Đặt vấn đề Từ khi Alexander Fleming (1881-1955) tìm ra kháng sinh penicillin cho đến nay, con số chất kháng sinh được nghiên cứu đã lên tới trên 5. Sự ra đời của kháng sinh được xem là thần dược mang lại sự sống cho hàng trăm triệu người trên thế giới. Số lượng kháng sinh mới được phát triển, bào chế ngày càng tăng để bắt kịp sự xuất hiện của các loại vi khuẩn gây bệnh mới. Tuy nhiên, vi sinh vật gây bệnh trở nên kháng với các loại thuốc điều trị là một vấn đề ngày càng lớn trong việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Khả năng kháng lại kháng sinh của vi sinh vật de dọa ngày càng cao việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm… gây ra. Ngày nay, khoảng 70% vi khuẩn gây nhiễm trùng có mặt tại các bệnh viện có khả năng kháng ít nhất một trong những loại thuốc thường được sử dụng để điều trị. Nguy cơ xuất hiện các chủng siêu vi khuẩn có khả năng kháng tất cả các loại kháng sinh hiện có là mối lo sợ của nhân loại và là thách thức lớn đối với giới khoa học. áo cáo giám sát toàn cầu về kháng kháng sinh năm 2014 của WHO cho thấy khả năng kháng thuốc kháng sinh không còn là một dự đoán cho tương lai, nó đang xảy ra, trên khắp thế giới, gây ra nhiều rủi ro trong khả năng điều trị những bệnh nhiễm trùng phổ biến trong cộng đồng và bệnh viện.
Vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) là một tác nhân gây ra rất nhiều loại bệnh nặng và có khả năng kháng kháng sinh rất cao. Nhiễm khuẩn tụ cầu có thể được chữa trị bằng kháng sinh bình thường, nhưng nhiều trường hợp vi khuẩn trở lên kháng thuốc, nhiễm vào các cơ quan nội tạng gây tử vong và những di chứng nặng nề khác. aureus) là một tác nhân gây viêm, ngộ độc thực phẩm và hội chứng sốc độc với tỷ lệ tử vong cao (Noble WC et al. Năm 1941, tất cả các tụ cầu khuẩn vàng gây bệnh dễ dàng bị diệt bởi kháng sinh penicillin, nhưng chỉ 3 năm sau tụ cầu khuẩn vàng đã trở nên kháng thuốc.
Các n 2 Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh của Mỹ cho biết năm 1972 chỉ có 2% trường hợp viêm nhiễm khuẩn tụ cầu vàng kháng thuốc, nhưng năm 2004 con số này là 63%. Cũng tương tự một số vi khuẩn khác, S. aureus tiết ra β lactamase để chống kháng sinh ampicillin, hoặc axetyl transferase để chống kháng sinh chloramphenicol… Một số thống kê cho thấy hiện nay có hơn 95% loài vi khuẩn kháng thuốc penicillin, thậm chí có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh, điển hình như S.aureus kháng methicillin (MRSA). Đứng trước nguy cơ trên, nhiều nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu các loại kháng sinh có nguồn gốc khác từ động vật, thực vật, côn trùng.
để tìm ra loại kháng sinh mới an toàn, có hiệu lực cao và khó bị vi khuẩn kháng lại. Một trong các chiến lược hiệu quả đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu để chống lại các vi khuẩn kháng thuốc đó là sử dụng lysin. Lysins, còn được gọi là endolysins hoặc murein hydrolases, là enzyme thủy phân peptidoglycan của các phage trong giai đoạn cuối cùng của chu kỳ ly giải tế bào. Khi tác dụng ngoại sinh (như lysin tái tổ hợp được tinh sạch) lên các vi khuẩn Gram dương gây ly giải nhanh chóng và tiêu diệt tế bào vi khuẩn (Loresser MJ, 2005).Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh tiềm năng lớn của các enzym này để kiểm soát và điều trị bệnh nhiễm trùng bề mặt niêm mạc và nhiễm trùng toàn thân.
Ngoài ra, lysin cũng có tiềm năng trong phát hiện và loại bỏ các tác nhân gây nhiễm độc thực phẩm. Các kết quả trên mở ra hướng nghiên cứu tiềm năng trong ứng dụng bacteriophage lysins tái tổ hợp như loại thuốc mới, một vũ khí mạnh trong cuộc chiến chống lại hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn (Fenton M et al. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu biểu hiện Lysin của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus ở Escherichia coli”. Mục đích nghiên cứu Biểu hiện được lysin tái tổ hợp của Bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus trong vi khuẩn E.
coli BL21 starTM ( DE3). Mục tiêu nghiên cứu - Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa lysin của thực khuẩn thể vi khuẩn Staphylococcus aureus. - Biểu hiện thành công gen mã hóa lysin trong E .coli chủng BL21 starTM (DE3). - Tối ưu một số điều kiện biểu hiện lysin phage trong E.
Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển được kháng sinh thế hệ mới thay thế, bổ sung cho kháng sinh trong việc điều trị vi khuẩn gây bệnh. Ý nghĩa thực tiễn Tạo được lysin tái tổ hợp có nguồn gốc từ bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus. n 4 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.
