Nghiên cứu đặc điểm hình thái và hiệu quả điều trị sán lá ruột nhỏ tại Việt Nam

Nghiên cứu hình thái và phân tử sán lá ruột nhỏ trên người tại một số tỉnh, đánh giá hiệu quả điều trị cộng đồng giai đoạn 2010-2013.

• Người hướng dẫn: GS. Lê Thanh Hòa
• Trường học: Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Trung Ương
• Chuyên ngành: Ký Sinh Trùng - Côn Trùng
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Hình Thái Và Hiệu Quả Điều Trị Sán Lá Ruột Nhỏ Tại Việt Nam (2010-2013)
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sỹ Y Học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• ĐẶT VẤN ĐỀ. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Một số đặc điểm chung của sán lá
• 1.2. Đặc điểm sinh học của sán lá
• 1.3. Đặc điểm phân loại hình thái học về sán lá ruột nhỏ trưởng thành
• 1.4. Đặc điểm của trứng sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và họ Echinostomatidae
• 1.5. Đặc điểm ấu trùng sán lá họ ruột nhỏ họ Heterophyidae và họ Echinostomatidae
• 1.6. Đặc điểm chu kỳ phát triển (vòng đời). Một số nghiên cứu về một số loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và Echinostomatidae trên thế giới
• 1.7. Tình hình nghiên cứu một số loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và Echinostomatidae ở động vật và người ở Việt Nam
• 1.8. Tổn thương giải phẫu bệnh, triệu chứng lâm sàng, chẩn đoán, điều trị và phòng chống sán lá ruột nhỏ
• 1.8.1. Tổn thương giải phẫu bệnh. Triệu chứng lâm sàng
• 1.8.2. Phòng bệnh
• 1.9. Một số kỹ thuật sinh học phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu về ký sinh trùng
• 1.9.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể loài sán lá ruột nhỏ và các chỉ thị phân tử của hệ gen ty thể thường gặp
• 1.9.2. Đặc điểm sinh học phân tử hệ gen nhân và chỉ thị phân tử ở hệ gen nhân tế bào. Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)
• 1.9.3. Một số ứng dụng phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu định loại, di truyền quần thể và phả hệ về ký sinh trùng
• 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Thiết kế nghiên cứu
• 2.4. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.5. Quy trình thu thập mẫu sán lá trưởng thành
• 2.6. Nội dung nghiên cứu đặc điểm hình thái sán lá ruột nhỏ trưởng thành
• 2.7. Nội dung nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử của một số loài sán lá nhỏ
• 2.8. Nội dung nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ trên người tại cộng đồng
• 2.9. Y đức trong nghiên cứu
• 2.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.10.1. Xử lý số liệu về hình thái học
• 2.10.2. Xử lý số liệu về sinh học phân tử
• 2.10.3. Phân tích số liệu nghiên cứu đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả điều tra xác định đối tượng nghiên cứu tại các tỉnh
• 3.2. Kết quả điều tra cắt ngang đánh giá tình hình nhiễm giun sán tại các tỉnh
• 3.3. Kết quả thu thập mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành tại các tỉnh
• 3.4. Đặc điểm hình thái học một số loài sán lá ruột thu được trong nghiên cứu
• 3.5. Kết quả thẩm định phân tử của các loài sán lá nhỏ thu được
• 3.5.1. Thu nhận chuỗi gen ty thể cox1
• 3.5.2. Thu nhận chuỗi gen nhân 28S
• 3.5.3. Kết quả thẩm định loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và Echinostomatidae sử dụng chỉ thị gen ty thể cox1
• 3.5.4. Kết quả thẩm định loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và Echinostomatidae sử dụng chỉ thị gen nhân 28S ribosome
• 3.5.5. Nghiên cứu về gen cox1 của Haplorchis tại chuỗi lại 3 tỉnh Hà Giang, Thanh Hoá và Quảng Trị
• 3.6. Kết quả đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng
• 4. CHƯƠNG 4: ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI SÁN LÁ THU ĐƯỢC
• 4.1. Đặc điểm hình thái của Heterophyidae
• 4.2. Đặc điểm hình thái của Echinostomatidae
• 4.3. Thẩm định loài sán lá ruột nhỏ trưởng thành họ Heterophyidae và Echinostomatidae bằng phương pháp sinh học phân tử
• 4.3.1. So sánh trình tự nucleotide của chuỗi gen cox1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng của các loài sán lá ruột nhỏ khác
• 4.3.2. Mối quan hệ phả hệ về loài giữa các chủng sán lá ruột nhỏ của Việt Nam và thế giới dựa trên trình tự gen cox1
• 4.3.3. So sánh trình tự nucleotide của gen 28S các chủng nghiên cứu với chuỗi gen tương ứng của các loài sán lá khác
• 4.3.4. Mối quan hệ phả hệ của các chủng sán lá nghiên cứu dựa trên một phần trình tự gen 28S
• 4.3.5. Đặc điểm sinh học phân tử của 3 quần thể sán lá ruột nhỏ Haplorchis tại Hà Giang, Thanh Hoá và Quảng Trị
• 4.4. Hiệu quả điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng
• 4.5. Nhiễm phối hợp sán lá ruột nhỏ và sán lá gan nhỏ trên người tại Việt Nam
• 4.6. Chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ
• 4.7. Hiệu quả điều trị sán lá nhỏ tại cộng đồng sử dụng liều Praziquantel 50mg/kg chia 2 lần
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• Những đóng góp mới của luận án
• Danh sách các bài báo khoa học liên quan đến luận án đã công bố
• Những hạn chế của luận án
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Sán Lá Ruột Nhỏ Hình Thái Tác Hại

Sán lá ruột nhỏ là một vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng, ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Theo ước tính của WHO, hơn nửa tỷ người có nguy cơ nhiễm các loại ký sinh trùng truyền qua thức ăn, trong đó có khoảng 40-50 triệu người nhiễm sán lá ruột. Hai họ sán lá ruột thường gặp nhất là Heterophyidae và Echinostomatidae. Sán lá ruột nhỏ có thể gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm, bao gồm cả ký sinh lạc chỗ, với trứng và con trưởng thành xâm nhập vào van tim, não và tủy sống, dẫn đến tử vong trong một số trường hợp. Do đó, việc nghiên cứu và kiểm soát sán lá ruột nhỏ là vô cùng cần thiết. Nghiên cứu này tập trung vào đặc điểm hình thái và hiệu quả điều trị sán lá ruột nhỏ tại Việt Nam trong giai đoạn 2010-2013. Mục tiêu: Xác định thành phần loài, mô tả đặc điểm hình thái sán lá ruột nhỏ trên người tại một số tỉnh của Việt Nam; Thẩm định loài sán lá ruột nhỏ bằng phương pháp sinh học phân tử; Đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ ở người bằng praziquantel liều 50mg/kg tại cộng đồng.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Chung Của Sán Lá Ruột Nhỏ

Sán lá ruột nhỏ thường có màu trắng đục, hồng hoặc nâu. Kích thước của sán lá thay đổi tùy thuộc vào vị trí ký sinh trên vật chủ. Sán lá sống trong ống tiêu hóa thường có hình lá, trong khi sán lá ký sinh trong mô của các nội quan thường có dạng hình cầu. Cơ thể sán có giác miệng và giác bụng giúp bám vào vật chủ. Lớp biểu bì (cutin) của sán thường có gai và vảy giúp cho sự di chuyển và bám dính. Sán lá không có hệ tuần hoàn và hô hấp, dinh dưỡng chủ yếu bằng thẩm thấu qua bề mặt cơ thể. Cơ quan bài tiết của sán lá là nguyên đơn thận, và cơ quan sinh dục có cả đực và cái trên cùng một cơ thể.

1.2. Phân Loại Hình Thái Học Sán Lá Ruột Nhỏ Trưởng Thành

Việc phân loại sán lá ruột nhỏ dựa trên đặc điểm hình thái học là vô cùng quan trọng. Các đặc điểm quan trọng bao gồm hình dạng cơ thể, vị trí và kích thước của giác miệng và giác bụng, sự phân bố của gai trên cutin, và cấu trúc của các cơ quan sinh sản. Hai họ sán lá ruột nhỏ thường gặp là Heterophyidae và Echinostomatidae. Các loài thuộc họ Heterophyidae thường có giác sinh dục nằm gần giác bụng. Các loài thuộc họ Echinostomatidae có vòng gai quanh miệng đặc trưng. Bảng 1 trong tài liệu gốc cung cấp một số đặc điểm phân loại của các giống sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae.

