Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong xu hướng phát triển của y học hiện đại, việc tìm kiếm và khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu tự nhiên ngày càng được quan tâm nhằm hạn chế các tác dụng phụ không mong muốn từ thuốc tổng hợp hóa dược. Việt Nam nằm trong đới khí hậu nhiệt đới gió mùa với hệ thực vật phong phú, trong đó họ Tầm gửi (Loranthaceae) là nhóm thực vật sống bán ký sinh có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền. Tầm gửi sinh trưởng trên nhiều cây chủ khác nhau, đặc biệt là cây khế chua, và được người dân thu hái để làm thuốc hỗ trợ điều trị nhiều chứng bệnh. Tuy nhiên, các dữ liệu khoa học về thành phần hóa học chi tiết của lá tầm gửi trên cây khế chua tại Việt Nam còn tương đối hạn chế. Xuất phát từ thực tiễn đó, khóa luận tốt nghiệp cử nhân chuyên ngành Sư phạm Hóa học của tác giả Nguyễn Thị Thảo Nguyên đã thực hiện đề tài "Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học cao chiết ethanol của lá tầm gửi trên cây khế chua".

Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể gồm:

  1. Xác định thành phần hóa học trong cao chiết ethanol còn lại từ tổng cao ethanol của lá tầm gửi trên cây khế chua.
  2. Phân lập phân đoạn cao ethanol còn lại từ tổng cao ethanol của lá tầm gửi trên cây khế chua.
  3. Xác định thành phần hóa học trong các phân đoạn phân lập được bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá của cây tầm gửi ký sinh trên cây khế chua (Ligaria cuneifolia / họ Loranthaceae).
  • Phạm vi không gian: Mẫu nguyên liệu thực vật được thu hái tại quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được giao ngày 01/08/2017, hoàn thành thực nghiệm ngày 15/03/2018 và nộp báo cáo tốt nghiệp ngày 26/04/2018 tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu dựa trên hệ thống phân loại học thực vật APG III (2009), xếp họ Tầm gửi (Loranthaceae) thuộc bộ Đàn hương (Santalales). Đây là nhóm thực vật bậc cao bán ký sinh, có lá xanh tự quang hợp nhưng hệ thống rễ biến đổi thành giác mút đâm xuyên qua vỏ thân cây chủ để hút nước và dưỡng chất. Về mặt hóa học thực vật, các nghiên cứu tổng quan chỉ ra rằng các loài thuộc họ Tầm gửi chứa các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu gồm flavonoid (chiếm tỷ lệ lớn, khoảng 70% trong lá), tanin (polyphenol tự nhiên), các dẫn xuất đường khử (monosaccharide, disaccharide, polyol), cùng các hợp chất steroid, triterpenoid và glycoside.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quá trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các phương pháp hóa học và hóa lý:

  • Phương pháp chuẩn bị và xử lý mẫu: Lá tầm gửi tươi sau khi thu hái được làm sạch, phơi khô tự nhiên, nghiền thành bột mịn và bảo quản trong túi polyetylen đặt trong bình thủy tinh kín.
  • Phương pháp chiết mẫu: Sử dụng kỹ thuật chiết ngâm dầm (maceration) ở nhiệt độ phòng với dung môi ethanol 96° để thu nhận tổng cao ethanol; tiếp theo sử dụng kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, dichloromethane) để phân đoạn cao chiết.
  • Phương pháp hóa học định tính: Thực hiện các phản ứng tạo màu và kết tủa đặc trưng để nhận biết sự hiện diện của các nhóm chức hữu cơ (alkaloid, flavonoid, sesquiterpen lacton, terpenoid – steroid, chất béo, glycoside, hợp chất phenol).
  • Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel Kieselgel 60F254 (độ dày 0,2 mm) để khảo sát độ dịch chuyển $R_f$, tối ưu hóa hệ dung môi giải ly dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện màu bằng thuốc thử vanilin – $\text{H}_2\text{SO}_4$ 5% kèm gia nhiệt trên 100°C.
  • Phương pháp sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ pha tĩnh silica gel Merck 60 (cỡ hạt 230 – 400 mesh / 0,063 – 0,200 mm), nhồi cột theo phương pháp ướt và nạp mẫu theo phương pháp nạp mẫu khô để phân tách các cấu tử.
  • Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Định danh các cấu tử bay hơi có trong các phân đoạn dịch chiết dựa trên thời gian lưu và phổ phân mảnh khối lượng.

Dữ liệu và trang thiết bị nghiên cứu

  • Thiết bị phân tích: Hệ thống máy sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS 7890A/5975C của hãng Agilent và máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 100 Perkin Elmer tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2 (Đà Nẵng); máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS LAMBDA 25 tại Phòng thí nghiệm Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
  • Thiết bị và dụng cụ phụ trợ: Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, tủ sấy, lò nung, cân phân tích 3 số, hệ thống cất quay cô chân không, bếp cách thủy, sinh hàn hồi lưu, cột sắc ký thủy tinh kích thước đường kính $d = 5\text{ cm}$, chiều cao $h = 50\text{ cm}$.
  • Hóa chất: Ethanol 96%, n-hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, methanol loại tinh khiết (pure) và tinh khiết phân tích (PA).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này tổng thuật toàn diện các cơ sở lý luận và thực tiễn về đối tượng nghiên cứu:

  • Đại cương thực vật học: Giới thiệu họ Loranthaceae gồm khoảng 40 chi và 1400 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam ghi nhận 5 chi với khoảng 35 loài mọc hoang. Tác giả trình bày chi tiết hình thái thực vật của tầm gửi trên cây khế chua (thân gỗ giòn có phân đốt, lá đơn nguyên mọc đối hoặc chụm ba, hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, quả mọng chứa chất dính giúp phát tán hạt).
  • Tri thức bản địa và y học cổ truyền: Tổng hợp các kinh nghiệm dân gian sử dụng tầm gửi làm thuốc điều trị phong thấp, đau nhức xương khớp, ho, viêm đường ruột, giải độc gan. Ghi nhận các bài thuốc cổ truyền kinh điển như Độc hoạt ký sinh thang (tang ký sinh phối hợp độc hoạt, phòng phong, ngưu tất, đỗ trọng...) và Thiên ma câu đằng ẩm (tang ký sinh phối hợp thiên ma, câu đằng, chi tử, đỗ trọng...).
  • Cơ sở hóa học của các nhóm hoạt chất: Trình bày cấu trúc và vai trò sinh học của flavonoid (chất chống oxy hóa, sắc tố thực vật tham gia vào quá trình hấp thụ tia UV), tanin (polyphenol có tính kháng khuẩn, thuộc da, làm đông tụ protein), đường khử (glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose, manitol, sorbitol).
  • Tổng quan nghiên cứu trong và ngoài nước: Trích dẫn các công bố quốc tế (nhóm nghiên cứu Indonesia tách quercitrin và quercetin từ Dendrophthoe pentandra ký sinh trên cây khế; thử nghiệm hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư T47D) và các công bố tại Việt Nam (nhóm Nguyễn Hoàng Hạt năm 2009 cô lập $\beta$-sitosterol, $\beta$-sitosteryl arachidate từ lá tầm gửi trên cây mít; nhóm Phạm Văn Ngọt 2010–2011 thử nghiệm tính kháng khuẩn và độc tính trên các dòng tế bào ung thư HeLa, NCI-H460, MCF-7 của cao chiết tầm gửi).

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa qua từng công đoạn:

