Luận văn tốt nghiệp: Nghiên cứu chiết tách và hoạt tính sinh học từ lá đu đủ đực Carica papaya

Luận văn nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học dịch chiết n-hexane lá đu đủ đực tại Quảng Nam - Đà Nẵng.

• Tác giả: Trần Thị Đức Ý
• Người hướng dẫn: GS. Đào Hùng Cường
• Trường học: Đại học Đà Nẵng
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chiết Tách Và Xác Định Hoạt Tính Sinh Học Từ Lá Đu Đủ Đực Tại Quảng Nam - Đà Nẵng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Đà Nẵng

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 0.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 0.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 0.4. Phương pháp nghiên cứu
• 0.4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
• 0.4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
• 0.5. Bố cục của khóa luận tốt nghiệp
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về cây Đu đủ
• 1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Đu đủ trong nước
• 1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Đu đủ ngoài nước
• 1.4. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ
• 1.4.1. Tác dụng kháng sinh, kháng nấm
• 1.4.2. Tác dụng trị u bướu, ung thư
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu hóa lý
• 2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học trong lá Đu đủ đực
• 2.2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật
• 2.2.2.2. Phương pháp định danh thành phần hóa học các hợp chất
• 2.2.2.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực
• 2.2.2.4. Sơ đồ điều chế các cao chiết
• 2.2.3. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane
• 2.2.3.1. Quy trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ đực để nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư
• 2.2.3.2. Các dòng tế bào
• 2.2.3.3. Phương pháp
• 2.2.3.4. Thử độc tế bào
• 2.2.3.5. Định danh thành phần hóa học dịch chiết n-hexane
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả xác định một số đại lượng vật lý
• 3.1.1. Hàm lượng tro
• 3.1.2. Hàm lượng kim loại
• 3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết hợp chất hóa học lá Đu đủ đực trong dung môi n-hexane
• 3.2.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết ngâm dầm
• 3.2.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết ngâm dầm trong dung môi n-hexane
• 3.2.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ Rắn/Lỏng (R/L) chiết trong dung môi n-hexane
• 3.2.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết soxhlet trong dung môi n-hexane
• 3.2.5. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp chiết siêu âm
• 3.2.6. Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm trong dung môi n-hexane
• 3.3. Kết quả định tính các lớp chất trong lá Đu đủ đực
• 3.4. Kết quả điều chế cao chiết
• 3.5. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane từ lá Đu đủ đực
• 3.6. Kết quả khảo sát thành phần hóa học dịch chiết n-hexane lá Đu đủ đực bằng phương pháp GC-MS
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Nghiên cứu về chiết tách hoạt chất từ lá đu đủ đực (Carica papaya L.) tại Quảng Nam - Đà Nẵng có ý nghĩa quan trọng trong bối cảnh y học hiện đại. Sự gia tăng bệnh tật trong xã hội hiện nay đã thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các phương pháp điều trị an toàn và hiệu quả hơn. Việc sử dụng các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên, như lá đu đủ, đang trở thành xu hướng phổ biến. Lá đu đủ đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm khả năng kháng viêm, kháng khuẩn và đặc biệt là khả năng chống ung thư. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin khoa học về thành phần hóa học của lá đu đủ đực mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong điều trị bệnh, đặc biệt là ung thư. Điều này rất cần thiết để tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng lá đu đủ trong y học, từ đó nâng cao giá trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là chiết tách, xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane từ lá đu đủ đực. Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc xác định các hợp chất sinh học có trong lá đu đủ, từ đó đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Việc này không chỉ giúp làm rõ giá trị của lá đu đủ đực mà còn góp phần vào việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên có khả năng điều trị bệnh. Đặc biệt, nghiên cứu sẽ thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết n-hexane trên các dòng tế bào ung thư, nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo và ứng dụng thực tiễn trong y học.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp chiết xuất thực vật và phân tích hóa học. Các phương pháp chiết xuất bao gồm ngâm dầm, chiết soxhlet và chiết siêu âm, nhằm tìm ra phương pháp chiết tối ưu cho lá đu đủ đực. Sau khi chiết xuất, dịch chiết sẽ được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để xác định thành phần hóa học. Đồng thời, các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học sẽ được áp dụng để đánh giá khả năng gây độc tế bào của dịch chiết n-hexane. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại trong nghiên cứu sẽ đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả, từ đó cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng lá đu đủ trong điều trị bệnh.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy lá đu đủ đực chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đáng chú ý. Các hợp chất như carpaine và pseudocarpaine đã được xác định có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong các thử nghiệm in vitro. Điều này khẳng định giá trị của lá đu đủ đực trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng lá đu đủ có khả năng kháng viêm và kháng khuẩn, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên. Những kết quả này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao, góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị an toàn và hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã xác định được thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của dịch chiết n-hexane từ lá đu đủ đực. Kết quả cho thấy lá đu đủ đực có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu. Để phát huy giá trị của lá đu đủ, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất có trong lá và khả năng ứng dụng của chúng trong y học. Đồng thời, việc phổ biến kiến thức về công dụng của lá đu đủ trong cộng đồng cũng rất cần thiết, nhằm nâng cao nhận thức và khuyến khích việc sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên trong điều trị bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Phần mở đầu (3 trang) Chƣơng 1 – Tổng quan tài liệu (13 trang) Chƣơng 2 – Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (13 trang) Chƣơng 3 – Kết quả và thảo luận (15 trang) Kết luận và kiến nghị (2 trang) Tài liệu tham khảo (4 trang) 3 Luan van CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ Đu đủ (Carica Papaya L. Nguồn gốc Châu Mỹ đƣợc trồng khắp nơi ở nƣớc ta.

Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nƣớc ta có một chi và một loài [1]. Cây Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2-4 mét, thân thẳng, không phân nhánh.

Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1]. Cây Đu đủ còn đƣợc gọi Thù đủ, Phiên mộc, Cà lào, Phiên qua, Phan qua thụ, Lô hong phlê (Campuchia), Mắc hung (Lào), Má hống (Thái). Đu đủ thƣờng là cây đồng chu, nhƣng Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phƣơng diện giới tính: cây đực, cây lƣỡng tính và cây cái.

Vài cây Đu đủ cũng có thể thuộc cả ba loại nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lƣỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa (Hình 1. Khuynh hƣớng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra nhƣ khô hạn và thay đổi nhiệt độ [5]. Ở Việt Nam, một số giống Đu đủ hiện nay đang đƣợc trồng bao gồm: - Giống Đu đủ ta: bao gồm các giống Đu đủ có từ lâu đời ở nƣớc ta.

Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trƣởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thƣờng có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp. - Giống Đu đủ Mehico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ XX. Quả dài, tƣơng đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao.

Lá xanh đậm, phiến lá dày, cuống lá to, màu xanh. - Giống Đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là Đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trƣởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lƣợng tốt, năng suất cao. Là giống yêu cầu nhiệt cao nên đƣợc trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam.

4 Luan van - Giống Đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc. Cây thấp, sinh trƣởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày.

- Giống Đu đủ Thái Lan: là giống đƣợc nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lƣợng tốt. Tuy nhiên giống này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá. - Giống Đu đủ Đài Loan: là giống mới đƣợc nhập trồng trong thời gian gần đây.

Cây thấp, sinh trƣởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60-70 kg quả/ cây. Thịt quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày [9]. A: hoa cái B: hoa lƣỡng tính C: hoa đực D: trái của cây cái E: trái lƣỡng tính F: cây đực H nh 1.

H nh ảnh Đu đủ 5 Luan van 1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ TRONG NƢỚC Năm 1983, Nguyễn Tƣờng Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định đƣợc alcaloid carpaine trong lá Đu đủ [10]. Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tƣơng ứng là 57,050% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định đƣợc lycopene [7].

Năm 2012, Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp đã phân lập đƣợc 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexane của lá Đu đủ. Bao gồm, β-sitosterol, daucosterol, cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol. Trong đó, sterculin và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol là 2 triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [3]. Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá Đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, buthanol).

Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập đƣợc 6 hợp chất: danielone, carpainone, acid pluchoic, apocynol , carpaine, pseudocarpaine. Trong đó carpainone là hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol lần đầu tiên đƣợc phân lập từ lá Đu đủ [4]. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ NGOÀI NƢỚC Trên thế giới, năm 1965, Govindachari T. đã xác định đƣợc cấu trúc của carpaine và pseudocarpaine là alcaloid đƣợc phân lập từ lá Đu đủ 30].

Năm 1979, Chung-Shih Tang đã phân lập đƣợc 2 alcaloid piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá Đu đủ [31]. và cộng sự đã xác định đƣợc glycoside là prunasin và sambunigrin trong lá và thân Đu đủ [28]. 6 Luan van Năm 2007, ntonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp chất phenol trong lá Đu đủ cho kết quả các hợp chất nhƣ sau: acid caffeic, acid p-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumair [18]. và cộng sự đã tổng hợp các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học các bộ phận cây Đu đủ, phát hiện trong lá Đu đủ có những chất nhƣ sau: Alcaloid carpaine, pseudocarpain và dehydrocarpaine I và II, choline, carposide, vitamin C, E [22] Năm 2012, dlin fzan và cộng sự đã xác định đƣợc 12 hợp chất có trong lá Đu đủ [15] bao gồm alcaloid piperideine là carpaine; acid hữu cơ: acid malic, acid quinic; dẫn xuất của acid malic: caffeoyl malate, ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ- coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2); flavonol glycoside: quercetin-3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranoside (manghaslin), kaempferol-3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl)glucopyranoside (clitorin), quercetin-3-O-rutinoside (rutin), kaempferol-3-O-rutinoside (nicotiflorin).