1.3. Chu Kỳ Phát Triển Của Sán Lá Ruột Nhỏ

Chu kỳ phát triển của sán lá ruột nhỏ phức tạp, thường bao gồm nhiều vật chủ trung gian. Sán trưởng thành ký sinh trong ruột của người hoặc động vật. Trứng sán được thải ra ngoài theo phân và nở thành ấu trùng miracidium. Ấu trùng miracidium xâm nhập vào ốc, phát triển thành ấu trùng redia và cercaria. Ấu trùng cercaria rời khỏi ốc và xâm nhập vào cá hoặc các động vật thủy sinh khác, tạo thành nang metacercaria. Người hoặc động vật ăn phải cá hoặc các động vật thủy sinh nhiễm nang metacercaria sẽ bị nhiễm sán lá ruột nhỏ.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Điều Trị Nhiễm Sán Lá Ruột Nhỏ

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về sán lá ruột nhỏ, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và điều trị. Một trong những thách thức lớn nhất là sự đa dạng về loài và sự khó khăn trong việc phân loại chính xác. Sự khác biệt nhỏ về hình thái giữa các loài sán lá ruột nhỏ có thể gây khó khăn cho việc chẩn đoán. Hơn nữa, tình trạng nhiễm phối hợp giữa sán lá gan nhỏ và các loài sán lá ruột nhỏ khác cũng gây khó khăn cho việc điều trị. Các dữ liệu về đặc điểm hình thái học và sinh học phân tử của sán lá ruột nhỏ trưởng thành tại Việt Nam còn thiếu hoặc chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Điều này gây khó khăn cho việc xây dựng các biện pháp kiểm soát và phòng ngừa hiệu quả.

2.1. Khó Khăn Trong Chẩn Đoán Phân Loại Sán Lá

Chẩn đoán nhiễm sán lá ruột nhỏ thường dựa trên xét nghiệm phân tìm trứng sán. Tuy nhiên, việc xác định loài sán lá ruột nhỏ dựa trên hình thái trứng là rất khó khăn. Do đó, cần có các phương pháp chẩn đoán chính xác hơn, chẳng hạn như sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử. Sự khác biệt nhỏ về hình thái giữa các loài sán lá ruột nhỏ cũng gây khó khăn cho việc phân loại chính xác, đặc biệt là đối với các chuyên gia không có kinh nghiệm.

2.2. Tình Trạng Nhiễm Phối Hợp Sán Lá Gan và Sán Lá Ruột

Nhiễm phối hợp giữa sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ là một vấn đề ngày càng phổ biến ở Việt Nam và các nước khác trong khu vực. Tình trạng này gây khó khăn cho việc điều trị, vì praziquantel, loại thuốc thường được sử dụng để điều trị sán lá ruột nhỏ, không hiệu quả đối với sán lá gan nhỏ. Do đó, cần có các chiến lược điều trị kết hợp để điều trị cả hai loại sán.

2.3. Thiếu Dữ Liệu Về Hình Thái Phân Tử Sán Trưởng Thành

Các dữ liệu về đặc điểm hình thái học và sinh học phân tử của sán lá ruột nhỏ trưởng thành tại Việt Nam còn rất hạn chế. Điều này gây khó khăn cho việc nghiên cứu cơ bản về phân loại và phân bố các loài sán lá ruột nhỏ ở Việt Nam và trên thế giới. Các nghiên cứu về hình thái và phân tử của sán lá ruột nhỏ trưởng thành sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc xây dựng các biện pháp kiểm soát và phòng ngừa hiệu quả.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Điểm Sán Lá Ruột Nhỏ Tại VN

Nghiên cứu này được thực hiện tại một số tỉnh của Việt Nam trong giai đoạn 2010-2013. Đối tượng nghiên cứu là người dân và các mẫu sán lá ruột nhỏ thu thập được từ người bệnh sau khi điều trị bằng praziquantel. Thiết kế nghiên cứu bao gồm điều tra cắt ngang để đánh giá tình hình nhiễm sán lá ruột nhỏ tại các tỉnh, thu thập mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành, nghiên cứu đặc điểm hình thái của sán lá ruột nhỏ, nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của một số loài sán lá ruột nhỏ, và đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ trên người tại cộng đồng.

3.1. Thu Thập Xử Lý Mẫu Sán Lá Ruột Trưởng Thành

Mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành được thu thập từ người bệnh sau khi điều trị bằng praziquantel. Các mẫu sán lá được nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm hình thái học. Các đặc điểm hình thái được ghi lại và phân tích để xác định loài sán lá.

3.2. Phân Tích Sinh Học Phân Tử Gen Ty Thể Gen Nhân

ADN từ các mẫu sán lá ruột nhỏ được chiết xuất và sử dụng để khuếch đại các đoạn gen ty thể (cox1) và gen nhân (28S) bằng kỹ thuật PCR. Các đoạn gen được giải trình tự và so sánh với các trình tự gen đã biết trong ngân hàng gen để xác định loài sán lá. Phân tích phả hệ được thực hiện để xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá.

3.3. Đánh Giá Hiệu Quả Điều Trị Praziquantel Tại Cộng Đồng

Hiệu quả điều trị sán lá ruột nhỏ bằng praziquantel liều 50mg/kg được đánh giá bằng cách xét nghiệm phân tìm trứng sán trước và sau khi điều trị. Tỷ lệ khỏi bệnh và giảm số lượng trứng sán trong phân được sử dụng để đánh giá hiệu quả điều trị. Nghiên cứu cũng xem xét tỷ lệ tái nhiễm sán lá sau điều trị.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Thành Phần Loài Đặc Điểm Hình Thái

Nghiên cứu đã xác định được một số loài sán lá ruột nhỏ ký sinh trên người tại Việt Nam, bao gồm Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio, Stellantchasmus falcatus, Centrocestus formosanus, và Echinostoma japonicus. Các loài sán lá ruột nhỏ này có đặc điểm hình thái khác nhau, đặc biệt là về kích thước cơ thể, vị trí và kích thước của giác miệng và giác bụng, và sự phân bố của gai trên cutin. Bảng 3 cung cấp thông tin chi tiết về đặc điểm hình thái của các loài sán lá ruột nhỏ này.

4.1. Đặc Điểm Hình Thái Của Haplorchis taichui

Haplorchis taichui là một trong những loài sán lá ruột nhỏ thường gặp nhất ở Việt Nam. Sán trưởng thành có kích thước nhỏ, khoảng 1-2 mm. Giác miệng và giác bụng có kích thước tương đương nhau. Gai trên cutin phân bố chủ yếu ở phần trước cơ thể.

4.2. Đặc Điểm Hình Thái Của Stellantchasmus falcatus

Stellantchasmus falcatus có hình dạng cơ thể dài và hẹp. Giác miệng lớn hơn giác bụng. Gai trên cutin phân bố đều trên toàn bộ cơ thể.

4.3. Đặc Điểm Hình Thái Của Echinostoma japonicus

Echinostoma japonicus có kích thước lớn hơn so với các loài sán lá ruột nhỏ khác. Vòng gai quanh miệng là một đặc điểm đặc trưng của loài này.

V. Thẩm Định Loài Sán Lá Bằng Phương Pháp Sinh Học Phân Tử

Phương pháp sinh học phân tử, sử dụng trình tự gen ty thể cox1 và gen nhân 28S, đã xác nhận và làm rõ thêm kết quả phân loại dựa trên hình thái. Phân tích phả hệ cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá ruột nhỏ ở Việt Nam và trên thế giới. Nghiên cứu cũng phát hiện sự khác biệt di truyền giữa các quần thể H. taichui ở các tỉnh khác nhau.