  • Quy trình định tính hóa học 7 nhóm chất trong dịch chiết:
    1. Alkaloid: Thử với thuốc thử Dragendorff (xuất hiện màu da cam) và thuốc thử Mayer (xuất hiện kết tủa trắng).
    2. Flavonoid: Phản ứng với $\text{H}_2\text{SO}_4$ đậm đặc đun cách thủy (chuyển đỏ/hồng) và phản ứng với dung dịch $\text{NaOH}$ 1%/ethanol (chuyển đỏ đậm hoặc đỏ tím).
    3. Sesquiterpen lacton: Thử bằng thuốc thử Tollens trong dung môi chloroform (tạo gương bạc hoặc kết tủa Ag đen).
    4. Terpenoid – Steroid: Thử với $\text{H}_2\text{SO}_4$ đậm đặc (chuyển đỏ đậm/xanh tím) và thử với dung dịch vanillin 1%/ethanol kèm $\text{HCl}$ đậm đặc (chuyển xanh lục hoặc tím).
    5. Chất béo: Phản ứng với dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ 50%/methanol (xuất hiện màu nâu đen hoặc đỏ tía).
    6. Glycoside: Tiến hành phản ứng Keller-Kilian với thuốc thử gồm axit axetic loãng, $\text{Fe}_2(\text{SO}_4)_3$ 5% và $\text{H}_2\text{SO}_4$ đậm đặc (xuất hiện màu xanh lục sau 1–2 phút).
    7. Phenol: Thử với thuốc thử Bortrager $\text{KOH}$ 50%/methanol (chuyển đỏ, tím hoặc xanh lục), phản ứng với dung dịch $\text{FeCl}_3$ 5%/ethanol (trầm hiện màu đỏ), và phản ứng với formol 36% kèm $\text{HCl}$ đậm đặc (trầm hiện màu đỏ).
  • Quy trình chiết ngâm dầm: Sử dụng 1 kg bột lá tầm gửi khô ngâm với ethanol 96° ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24 giờ mỗi lần (lần 1 dùng 8000 ml dung môi, các lần tiếp theo dùng 7000 ml dung môi), lọc gộp dịch chiết và cất thu hồi dung môi để thu cao tổng ethanol.
  • Quy trình chiết phân bố lỏng – lỏng: Hòa tan 50 g cao tổng ethanol trong lượng tối thiểu ethanol rồi phân tán vào nước cất, tiến hành chiết lỏng – lỏng lần lượt bằng n-hexane và dichloromethane (mỗi dung môi chiết 3 lần, mỗi lần 400 ml, thời gian lắc 3 giờ). Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được phân đoạn cao n-hexane, phân đoạn cao dichloromethane và phần cao ethanol còn lại.
  • Khảo sát hệ dung môi sắc ký bản mỏng (TLC): Thử nghiệm các dung môi đơn (n-hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, methanol) và các tỷ lệ phối hợp hệ dung môi ethyl acetate : dichloromethane (1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1). Kết quả cho thấy tỷ lệ ethyl acetate : dichloromethane = 9:1 cho khả năng phân tách vết rõ nét, khoảng cách vết tách biệt tốt và được chọn làm hệ dung môi khởi đầu cho quá trình rửa giải sắc ký cột.
  • Vận hành sắc ký cột: Sấy 150 g silica gel ở 130°C trong 4 giờ, nhồi ướt vào cột ($d = 5\text{ cm}, h = 50\text{ cm}$) với n-hexane. Nạp mẫu khô gồm 6 g cao hòa tan trong dung môi phối trộn với 3 g silica gel, cất khô và nghiền mịn. Tiến hành giải ly bằng hệ dung môi với độ phân cực tăng dần, thu thập các phân đoạn trong 179 lọ hứng (thể tích 15 ml/lọ, ký hiệu từ L1 đến L179).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các dữ liệu định lượng và định danh thực nghiệm thu được từ quá trình phân tích:

  • Kết quả thu nhận cao chiết: Đánh giá thể tích dịch chiết qua từng lần ngâm dầm, hiệu suất tạo tổng cao ethanol sau khi cô quay chân không đuổi dung môi, xác định khối lượng cao phân đoạn n-hexane, dichloromethane và cao ethanol còn lại.
  • Kết quả định tính nhóm chức: Phân tích các phản ứng hóa màu xác nhận sự có mặt của các nhóm hợp chất thứ cấp trong từng phân đoạn cao chiết.
  • Kết quả sắc ký cột và gộp phân đoạn: Dựa trên kiểm tra sắc ký bản mỏng của 179 lọ giải ly, các lọ có cùng giá trị $R_f$ và hình ảnh vết sắc ký tương đồng được gộp lại thành các phân đoạn chính để chuẩn bị cho bước phân tích phổ.
  • Kết quả phân tích GC-MS: Sắc ký đồ GC và phổ khối lượng MS ghi nhận sự xuất hiện của các píc cấu tử trong dịch chiết ethanol và các phân đoạn phân lập, cho phép định danh cấu trúc các hợp chất hữu cơ dựa trên ngân hàng phổ chuẩn.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra và ghi nhận các kết quả thực nghiệm cụ thể:

Hạng mục thực nghiệm Quy trình và thông số kỹ thuật Kết quả đạt được
Thu nhận tổng cao Ngâm dầm 1 kg bột lá khô với ethanol 96° (1 lần 8000 ml, 2 lần 7000 ml, 24 giờ/lần) Thu hồi toàn bộ dịch chiết, cô quay chân không tạo cao tổng ethanol
Phân đoạn lỏng – lỏng 50 g cao tổng phân tán trong nước, lắc với n-hexane và dichloromethane (3 lần x 400 ml) Thu được cao n-hexane, cao dichloromethane và phân đoạn cao ethanol còn lại
Khảo sát TLC Silica gel 60F254, soi UV 365 nm, thử nghiệm hệ dung môi đơn và hỗn hợp Chọn được hệ giải ly tối ưu bắt đầu từ ethyl acetate : dichloromethane (9:1)
Sắc ký cột cổ điển Cột $d=5\text{ cm}, h=50\text{ cm}$, 150 g silica gel sấy 130°C, nạp 6 g mẫu khô Thu thập 179 lọ phân đoạn giải ly (15 ml/lọ), gộp thành các phân đoạn đặc trưng
Định tính & GC-MS Phản ứng hóa màu chuyên biệt và phân tích trên Agilent 7890A/5975C Định tính các nhóm chất và định danh thành phần hóa học cấu tử trong phân đoạn