Sahira Banu đã khảo sát thành phần hóa học của lá Đu đủ cái ở Ấn Độ với 7 dung môi ethanol, methanol, aceton, chloroform, petroleum ether, hexane và ethyl acetate. Kết quả cho thấy sự có mặt của các hợp chất phenol, protein, amino acid, carbohydrate, glycoside, flavonoid, saponin, alcaloid, phytosterol và terpenoid [23]. Dƣới đây là công thức cấu tạo các hợp chất hóa học trong lá Đu đủ: β-sitosterol Daucosterol 7 Luan van Sterculin A Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol Carpaine Pseudocarpaine Dehydrocarpaine I Dehydrocarpaine II Kaempferol Acid protocatechuic H nh 1. Công thức cấu tạo các hợp chất trong lá Đu đủ 8 Luan van Bảng 1.

Thành phần hóa học lá Đu đủ Nhóm chất Thành phần hóa học Phenolic, 5,7-dimetthoxy coumarin, xit Protocatechui, xit ρ-coumaric, Flavonoid Axit Caffeic, Kaempferol, Quercetin Alcaloid Carpaine, Pseudocarpain và Dehydrocarpaine I và II, Choline Glycoside Prunasin, Sambunigrin Sterol β-sitosterol, Daucosterol Triterpene Sterculin A và Cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol Acid malic, Acid quinic; dẫn xuất của Acid malic: caffeoyl Acid hữu cơ malate, ρ-coumaroyl malate (isomer 1), ρ-coumaroyl malate (isomer 2), feruloyl malate (isomer 1), feruloyl malate (isomer 2) Như vậy, thành phần hóa học lá Đu đủ cái đã được nghiên cứu. Chưa thấy nghiên cứu trên lá cây Đu đủ đực. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ ĐU ĐỦ Các phƣơng pháp nghiên cứu về hoạt tính sinh học, dƣợc lý của thực vật đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm [2, 26, 34]. Hoạt tính sinh học của lá Đu đủ đƣợc các nhà khoa học trong nƣớc và trên thế giới công bố khá phong phú.

 Tác dụng kháng sinh, kháng nấm Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006) công bố nghiên cứu cao lá Đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.rubrum và Staphylococcus aureus [1]. và cộng sự nghiên cứu dịch chiết ethanol 95% của lá đƣợc thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm và gram dƣơng tại nồng độ 5 và 10 mg/mL. Kết quả cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của lá 1250-5000 μg/L [29]. Năm 2012, Moses lo và cộng sự đã chứng minh dịch chiết lá đu đủ bằng nƣớc lạnh và ethanol đều có hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi [17].

Kayalvizhi và cộng sự đã công bố hoạt tính kháng khuẩn của lá Đu đủ cái thu hái ở Ấn Độ đối với các vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol lá Đu đủ cái ức chế các vi khuẩn gram dƣơng: Staphylococcus aureus và Staphylococcus faecalis và các vi khuẩn gram âm: Escherichia coli, Klebsiella pneumonis, Enterobacter aerogenes, Salmonella paratyphi, Vibro chloreae [23]. Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định hầu hết lá Đu đủ cái có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm. Chưa có công bố về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của lá Đu đủ đực.

 Tác dụng trị u bƣớu, ung thƣ Năm 2001, tác giả Phạm Kim Mãn và cộng sự đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thƣ Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thƣ, giảm sự tăng sinh khối u [6]. Theo Đỗ Thị Thảo (năm 2006), cặn chiết methanol của lá Đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ phổi LU với IC50 = 19,2 μg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thƣ khác nhƣ ung thƣ biểu mô KB, ung thƣ v MCF-7, ung thƣ máu cấp tính HL-60, ung thƣ tiền liệt tuyến LNCaP, ung thƣ gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [8].

Năm 2006, Rumiyati và Sismindari dan riyani đã chứng minh trong lá Đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs). RIPs có khả năng gây độc tế bào in vitro trên các d ng tế bào ung thƣ v T47D với IC50 = 2,8 μg/mL. Đồng thời nghiên cứu này đã chứng minh ảnh hƣởng của protein có chứa RIPs lên gen p53 và Bcl-2, ảnh hƣởng của các protein đến quá trình phân bào của dòng tế bào ung thƣ v T47D. Mức độ biểu hiện của p53 tăng lên đến 59,4% còn protein Bcl-2 giảm xuống còn 63%.

Các kết quả này cho thấy RIPs có khả năng dẫn đến quá trình tự chết của tế bào ung thƣ 35]. 10 Luan van Năm 2014, Hồ Thị Hà đã xác định đƣợc phân đoạn dịch chiết CH2Cl2 của lá Đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thƣ phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thƣ v MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/mL). Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ phân đoạn CH2Cl2 của lá Đu đủ lần đầu tiên đƣợc chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thƣ ngƣời: ung thƣ biểu mô KB, ung thƣ máu HL-60, ung thƣ phổi LU-1, ung thƣ v MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) [4].