5.1. So Sánh Trình Tự Gen cox1 Sán Lá Ruột Nhỏ

Trình tự gen cox1 của các mẫu sán lá ruột nhỏ thu thập được từ Việt Nam đã được so sánh với các trình tự gen cox1 của các loài sán lá ruột nhỏ khác trong ngân hàng gen. Kết quả cho thấy sự tương đồng cao giữa các mẫu sán lá ruột nhỏ của Việt Nam và các mẫu sán lá ruột nhỏ từ các nước khác trong khu vực.

5.2. Phân Tích Phả Hệ Dựa Trên Gen 28S Ribosome

Phân tích phả hệ dựa trên trình tự gen 28S ribosome đã xác nhận mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá ruột nhỏ. Cây phả hệ cho thấy các mẫu sán lá ruột nhỏ từ Việt Nam tập trung thành các nhánh riêng biệt, cho thấy sự đa dạng di truyền của các loài sán lá ruột nhỏ ở Việt Nam.

5.3. Đa Dạng Di Truyền Quần Thể Haplorchis taichui

Nghiên cứu cũng phát hiện sự khác biệt di truyền giữa các quần thể H. taichui ở các tỉnh khác nhau, cho thấy sự phân bố địa lý có thể ảnh hưởng đến sự đa dạng di truyền của loài này.

VI. Đánh Giá Hiệu Quả Điều Trị Sán Lá Ruột Nhỏ Praziquantel

Praziquantel liều 50mg/kg chia 2 lần cho thấy hiệu quả điều trị tốt đối với sán lá ruột nhỏ tại cộng đồng. Tỷ lệ khỏi bệnh cao và số lượng trứng sán trong phân giảm đáng kể sau khi điều trị. Tuy nhiên, tỷ lệ tái nhiễm sán lá cũng là một vấn đề cần quan tâm.

6.1. Tỷ Lệ Nhiễm Sán Lá Trước Và Sau Điều Trị

Tỷ lệ nhiễm sán lá ruột nhỏ giảm đáng kể sau khi điều trị bằng praziquantel. Tuy nhiên, tỷ lệ tái nhiễm sán lá ruột nhỏ cũng tăng lên sau một thời gian, cho thấy cần có các biện pháp phòng ngừa tái nhiễm hiệu quả.

6.2. Ảnh Hưởng Của Praziquantel Đến Số Lượng Trứng Sán

Số lượng trứng sán trong phân giảm đáng kể sau khi điều trị bằng praziquantel. Điều này cho thấy praziquantel có hiệu quả trong việc giảm gánh nặng nhiễm sán lá ruột nhỏ trong cộng đồng.

6.3. Khuyến Nghị Phòng Ngừa Tái Nhiễm Sán Lá Hiệu Quả

Để phòng ngừa tái nhiễm sán lá ruột nhỏ, cần thực hiện các biện pháp vệ sinh cá nhân và vệ sinh môi trường, bao gồm rửa tay trước khi ăn, nấu chín thức ăn, và xử lý phân đúng cách. Cần tăng cường giáo dục sức khỏe cho cộng đồng về các biện pháp phòng ngừa sán lá ruột nhỏ.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh ký sinh trùng truyền qua thực phẩm, đặc biệt là các bệnh do sán lá truyền qua cá, đang là một vấn đề sức khỏe cộng đồng đáng lo ngại trên quy mô toàn cầu và khu vực. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có hơn nửa tỷ người trên thế giới có nguy cơ nhiễm các loại ký sinh trùng truyền qua thức ăn, trong đó khoảng 40 đến 50 triệu người nhiễm các loài sán lá ruột và ít nhất 18 triệu người nhiễm các loài sán lá truyền qua cá. Khoảng 70 loài sán lá ruột đã được ghi nhận ký sinh trên người tại nhiều quốc gia, tập trung chủ yếu ở hai họ Heterophyidae và Echinostomatidae.

Khi ký sinh trên cơ thể người, các loài sán lá ruột nhỏ không chỉ gây tổn thương tại chỗ ở niêm mạc ruột non (viêm, loét, teo nhung mao, rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy kéo dài) mà một số loài thuộc họ Heterophyidae như Stellantchasmus falcatus, Haplorchis spp., Procerovum spp. còn có thể gây hiện tượng ký sinh lạc chỗ. Trứng và sán trưởng thành có thể theo đường tuần hoàn xâm nhập vào van tim, tủy sống hoặc kết thành nang ở não gây các biến chứng thần kinh nặng nề dẫn đến tử vong.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung khảo sát ấu trùng sán lá ruột (metacercaria) trên các loài ốc và cá nước ngọt, hoặc ghi nhận sán trưởng thành ký sinh trên động vật nuôi và chim hoang dã. Các dữ liệu về đặc điểm hình thái học chi tiết và sinh học phân tử của sán lá ruột nhỏ trưởng thành ký sinh trên người còn thiếu hụt. Thêm vào đó, tại các ổ dịch tễ sán lá truyền qua cá, hiện tượng nhiễm phối hợp giữa sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini) và các loài sán lá ruột nhỏ diễn ra phổ biến. Do kích thước và hình thái trứng của các loài này tương đối đồng nhất, các kỹ thuật xét nghiệm phân truyền thống như Kato hoặc Kato-Katz không thể phân biệt được, gây khó khăn cho công tác chẩn đoán xác định và hoạch định chiến lược điều trị tại thực địa.

Xuất phát từ những khoảng trống nghiên cứu và nhu cầu thực tiễn đó, luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Đỗ Trung Dũng với đề tài "Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử sán lá ruột nhỏ trên người ở một số tỉnh và hiệu quả điều trị tại cộng đồng, năm 2010-2013" (Chuyên ngành: Ký sinh trùng - Côn trùng Y học, Mã số: 62 72 01 16, thực hiện tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, Hà Nội, năm 2014) được triển khai nhằm giải quyết 3 mục tiêu cụ thể:

1. Xác định thành phần loài, mô tả đặc điểm hình thái sán lá ruột nhỏ trên người tại một số tỉnh của Việt Nam.
2. Thẩm định loài sán lá ruột nhỏ bằng phương pháp sinh học phân tử.
3. Đánh giá hiệu quả điều trị sán lá nhỏ ở người bằng Praziquantel liều 50mg/kg tại cộng đồng.

Đối tượng nghiên cứu của luận án bao gồm: sán lá ruột nhỏ trưởng thành thu thập từ bệnh nhân sau khi tẩy sán bằng thuốc Praziquantel; trứng sán lá nhỏ trong phân người bệnh; người dân sống tại các điểm nghiên cứu dịch tễ có tập quán ăn gỏi cá. Phạm vi không gian nghiên cứu bao gồm việc thu mẫu sán lá tại các tỉnh đại diện như Hà Giang, Thanh Hóa, Quảng Trị, Nam Định và các khu vực lân cận; triển khai can thiệp đánh giá hiệu quả điều trị tại 2 xã (Nghĩa Hồng và Hải Hòa) thuộc huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định. Phạm vi thời gian nghiên cứu và can thiệp thực địa được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2010 đến năm 2013.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến đặc điểm sinh học, phân loại học, chu kỳ phát triển, dịch tễ học và chẩn đoán điều trị sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae và Echinostomatidae:

