Nghiên cứu bào chế và cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu Leuprolid Acetat

Luận văn tốt nghiệp y tế nghiên cứu Vũ thị hồng hạnh nghiên cứu bào chế và cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu leuprolid acetat đông, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề

• Tác giả: Vũ Thị Hồng Hạnh
• Người hướng dẫn: PGS.TS Trần Thị Hải Yến
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Bào Chế Vi Cầu Leuprolid Acetat Và Cơ Chế Giải Phóng Dược Chất
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• 2. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 3. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
• 4. TỔNG QUAN
• 4.1. Tổng quan về Leuprolid acetat
• 4.2. Công thức hóa học
• 4.3. Tính chất vật lý, hóa học
• 4.4. Ứng dụng trong điều trị
• 4.5. Tổng quan về vi cầu PLGA
• 4.6. Phương pháp bào chế vi cầu PLGA bằng nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi
• 4.7. Tổng quan về đông khô vi cầu PLGA
• 4.8. Tổng quan về cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PGLA
• 4.9. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất in vitro
• 5. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng
• 5.2. Nguyên vật liệu
• 5.3. Nội dung nghiên cứu
• 5.4. Bào chế vi cầu PLGA – LA bằng phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi
• 5.5. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA – LA đông khô
• 5.6. Nghiên cứu cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA – LA
• 5.7. Phương pháp nghiên cứu
• 5.8. Phương pháp bào chế vi cầu PLGA-LA
• 5.9. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của vi cầu đông khô PLGA-LA
• 5.10. Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện dài hạn
• 5.11. Phương pháp đánh giá giải phóng dược chất in vitro điều kiện cấp tốc
• 5.12. Phương pháp xử lý số liệu
• 6. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
• 6.1. Khảo sát ảnh hưởng của tá dược đông khô đến vi cầu PLGA – LA đông khô
• 6.2. Điều kiện và thông số của quy trình đông khô
• 6.3. Ảnh hưởng của tá dược đông khô đến vi cầu đông khô PLGA-LA
• 6.4. Ảnh hưởng của nồng độ D- manitol vi cầu đông khô PLGA− LA
• 6.5. Khảo sát ảnh hưởng của loại polyme PLGA đến khả năng giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA – LA
• 6.6. Kết quả giải phóng in vitro của vi cầu PLGA – LA điều kiện dài hạn
• 6.7. Kết quả giải phóng in vitro của vi cầu PLGA – LA ở điều kiện cấp tốc
• 7. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu bào chế vi cầu Leuprolid Acetat

Nghiên cứu bào chế vi cầu Leuprolid Acetat là một lĩnh vực quan trọng trong ngành dược phẩm. Leuprolid Acetat là một loại thuốc có tác dụng điều trị các rối loạn liên quan đến hormon giới tính. Vi cầu PLGA được sử dụng để bào chế Leuprolid Acetat nhằm cải thiện khả năng giải phóng dược chất và tăng cường hiệu quả điều trị. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về cơ chế giải phóng dược chất mà còn mở ra hướng đi mới cho các phương pháp điều trị hiện đại.

1.1. Giới thiệu về Leuprolid Acetat và ứng dụng

Leuprolid Acetat là một nonapeptid tổng hợp, có tác dụng tương tự hormon GnRH. Nó được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tiền liệt, lạc nội mạc tử cung và dậy thì sớm. Việc bào chế Leuprolid Acetat dưới dạng vi cầu giúp cải thiện tính ổn định và khả năng giải phóng dược chất.

1.2. Tính chất vật lý và hóa học của Leuprolid Acetat

Leuprolid Acetat có dạng bột kết tinh màu trắng, dễ hút ẩm và tan tốt trong nước. Độ pH của dung dịch chứa Leuprolid Acetat nằm trong khoảng từ 5,5 đến 7,5. Những tính chất này ảnh hưởng đến quá trình bào chế và giải phóng dược chất từ vi cầu.

II. Thách thức trong bào chế vi cầu Leuprolid Acetat

Bào chế vi cầu Leuprolid Acetat gặp nhiều thách thức, bao gồm việc kiểm soát kích thước vi cầu, độ đồng đều và khả năng giải phóng dược chất. Các yếu tố như nồng độ polymer, loại tá dược và quy trình bào chế đều ảnh hưởng đến chất lượng vi cầu. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đảm bảo hiệu quả điều trị.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước vi cầu

Kích thước vi cầu ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất. Các yếu tố như nồng độ polymer, tốc độ nhũ hóa và thời gian bốc hơi dung môi cần được kiểm soát chặt chẽ để đạt được kích thước mong muốn.

2.2. Khó khăn trong việc kiểm soát độ đồng đều

Độ đồng đều của vi cầu là yếu tố quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Việc kiểm soát quy trình bào chế và lựa chọn tá dược phù hợp là cần thiết để giảm thiểu sự biến đổi trong kích thước và hàm lượng dược chất.

III. Phương pháp bào chế vi cầu Leuprolid Acetat hiệu quả

Phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi là một trong những phương pháp chính để bào chế vi cầu Leuprolid Acetat. Phương pháp này cho phép giữ dược chất bên trong vi cầu và cải thiện khả năng giải phóng dược chất. Việc tối ưu hóa quy trình bào chế sẽ giúp nâng cao hiệu suất vi cầu hóa và chất lượng sản phẩm.

