Luận Văn Thạc Sĩ: Nghiên Cứu Biểu Hiện Lysin Của Bacteriophage Chủng K Đặc Hiệu Staphylococcus Aureus Trong Escherichia Coli

• Tác giả: Vũ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Lysin Của Bacteriophage Chủng K Đặc Hiệu Staphylococcus Aureus Trong Escherichia Coli
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• MỤC LỤC
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Cơ sở thực tiễn và cơ sở khoa học của đề tài
• 2.2. Tình trạng kháng kháng sinh
• 2.2.1. Tình hình kháng kháng sinh trên thế giới
• 2.2.2. Tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam
• 2.3. Các phương pháp điều trị bệnh do vi khuẩn
• 2.3.1. Các peptide kháng vi sinh vật
• 2.3.2. Phương pháp chống độc
• 2.3.3. Liệu pháp sử dụng phage và lysin phage
• 2.3.4. Liệu pháp kháng thể
• 2.3.5. Vaccine
• 2.3.6. Các loại thuốc kháng sinh và kháng khuẩn sinh học
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.3. Trang thiết bị
• 3.4. Môi trường và dung dịch làm việc
• 3.5. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
• 3.7.2. Phương pháp điện di trên gel Agarose
• 3.7.3. Thu nhận DNA từ gel agarose (thôi gel)
• 3.7.4. Gắn đoạn gen mã hóa lysin vào vector biểu hiện
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
• 3.7.8. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli
• 3.7.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
• 3.7.10. Phương pháp biểu hiện - xác định trạng thái tồn tại của lysin
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thiết kế vector biểu hiện
• 4.2. Kết quả thiết kế vector pET32(a+) mang gen lysK
• 4.3. Chọn lọc các dòng plasmid mang gen lysK bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 4.4. Kiểm tra chiều gắn khung đọc của đoạn chèn trong vector pET32a(+)
• 4.5. Biểu hiện gene mã hóa lysin trong vi khuẩn
• 4.6. Biểu hiện lysin phage trong vi khuẩn E. coli
• 4.7. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào biểu hiện lysin của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus trong Escherichia coli. Mục tiêu chính là thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa lysin, biểu hiện thành công gen này trong E. coli chủng BL21 starTM (DE3), và tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện. Lysin, một enzyme thủy phân peptidoglycan, có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát và điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, đặc biệt là các chủng kháng kháng sinh.

1.1. Cơ sở khoa học

Bacteriophage là virus lây nhiễm vi khuẩn, và lysin là enzyme giúp phá vỡ thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối của chu kỳ ly giải. Staphylococcus aureus, đặc biệt là các chủng kháng methicillin (MRSA), là mối đe dọa lớn trong y tế. Việc biểu hiện lysin trong E. coli mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng khuẩn thế hệ mới.

1.2. Mục tiêu cụ thể

Nghiên cứu nhằm thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) mang gen lysK, biểu hiện thành công lysin trong E. coli, và tối ưu hóa các điều kiện như nhiệt độ và nồng độ IPTG để đạt hiệu quả biểu hiện cao nhất. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các ứng dụng thực tiễn trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh.

II. Tổng quan về tình trạng kháng kháng sinh

Tình trạng kháng kháng sinh đang trở thành vấn đề toàn cầu, đặc biệt là với các chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus và Escherichia coli. Báo cáo của WHO năm 2014 chỉ ra rằng khả năng kháng thuốc kháng sinh đang xảy ra trên khắp thế giới, gây ra nhiều rủi ro trong điều trị các bệnh nhiễm trùng. Staphylococcus aureus, đặc biệt là MRSA, là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất với tỷ lệ kháng kháng sinh cao.

2.1. Tình hình toàn cầu

Theo báo cáo của WHO, Escherichia coli và Staphylococcus aureus là hai trong số các vi khuẩn có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất. MRSA đã trở thành mối đe dọa lớn trong các bệnh viện, với tỷ lệ kháng methicillin lên đến 63% vào năm 2004. Điều này đòi hỏi các giải pháp thay thế kháng sinh truyền thống.

2.2. Tình hình tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh cũng đang ở mức báo động. Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng penicillin và erythromycin ở Streptococcus pneumoniae lần lượt là 71.4% và 92.1%. Staphylococcus aureus cũng có tỷ lệ kháng kháng sinh cao, đặc biệt là với các loại kháng sinh phổ biến như methicillin và cephalosporin.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) mang gen lysK, biến nạp vào E. coli chủng BL21 starTM (DE3), và tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện. Các bước bao gồm cắt và gắn gen bằng enzyme giới hạn, điện di DNA, tách chiết plasmid, và biểu hiện protein tái tổ hợp.

3.1. Thiết kế vector biểu hiện

Vector pET32a(+) được sử dụng để mang gen lysK. Gen này được cắt bằng enzyme giới hạn và gắn vào vector. Sau đó, vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli để biểu hiện lysin. Quá trình này được kiểm tra bằng phương pháp điện di DNA và xác định trình tự gen.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện

Các điều kiện như nhiệt độ và nồng độ IPTG được tối ưu hóa để đạt hiệu quả biểu hiện cao nhất. Kết quả biểu hiện lysin được đánh giá bằng phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide. Nghiên cứu cũng xác định trạng thái tồn tại của lysin trong tế bào E. coli.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) mang gen lysK và biểu hiện lysin trong E. coli. Kết quả điện di protein cho thấy sự hiện diện của lysin tái tổ hợp. Các điều kiện biểu hiện như nhiệt độ và nồng độ IPTG cũng được tối ưu hóa, mang lại hiệu quả cao trong quá trình biểu hiện.

4.1. Kết quả biểu hiện lysin

Kết quả điện di protein trên gel polyacrylamide cho thấy sự hiện diện của lysin tái tổ hợp. Điều này chứng minh rằng gen lysK đã được biểu hiện thành công trong E. coli. Nghiên cứu cũng xác định được nhiệt độ và nồng độ IPTG tối ưu cho quá trình biểu hiện.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu mở ra tiềm năng ứng dụng lysin tái tổ hợp trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh. Lysin có thể trở thành một loại thuốc mới, thay thế hoặc bổ sung cho các loại kháng sinh truyền thống, đặc biệt là trong bối cảnh kháng kháng sinh đang gia tăng.