• Nghiên cứu trên thế giới: Các công trình của Pearson (1982), Ichiro Miyazaki (1991), Prayong (2004), Chai (1988) đã thiết lập các khóa phân loại hình thái chuẩn cho sán lá ruột nhỏ. Các thống kê dịch tễ của Jitra Waikagul và cộng sự ghi nhận Thái Lan có 14 loài sán lá ruột nhỏ ký sinh trên người, Philippines có 12 loài, Indonesia có 8 loài và Malaysia có 4 loài. Tại Hàn Quốc, điều tra quốc gia năm 2004 cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis) và sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae có chiều hướng gia tăng. Tại Lào, các khảo sát tại tỉnh Savannakhet ghi nhận tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ lên tới 67,1%, trong đó có sự nhiễm phối hợp phức tạp giữa O. viverrini với H. yokogawai, H. pumilio, H. taichui, Prosthodendrium molenkampi, Phaneropsolus bonnei và các loài thuộc họ Echinostomatidae.
• Nghiên cứu tại Việt Nam: Từ năm 1968, Nguyễn Thị Lê đã phát hiện Echinostoma revolutum ký sinh trên nhiều loài gia cầm và chim nước, sau đó ghi nhận Echinochasmus japonicus, Centrocestus formosanus, Procerovum cheni trên vịt, gà, cò bợ tại Hà Tây cũ và Hà Nội, cũng như Haplorchis taichui ký sinh ở diều hâu tại Nam Định (1995). Về ấu trùng sán lá trên cá (metacercaria), Hà Ký và Bùi Quang Tề đã tìm thấy nang ấu trùng của H. taichui, H. pumilio, S. falcatus, Centrocestus spp. trên nhiều loài cá nước ngọt như cá mè trắng, trắm cỏ, cá chép, rô đồng, cá diếc, cá bống bớp tại Nam Định, Cần Thơ, Nha Trang. Các nghiên cứu tiếp theo của Nguyễn Văn Đề, Dung và cộng sự (2006, 2007) đã ghi nhận sự lưu hành của các loài H. pumilio, H. taichui, S. falcatus, Centrocestus spp., Echinostoma spp. trên người tại Hà Tây, Nam Định, Yên Bái, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Thừa Thiên Huế với tỷ lệ nhiễm từ 0,2% đến 64,9% tùy từng vùng tập quán ăn gỏi cá.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù đã có những ghi nhận bước đầu, các dữ liệu về đặc điểm cấu tạo hình thái chi tiết của từng loài sán lá ruột nhỏ trưởng thành ký sinh trên người tại Việt Nam chưa được mô tả đầy đủ. Việc ứng dụng chỉ thị sinh học phân tử hệ gen ty thể (cox1) và hệ gen nhân (28S rDNA) để định loại chính xác và phân tích phả hệ di truyền quần thể sán lá ruột nhỏ ở các vùng địa lý khác nhau chưa được thực hiện có hệ thống. Đồng thời, luận án giải quyết vấn đề thực tiễn trong điều trị cộng đồng: đánh giá hiệu lực và tính an toàn của phác đồ Praziquantel liều 50mg/kg chia 2 lần trong ngày đối với việc làm sạch trứng và động học tái nhiễm theo thời gian tại các vùng dịch tễ trọng điểm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và phân loại học

Luận án dựa trên hệ thống phân loại sán lá nhỏ thuộc phân lớp Digenea, bộ Opisthorchiida, tập trung vào hai họ chính:

• Họ Heterophyidae: Gồm các giống Haplorchis (đặc trưng bởi 1 tinh hoàn, giác bụng sinh dục có cấu trúc phức tạp mang các hàng gai hình dáng khác nhau, có túi lưng), Stellantchasmus (có 2 tinh hoàn nằm đối diện hoặc lệch nhau, giác bụng có nhóm gai nhỏ ở rìa), Centrocestus (có 2 hàng gai xếp quanh giác miệng, 2 tinh hoàn nằm ngang ở phần sau cơ thể), Procerovum (có 1 tinh hoàn, túi mầm sinh dục expulsor phát triển).
• Họ Echinostomatidae: Gồm các giống Echinostoma, Echinochasmus (đặc trưng bởi đĩa đầu mang các vòng gai/móc kitin quanh giác miệng với số lượng gai định hình theo từng loài, tinh hoàn xếp trước - sau).

Về mặt sinh học phân tử, luận án vận dụng cơ sở di truyền của hai hệ thống chỉ thị:

1. Hệ gen ty thể (mitochondrial DNA): Có tốc độ đột biến tiến hóa nhanh hơn hệ gen nhân từ 10 đến 15 lần, di truyền theo dòng mẹ, không có hiện tượng tái tổ hợp, rất giá trị trong việc phân định các loài có quan hệ họ hàng gần và phân tích cấu trúc di truyền quần thể. Đoạn gen Cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) được lựa chọn làm chỉ thị chính.
2. Hệ gen nhân tế bào (nuclear ribosomal DNA): Cụm gen ARN ribosome nhân (18S - ITS1 - 5.8S - ITS2 - 28S), trong đó đoạn gen 28S ribosome (nLSU) có mức độ bảo tồn cao, thích hợp cho việc thẩm định quan hệ phân loại và cây phả hệ ở cấp độ loài và trên loài.

Phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa điều tra dịch tễ học cắt ngang, phân tích hình thái học thực nghiệm, kỹ thuật sinh học phân tử và thử nghiệm can thiệp cộng đồng:

Nội dung nghiên cứu	Đối tượng & Cỡ mẫu	Phương pháp / Kỹ thuật áp dụng	Chỉ số & Mục tiêu theo dõi
Dịch tễ & Thu mẫu sán	Người dân tại các điểm nghiên cứu; mẫu phân; mẫu sán trưởng thành.	Xét nghiệm phân định lượng bằng kỹ thuật Kato-Katz; cho người bệnh uống Praziquantel liều 25mg/kg sau đó uống thuốc tẩy muối magie sulfat để thu gom toàn bộ sán trưởng thành trong phân qua rây chuyên dụng.	Xác định tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ; thu thập mẫu sán phục vụ nghiên cứu hình thái và sinh học phân tử.
Hình thái học	Các cá thể sán lá ruột nhỏ trưởng thành thu được từ bệnh nhân.	Cố định mẫu bằng cồn 70% hoặc formalin, nhuộm màu bằng Semichon's acetocarmine, khử nước qua cồn tăng độ, làm trong bằng methyl salicylate/xylen và gắn tiêu bản bằng Canada balsam; quan sát và đo đạc kích thước dưới kính hiển vi quang học có trắc vi thị kính.	Đo chiều dài, chiều rộng cơ thể, kích thước giác miệng, giác hầu, giác bụng sinh dục, số lượng và hình thái gai sinh dục, kích thước tinh hoàn, buồng trứng, trứng sán.
Sinh học phân tử	29 chủng sán lá cho gen cox1 và 27 chủng cho gen 28S.	Tách chiết ADN tổng số; khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu; điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%; giải trình tự nucleotide trực tiếp bằng máy giải trình tự tự động ABI; xử lý dữ liệu bằng phần mềm BioEdit và MEGA; xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp Neighbor-joining (NJ).	Xác định trình tự đoạn gen cox1 (đoạn ~350 bp) và gen nhân 28S; phân tích khoảng cách di truyền, thiết lập cây phả hệ, phân tích đa dạng haplotype của H. taichui tại 3 tỉnh.
Can thiệp điều trị	Quần thể người dân tại 2 xã Nghĩa Hồng và Hải Hòa (huyện Nghĩa Hưng, Nam Định).	Thử nghiệm can thiệp cộng đồng: Điều trị bằng Praziquantel liều 50mg/kg chia 2 lần uống trong ngày; xét nghiệm phân đánh giá lại bằng kỹ thuật Kato-Katz tại các mốc: trước điều trị, sau 2 tuần, 4 tháng, 7 tháng và 15 tháng.	Đánh giá tỷ lệ sạch trứng (Cure Rate - CR), tỷ lệ giảm số trứng (Egg Reduction Rate - ERR), cường độ nhiễm (EPG) và tỷ lệ tái nhiễm theo thời gian.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày chi tiết về cấu tạo giải phẫu học, sinh học và chu kỳ phát triển của các loài sán lá ruột nhỏ. Cơ thể sán lá dẹp, phủ lớp biểu bì cutin có gai vảy; hệ cơ quan gồm giác miệng, giác bụng, hầu, thực quản, hai nhánh ruột tịt; hệ bài tiết gồm các tế bào ngọn lửa đối xứng đổ vào ống bài tiết và túi bài tiết mở ở mút sau cơ thể. Cơ quan sinh dục lưỡng tính có cấu tạo phức tạp, đặc trưng cho từng giống loài (tinh hoàn, túi chứa tinh, gai giao phối, buồng trứng, tuyến Mehlis, ống Laurer, tuyến noãn hoàng và tử cung).