3.1. Quy trình nhũ hóa kép nước dầu nước

Quy trình nhũ hóa kép nước/dầu/nước (W/O/W) giúp tạo ra nhũ tương ổn định, giữ dược chất bên trong vi cầu. Dược chất được hòa tan trong pha nước nội, trong khi PLGA được hòa tan trong dung môi hữu cơ để tạo pha dầu.

3.2. Bốc hơi dung môi và thu hồi vi cầu

Sau khi tạo nhũ tương, dung môi hữu cơ được loại bỏ bằng cách bốc hơi. Vi cầu thu được sẽ được lọc và rửa sạch để loại bỏ chất diện hoạt và dược chất tự do, đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng.

IV. Cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu Leuprolid Acetat

Cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm khuếch tán, hòa tan và ăn mòn. Hiểu rõ cơ chế này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình bào chế và cải thiện hiệu quả điều trị. Nghiên cứu cho thấy rằng việc kiểm soát độ xốp và tính chất của polymer là rất quan trọng trong quá trình giải phóng dược chất.

4.1. Khuếch tán và hòa tan dược chất

Khuếch tán là cơ chế chính giúp giải phóng dược chất từ vi cầu. Khi môi trường giải phóng xâm nhập vào vi cầu, dược chất sẽ hòa tan và khuếch tán qua các lỗ xốp. Tốc độ khuếch tán phụ thuộc vào độ xốp và tính chất của polymer.

4.2. Ăn mòn và ảnh hưởng đến giải phóng

Ăn mòn là quá trình giúp dược chất được giải phóng mà không cần phải vận chuyển ra ngoài. Quá trình này diễn ra đồng nhất bên trong vi cầu và ảnh hưởng đến kích thước và tốc độ giải phóng dược chất.

V. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu vi cầu Leuprolid Acetat

Nghiên cứu về vi cầu Leuprolid Acetat đã cho thấy nhiều kết quả khả quan trong việc cải thiện khả năng giải phóng dược chất. Việc ứng dụng vi cầu trong điều trị các bệnh lý liên quan đến hormon giới tính đã mở ra hướng đi mới cho các phương pháp điều trị hiện đại. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi cầu PLGA-LA có hiệu suất vi cầu hóa trên 50% và khả năng giải phóng kéo dài dược chất.

5.1. Kết quả giải phóng dược chất in vitro

Kết quả nghiên cứu cho thấy vi cầu PLGA-LA có khả năng giải phóng dược chất ổn định trong điều kiện in vitro. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của vi cầu trong điều trị kéo dài.

5.2. Ứng dụng trong điều trị thực tiễn

Vi cầu Leuprolid Acetat đã được ứng dụng trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt và các rối loạn hormon khác. Việc sử dụng vi cầu giúp giảm thiểu tần suất tiêm và cải thiện tuân thủ điều trị của bệnh nhân.

VI. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu bào chế vi cầu Leuprolid Acetat đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực dược phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình bào chế và hiểu rõ cơ chế giải phóng dược chất sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều sản phẩm thuốc mới, cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

6.1. Tương lai của bào chế vi cầu

Nghiên cứu và phát triển các phương pháp bào chế mới sẽ giúp cải thiện chất lượng và hiệu quả của vi cầu. Việc áp dụng công nghệ mới trong bào chế sẽ mở ra nhiều cơ hội cho ngành dược phẩm.

6.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất và phát triển các sản phẩm vi cầu mới với tính năng vượt trội.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Leuprolid acetat (LA) là một nonapeptid tổng hợp có hoạt tính tương tự hormon giải phóng gonadotropin (GnRH) tự nhiên, giữ vai trò quan trọng trong phác đồ điều trị các bệnh lý phụ thuộc hormon sinh dục như ung thư tuyến tiền liệt tiến triển, lạc nội mạc tử cung, u xơ tử cung và dậy thì sớm phụ thuộc gonadotropin. Tuy nhiên, do đặc tính peptit có thời gian bán thải ngắn, dạng thuốc tiêm giải phóng quy ước đòi hỏi phải sử dụng hàng ngày bằng đường tiêm. Việc tiêm nhắc lại liên tục trong các liệu trình điều trị kéo dài từ vài tháng đến vài năm gây nhiều bất tiện cho bệnh nhân, giảm độ tuân thủ điều trị và gia tăng nguy cơ gặp biến cố bất lợi.

Để khắc phục nhược điểm trên, giải pháp công nghệ bào chế vi cầu từ polyme phân hủy sinh học poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) giúp kéo dài thời gian giải phóng dược chất đã được nghiên cứu và thương mại hóa (tiêu biểu như các biệt dược Lupron Depot®, Lupaneta Pack™). Tại Bộ môn Bào chế – Trường Đại học Dược Hà Nội, các công trình nghiên cứu trước đây (của Nguyễn Thị Phương Liên, Nguyễn Thị Ngọc Minh, Mai Văn Tân năm 2021) đã bước đầu xây dựng được quy trình bào chế vi cầu PLGA-LA với hiệu suất vi cầu hóa đạt trên 50% và ghi nhận đặc tính giải phóng kéo dài. Dẫu vậy, các nghiên cứu này chưa làm rõ tác động của các yếu tố công thức (như tỷ lệ phối hợp các phân đoạn polyme, bản chất tá dược đông khô) đến động học và cơ chế giải phóng dược chất in vitro.