Đóng góp của đề tài:

  • Thiết lập quy trình chiết tách, phân đoạn và sắc ký cột phù hợp cho mẫu lá tầm gửi ký sinh trên cây khế chua tại địa bàn Đà Nẵng.
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa học của cao chiết lá tầm gửi, góp phần bổ sung tư liệu khoa học cho nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên từ chi Ligaria / họ Loranthaceae tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu chỉ tập trung vào mẫu nguyên liệu thu hái tại một địa điểm duy nhất (quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng) trong một thời điểm nhất định; phương pháp định danh bằng GC-MS bị giới hạn ở các hợp chất bay hơi, bền nhiệt và có khối lượng phân tử đặc trưng dưới 500 amu, chưa phân tích được các hợp chất phân tử lượng lớn hoặc kém bền nhiệt.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng lấy mẫu tầm gửi trên cây khế ở các vùng sinh thái khác nhau để so sánh hàm lượng hoạt chất; áp dụng thêm các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để cô lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân cực cao; triển khai thử nghiệm các hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme) của các phân đoạn thu được.

Giá trị tham khảo

Công trình khóa luận là tài liệu tham khảo thực tế cho:

  • Sinh viên, học viên ngành Sư phạm Hóa học, Hóa học phân tích, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Dược liệu học khi tìm hiểu quy trình chiết tách thực vật.
  • Người làm đề tài nghiên cứu về thực vật ký sinh họ Tầm gửi (Loranthaceae) có thể tham khảo chi tiết quy trình thực nghiệm định tính 7 nhóm hoạt chất hóa học, phương pháp chuẩn bị cột sắc ký và kinh nghiệm tối ưu hóa hệ dung môi rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng TLC.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu nguyên liệu nghiên cứu trong khóa luận được thu hái ở đâu và xử lý ban đầu ra sao?
Mẫu lá tầm gửi ký sinh trên cây khế chua được thu hái tại quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng. Mẫu tươi sau khi thu hái được phơi khô tự nhiên, nghiền thành bột mịn và bảo quản trong bao polyetylen đặt trong hộp nhựa có nắp đậy kín.

2. Tác giả đã sử dụng kỹ thuật nào để phân đoạn từ tổng cao ethanol?
Tác giả sử dụng kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng. Lấy 50 g cao ethanol hòa tan trong một lượng ethanol tối thiểu, phân tán đều vào nước cất, sau đó chiết nối tiếp lần lượt với hai dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexane và dichloromethane (mỗi loại chiết 3 lần, mỗi lần 400 ml, thời gian lắc 3 giờ).

3. Hệ dung môi nào được lựa chọn để bắt đầu quá trình rửa giải trên sắc ký cột?
Qua khảo sát trên bản mỏng silica gel 60F254 dưới đèn UV 365 nm với nhiều hệ dung môi, tác giả lựa chọn hệ ethyl acetate : dichloromethane theo tỷ lệ 9:1 làm hệ dung môi khởi đầu để giải ly, sau đó tăng dần độ phân cực.

4. Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) sử dụng trong đề tài có model gì và đặt tại cơ sở nào?
Thiết bị sử dụng là máy sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS model 7890A/5975C của hãng Agilent, được thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2 – Đà Nẵng.

5. Nhóm chất flavonoid được định tính bằng những phản ứng hóa học nào trong đề tài?
Flavonoid được định tính qua 2 phản ứng: (1) Hòa tan cao chiết trong methanol, thêm vài giọt $\text{H}_2\text{SO}_4$ đậm đặc và đun cách thủy vài phút, dung dịch chuyển sang màu đỏ hoặc hồng; (2) Thêm vài giọt dung dịch $\text{NaOH}$ 1%/ethanol vào dịch lọc, dung dịch chuyển sang màu đỏ đậm hoặc đỏ tím.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thảo Nguyên đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình thực nghiệm chiết ngâm dầm, chiết phân bố lỏng – lỏng và sắc ký cột để phân lập các phân đoạn từ lá tầm gửi trên cây khế chua tại Liên Chiểu, Đà Nẵng. Nghiên cứu đã xác lập các điều kiện tối ưu cho hệ dung môi giải ly bản mỏng và sắc ký cột, đồng thời tiến hành định tính các nhóm hoạt chất hữu cơ chính cùng việc ứng dụng kỹ thuật GC-MS để định danh cấu tử. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm có giá trị cho hướng khai thác và nâng cao tiềm năng ứng dụng của nguồn dược liệu họ Tầm gửi.