Chu kỳ sinh học của sán lá ruột nhỏ bắt buộc phải trải qua hai vật chủ trung gian:

• Vật chủ trung gian thứ nhất: Các loài ốc nước ngọt (Melania, Melanoides tuberculata, Thiara granifera, Parafossarulus manchouricus, Semisulcospira spp.), trong đó ấu trùng lông (miracidium) phát triển qua các giai đoạn nang bào tử (sporocyst), bào tử trùng (redia) và ấu trùng đuôi (cercaria).
• Vật chủ trung gian thứ hai: Các loài cá nước ngọt thuộc các họ Cyprinidae, Siluridae, Cobitidae hoặc cá nước lợ (cá đối, cá bống bớp). Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cơ thịt, vây, mang cá và tạo thành nang ấu trùng (metacercaria).

Vật chủ chính (người, chó, mèo, gia cầm, chim ăn cá) bị nhiễm do ăn phải cá sống, gỏi cá hoặc cá chế biến chưa chín chứa metacercaria. Chương 1 cũng tổng kết sâu các tài liệu về giải phẫu bệnh học (tổn thương viêm xuất huyết, teo cụt nhung mao ruột, thâm nhiễm bạch cầu ưa acid), triệu chứng lâm sàng (tiêu chảy, đau bụng, mệt mỏi), các biến chứng ký sinh lạc chỗ ở van tim và não, cũng như cơ sở lý thuyết của việc giải mã hệ gen ty thể và gen nhân trong phân loại ký sinh trùng học.

Chương 2. Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết địa bàn nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu và quy trình kỹ thuật chuẩn:

• Địa điểm thu mẫu và can thiệp: Thu thập mẫu bệnh phẩm tại các tỉnh đại diện các vùng sinh thái địa lý (Hà Giang - miền núi phía Bắc; Thanh Hóa - Bắc Trung Bộ; Quảng Trị - Trung Trung Bộ; Nam Định - đồng bằng sông Hồng). Điểm can thiệp cộng đồng được chọn tại xã Nghĩa Hồng và xã Hải Hòa, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định.
• Quy trình thu thập sán trưởng thành: Bệnh nhân được chẩn đoán xác định có trứng sán lá nhỏ trong phân bằng kỹ thuật Kato-Katz được chỉ định uống Praziquantel liều duy nhất 25mg/kg cân nặng, sau 1 giờ uống thuốc tẩy magie sulfat (20-30g) kèm nhiều nước ấm. Toàn bộ phân thải ra trong 4-6 giờ tiếp theo được thu gom, gạn rửa nhiều lần qua rây kim loại mắt lưới mịn (đường kính lỗ 100-150 $\mu$m) dưới vòi nước chảy nhẹ để thu hồi sán trưởng thành dưới kính lúp cầm tay.
• Quy trình nhuộm và xử lý phân tử: Mô tả thành phần thuốc nhuộm Semichon's acetocarmine; quy trình tách chiết ADN bằng kit thương mại; thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen cox1 và gen nhân 28S ribosome.
• Quy trình can thiệp và xử lý số liệu: Triển khai uống Praziquantel 50mg/kg chia làm 2 lần cách nhau 4-6 giờ cho toàn bộ người dân có xét nghiệm phân dương tính tại 2 xã can thiệp; quy trình theo dõi tác dụng không mong muốn; phương pháp thống kê y học đánh giá tỷ lệ sạch trứng và số lượng trứng trung bình trên một gram phân (EPG).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 tổng hợp toàn bộ các kết quả định lượng thu được từ các nội dung nghiên cứu của luận án:

1. Kết quả định loại hình thái học sán lá ruột nhỏ: Luận án đã thu thập, xử lý nhuộm tiêu bản và định loại hình thái học thành công 5 loài sán lá ruột nhỏ ký sinh trên người tại các tỉnh nghiên cứu:

   • Haplorchis taichui: Thân hình quả lê nhỏ, kích thước chiều dài 500 - 850 $\mu$m, chiều rộng 250 - 400 $\mu$m. Đặc điểm đặc trưng nhất là giác bụng sinh dục mang một chùm gồm 12 - 16 gai lớn (chiều dài gai lên tới 30 $\mu$m) xếp thành hình nải chuối/hình trăng khuyết; có 1 tinh hoàn đơn nằm ở phần sau thân.
   • Haplorchis pumilio: Cơ thể hình lá thuôn dài, kích thước 450 - 750 $\mu$m $\times$ 180 - 320 $\mu$m. Giác bụng sinh dục mang một vành gồm 32 - 40 gai nhỏ xếp dạng hình chữ T hoặc hình chữ A; có 1 tinh hoàn lớn hình bầu dục nằm sát mút đuôi.
   • Stellantchasmus falcatus: Kích thước 400 - 650 $\mu$m $\times$ 200 - 350 $\mu$m. Có 2 tinh hoàn nằm đối xứng hai bên cơ thể; giác bụng biến đổi nằm lệch trục thân, có các nhóm gai nhỏ ở phần rìa.
   • Centrocestus formosanus: Kích thước nhỏ, đặc trưng bởi đĩa quanh giác miệng mang 32 gai móc xếp thành 2 hàng đều đặn; có 2 tinh hoàn nằm ngang ở phần sau cơ thể.
   • Echinochasmus japonicus: Thuộc họ Echinostomatidae, kích thước lớn hơn (900 - 1.450 $\mu$m $\times$ 280 - 450 $\mu$m). Đĩa đầu mang 24 móc gai xếp thành một hàng gián đoạn ở phần lưng; giác bụng phát triển lớn hơn giác miệng; 2 tinh hoàn xếp trước - sau.

2. Kết quả thẩm định sinh học phân tử:

   • Khuếch đại thành công đoạn gen ty thể cox1 (đoạn kích thước 350 bp) trên 29 chủng sán lá và đoạn gen nhân 28S ribosome trên 27 chủng đại diện.
   • Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen cox1 cho thấy mức độ đồng nhất hoàn toàn giữa các mẫu nghiên cứu của Việt Nam với các trình tự chuẩn tương ứng của các loài H. taichui, H. pumilio, S. falcatus, C. formosanus, E. japonicus được công bố trên Ngân hàng Gen thế giới (GenBank).
   • Cây phả hệ xây dựng bằng phương pháp Neighbor-joining dựa trên chỉ thị gen cox1 và gen nhân 28S đã phân định rõ ràng các nhánh phân loại của từng loài thuộc họ Heterophyidae và Echinostomatidae với giá trị bootstrap hỗ trợ cao.
   • Nghiên cứu đa dạng gen cox1 của loài H. taichui tại 3 tỉnh (Hà Giang, Thanh Hóa, Quảng Trị) đã xác định được các kiểu đơn di truyền (haplotype) khác nhau, phản ánh sự biến đổi di truyền quần thể gắn liền với yếu tố cách ly địa lý.

3. Kết quả đánh giá hiệu quả can thiệp điều trị tại cộng đồng:

   • Tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ ban đầu trước điều trị tại 2 xã Nghĩa Hồng và Hải Hòa (Nam Định) rất cao, dao động từ 37,0% đến 64,9%, trong đó tỷ lệ nhiễm ở nam giới cao vượt trội so với nữ giới (ở một số nhóm tuổi nam giới lên tới trên 68%) do thói quen ăn gỏi cá trong các dịp lễ hội, liên hoan.
   • Phác đồ Praziquantel liều 50mg/kg chia 2 lần uống trong ngày đạt tỷ lệ sạch trứng rất cao sau 2 tuần điều trị (đạt 98,5% - 100%), tỷ lệ giảm số trứng EPG đạt gần 100%. Thuốc dung nạp tốt, chỉ xuất hiện một số triệu chứng nhẹ thoáng qua như chóng mặt, đau đầu, buồn nôn nhưng tự hết trong vòng 24 giờ.
   • Theo dõi dọc sau điều trị ghi nhận tỷ lệ tái nhiễm tăng dần theo thời gian: sau 4 tháng tỷ lệ nhiễm bắt đầu xuất hiện trở lại; sau 7 tháng và 15 tháng, tỷ lệ nhiễm sán lá nhỏ tại cộng đồng có xu hướng tăng lên đáng kể (đạt khoảng 15% - 25% tại các mốc theo dõi), chứng minh sự tồn tại dai dẳng của tập quán ăn cá sống chưa được loại bỏ hoàn toàn.

Chương 4. Bàn luận

Chương Bàn luận của luận án tập trung phân tích sâu các luận điểm khoa học chính:

• Về giá trị định loại hình thái học: Luận án khẳng định cấu trúc giác bụng sinh dục và hệ thống gai sinh dục (ở họ Heterophyidae) cũng như số lượng móc gai đĩa đầu (ở họ Echinostomatidae) là tiêu chuẩn vàng mang tính quyết định trong định loại hình thái học. Tuy nhiên, do kích thước sán rất nhỏ và dễ bị biến dạng trong quá trình thu thập và cố định, kỹ thuật nhuộm Semichon's acetocarmine đòi hỏi sự chuẩn xác cao.
• Về ý nghĩa của phân tích sinh học phân tử: Chỉ thị gen ty thể cox1 thể hiện tính ưu việt trong việc định danh loài nhanh chóng, chính xác và phân tích cấu trúc quần thể nội loài, trong khi gen nhân 28S có giá trị xác lập vị trí phân loại học ở cấp độ họ và giống. Sự tương đồng cao về trình tự gen giữa các chủng Việt Nam và các chủng trong khu vực Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Trung Quốc) chứng minh tính thống nhất về mặt tiến hóa của các loài sán lá truyền qua cá trong khu vực.
• Về vấn đề dịch tễ học và nhiễm phối hợp: Luận án bàn luận chi tiết về thực trạng nhiễm phối hợp sán lá ruột nhỏ và sán lá gan nhỏ tại đồng bằng sông Hồng. Nghiên cứu chỉ ra rằng phần lớn các ca bệnh trước đây được chẩn đoán là sán lá gan nhỏ đơn thuần qua xét nghiệm phân thực chất là tình trạng đồng nhiễm nhiều loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae.
• Về hiệu quả phác đồ Praziquantel và chiến lược phòng chống: Phác đồ 50mg/kg chia 2 lần trong ngày cho hiệu lực làm sạch sán triệt để cả đối với sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ. Hiện tượng tái nhiễm sau 7 và 15 tháng phản ánh chu kỳ lây truyền trong tự nhiên vẫn duy trì mạnh mẽ qua nguồn ốc, cá nhiễm metacercaria và tập quán ăn uống của người dân. Do đó, việc can thiệp bằng thuốc (MDA) cần phải kết hợp chặt chẽ với truyền thông thay đổi hành vi không ăn gỏi cá và quản lý nguồn phân người/động vật.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Cung cấp bộ dẫn liệu hoàn chỉnh, có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về thành phần loài, các chỉ số kích thước và mô tả chi tiết đặc điểm giải phẫu hình thái học của 5 loài sán lá ruột nhỏ ký sinh trên người (Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio, Stellantchasmus falcatus, Centrocestus formosanus, Echinochasmus japonicus).
2. Thẩm định thành công danh tính loài của các chủng sán lá ruột nhỏ tại Việt Nam ở mức độ sinh học phân tử thông qua giải mã và phân tích trình tự đoạn gen ty thể cox1 và gen nhân 28S ribosome; đăng ký các chuỗi trình tự mới vào Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank).
3. Xác lập cây phả hệ di truyền phân tử và bước đầu chứng minh sự đa dạng về kiểu đơn (haplotype) của gen cox1 ở các quần thể Haplorchis taichui phân bố tại 3 vùng địa lý sinh thái khác nhau của Việt Nam (Hà Giang, Thanh Hóa, Quảng Trị).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

1. Chứng minh trên thực địa tình trạng nhiễm phối hợp phổ biến giữa sán lá ruột nhỏ và sán lá gan nhỏ trên người tại các vùng dịch tễ sán lá truyền qua cá, làm sáng tỏ hạn chế của kỹ thuật xét nghiệm phân Kato-Katz trong việc định danh trứng sán lá nhỏ.
2. Khẳng định hiệu lực làm sạch trứng cao (98,5% - 100%) và tính an toàn của phác đồ điều trị Praziquantel liều 50mg/kg chia 2 lần uống trong ngày đối với bệnh sán lá nhỏ tại cộng đồng.
3. Cung cấp các dẫn liệu dịch tễ học và động học tái nhiễm sán lá nhỏ theo thời gian (2 tuần, 4 tháng, 7 tháng, 15 tháng), làm cơ sở khoa học để Bộ Y tế và các cơ quan y tế dự phòng xây dựng phác đồ điều trị, chu kỳ phát thuốc tẩy sán định kỳ (MDA) và các biện pháp can thiệp phòng chống bền vững.

Kiến nghị đề xuất từ luận án

• Cần áp dụng phác đồ Praziquantel liều 50mg/kg chia 2 lần trong ngày để điều trị triệt để cho các bệnh nhân nhiễm sán lá nhỏ tại các vùng có lưu hành đồng thời sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ.
• Tăng cường công tác truyền thông giáo dục sức khỏe nhằm thay đổi tập quán ăn cá sống, gỏi cá chưa nấu chín của người dân tại các vùng ven sông, vùng nuôi trồng thủy sản.
• Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, Real-time PCR) trong giám sát dịch tễ học nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp xét nghiệm phân truyền thống.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án: Kỹ thuật xét nghiệm Kato-Katz tại thực địa không thể phân biệt được trứng sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ, việc xác định thành phần loài phụ thuộc vào việc thu hồi sán trưởng thành sau khi uống thuốc tẩy; số lượng mẫu thu thập của một số loài hiếm (Centrocestus formosanus, Echinochasmus japonicus) còn hạn chế; nghiên cứu sinh học phân tử mới dừng lại ở việc giải trình tự các đoạn gen chỉ thị (cox1, 28S) chứ chưa giải mã toàn bộ hệ gen ty thể (mitogenome).
• Hướng nghiên cứu tiếp theo: Phát triển và chuẩn hóa các kỹ thuật multiplex PCR hoặc ELISA phục vụ chẩn đoán phân biệt nhanh trực tiếp từ mẫu phân; tiến hành giải mã toàn bộ hệ gen ty thể của các loài sán lá ruột nhỏ phổ biến tại Việt Nam; mở rộng điều tra dịch tễ và cấu trúc di truyền quần thể sán lá tại các tỉnh miền Trung và miền Nam; nghiên cứu sâu hơn về cơ chế đáp ứng miễn dịch và tổn thương bệnh học khi nhiễm phối hợp nhiều loài sán lá.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cao đối với nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên ngành Ký sinh trùng Y học, Thú y, Sinh học thực nghiệm: Tham khảo phương pháp định loại hình thái học, kỹ thuật nhuộm tiêu bản Semichon's acetocarmine, quy trình khuếch đại PCR và phân tích phả hệ di truyền phân tử.
• Bác sĩ lâm sàng, cán bộ xét nghiệm truyền nhiễm: Cung cấp kiến thức về chẩn đoán phân biệt, triệu chứng lâm sàng và phác đồ sử dụng Praziquantel hiệu quả.
• Cán bộ Y tế dự phòng và các nhà hoạch định chính sách y tế công cộng: Cung cấp cơ sở khoa học, số liệu dịch tễ học và mô hình động học tái nhiễm phục vụ việc thiết kế các chương trình can thiệp phân phối thuốc điều trị hàng loạt (MDA) tại cộng đồng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao các kỹ thuật xét nghiệm phân thông thường như Kato-Katz không thể phân biệt được trứng sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae?
Trứng của sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae (như H. taichui kích thước 24,2-28,1 $\times$ 12,8-16,6 $\mu$m; H. pumilio kích thước 25,5-31,9 $\times$ 12,8-17,9 $\mu$m) có hình thái ô van, màu vàng nhạt, có nắp và kích thước gần như trùng khớp với trứng của sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis (25,5-30,6 $\times$ 12,8-15,3 $\mu$m). Do độ phóng đại và tính chất của kỹ thuật Kato-Katz, không thể phân biệt được nắp và mấu gai nhỏ ở đuôi trứng, dẫn đến việc không thể định danh chính xác loài chỉ qua soi kính hiển vi thông thường.

2. Tiêu chuẩn hình thái học quan trọng nhất để phân biệt hai loài Haplorchis taichui và Haplorchis pumilio là gì?
Tiêu chuẩn quyết định nằm ở cấu trúc và số lượng gai tại giác bụng sinh dục: Haplorchis taichui có một chùm gồm 12 đến 16 gai lớn (chiều dài lên tới 30 $\mu$m) xếp thành hình nải chuối/trăng khuyết; trong khi Haplorchis pumilio có một vành gồm 32 đến 40 gai nhỏ xếp dạng hình chữ T hoặc hình chữ A.

