Tổng quan luận án

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue (DENV) gây nên với trung gian truyền bệnh chủ yếu là muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus. Bệnh phân bố rộng rãi tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, gây ảnh hưởng đến hơn một phần ba dân số toàn cầu. Theo số liệu thống kê được luận án ghi nhận, số ca mắc SXHD trên thế giới đã tăng gấp 30 lần trong vòng 50 năm, với khoảng 390 triệu ca nhiễm mỗi năm, trong đó 96 triệu ca xuất hiện triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ tử vong chung khoảng 2,5%. Tại Việt Nam, dịch bệnh lưu hành phức tạp theo chu kỳ; riêng năm 2022, toàn quốc ghi nhận 367.729 ca mắc và 140 trường hợp tử vong.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án chỉ ra xuất phát từ thực tế chẩn đoán: bốn týp huyết thanh vi rút Dengue (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) cùng lưu hành với mức độ tương đồng trình tự bộ gen từ 60% đến 80%. Các phương pháp chẩn đoán phân tử như RT-PCR và phân lập vi rút đòi hỏi trang thiết bị chuyên sâu và kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm, đồng thời độ nhạy giảm nhanh sau 5 ngày đầu khởi phát khi lượng vi rút trong máu suy giảm. Các kỹ thuật huyết thanh học tìm kháng thể hoặc kháng nguyên thương mại hiện hành chủ yếu dựa trên các cấu trúc đơn lẻ hoặc chưa bao phủ đồng đều cả 4 týp, dẫn đến nguy cơ bỏ sót chẩn đoán. Protein phi cấu trúc NS1 (Nonstructural Protein 1) là kháng nguyên kết hợp bổ thể duy nhất được tiết vào máu ở nồng độ cao trong giai đoạn cấp tính và có tính sinh miễn dịch mạnh. Tuy nhiên, trước nghiên cứu này, chưa có chế phẩm kháng nguyên NS1 tái tổ hợp nào tích hợp đầy đủ các epitop đặc hiệu cho cả 4 týp DENV được thiết kế và đánh giá ứng dụng tại Việt Nam.

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022.
  2. Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA.
  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Về mặt lâm sàng: Người bệnh được chẩn đoán mắc sốt xuất huyết Dengue điều trị nội trú.
    • Về mặt thực nghiệm: Gen mã hóa vùng kháng nguyên NS1 của 4 týp DENV; chủng vi khuẩn Escherichia coli (E. coli BL21); các plasmid tách dòng và biểu hiện (pJET, pET22b+); các mẫu huyết thanh bệnh nhân SXHD và mẫu chứng âm.
  • Phạm vi không gian: Bệnh viện Quân y 103 (Hà Nội), Bệnh viện Quân y 175 (TP. Hồ Chí Minh), Viện Nghiên cứu hệ gen (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương.
  • Phạm vi thời gian: Dữ liệu lâm sàng thu thập năm 2022; các nội dung thực nghiệm sinh học phân tử và phân tích hoàn thành năm 2024.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế trên ba phương diện chính: cơ chế sinh bệnh học, biểu hiện lâm sàng - cận lâm sàng và công nghệ chẩn đoán miễn dịch.

Về cơ chế bệnh sinh và phân loại bệnh, tác giả điểm lại các giả thuyết kinh điển giải thích cơ chế SXHD nặng:

  • Giả thuyết của Hammon: Hiện tượng nhiễm đồng thời hai týp huyết thanh khác nhau của vi rút Dengue.
  • Giả thuyết của Leon Rose: Sự khác biệt về độc lực và khả năng nhân lên giữa các týp vi rút (đặc biệt là DENV2 liên quan đến tỷ lệ bệnh nặng cao).
  • Giả thuyết tăng cường miễn dịch phụ thuộc kháng thể (ADE) của Halstead: Đáp ứng miễn dịch nhớ lại khi tái nhiễm một týp huyết thanh DENV khác làm gia tăng giải phóng chuỗi cytokine (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-alpha), kích thích tế bào nội mô mạch máu dẫn đến tăng tính thấm thành mạch và thoát huyết tương.