Xuất phát từ thực tế đó, đề tài khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Vũ Thị Hồng Hạnh đặt ra hai nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA – LA đông khô.
2. Nghiên cứu cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA – LA đông khô.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hệ vi cầu polyme phân hủy sinh học PLGA nạp hoạt chất leuprolid acetat ở dạng bột đông khô (PLGA-LA). Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tại Bộ môn Bào chế phối hợp cùng Bộ môn Hóa phân tích, Bộ môn Công nghiệp Dược và Bộ môn Vật lý – Hóa lý thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội, hoàn thành vào tháng 6 năm 2022. Khóa luận tập trung khảo sát đặc tính lý hóa, hình thái bề mặt vi cấu trúc và đánh giá động học giải phóng dược chất in vitro ở hai điều kiện: dài hạn (37°C trong môi trường đệm phosphat pH 7,4 kéo dài 56 ngày) và cấp tốc (50°C trong dung dịch Tween 80 0,02% trong 54 giờ), có đối chiếu với tiêu chuẩn giải phóng của biệt dược gốc Lucrin Depot PDS 3,75 mg (Takeda, Nhật Bản).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết phân hủy sinh học của polyme PLGA và động học khuếch tán thuốc từ chất mang polyme. PLGA là polyeste tổng hợp cấu tạo từ hai monome acid lactic (LA) và acid glycolic (GA). Sự phân hủy sinh học của PLGA xảy ra thông qua phản ứng thủy phân liên kết este trong môi trường nước tạo thành các oligome và monome acid nội sinh, đào thải qua chu trình chuyển hóa tự nhiên. Tỷ lệ LA:GA và khối lượng phân tử (KLPT) quyết định tính thân nước, tốc độ suy thoái và nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh ($T_g$) của polyme: tỷ lệ acid glycolic càng cao hoặc KLPT càng thấp thì tính thân nước và tốc độ thủy phân càng gia tăng. Về mặt tương tác phân tử, leuprolid acetat mang điện tích dương ở pH trung tính, có khả năng tương tác tĩnh điện với nhóm tận cùng carboxyl (-COOH) mang điện tích âm của chuỗi PLGA, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất vi cầu hóa và tốc độ giải phóng.

Phương pháp bào chế được sử dụng là kỹ thuật nhũ hóa kép nước/dầu/nước (W/O/W hay N/D/N) kết hợp bốc hơi dung môi:

• Pha nước nội ($W_1$): Dung dịch chứa 60 mg leuprolid acetat và 6,6 mg gelatin phân tán trong 0,6 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,4.
• Pha dầu (O): 360 mg polyme PLGA (khảo sát các loại và tỷ lệ khác nhau) hòa tan trong 4 ml dicloromethan (DCM).
• Quá trình tạo nhũ tương sơ cấp ($W_1/O$): Nhũ hóa bằng máy đồng nhất hóa Unidrive X1000 với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở điều kiện cách thủy đá.
• Pha nước ngoại ($W_2$) và tạo nhũ tương kép ($W_1/O/W_2$): Bổ sung 10 ml dung dịch alcol polyvinylic (PVA) 1,5% kết hợp natri clorid 1,5%, đồng nhất hóa ở 4.000 vòng/phút trong 40 giây.
• Rắn hóa và thu hồi vi cầu: Pha loãng với 20 ml dung dịch PVA 1,5% - NaCl 1,5%, sục khí nitrogen với lưu lượng 20 ml/phút trong 30 phút để loại bỏ dung môi DCM. Vi cầu được thu hồi bằng máy ly tâm lạnh Hanil Supra R2 (5.000 vòng/phút, 5 phút, 5°C), rửa sạch 2 lần bằng nước cất để loại chất diện hoạt và dược chất tự do.
• Đông khô: Bột nhão vi cầu được phân tán trong dung dịch tá dược tạo khung (D-manitol), nạp vào lọ thủy tinh 10 ml (2 ml/lọ), cấp đông sâu ở -70°C trong 7 giờ tại tủ âm sâu BINDER UFV 500, sau đó tiến hành thăng hoa làm khô trên máy đông khô Alpha 1-2 LD Plus ở -50°C, áp suất 0,04 mbar trong 24 giờ.

Các phương pháp phân tích và đánh giá thực nghiệm gồm:

• Cảm quan và độ phân tán lại: Đánh giá hình thức bánh đông khô và tính đồng nhất của hỗn dịch sau khi hoàn nguyên với nước cất.
• Kích thước tiểu phân (KTTP) và độ phân bố (Span): Xác định bằng thiết bị tán xạ laser Mastersizer 3000E.
• Hình thái bề mặt và cấu trúc vi thể: Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường SEM Regulus8100-HITACHI ở điện thế 1 – 1,5 kV, độ phóng đại từ 3.000 đến 10.000 lần sau khi xử lý mẫu bằng phương pháp phủ màng Platin trong 35 giây.
• Định lượng dược chất và hiệu suất vi cầu hóa (EE%): Thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu 20A, cột pha đảo InertSustain C18 ($5\ \mu\text{m},\ 4,6 \times 250\text{ mm}$), đầu dò UV ở bước sóng 280 nm, pha động gồm dung dịch đệm amoni dihydrophosphat 0,03 M pH 4,0 : acetonitril tỷ lệ 75:25 (tt/tt), tốc độ dòng 0,8 ml/phút.
• Thử giải phóng dược chất in vitro: Áp dụng phương pháp lấy mẫu và phân tách (sample and separate) trong máy lắc ngang điều nhiệt WiseBath SciLab ở tốc độ 125 vòng/phút; nồng độ LA giải phóng được định lượng bằng phương pháp đo huỳnh quang trên máy Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer tại bước sóng kích thích 280 nm và bước sóng phát xạ 356 nm. Thử nghiệm dài hạn tiến hành ở 37°C trong môi trường đệm phosphat saline (PBS) pH 7,4 (chứa 0,02% Tween 80 và 0,02% natri diazid); thử nghiệm cấp tốc tiến hành ở 50 ± 0,5°C trong môi trường Tween 80 0,02%.
• Xử lý số liệu: Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần ($n=3$), tính toán giá trị trung bình và độ lệch chuẩn ($\text{TB} \pm \text{SD}$) bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu là các số liệu thực nghiệm đo đạc trực tiếp từ mẫu vi cầu tự bào chế, số liệu sắc ký đồ, phổ huỳnh quang, ảnh chụp vi cấu trúc SEM và dữ liệu đối chiếu từ tiêu chuẩn nhà sản xuất thuốc tiêm Lucrin Depot PDS 3,75 mg.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này tổng thuật toàn diện các y văn liên quan đến phân tử leuprolid acetat, chất mang polyme PLGA, kỹ thuật đông khô và động học giải phóng. LA là muối acetat của nonapeptid tổng hợp có công thức phân tử $\text{C}{59}\text{H}{84}\text{N}{16}\text{O}{12}$, KLPT 1269,45 g/mol, tan tốt trong nước, dung dịch acid acetic và DMSO. LA có hoạt tính chủ vận mạnh hơn GnRH tự nhiên; khi sử dụng liên tục, LA gây trơ hóa thụ thể tuyến yên qua cơ chế điều hòa ngược âm tính (negative feedback), ức chế bài tiết LH, FSH, từ đó làm giảm mạnh nồng độ hormon sinh dục trong huyết thanh.

Về cơ chế giải phóng thuốc từ chất mang PLGA, chương tổng quan phân tích 3 quá trình chủ đạo: khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp/mạng lưới polyme, hòa tan và ăn mòn (ăn mòn bề mặt hoặc ăn mòn toàn bộ). Động học giải phóng thường diễn ra theo mô hình hai pha hoặc ba pha. Mô hình ba pha bao gồm:

1. Pha giải phóng ồ ạt ban đầu (burst release): xảy ra trong 24 giờ đầu do dược chất tự do bám lỏng lẻo ở bề mặt hoặc phân tán sát vỏ ngoài khuếch tán nhanh ra môi trường.
2. Pha giải phóng chậm hoặc trì hoãn (lag phase): xuất hiện khi mạng lưới polyme chưa đủ thời gian thủy phân cắt mạch, độ xốp bề mặt suy giảm do chuỗi polyme dẻo hóa hoặc kết dính, cản trở sự thấm nước vào sâu bên trong lõi.
3. Pha giải phóng nhanh (erosion phase hoặc rapid phase): diễn ra khi các chuỗi PLGA bị thủy phân đạt đến khối lượng phân tử tới hạn (khoảng 20 kDa), vi cầu phồng nở, nứt vỡ toàn bộ ma trận polyme và giải phóng triệt để lượng dược chất còn lại theo động học bậc không biểu kiến.

Chương 1 cũng dẫn xuất tiêu chuẩn thử giải phóng cấp tốc của chế phẩm đối chiếu Lucrin Depot PDS 3,75 mg trong môi trường Tween 80 0,02% ở 50°C: tại thời điểm 1 giờ giải phóng không quá 25%, thời điểm 7 giờ giải phóng từ 45% đến 75%, và thời điểm 30 giờ giải phóng không ít hơn 85%.

Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày danh mục 21 loại nguyên vật liệu, hóa chất đạt tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu (EP8), Dược điển Việt Nam V hoặc độ tinh khiết phân tích (như leuprolid acetat, PLGA 50:50 phân đoạn 7-17 kDa và 24-38 kDa, PLGA 75:25 phân đoạn 4-15 kDa từ hãng Sigma - Đức, PVA-124, D-manitol, gelatin type B, DCM, DMSO, ACN...).

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình 4 giai đoạn bào chế vi cầu N/D/N kết hợp bốc hơi dung môi loại DCM bằng dòng sục nitrogen, phương pháp thu tủa bằng máy ly tâm lạnh ở 5°C nhằm hạn chế kết dính vi cầu, và quy trình đông khô mẫu. Chương này cũng thiết lập phương trình toán học tính hàm lượng lý thuyết ($LC_{lt}$), hàm lượng thực tế ($LC_{tt}$) và hiệu suất vi cầu hóa ($EE%$). Thiết lập quy trình phân tích HPLC định lượng LA với tính tuyến tính cao và phương pháp đo cường độ huỳnh quang ($F = a \times C + b$) để xác định chính xác phần trăm dược chất giải phóng tích lũy tại các thời điểm lấy mẫu trong điều kiện dài hạn và cấp tốc.

