2,4 2,2 Có (+) Có (+) Có (+)
TX9 2,1 4,0 2,4 2,2 2,2 Có (+) Có (+) Có (+)

Ghi chú: Giá trị đường kính vòng phân giải enzyme được tính bằng hiệu số (D - d, cm); dấu (-) là không phân giải.

Bảng số liệu cho thấy chủng TX4 có hoạt tính phân giải cellulose vượt trội với đường kính vòng thủy phân đạt 3,5 cm, trong khi chủng TX9 thể hiện phổ enzyme toàn diện hơn khi có thêm hoạt tính xylanase rất mạnh đạt 4,0 cm bên cạnh hoạt tính phân giải cellulose (2,4 cm), amylase (2,2 cm), protease (2,2 cm) và β-glucosidase (2,1 cm). Đồng thời, cả hai chủng đều có khả năng ức chế mạnh cả 3 chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi.

Về đặc điểm sinh lý sinh thái, các điều kiện sinh trưởng tối ưu của hai chủng TX4 và TX9 được xác định chi tiết:

  • Nhiệt độ nuôi cấy: Sinh trưởng tốt trong dải 30-45°C, sinh trưởng mạnh nhất ở 37°C (mức nhiệt độ này rất gần với nhiệt độ sinh lý cơ thể lợn sau cai sữa là 38,5°C), kém sinh trưởng ở 20°C và 50°C.
  • Độ pH môi trường: Chủng TX4 sinh trưởng ở dải pH 5,0-9,0, đạt mật độ quang tối đa tại pH 6,0 với OD600nm = 1,36; chủng TX9 sinh trưởng ở dải pH 5,0-8,0, tối ưu tại pH 6,0 với OD600nm = 1,43. Ở pH < 5,0 và > 9,0, cả hai chủng hầu như không phát triển, chứng minh hai chủng thuộc nhóm vi khuẩn ưa trung tính.
  • Nồng độ muối NaCl: Cả hai chủng phát triển tốt ở dải nồng độ muối từ 1-7%, tối ưu tại nồng độ 2% với OD600nm đạt 1,205 (đối với TX4) và 1,671 (đối với TX9). Ở nồng độ muối trên 7%, hai chủng bị ức chế hoàn toàn do hiện tượng co nguyên sinh chất.

Về định danh phân tử, kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng TX9 cho thấy mức độ tương đồng 99% với các chủng chuẩn Bacillus amyloliquefaciens trên ngân hàng GenBank (mã số truy cập KM036068.1, JX971532.1, FJ889051.1, KY697808.1, KY515456.1). Tác giả đã kết luận định danh và đặt tên chủng là Bacillus amyloliquefaciens TX9.

Giải pháp và kiến nghị tác giả đề xuất:

  • Đề xuất ứng dụng chủng Bacillus amyloliquefaciens TX9 và chủng Bacillus sp. TX4 làm nguồn giống tiềm năng để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng cho lợn.
  • Đề xuất hướng tận dụng nguồn đường rẻ tiền trong thực tế để nuôi cấy nhân giống do hai chủng này có khả năng đồng hóa tốt nhiều nguồn carbon khác nhau (Myo-Inositol, Cellobiose, Lactose, Arabinose, Galactose, Mannose).
  • Đề xuất tiếp tục phối trộn các chủng vi khuẩn tuyển chọn với nấm men và vi khuẩn lactic nhằm tạo chế phẩm đa chủng hoàn chỉnh xử lý phụ phẩm nông nghiệp giàu protein và chất xơ.

Đóng góp của khóa luận:

  • Cung cấp dẫn liệu khoa học chính xác về đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh học phân tử của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens TX9 phân lập tại Việt Nam, chứng minh chủng có khả năng sinh đồng thời hệ 5 enzyme ngoại bào phân giải chất xơ và polysaccharide.
  • Bổ sung nguồn vi sinh vật hữu ích có phổ kháng khuẩn rộng, làm cơ sở khoa học để nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng, góp phần giải quyết bài toán giảm giá thành thức ăn chăn nuôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tồn tại một số hạn chế gắn liền với phạm vi nghiên cứu thực nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm:

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở các thử nghiệm in vitro, chưa khảo sát động học lên men trên cơ chất thức ăn thô xanh thực tế (như cỏ, thân lá cây họ đậu, khô dầu đậu tương).
  • Mới chỉ tiến hành phân tích trình tự gen 16S rDNA và định danh phân tử đối với chủng TX9, chưa thực hiện giải trình tự định danh cho chủng TX4.
  • Chưa khảo sát các chỉ tiêu về độ ổn định của bào tử khi sấy khô, khả năng tồn tại của chủng vi khuẩn qua đường tiêu hóa của động vật mô hình, và chưa thử nghiệm in vivo đánh giá khả năng tăng trọng hoặc phòng bệnh tiêu chảy trên đàn lợn thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả và phạm vi đề tài mở ra:

  • Tiến hành tách chiết DNA, khuếch đại và giải trình tự gen 16S rDNA để phân loại và định danh chính xác loài đối với chủng TX4.
  • Tối ưu hóa các thông số công nghệ lên men (nhiệt độ, pH, tỷ lệ phối trộn cơ chất, độ ẩm, thời gian lên men) nhằm thu nhận sinh khối vi khuẩn và hoạt tính enzyme cao nhất.
  • Nghiên cứu công nghệ phối chế chủng Bacillus amyloliquefaciens TX9 với các nhóm vi sinh vật có ích khác (vi khuẩn lactic, nấm men Saccharomyces cerevisiae) để tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng dạng bột hoặc lỏng.
  • Tiến hành thử nghiệm lên men thức ăn thô xanh quy mô bán công nghiệp (pilot) và thử nghiệm bổ sung vào khẩu phần ăn của lợn để đánh giá các chỉ tiêu kinh tế kỹ thuật (tỷ lệ tiêu chảy, tốc độ tăng khối lượng, hệ số tiêu tốn thức ăn).

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho nhiều nhóm đối tượng học thuật và ứng dụng:

  • Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng, Công nghệ Thực phẩm và Dinh dưỡng Động vật (Chăn nuôi - Thú y).
  • Các cán bộ kỹ thuật tại các trung tâm khuyến nông, phòng nghiên cứu và phát triển (R&D) của các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học, men tiêu hóa vi sinh cho vật nuôi.

Các phần nội dung đáng tham khảo chuyên sâu trong tài liệu gồm:

  • Quy trình sàng lọc định tính hoạt tính của 5 loại enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase) bằng phương pháp cấy chấm điểm trên thạch kết hợp hóa chất hiện màu đặc hiệu (Lugol, acid trichloroacetic 10%, esculin-ferric ammonium citrate, ethanol).
  • Thao tác thực nghiệm phương pháp đục lỗ thạch đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định chuẩn ATCC.
  • Các bước kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn trực khuẩn sinh bào tử và điều kiện luân nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA kích thước 1500 bp với cặp mồi 27F/1429R.
  • Số liệu khảo sát dải nhiệt độ, pH và nồng độ NaCl làm cơ sở thiết lập môi trường nuôi cấy nhân sinh khối cho các chủng Bacillus.

Câu hỏi thường gặp

1. Trong số 24 chủng vi khuẩn khảo sát ban đầu, có bao nhiêu chủng được xác định thuộc chi Bacillus?
Qua kiểm tra hình thái tế bào, phương pháp nhuộm Gram và phản ứng sinh hóa, kết quả ghi nhận có 20/24 chủng bắt màu Gram dương và 19/24 chủng có phản ứng sinh enzyme catalase dương tính. Đối chiếu với khóa phân loại của Bergey, tác giả kết luận có 19 trong tổng số 24 chủng thuộc chi Bacillus.

2. Hai chủng vi khuẩn ưu tú TX4 và TX9 có hoạt tính enzyme ngoại bào khác biệt nhau như thế nào?
Chủng TX4 thể hiện hoạt tính cellulase rất cao với đường kính vòng phân giải đạt 3,5 cm, hoạt tính amylase đạt 2,4 cm, protease đạt 2,2 cm, β-glucosidase đạt 2,2 cm, nhưng không có hoạt tính xylanase. Ngược lại, chủng TX9 có khả năng sinh toàn diện cả 5 loại enzyme, trong đó hoạt tính xylanase đạt mức cao nhất (4,0 cm), cellulase đạt 2,4 cm, amylase đạt 2,2 cm, protease đạt 2,2 cm và β-glucosidase đạt 2,1 cm.

3. Các điều kiện nhiệt độ, pH và nồng độ muối NaCl tối ưu cho sự sinh trưởng của hai chủng TX4 và TX9 là bao nhiêu?
Hai chủng TX4 và TX9 sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 37°C (phát triển trong dải 30-45°C), độ pH ban đầu tối ưu là 6,0 (TX4 phát triển ở pH 5,0-9,0; TX9 phát triển ở pH 5,0-8,0) và nồng độ muối NaCl tối ưu là 2% (cả hai chủng chịu được nồng độ muối từ 1% đến 7% và ngừng sinh trưởng khi nồng độ NaCl lớn hơn 7%).

4. Chủng vi khuẩn TX9 được định danh bằng phương pháp nào và thuộc loài gì?
Chủng TX9 được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (sử dụng cặp mồi 27F và 1429R tạo sản phẩm kích thước khoảng 1500 bp) và giải trình tự tự động trên hệ thống ABI PRISM 3100. So sánh BLAST trên ngân hàng GenBank cho thấy độ tương đồng 99% với loài Bacillus amyloliquefaciens (đối chiếu các mã số truy cập KM036068.1, JX971532.1, FJ889051.1, KY697808.1, KY515456.1), từ đó chủng được đặt tên khoa học là Bacillus amyloliquefaciens TX9.

5. Hoạt tính đối kháng của hai chủng TX4 và TX9 được thử nghiệm trên những loài vi sinh vật kiểm định nào?
Hoạt tính đối kháng được thử nghiệm trên 3 chủng vi khuẩn kiểm định chuẩn gồm Salmonella enterica ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 11105 và Bacillus cereus ATCC 11778. Cả hai chủng TX4 và TX9 đều tạo vòng vô khuẩn ức chế sinh trưởng rõ rệt đối với cả 3 tác nhân gây bệnh này.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã sàng lọc thành công từ 24 chủng vi khuẩn ban đầu để lựa chọn được hai chủng vi khuẩn ưu tú là TX4 và TX9 sở hữu hoạt tính enzyme ngoại bào cao và phổ đối kháng rộng đối với các vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường tiêu hóa (E. coli, S. enterica, B. cereus). Các nghiên cứu sinh lý sinh hóa đã xác lập các điều kiện nuôi cấy tối ưu của hai chủng ở 37°C, pH 6,0, nồng độ muối NaCl 2%, cùng khả năng đồng hóa đa dạng các nguồn carbon. Chủng TX9 đã được định danh phân tử chính xác là loài Bacillus amyloliquefaciens TX9 với độ tương đồng trình tự gen 16S rDNA đạt 99% so với ngân hàng dữ liệu GenBank. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học và nguồn giống vi sinh vật giá trị phục vụ mục tiêu sản xuất chế phẩm sinh học lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng trong chăn nuôi.