Về các nghiên cứu lâm sàng và dịch tễ:

  • Tác giả dẫn chứng các công trình của Idota và cộng sự (2006) về tỷ lệ phát ban (82%) trên bệnh nhân nhập viện; các nghiên cứu tại khu vực Nam Mỹ (Peru, Bolivia, Ecuador, Paraguay) ghi nhận tỷ lệ đau cơ lên đến 90,1% (1.546/1.716 ca).
  • Các công trình dịch tễ học tại Việt Nam qua các giai đoạn từ 1958 đến 2023, phân tích chu kỳ dịch 4–5 năm và 10 năm, phản ánh sự lưu hành chủ yếu của DENV1 và DENV2 tại miền Bắc và miền Nam.

Về chẩn đoán huyết thanh học và kháng nguyên NS1:

  • Nghiên cứu của Roy SK và cộng sự (2021) về cấu trúc phân tử và chức năng 10 protein của vi rút Dengue.
  • Nghiên cứu của Luvira so sánh xét nghiệm ELISA NS1 (độ nhạy 82,4%, độ đặc hiệu 94,3%) với kit chẩn đoán nhanh (độ nhạy 76,5%) và sự kết hợp giữa NS1 và IgM (độ nhạy 78,4%, độ đặc hiệu 97,1%).
  • Công trình tại Quảng Châu (Trung Quốc, 2006) chỉ ra việc kết hợp NS1 và IgM cho tỷ lệ chẩn đoán dương tính đạt từ 96,9% đến 100% sau ngày thứ 3 của bệnh.
  • Nghiên cứu của Versiani đánh giá hệ thống VIDAS kết hợp NS1/IgM đạt độ phù hợp 96,4% ở giai đoạn cấp (0–5 ngày).
  • Khảo sát tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương (TP. Hồ Chí Minh) trên hai bộ kit test nhanh SD Bioline Dengue NS1 và careUS Dengue IgM/IgG cho thấy độ nhạy của NS1 đạt 51,2% (độ đặc hiệu 92,9%) và IgM đạt 21,4% (độ đặc hiệu 76,9%).

Vị trí của luận án: Luận án giải quyết khoảng trống trong việc tự chủ công nghệ tạo nguồn kháng nguyên tái tổ hợp mang đầy đủ epitop nhận biết 4 týp huyết thanh DENV, phục vụ phát triển kỹ thuật ELISA gián tiếp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời bổ sung dữ liệu lâm sàng thực chứng tại hai bệnh viện quân y lớn đại diện cho hai miền Nam - Bắc trong đợt dịch năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cấu trúc phân tử

Hệ gen của vi rút Dengue là một chuỗi đơn RNA dương (~11 kb), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa polyprotein gồm khoảng 3.400 axit amin, được phân cắt sau dịch mã thành 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc:

Loại protein Tên protein Số lượng axit amin Trọng lượng phân tử (kDa) Chức năng chính
Cấu trúc Capsid (C) 100 12 Bao bọc RNA, tạo nucleocapsid
Màng (prM/M) 166 (prM) / 75 (M) 26 (prM) / 8,2–8,5 (M) Định hình và hỗ trợ sự trưởng thành của hạt vi rút
Vỏ (E) 495 ~50 Gắn kết thụ thể tế bào chủ, hòa màng
Phi cấu trúc NS1 350–352 45 Kháng nguyên kết hợp bổ thể, bài tiết dạng hexamer (sNS1)
NS2A 218–231 22 Phối hợp sao chép, bài tiết vi rút
NS2B 130 14 Cofactor cho protease NS3
NS3 618 ~70 Hoạt tính serine protease, RNA helicase, RTPase/NTPase
NS4A 127 16 Biến đổi màng tế bào hỗ trợ sao chép
NS4B 248 27 Tương tác với NS3 hỗ trợ sao chép RNA
NS5 900 104 Methyltransferase (đầu N) và RNA polymerase phụ thuộc RNA (đầu C)

Protein NS1 có cấu trúc không gian gồm ba miền: miền $\beta$-roll (axit amin 1–29), miền cánh (axit amin 30–180 với 2 vị trí glycosyl hóa Asn130 và Asn175) và thang $\beta$ (axit amin 181–352). Kháng nguyên NS1 tồn tại ở dạng dimer trên màng nội bào và dạng hexamer khi tiết ra ngoài tuần hoàn máu.

Phương pháp nghiên cứu

                                                                                  vẽ đường cong ROC, tính độ nhạy/đặc hiệu

  1. Phương pháp nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng:

    • Thiết kế: Nghiên cứu mô tả cắt ngang trên các bệnh nhân SXHD điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 trong năm 2022.
    • Biến số thu thập: Đặc điểm nhân khẩu học (tuổi, giới, nghề nghiệp); triệu chứng lâm sàng (tính chất sốt, đau cơ, đau đầu, đau mắt, phát ban, dạng xuất huyết dưới da/niêm mạc/tạng, dấu hiệu thoát huyết tương); chỉ số cận lâm sàng (công thức máu: tiểu cầu, Hematocrit, bạch cầu, hồng cầu, hemoglobin; đông máu: APTT, PT, Fibrinogen; sinh hóa: AST, ALT, Creatinin, Albumin, điện giải đồ; chẩn đoán hình ảnh: dịch màng phổi, màng bụng, phù nề túi mật trên siêu âm).
    • Phân loại bệnh: Theo hướng dẫn của Bộ Y tế và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) gồm 3 mức độ: Sốt xuất huyết Dengue, Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo, và Sốt xuất huyết Dengue nặng.

  2. Phương pháp công nghệ sinh học phân tử và miễn dịch học:

    • Thiết kế in silico: Mô phỏng cấu trúc không gian và phân tích docking phân tử giữa đoạn peptit mang epitop tái tổ hợp (axit amin 112–260) với các kháng thể đặc hiệu (kháng thể đơn dòng 1G5 và 2B).
    • Tách dòng và biểu hiện gen: Gen mã hóa rNS1 gộp 4 týp được gắn vào vector tách dòng pJET, sau đó chuyển sang vector biểu hiện pET22b+ và biến nạp vào tế bào chủ E. coli BL21. Kiểm tra dòng tái tổ hợp bằng giải trình tự Sanger (khuẩn lạc số 2).
    • Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện: Khảo sát các dải nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG (Isopropyl $\beta$-D-1-thiogalactopyranoside) và thời gian biểu hiện protein.
    • Kiểm tra và định lượng protein: Điện di biến tính SDS-PAGE; phản ứng Western blot kiểm tra độ đặc hiệu với kháng thể thương mại và kháng thể đơn dòng tự sản xuất; định lượng nồng độ protein bằng phương pháp Bradford qua đường chuẩn mật độ quang (OD).
    • Kỹ thuật ELISA gián tiếp: Hấp phụ kháng nguyên rNS1 gộp 4 týp lên giếng microplate, tối ưu hóa nồng độ phủ kháng nguyên và độ pha loãng huyết thanh; đọc mật độ quang phổ kế; xác định giá trị ngưỡng (cut-off) và đánh giá độ chính xác qua diện tích dưới đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng thuật các kiến thức toàn diện về dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết Dengue trên quy mô toàn cầu và tại Việt Nam qua các mốc thời gian từ 1958 đến năm 2023. Tác giả phân tích sâu cơ chế bệnh sinh của hiện tượng tăng tính thấm thành mạch, thoát huyết tương gây cô đặc máu và sốc, cùng cơ chế rối loạn đông máu đa yếu tố (giảm tiểu cầu, biến đổi thành mạch, suy giảm tổng hợp các yếu tố đông máu tại gan và hoạt hóa dòng thác đông máu qua trung gian IL-6). Chương này mô tả chi tiết chu kỳ phát triển của véc tơ truyền bệnh Aedes aegypti (từ trứng đến muỗi trưởng thành mất 12–17 ngày ở $20^\circ\text{C}$ và độ ẩm 80%), đặc điểm sinh học và vai trò truyền bệnh chính (95% tại Việt Nam).

Đồng thời, cấu trúc 10 protein của virut DENV được phân tích chi tiết, nhấn mạnh vào cấu tạo monomer, dimer và hexamer của glycoprotein NS1. Chương tổng quan phân loại các nguyên lý chẩn đoán (phân lập vi rút, MAC-ELISA, NS1-ELISA, rRT-PCR, test nhanh combo) và nêu rõ quy trình chuẩn trong sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp trên hệ thống vi khuẩn E. coli.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về cỡ mẫu, tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ người bệnh tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175. Quy trình kỹ thuật thu thập và lưu trữ bệnh phẩm huyết thanh được chuẩn hóa. Các công thức toán học và tiêu chuẩn kỹ thuật phân tích được thiết lập chặt chẽ:

  • Quy trình thiết kế chuỗi mồi, phản ứng khuếch đại gen xác định týp DENV.
  • Quy trình biến nạp plasmid pJET-rNS1 và pET22b+-rNS1 vào tế bào E. coli BL21.
  • Các bước thực hiện phản ứng Western blot và phản ứng ELISA gián tiếp.
  • Các biến số nghiên cứu, quy trình kiểm soát sai số và phương pháp xử lý số liệu thống kê y sinh học. Luận án cam kết tuân thủ các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và số liệu lâm sàng:

  • Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng: Phân tích phân bố bệnh nhân theo tuổi, giới, nghề nghiệp và thời gian mắc bệnh trước khi vào viện. Tỷ lệ các triệu chứng thực thể, các dạng xuất huyết (dưới da, niêm mạc, xuất huyết tạng) và số lượng dạng xuất huyết kết hợp được thống kê chi tiết.
  • Biến đổi huyết học và sinh hóa: Ghi nhận sự biến thiên của số lượng tiểu cầu (giảm nặng ở nhóm bệnh nhân có dấu hiệu cảnh báo và nặng), tỷ lệ tăng Hematocrit liên quan đến cô đặc máu, biến đổi nồng độ Hemoglobin và số lượng bạch cầu. Đánh giá mức tăng men gan AST và ALT (trong đó AST tăng ưu thế so với ALT), chỉ số đông máu (APTT kéo dài, giảm tỷ lệ prothrombin), điện giải đồ (hạ natri máu) và tỷ lệ phát hiện tràn dịch màng phổi, tràn dịch màng bụng, phù nề túi mật trên siêu âm.
  • Kết quả tạo kháng nguyên tái tổ hợp rNS1 gộp 4 týp:
    • Mô phỏng in silico xác định đoạn peptit 112–260 tương tác docking ổn định với các kháng thể 1G5 và 2B.
    • Sàng lọc khuẩn lạc E. coli BL21 sau biến nạp và xác nhận đúng trình tự mã hóa bằng giải trình tự Sanger tại khuẩn lạc số 2.
    • Xác định các điều kiện tối ưu để biểu hiện protein rNS1: nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng thích hợp.
    • Đường chuẩn Bradford cho phép định lượng chính xác nồng độ protein tái tổ hợp tinh sạch.
    • Phản ứng Western blot xác nhận kháng nguyên rNS1 gộp 4 týp phản ứng đặc hiệu với cả kháng thể NS1 thương mại và kháng thể đơn dòng tự sản xuất.
    • Phân tích xét nghiệm ELISA gián tiếp xác định giá trị điểm cắt ngưỡng cut-off = 0,353. Đường cong ROC được thiết lập chứng minh độ tin cậy, độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phân biệt mẫu huyết thanh dương tính SXHD và mẫu chứng âm.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 biện luận về mối tương quan giữa các biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng với mức độ nặng của bệnh theo các phân nhóm tuổi và giới tính. Tác giả so sánh tỷ lệ tổn thương gan, biến đổi đông máu và hiện tượng thoát huyết tương với các nghiên cứu trong nước và quốc tế trước đó.