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả

Chương này tập trung trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tối ưu công thức và khảo sát cơ chế giải phóng:

• Khảo sát tá dược tạo khung đông khô: Thử nghiệm 3 loại đường D-manitol, lactose và saccarose ở nồng độ 1,25%. Kết quả cho thấy mẫu dùng D-manitol cho bánh đông khô định hình xốp, mịn, màu trắng đục, không bị co ngót và phân tán lại nhanh chóng thành hỗn dịch đồng nhất không lắng cặn. Ngược lại, mẫu sử dụng lactose và saccarose bị co ngót mạnh, nứt cạnh, vi cầu sau khi hoàn nguyên khó phân tán và sa lắng nhiều xuống đáy lọ.
• Khảo sát nồng độ D-manitol: Đánh giá 3 nồng độ 1,25% (mẫu M1), 2,5% (mẫu M2) và 5% (mẫu M3). Ở nồng độ 1,25%, kích thước tiểu phân trung bình trước đông khô (14,35 $\mu$m) và sau đông khô (15,20 $\mu$m) ít chênh lệch nhất, độ phân bố hạt đồng đều, hỗn dịch dễ phân tán trở lại và hình thái bề mặt vi cầu không bị bao phủ bởi tinh thể đường dư thừa khi soi kính hiển vi SEM.

Mẫu khảo sát	Tá dược tạo khung	Nồng độ (% kl/tt)	Trạng thái bánh đông khô	Khả năng phân tán lại	KTTP sau đông khô ($D[4,3]\ \mu\text{m}$)
Không tá dược	Không	0%	Không đóng bánh, co ngót	Kém, sa lắng nhiều	—
Mẫu M1	D-manitol	1,25%	Xốp mịn, trắng đục, không co	Dễ phân tán, đồng nhất	15,20
Mẫu M2	D-manitol	2,5%	Bánh xốp, ít co ngót	Phân tán trung bình	27,50
Mẫu M3	D-manitol	5,0%	Bánh đặc, hơi co ngót	Phân tán trung bình	30,12
Mẫu Lactose	Lactose	1,25%	Co ngót nhiều, nứt cạnh	Khó phân tán, bám thành lọ	—
Mẫu Saccarose	Saccarose	1,25%	Co ngót lớn, bề mặt sần sùi	Lắng cặn nhanh, khó phân tán	—

• Động học giải phóng in vitro dài hạn (37°C): So sánh mẫu M5 (sử dụng PLGA 50:50 7-17 kDa và PLGA 50:50 24-38 kDa theo tỷ lệ 7:3) và mẫu M7 (sử dụng PLGA 50:50 24-38 kDa và PLGA 75:25 4-15 kDa theo tỷ lệ 3:7):

  • Mẫu M5 giải phóng theo mô hình 3 pha: pha burst kéo dài từ ngày 0 đến ngày 4 giải phóng 27,42% dược chất; pha ổn định kéo dài từ ngày 4 đến ngày 21 giải phóng lũy kế đạt 50,80%; tiếp đến là pha giải phóng nhanh từ ngày 21 đến ngày 28 giải phóng thêm 24,08% (lũy kế 74,88%), sau đó tiếp tục ăn mòn chậm đến ngày 56 đạt tổng cộng 92,18%. Ảnh chụp SEM cho thấy sau ngày 21, vi cầu M5 vỡ vụn thành các mảnh nhỏ, tạo điều kiện cho dược chất trong lõi thoát ra ồ ạt.
  • Mẫu M7 giải phóng theo mô hình 2 pha: pha burst từ ngày 0 đến ngày 4 giải phóng 33,92% dược chất; sau đó chuyển trực tiếp sang pha giải phóng ổn định kéo dài liên tục từ ngày 4 đến ngày 56 đạt tổng cộng 88,60% mà không xuất hiện pha giải phóng nhanh riêng biệt. SEM chứng minh mẫu M7 khi bị thủy phân vỡ thành các mảng lớn, ma trận polyme 75:25 có tốc độ ăn mòn chậm và đồng đều hơn.

• Động học và cơ chế giải phóng in vitro cấp tốc (50°C):

  • Ảnh hưởng tỷ lệ phối hợp PLGA 50:50 (mẫu M4, M5, M6): Khảo sát tỷ lệ PLGA 7-17 kDa và 24-38 kDa ở các mức 8:2 (M4), 7:3 (M5) và 6:4 (M6). Khi tăng tỷ lệ phân đoạn KLPT thấp (7-17 kDa), hàm lượng dược chất nạp vào tăng và giải phóng ban đầu tăng do tốc độ hydrat hóa cao. Cả 3 mẫu đều tuân theo mô hình 3 pha nhưng xuất hiện pha lag kéo dài (từ giờ thứ 7 đến giờ thứ 24). Đến mốc 30 giờ, lượng giải phóng cao nhất ở mẫu M5 chỉ đạt 63,44% (M4 đạt 58,12%, M6 đạt 46,20%), chưa đạt tiêu chuẩn quy định của Lucrin Depot ($\ge 85%$). Ảnh SEM cho thấy tại 50°C ($> T_g$ của PLGA), các vi cầu bị dẻo hóa, kết tụ thành từng mảng lớn che lấp hệ thống lỗ xốp, ức chế sự thấm nước vào sâu bên trong.
  • Phối hợp với polyme PLGA 75:25 4-15 kDa (mẫu M7, M8, M9):
    • Mẫu M8 (phối hợp PLGA 50:50 7-17 kDa và PLGA 75:25 4-15 kDa tỷ lệ 7:3): Có lượng giải phóng 1 giờ đầu cao tới 28,37% (vượt mức tiêu chuẩn $\le 25%$), sau đó vướng pha lag kéo dài, đến 30 giờ chỉ giải phóng được 55,72%.
    • Mẫu M7 (phối hợp PLGA 50:50 24-38 kDa và PLGA 75:25 4-15 kDa tỷ lệ 3:7): Giải phóng 1 giờ đầu đạt 23,31%, xu hướng 2 pha ổn định nhưng tốc độ chậm dần, 30 giờ chỉ đạt 65,20%.
    • Mẫu M9 (sử dụng 100% polyme PLGA 75:25 4-15 kDa): Khắc phục hoàn toàn pha lag, giải phóng liên tục theo mô hình 2 pha. Tại thời điểm 1 giờ giải phóng 21,99% (đáp ứng tiêu chuẩn $\le 25%$), thời điểm 7 giờ đạt 58,40% (nằm trong khoảng tiêu chuẩn 45-75%), và thời điểm 30 giờ đạt 83,68% (tiệm cận tiêu chuẩn $\ge 85%$).

Ảnh chụp SEM mặt cắt ngang mẫu M9 tại thời điểm 4 giờ cho thấy hiện tượng tự xúc tác phân hủy: các oligome acid sinh ra từ sự thủy phân PLGA KLPT thấp tích tụ trong lòng vi cầu, làm giảm pH nội tại và xúc tác thủy phân ma trận từ trong lõi ra ngoài, tạo các kênh dẫn lớn đưa dược chất khuếch tán ra môi trường mà không bị kết tụ bề mặt.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã định lượng hóa và so sánh chi tiết các thông số hóa lý của các công thức vi cầu thực nghiệm:

Mẫu vi cầu	Thành phần polyme sử dụng	Tỷ lệ phối hợp	$KTTP\ (\mu\text{m})$	Hàm lượng thực tế ($LC_{tt}%$)	% Giải phóng cấp tốc tại 1 giờ	% Giải phóng cấp tốc tại 30 giờ	Mô hình giải phóng ghi nhận
M4	PLGA 50:50 (7-17k : 24-38k)	8 : 2	14,80	16,15%	24,10%	58,12%	3 pha (có pha lag kéo dài)
M5	PLGA 50:50 (7-17k : 24-38k)	7 : 3	15,20	15,36%	22,50%	63,44%	3 pha (có pha lag kéo dài)
M6	PLGA 50:50 (7-17k : 24-38k)	6 : 4	16,35	11,20%	18,20%	46,20%	3 pha (có pha lag kéo dài)
M7	PLGA 50:50 (24-38k) : PLGA 75:25 (4-15k)	3 : 7	25,40	11,80%	23,31%	65,20%	2 pha (tốc độ chậm dần)
M8	PLGA 50:50 (7-17k) : PLGA 75:25 (4-15k)	7 : 3	28,15	14,29%	28,37%	55,72%	3 pha (pha burst cao, có pha lag)
M9	100% PLGA 75:25 (4-15k)	1	24,10	12,50%	21,99%	83,68%	2 pha (ổn định, không có pha lag)

Đóng góp của khóa luận đối với lĩnh vực nghiên cứu:

• Xác định được thông số quy trình đông khô tối ưu cho vi cầu PLGA-LA: sử dụng tá dược tạo khung D-manitol ở nồng độ thấp 1,25% (thay vì mức 10% trong các nghiên cứu tiền đề), tiền đông tại -70°C trong 7 giờ, thăng hoa ở -50°C và áp suất 0,04 mbar trong 24 giờ. Tỷ lệ này tạo cấu trúc bánh xốp mịn, hỗn dịch hoàn nguyên dễ dàng và bề mặt vi cầu sạch, hỗ trợ chính xác phép đo vi cấu trúc SEM.
• Làm sáng tỏ ảnh hưởng cốt lõi của loại polyme PLGA đến động học giải phóng: hệ chất mang chứa đa số PLGA 50:50 tuân theo mô hình 3 pha, trong khi hệ chất mang sử dụng đa số PLGA 75:25 giải phóng theo mô hình 2 pha.
• Phát hiện bản chất hiện tượng pha lag ở điều kiện thử cấp tốc 50°C là do sự dẻo hóa polyme và kết tụ các hạt vi cầu khi nhiệt độ vượt quá $T_g$. Đồng thời, nghiên cứu chứng minh giải pháp sử dụng 100% polyme PLGA 75:25 KLPT thấp (4-15 kDa) ở mẫu M9 giúp khắc phục triệt để pha lag nhờ cơ chế tự xúc tác thủy phân tạo kênh xốp từ lõi, đạt tỷ lệ giải phóng ở 30 giờ tiệm cận tốt nhất với biệt dược gốc Lucrin Depot (83,68% so với $\ge 85%$).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra một số hạn chế nội tại:

• Mẫu tối ưu nhất về mặt động học giải phóng cấp tốc (mẫu M9) mới đạt mức giải phóng 83,68% sau 30 giờ, chưa đạt trọn vẹn chỉ tiêu $\ge 85%$ theo tiêu chuẩn kiểm nghiệm của thuốc đối chiếu Lucrin Depot.
• Nghiên cứu chỉ dừng lại ở các đánh giá giải phóng in vitro trong phòng thí nghiệm (cấp tốc và dài hạn), chưa triển khai các thử nghiệm dược động học in vivo trên động vật để thiết lập tương quan in vitro – in vivo (IVIVC).
• Quy trình đông khô mới khảo sát ở một chế độ thông số áp suất và nhiệt độ cố định do hạn chế về thời gian và trang thiết bị thực nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả kiến nghị là tiếp tục hoàn thiện, chuẩn hóa quy trình bào chế và điều chỉnh thông số công nghệ nhằm nâng tỷ lệ giải phóng cấp tốc ở mốc 30 giờ đạt trên 85%, đồng thời mở rộng nghiên cứu độ ổn định của bột đông khô vi cầu trong điều kiện bảo quản dài hạn.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị thực tiễn và chuyên môn cao đối với:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đang triển khai các đề tài về hệ phân phối thuốc giải phóng kéo dài, vi cầu polymer phân hủy sinh học, hoặc các dạng thuốc tiêm tác dụng kéo dài nạp peptide/protein.
• Cán bộ nghiên cứu R&D tại các viện nghiên cứu và nhà máy sản xuất dược phẩm trong việc tiếp cận quy trình bào chế nhũ hóa kép W/O/W kết hợp bốc hơi dung môi, phương pháp xử lý đông khô polyme và xây dựng phương pháp đánh giá thử giải phóng in vitro cấp tốc để rút ngắn thời gian sàng lọc công thức.
• Phần đáng tham khảo nhất là quy trình định lượng HPLC kết hợp đo huỳnh quang độ nhạy cao và bộ dữ liệu ảnh chụp SEM phân tích cơ chế ăn mòn, tạo vi xốp và phân hủy ma trận PLGA theo thời gian.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn D-manitol 1,25% làm tá dược đông khô thay vì sử dụng nồng độ 10% như các nghiên cứu trước đó tại bộ môn?
Nghiên cứu trước đây dùng D-manitol 10% khiến hàm lượng đường dư thừa quá lớn, kết tinh bao phủ dày đặc bề mặt vi cầu, gây cản trở nghiêm trọng việc quan sát vi cấu trúc và phân tích cơ chế giải phóng trên ảnh chụp SEM. Khảo sát thực nghiệm cho thấy D-manitol ở nồng độ 1,25% vẫn bảo đảm bánh đông khô xốp, mịn, không co ngót, vi cầu phân tán lại hoàn toàn đồng nhất, kích thước hạt trước và sau đông khô biến động không đáng kể (14,35 $\mu$m lên 15,20 $\mu$m) và bề mặt vi cầu sạch, hiển thị rõ cấu trúc lỗ xốp dưới kính hiển vi điện tử.

2. Nguyên nhân dẫn đến hiện tượng pha lag (ngừng hoặc chậm giải phóng) kéo dài ở các công thức M4, M5, M6 khi thử giải phóng cấp tốc ở 50°C là gì?
Khi thử nghiệm ở nhiệt độ 50°C, môi trường vượt quá nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh ($T_g$) của polyme PLGA, khiến các chuỗi polyme chuyển sang trạng thái dẻo và làm các vi cầu bị kết dính thành từng mảng lớn. Hiện tượng kết tụ này làm giảm mạnh diện tích tiếp xúc giữa hạt vi cầu với môi trường hòa tan, ngăn cản nước thẩm thấu vào ma trận để hydrat hóa PLGA và chặn đường khuếch tán của leuprolid acetat ra ngoài.

3. Khác biệt cốt lõi về mô hình giải phóng dài hạn (37°C) giữa mẫu vi cầu M5 và mẫu M7 là gì?
Mẫu M5 (sử dụng PLGA 50:50) giải phóng theo mô hình 3 pha: pha burst (ngày 0-4), pha ổn định (ngày 4-21) và pha giải phóng nhanh riêng biệt (ngày 21-28 giải phóng tới 24,08%) do vi cầu vỡ vụn thành các mảnh nhỏ. Mẫu M7 (sử dụng phần lớn PLGA 75:25) giải phóng theo mô hình 2 pha: pha burst (ngày 0-4) và pha ổn định kéo dài liên tục từ ngày 4 đến ngày 56 do polyme 75:25 ít thân nước hơn, vi cầu vỡ thành các mảng lớn và quá trình xói mòn diễn ra từ từ, không tạo ra pha giải phóng nhanh đột ngột.

4. Vì sao công thức M9 (100% PLGA 75:25 4-15 kDa) lại loại bỏ được pha lag và đạt mức giải phóng cấp tốc cao nhất?
Polyme PLGA 75:25 phân đoạn khối lượng phân tử thấp (4-15 kDa) làm tăng tính linh động chuỗi và độ xốp ban đầu của vi cầu. Khi tiếp xúc với môi trường giải phóng, polyme nhanh chóng thủy phân sinh ra các oligome có tính acid. Do các sản phẩm này tích tụ nhiều ở vùng trung tâm hạt nên đã thúc đẩy hiện tượng tự xúc tác phân hủy từ trong lõi ra ngoài, tạo nên hệ thống vi kênh và lỗ rỗng lớn liên thông ra vỏ hạt, giúp dược chất khuếch tán liên tục mà không gặp tình trạng nghẽn mạch kết tụ.

5. Tiêu chuẩn giải phóng in vitro ở điều kiện cấp tốc của biệt dược đối chiếu Lucrin Depot PDS 3,75 mg được quy định ra sao?
Theo tiêu chuẩn kiểm nghiệm của nhà sản xuất Takeda (thử nghiệm trong môi trường dung dịch Tween 80 0,02% ở 50 ± 0,5°C, tốc độ lắc 125 chu kỳ/phút), tỷ lệ giải phóng leuprolid acetat quy định: tại thời điểm 1 giờ không được vượt quá 25%, tại thời điểm 7 giờ nằm trong giới hạn từ 45% đến 75%, và tại thời điểm 30 giờ không được thấp hơn 85%.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Vũ Thị Hồng Hạnh đã tối ưu hóa thành công thông số đông khô vi cầu PLGA-LA với tá dược tạo khung D-manitol 1,25%, tạo được sản phẩm bột đông khô có độ tơi xốp tốt và kích thước tiểu phân ổn định sau khi phân tán lại. Công trình đã làm sáng tỏ mối liên hệ mật thiết giữa bản chất polyme PLGA với mô hình động học giải phóng thuốc, chỉ ra cơ chế gây pha lag do sự kết tụ vi cầu ở điều kiện cấp tốc và hiện tượng tự xúc tác phân hủy ma trận từ lõi. Công thức M9 sử dụng polyme PLGA 75:25 phân đoạn 4-15 kDa là công thức tối ưu nhất, loại bỏ hoàn toàn pha lag và đạt mức giải phóng cấp tốc 83,68% sau 30 giờ, tiệm cận với tiêu chuẩn của chế phẩm đối chiếu Lucrin Depot.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Leuprolid là một nonapeptid tổng hợp có tác dụng tương tự với hormon giải phóng gonadotropin (GnRH) có trong tự nhiên, được sử dụng để điều trị các rối loạn liên quan đến hormon giới tính bao gồm: ung thư tuyến tiền liệt, lạc nội mạc tử cung, u xơ tử cung và dậy thì sớm phụ thuộc hormon [27], [51].Thời gian bán thải của LA ngắn nên dạng thuốc tiêm giải phóng ngay cần được sử dụng hàng ngày. Trong khi đó, thời gian điều trị các bệnh liên quan đến hormon thường kéo dài từ vài tháng đến vài năm. Điều này dẫn đến sự bất tiện cho bệnh nhân và làm giảm hiệu quả của quá trình điều trị. Vì vậy, bào chế dạng thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa LA nạp trong vi cầu polyme phân hủy sinh học (PLGA) là vô cùng cần thiết để đảm bảo tuân thủ điều trị của bệnh nhân.

Tuy nhiên, việc sản xuất các vi cầu này thường gặp nhiều khó khăn bởi sự phức tạp trong quy trình bào chế. Đánh giá khả năng giải phóng từ vi cầu giải phóng kéo dài đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phát triển công thức thuốc. Trong các nghiên cứu trước đây tại bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội về vi cầu PLGA-LA, vi cầu PLGA chứa leuprolid acetat bào chế được có hiệu suất vi cầu hóa trên 50% và đã bước đầu đánh giá được đặc tính giải phóng kéo dài của vi cầu PLGA-LA [1], [2]. Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về công thức bào chế đến khả năng và cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế và cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu leuprolid acetat đông khô” với các mục tiêu sau: 1. Khảo sát một số yếu tố công thức ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA – LA đông khô. Nghiên cứu cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA – LA đông khô. Công thức hóa học Hình 1.

Công thức phân tử của Leuprolid acetat - Công thức phân tử: C59H84N16O12. - Khối lượng phân tử: 1269,45 g/mol. - Danh pháp IUPAC: 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D- leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid acetat. - Công thức viết tắt: pGlu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-Leu6-Leu7-Arg8-Pro9- NHEt.

- Tên chung quốc tế: leuprolid acetat. Tính chất vật lý, hóa học 1. Tính chất vật lý - Cảm quan: dạng bột kết tinh màu trắng đến hơi vàng, dễ hút ẩm [38]. - Độ tan: tan tốt trong nước và acid acetic, và DMSO (ở 25oC độ tan 100mg/mL), tan tự do trong methanol, ít tan trong ethanol.

Tính chất hóa học - Độ pH của dung dịch chứa 0,10 g muối leuprolid acetat trong 10 ml nước có pH nằm trong khoảng từ 5,5 đến 7,5. - Leuprolid acetat dễ dàng bị thủy phân trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh [51]. Ứng dụng trong điều trị 1. Tác dụng dược lý Leuprolid được định nghĩa như một chất chủ vận có hiệu lực lớn hơn hormone tự nhiên GnRH, có khả năng ức chế bài tiết gonadotropin khi dùng liên tục với liều điều trị.

Nguyên nhân do LA có cấu trúc tương tự chất chủ vận LH-RH nên thể hiện ái lực mạnh mẽ với thụ thể tuyến yên. Đồng thời, trong cấu trúc của LA có một axit amin D, 2 góp phần tăng tính ổn định sinh học. Cả nghiên cứu trên động vật và con người đều chứng minh rằng LA làm tăng mạnh bài tiết tuyến yên, nồng độ LH và FSH trong huyết thanh, sau đó dẫn đến tăng hormon sinh dục trong huyết thanh trong/3 ngày kể từ ngày điều trị đầu tiên. Khi được đưa vào liên tục với liều điều trị, LA tạo ra ức chế trục tuyến yên- tuyến sinh dục do cơ chế ‘feedback âm’ của tuyến yên với chất chủ vận.