3. Tại sao tác giả lựa chọn chỉ thị gen ty thể cox1 và gen nhân 28S ribosome để thẩm định loài?
Gen ty thể cox1 có tốc độ tiến hóa nhanh, mức độ biến dị nucleotide phù hợp để phân biệt các loài có họ hàng gần và khảo sát cấu trúc phả hệ nội loài/quần thể. Ngược lại, gen nhân 28S ribosome có tính bảo tồn cao hơn, thích hợp để xác lập mối quan hệ phát sinh loài ở cấp độ loài, giống và họ, tạo nên sự phối hợp bổ trợ tin cậy trong phân loại học phân tử.

4. Phác đồ Praziquantel liều 50mg/kg chia 2 lần có ưu điểm gì trong điều trị cộng đồng tại các điểm nghiên cứu?
Tại các điểm dịch tễ sán lá truyền qua cá, người dân thường bị nhiễm phối hợp cả sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ. Phác đồ 50mg/kg chia 2 lần đảm bảo nồng độ thuốc đủ để tiêu diệt triệt để cả hai loại sán (đạt tỷ lệ sạch trứng 98,5% - 100%), đồng thời việc chia nhỏ liều giúp giảm thiểu các tác dụng phụ thoáng qua so với việc uống dồn một lần.

5. Kết quả theo dõi dọc sau can thiệp điều trị tại Nam Định cho thấy động học tái nhiễm diễn ra như thế nào?
Sau khi sạch trứng hoàn toàn ở tuần thứ 2, tỷ lệ nhiễm bắt đầu xuất hiện lại sau 4 tháng và tăng rõ rệt sau 7 tháng và 15 tháng (đạt khoảng 15% - 25%). Điều này chứng minh rằng việc điều trị bằng thuốc chỉ giải quyết mầm bệnh tạm thời trên người, nếu không chấm dứt tập quán ăn gỏi cá sống thì nguy cơ tái nhiễm từ nguồn cá mang metacercaria trong môi trường là rất cao.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đỗ Trung Dũng là một công trình nghiên cứu toàn diện, kết hợp chặt chẽ giữa hình thái học cổ điển, sinh học phân tử hiện đại và dịch tễ học can thiệp lâm sàng. Luận án đã mô tả chi tiết đặc điểm cấu tạo của 5 loài sán lá ruột nhỏ trên người tại Việt Nam, thẩm định chính xác loài bằng chỉ thị gen cox1 và 28S, đồng thời làm rõ mối quan hệ di truyền quần thể của Haplorchis taichui. Kết quả thử nghiệm can thiệp bằng Praziquantel 50mg/kg chia 2 lần đã chứng minh hiệu lực điều trị cao tại cộng đồng, cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho công tác chẩn đoán, điều trị và hoạch định chiến lược phòng chống bệnh sán lá truyền qua thực phẩm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU l. Một số đạc diem chung của sán lá 1. Đặc diêm sinh học cùa sán lá I linh the chung của sán lá dược trinh bày ớ hình I theo lãc gia lchiro Miyazaki (79]. Cư thè sân lá dọt.

lỗ sinh dục mở ờ mặt bụng. I linh dạng sán lá có the thay dổi phụ thuộc vào vị tri ký sinh cùa kỹ sinh trùng trên vật chú. Sân lã sống trong mạch máu vã ổng dẫn cùa các tuyển thường có hình dài. sán lá ký sinh ờ trong mô của các nội quan dược bao bọc trong nang thường có dạng hình cẩu.

co thè sán hĩnh lá chú yếu gặp ờ hộ tiêu hóa. Độc diêm hình the chung cũa sán lá trưởng thành (Ichiro. 1991) Mâu sắc của sán lá thường là màu trắng dục. màu hồng hoặc màu nâu.

Kích thước của cơ thê sán rầt biển dối. chủ yếu phụ thuộc vào nơi ký sinh cua cơ thè vật chủ. -c ZÍM «4 ugc V Hỉỉ 4 Cơ quan vận động: giác miệng (I) nằm ờ mút trước cơ thể, giác bụng (2) nằm ở mặt bụng ở phần trước cơ thể. Ờ sán lá ký sinh trong ống tiêu hóa giác bám thường phát triển.

Ngược lại sán lá ký sinh ở các cơ quan kín, các giác bám kém phát triển, dôi khi tiêu giảm. Các giác bám, móc, gai và vây giúp sán có the di chuyển hoặc bám chắc vào vị trí ký sinh. Kích thước, vị trí cùa các giác, hỉnh dạng và mức dộ phát triển của các móc gai còn có giá trị trong định loại các loài sán lá. Ngoài cùng cơ the sán phủ lớp biểu bì (cutin) thưởng có gai vày.

Gai cutin thường dài và dày ở nửa trirớc cơ the. Ở một số loài xung quanh giác miệng có móc kitin lớn. Dưới lớp tiểu bi là lớp hạ bì gồm lớp cơ vòng và cơ dọc tạo thành túi bao bì cơ. Bên trong là nội quan, giừa các nội quan chứa dầy nhu mô.

Ờ sán lá không có hệ tuần hoàn và hô hấp. Nội quan gồm có hệ tiêu hóa, bài tiết, thần kinh và hệ sinh dục. Cơ quan tiêu hóa: bắt dầu từ lồ miệng, nằm ở dáy giác miệng, tiep den hầu (3), thực quân (4) và hai nhánh ruột tịt (5) kéo dài về phía sau cơ thể, ở một số loài hai bên hai nhánh ruột có nhiều mấu bên, mấu phía ngoài nhánh ruột phân nhánh hình cành cây (ví dụ Fasciola gigantíca). Cặn thức ăn dược thãi ra ngoài qua lồ miệng.

Sán lá không có hậu môn vì dinh dường cùa sán chù yếu là hình thức thẩm thấu các chất dinh dưỡng qua bề mặt cùa sán. Do vậy, trên thân sán có rất nhiều luyến dinh dưỡng. Cơ quan bài tiết (màu vàng): cấu tạo theo kiểu nguyên dơn thận gồm 2 ống (7) chạy dọc cơ thể và nối với nhau lạo thành túi (ống) bài tiết chính (8) mờ ra ờ lỗ bài tiết (9) ờ mút sau cư thể, mỗi ống bài tiết có nhiều nhánh bé (6), Lận cùng có tể bào ngọn lừa thực hiện chức năng bài tiết. Các tế bào ngọn lửa thường dược sắp xếp dối xứng.

Vị trí vả số lượng của tế bào ngọn lừa dược sắp xếp như công thức, công thức tế bào ngọn lửa dược sử dụng dể phân biệt loài trong giai đoạn ấu trùng. Kích thước và hình dạng cùa túi bài tiết cùng hiệu quả trong định loại các loài sán.ĩịn íị: ■: 41 5 Cơ quan sinh dục dực: tinh dịch dược sàn xuất từ một, hai hoặc nhiều tinh hoàn (10), qua ổng dần tinh (11) dổ vào ổng dẫn tinh chung (12) tập trung vào túi chứa tinh (13) dược giãi phóng ra qua gai giao phối (15), tiếp theo túi chứa tinh là tuyến tiền liệt (14) bao quanh ống phóng tinh, bao quanh gai giao phổi và các tuyến sinh dục như túi chứa tinh, tuyến tiền liệt là túi sinh dục (16). Lồ sinh dục (17) mở ra ờ mặt bụng, thường ở trước giác bụng. Lồ sinh dục có thê là chung cùa cơ quan sinh dục đực và cái như trong hình vè hoặc cơ quan sinh dục dực và cái mở dộc lập.

Phần cuối của cơ quan sinh dục có cấu trúc phức tạp dặc trưng cho từng loài. Cơ quan sinh dục cái: vòi trứng ngắn từ buồng trứng (18) gặp túi nhận tinh (19) và ống Laurer (20) mở ở phía mặt lưng, tiếp theo đến ootype (21) dược bao quanh bởi dào Mchlis (22). Tiếp đến từ cung (23), tử cung dài với nhiều gấp khúc tới lỗ sinh dục chung (17). Óng nhò từ các tuyến noãn hoàng (24), trong hình 1.1 cỏ màu đen, tập trung dần vào ống noãn hoàng phải và trái rồi dổ vào ống noãn hoàng chung (25) mở vào phía trước ootype.

Quá trinh thụ tinh diễn ra ờ ootype. Lồ sinh dục cái thường nằm ở trước giác bụng. Hệ thằn kinh: gồm vòng thần kinh hầu nằm ở phần trước cơ thể, từ dó có các dây thần kinh chạy về phía sau và nối với nhau bời các cầu nối ngang. Phân loại Phân loại dề cập ở dây, chù yếu tập trung vào một số loài sán lá ruột nhỏ ký sinh dà dược phát hiện trên người tại Việt Nam và các nước Đông Nam Ă khác thuộc họ Heterophyidae và Echinostomatidac.

Phàn loại sán lá nhô [154] Giới: Động vật (Kingdom Animalia) Ngành: Sán dẹt (Phylum Platyhelminthes) Lớp: Sán lá (Class Trematoda) Phân lớp: Digenea (Subclass digenea) Bộ: Opisthorchiida (Order Opisthorchiida) 6 Họ: Bao gồm các họ I letcrophyidac, Echinoslomatidae, Plagiorchiidae, Cathacmaciidae, Fasciolidae, Gastrodiscidae, Gymnophallidae, Microphallidac, Strigcidac và Brachylaimidae. Nghiên cứu chủ yếu lập trung vào một sổ loài sán lá ruột nhỏ thuộc họ Hctcrophyidae và Echinostomatidae dà lừng dược phái hiện ký sinh trên người tại các nước Đông Nam Á. I lọ I Ictcrophyidae bao gồm một số loài thường gập: Haplorchis pumiỉio Heterophyes nocens Haplorchis taichui Metagoninius minutes Haplochis yokogawai Metagonimus yokogawai Procerovum varium Centrocestĩis armatus Stellantchasmusfalcatus Centrocestusformanus Heterophyes dispar Centrocestus formosanus Heterophyes heterophyes Centrocestus longus Họ Echinostomalidac bao gồm một số loài thường gặp: Echinochasmus japonicus Echinostoma revolution Echinostoma maỉayanum Echinostoma ilocanum 1. Đặc điểm phân loại hình thái học VC sán lá ruột nhỏ trường thành 1.

Dặc điểm hình thái học phân loại giống Haplorchìs, Proccrovuni. và Stdlantchasmus [115] Bâng 1. Một số dặc diem phân loại các giống sán lá ruột nhò thuộc họ Heterophyidac '^\Giống Đặc dierh'^. lỉaplorchis Procerovum Stellantchasmus Giác bụng sinh Có gai Có gai rất nhỏ Không có gai dục Tinh hoàn Một Một Một hoặc hai Túi lưng Có Không có Không có -•c «4 ugc V Hl 7 //.

Hình ảnh sán lá ruột Heterophyid trưởng thành (Pearson, 1982) (Thước do = 100 pin, GM: giác miệng, GBSĐ: giác bụng sinh dục, I I: hầu, R: ruột, BT: buông trứng, TCT: tủi chứa tinh, TH: tinh hoàn, độ phóng dại của ảnh so với thực tế 150 lần) Trên thực tế kích thước toàn thân của sán lá ruột nhò họ Heterophyidae rat nhỏ chi từ khoảng 350 - 1100 pin chiều dài và 120 - 650 pin chiều ngang. Đây là hình ảnh vẽ phóng dại các giống sán lá nhỏ họ Hctcrophyiadc của tá giã Pearson. Đặc điểm phần loại một sổ loài thuộc giống Hapỉorchis [115] II. pumiliot Sán trưởng thành cỏ dạng hình quả lê, giác bụng sinh dục có 32-40 gai cỏ hình chừ 1 hoặc hình chừ A, thủy trước bên không nổi rõ có một số gai nhò, thùy lưng giữa xuất hiện có nhiều gai nhỏ.

paraptnnỉlio: Giác bụng sinh dục có 23-32 gai bào vệ hình chừ 1 hoặc A. Thùy bên trước nhô lên cùng với một vài gai nhỏ, thùy lưng giữa xuất hiện với một vài gai. Phía trước cơ thể nhỏ mỏng có hình thìa, phía sau cơ thể phình to có hình quà lê. rủi lưng có gai bão vệ, giác bụng dơn giản, không phân chia thành thùy và những vành gai gát quàng.

vanissimus: 'l úi lưng có gai bảo vệ, giác bụng chia làm 4 thùy có nhiều gai nhò nối liền ờ bề mật giác bụng. taichuì: Giác bụng có 12-16 gai to lên tới 30 pin chiều dài (xếp thành hình nài chuối), ruột phân 2 nhánh kéo dài đến vị trí tinh hoàn. parataichui: Giác bụng có 15-21 gai kính thước lớn nhất lên tới 17 Ịim chiều dài. Ruột phân 2 nhánh không kéo dài xuống den vị trí tinh hoàn.

wellsi: Túi lưng không có gai, giác bụng rất to có 3 thủy hiện rõ. yokogawai: Giác bụng nhỏ hơn giác miệng, giác bụng có thùy bụng rât to cùng nhiều gai nhỏ li ti, có 3 thùy nhỏ. Ruột phân 2 nhánh kéo dài xuống vị trí giừa cúa tinh hoàn. sprenti: Giác bụng có một thùy bụng lớn và một thủy xoắn trái nhỏ, cà 2 đều có nhiều gai nhò, ruột phân nhánh không kéo dài tới vị tri giữa cùa tinh hoàn.

Đặc điềm phân loại một số loài thuộc giống Procerovum [115] p. cheni: Túi mầm sinh dục (cxpulsor) ngắn hơn 100 pm chiều dài, túi chứa tinh có 2 vách mỏng tách biệt. Ruột kéo dài tới vị tri giừa cùa tinh hoàn. Túi mầm sinh dục có kích thước 112 (96-140) pm chiều dài, ruột kéo dài tới vị trí trước cùa tinh hoàn.

caldcroni: Túi mầm sinh dục dài hơn 200 pin: Ruột kéo dài tới phần sau tinh hoàn.: Túi mam sinh dục ngắn hơn 100 pm, túi chứa tinh có một lớp vỏ mòng; Ruột không kéo dài dến vị trí tinh hoàn. Đặc điểm phân loại một sổ loài thuộc giống Stellantchasnius [115] 5. falcatus: Hai tinh hoàn dối diện nhau, giác bụng 2 nhóm gai nhô ờ phần rìa. batillans: Một tinh hoàn, giác bụng cỏ một mãnh gai to hình xẻng.

aspinosus: Hai tinh hoàn dối diện nhau, giác bụng không có gai. -•c «4 ugc V Hl 9 Ịiullinae: I lai tinh hoàn ớ vị trí trước san. giác bụng có gai hoặc không có gai nhó bao vệ. Dục diêm phân loại hình thái một sổ loài thuộc ỉỳổng Echiuostmua Echinostomatidac: ĐTa bám phát triền, linh hoàn xểp cái trước, cái san.

Móc sếp một hàng, không ngát quàng ờ lưng, có dường viền bụng. Túi sinh dục không vượt quá mép sau giác bụng. Tir cung phát triển chứa nhiều trứng 114|. Đầu cỏ 37 móc, tinh hoàn hình bầu dục hoậc phân thủy nông.

Tuyến noãn hoàn không lấp dầy khoáng trống phía sau tinh hoàn 114|. giác miệng nho hơn giác bụng, tinh hoàn phân nhánh nhiều nằm phía trước sau 1154|. ilocanum: Xung quanh giác miệng có 49-51 móc. tinh hoàn phán thùy |154|.japonicus: Dầu có 24 vòng móc.

giác bụng lớn hơn giác miệng nảin ớ khoang giữa cơ the. linh hoàn hình bầu dục nằm ở phía sau cơ the. Tuyền noãn hoàng bắt dầu ngay sau giác bụng 114 ị.