Trong phần công nghệ sinh học, tác giả phân tích tính hiệu quả của chiến lược thiết kế vùng peptit mang epitop gộp chung 4 týp thay vì sử dụng toàn bộ phân tử protein NS1 đơn lẻ, lý giải ưu điểm của hệ thống biểu hiện E. coli BL21 kết hợp vector pET22b+ về mặt năng suất và độ ổn định của sản phẩm tái tổ hợp, đồng thời đánh giá tiềm năng ứng dụng của chế phẩm ELISA gián tiếp trong chẩn đoán và sàng lọc dịch tễ học.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

  1. Cung cấp dữ liệu khoa học cập nhật và toàn diện về bức tranh lâm sàng, cận lâm sàng, cùng các chỉ số biến đổi huyết học, đông máu, men gan và dấu hiệu thoát dịch trên siêu âm của người bệnh SXHD điều trị tại hai miền Nam - Bắc trong đợt dịch năm 2022.
  2. Chứng minh trên mô hình in silico và thực nghiệm sinh học phân tử rằng vùng peptit 112–260 của protein NS1 chứa các epitop bảo tồn có khả năng gắn kết đặc hiệu với kháng thể của cả 4 týp huyết thanh DENV1–4.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  1. Thiết kế, tách dòng và biểu hiện thành công protein kháng nguyên tái tổ hợp rNS1 gộp 4 týp trên vi khuẩn E. coli BL21 bằng vector pET22b+, xác nhận trình tự chuẩn xác qua giải trình tự Sanger.
  2. Xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình xét nghiệm ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên rNS1 gộp 4 týp để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue trong mẫu huyết thanh với giá trị cut-off xác định là 0,353, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao được lượng hóa qua phân tích đường cong ROC. Chế phẩm này mở ra tiềm năng sản xuất sinh phẩm chẩn đoán nội địa, giảm phụ thuộc vào sinh phẩm nhập ngoại.

Kiến nghị và đề xuất

  • Ứng dụng quy trình ELISA sử dụng kháng nguyên rNS1 tái tổ hợp gộp 4 týp vào công tác giám sát huyết thanh học và chẩn đoán hỗ trợ tại các cơ sở y tế.
  • Tăng cường theo dõi sớm các chỉ số tiểu cầu, Hematocrit, enzym gan AST/ALT và siêu âm tìm tràn dịch ở bệnh nhân SXHD trong giai đoạn nguy hiểm (ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 của bệnh) để phát hiện kịp thời các dấu hiệu cảnh báo chuyển nặng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:

    • Nghiên cứu lâm sàng được thực hiện tại hai bệnh viện tuyến cuối của quân đội (BVQY 103 và BVQY 175) trong năm 2022, chưa bao quát toàn bộ các cơ sở y tế tuyến dưới hoặc toàn bộ các vùng địa lý khác nhau trên cả nước.
    • Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp sử dụng tế bào nhân sơ E. coli, dù có ưu thế về năng suất và chi phí nhưng không có hệ thống glycosyl hóa hoàn chỉnh như tế bào nhân chuẩn (protein NS1 tự nhiên có các vị trí glycosyl hóa tại Asn130 và Asn175).

  • Hướng nghiên cứu tiếp:

    • Mở rộng thử nghiệm lâm sàng và đánh giá hiệu năng của sinh phẩm ELISA rNS1 gộp 4 týp trên các tập mẫu huyết thanh quy mô lớn hơn từ nhiều vùng dịch tễ khác nhau.
    • Nghiên cứu nâng quy mô sản xuất, tinh sạch protein ở mức độ công nghiệp và tích hợp kháng nguyên rNS1 gộp 4 týp vào các dạng que thử sắc ký miễn dịch nhanh hoặc hệ thống chẩn đoán tự động.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho nhiều đối tượng:

  • Bác sĩ lâm sàng chuyên ngành Truyền nhiễm và Cấp cứu: Cung cấp tài liệu tra cứu về diễn biến các giai đoạn bệnh, các dấu hiệu cảnh báo sớm, mức độ tăng men gan, biến đổi đông máu và giá trị của siêu âm trong đánh giá thoát huyết tương.
  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên khối ngành Y - Dược, Công nghệ sinh học: Cung cấp quy trình chi tiết từ thiết kế in silico, tách dòng vào vector pJET/pET22b+, biểu hiện protein trên E. coli, tinh sạch, Western blot đến quy chuẩn thiết lập xét nghiệm ELISA và xử lý đường cong ROC.
  • Các nhà phát triển sinh phẩm chẩn đoán y sinh: Cung cấp thông số kỹ thuật thực nghiệm và dữ liệu chứng minh khả năng thay thế kháng nguyên đơn týp bằng kháng nguyên gộp đa týp trong chẩn đoán huyết thanh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng nguyên NS1 của vi rút Dengue có kích thước và cấu trúc chức năng như thế nào?
Protein NS1 có độ dài 350–352 axit amin với trọng lượng phân tử monomer từ 45 đến 55 kDa (tùy trạng thái glycosyl hóa). Cấu trúc của NS1 gồm 3 miền chức năng chính: miền $\beta$-roll (axit amin 1–29), miền cánh (axit amin 30–180 với 2 vị trí glycosyl hóa Asn130 và Asn175) và thang $\beta$ (axit amin 181–352). NS1 tạo thành dimer nội bào và liên kết tạo hexamer (sNS1) bài tiết ra máu bệnh nhân trong giai đoạn cấp.

2. Luận án đã sử dụng vector và hệ thống tế bào chủ nào để tạo kháng nguyên rNS1 gộp 4 týp?
Tác giả sử dụng vector tách dòng pJET (tạo dòng pJET-rNS1) và vector biểu hiện pET22b+ (tạo dòng pET22b+-rNS1), sau đó biến nạp và biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chủ vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21 dưới sự cảm ứng của chất IPTG.

3. Giá trị điểm cắt (cut-off) và phương pháp đánh giá độ chính xác của xét nghiệm ELISA trong luận án là gì?
Xét nghiệm ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên rNS1 gộp 4 týp xác định giá trị điểm cắt ngưỡng cut-off = 0,353. Độ tin cậy, độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm được đánh giá và xác thực thông qua việc phân tích diện tích dưới đường cong đặc trưng hoạt động máy thu ROC (Receiver Operating Characteristic).

4. Phân loại mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue được áp dụng trong luận án gồm những nhóm nào?
Theo hướng dẫn của WHO và Bộ Y tế được áp dụng trong luận án, bệnh SXHD được phân chia thành 3 mức độ: (1) Sốt xuất huyết Dengue; (2) Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo (có đau bụng vùng gan, gan to > 2 cm, nôn nhiều, ứ dịch màng phổi/bụng, xuất huyết niêm mạc, tiểu ít, tiểu cầu giảm nhanh, AST/ALT $\ge$ 400 U/L); (3) Sốt xuất huyết Dengue nặng (thoát huyết tương nặng dẫn đến sốc/ứ dịch gây suy hô hấp, xuất huyết nặng, suy tạng nặng như AST/ALT > 1000 U/L hoặc rối loạn tri giác, suy thận cấp).

5. Điểm khác biệt chính giữa protein NS1 và các protein phi cấu trúc khác của vi rút Dengue trong ứng dụng chẩn đoán là gì?
Trong khi 6 protein phi cấu trúc khác (NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) chủ yếu nằm trong nội bào hoặc liên kết với phức hợp sao chép hạt vi rút, NS1 là protein phi cấu trúc duy nhất được bài tiết trực tiếp vào máu với số lượng lớn dưới dạng hexamer trong giai đoạn cấp tính, có tính sinh miễn dịch cao, cho phép phát hiện sớm cả kháng nguyên lẫn kháng thể đặc hiệu trong tuần đầu của bệnh.

Kết luận

Luận án của tác giả Hoàng Xuân Cường là công trình nghiên cứu kết hợp giữa y học lâm sàng và công nghệ sinh học phân tử trong bệnh truyền nhiễm. Đề tài đã mô tả chi tiết các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 trong đợt dịch năm 2022. Đồng thời, nghiên cứu đã thiết kế, biểu hiện thành công kháng nguyên tái tổ hợp rNS1 gộp 4 týp trên hệ thống E. coli BL21 và chuẩn hóa quy trình ELISA gián tiếp với giá trị cut-off 0,353. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học và kỹ thuật quan trọng cho việc phát triển các bộ sinh phẩm chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue đa týp tại Việt Nam.