Cơ sở thực tiễn và cơ sở khoa học của đề tài 2. Tình trạng kháng kháng sinh 2. Tình hình kháng kháng sinh trên thế giới. Theo Trung tâm ệnh Dynamics, Kinh tế và Chính sách (Center for Disease Dynamics, Economics &Policy) và dự án Hợp tác toàn cầu về đề kháng kháng sinh (The Global Antibiotic Resistance Partnership) đã cùng đưa ra báo cáo mới về tình hình kháng sinh toàn thế giới 2015 đề cập đến tình trạng sử dụng kháng sinh và đề kháng kháng sinh ở người và vật nuôi.
Theo đó trình trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh đang ở mức đáng báo động, có 39 quốc gia xảy ra tình trạng kháng thuốc trên tổng số 69 quốc gia sử dụng thuốc kháng sinh. Dữ liệu Resistance Map đề cập đến các bệnh nhiễm do 12 loại vi khuẩn nguy hiểm thường gặp trong đó có E.coli, Salmonella, Methicillin-resistant S.1: Vi khuẩn thƣờng gây nhiễm trùng trong bệnh viện và cộng đồng năm 2014 Khu vực Số nƣớc bị của WHO nhiễm có tình trên tổng số trạng Tác hại Tên loài vi khuẩn kháng 194 nƣớc kháng > kháng sinh thành viên 50% hoặc của WHO hơn Escherichia coli Nhiễm trùng Kháng cephalosporins 86 5/6 đường tiết niệu, Kháng fluoroquinolones 92 5/6 nhiễm trùng máu Viêm phổi, nhiễm Klebsiella pneumonia 87 6/6 trùng máu, nhiễm Kháng cephalosporins 71 2/6 trùng đường tiết Kháng carbapenems niệu Nhiễm trùng vết Staphylococcus aureus 85 5/6 thương, nhiễm Kháng methicillin MRSA trùng máu n 5 2. Tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam. Tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao.
Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu cho thấy: Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae - một trong những nguyên nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp – kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001, 75% các chủng pneumococci kháng với ba hoặc trên ba loại kháng sinh, 57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi khuẩn phổ biến khác) phân lập từ bệnh nhi ở Hà Nội (2000-2002) kháng với ampicillin. Tỉ lệ tương tự cũng được báo cáo ở Nha Trang. Các vi khuẩn gram âm đa số là kháng kháng sinh (enterobacteriaceae): hơn 25% số chủng phân lập tại một bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, theo nghiên cứu năm 2000-2001. Theo báo cáo của một nghiên cứu khác năm 2009 cho thấy, 42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic tại cả bệnh viện và trong cộng đồng.
Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt. Những năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng pneumococcus kháng với penicillin. Đến năm1999-2000, tỉ lệ này đã tăng lên 56%. Xu hướng tương tự cũng được báo cáo tại các tỉnh phía bắc Việt Nam (Bộ y tế - 2010).2 Staphylococcus aureus Chi Staphylococus là cầu khuẩn Gram dương, được giới thiệu trong cuốn Sổ tay Hệ thống vi khuẩn học của ergey.
Được chia làm 2 nhóm: Hiếu khí (Micrococcus, planococcus, và Deinococcus) và kị khí (Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Coprococus, và Sacina). Họ Micrococcaceae gồm 4 loài: Micrococcus, Stomatococus, Planococus, và Staphylococus. Thuộc tính khác biệt của cầu khuẩn Gram dương gồm sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, hiếu khí tùy ý hoặc vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện của cytochrome, sản phẩm n 6 lên men kị khí chủ yếu từ carbohydrates, peptidoglycan, acid teichois trên thành tế bào, menaquinones (Scott EM et al. Sự phân loại của Staphylococus aures như sau: Giới: Procaryotae.
Họ: Micrococaceae Chi: Staphylococcus. Theo nhiều nghiên cứu ở Việt Nam, trong các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu vàng (S. aureus) là loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và kháng lại kháng sinh mạnh nhất. Đặc biệt là gây nhiễm khuẩn huyết, gây ngộ độc thức ăn, gây nhiễm trùng bệnh viện… Tụ cầu vàng thường ký sinh ở mũi họng và có thể cả ở da.
Vi khuẩn này gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yêu tố độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp (Le Huy Chinh, 2001). Hình dạng và kích thƣớc Tụ cầu là những cầu khuẩn, có đường kính từ 0,8-1,0 μm và đứng thành hình chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường không có vỏ (Lê Huy Chinh, 2001). Nuôi cấy Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 – 450C và nồng độ muối cao tới 10%.
Thích hợp được ở điều kiện hiếu và kỵ khí. – Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẵn. Sau 24 giờ ở 370C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh. – Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn.
Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysin): a, β, δ, e, y. n 7 – Trên môi trường canh thang: tụ cầu vàng làm đục môi trường, để lâu nó có thể lắng cặn. Khả năng để kháng Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có nha bào khác. Nó bị diệt ở 800C trong một giờ (các vi khuẩn khác thường bị diệt ở 600C trong 30 phút).
Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà vi khuẩn có thể phát triển. Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường.