Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Viêm khớp dạng thấp (VKDT) là bệnh lý tự miễn mạn tính đặc trưng bởi tình trạng viêm màng hoạt dịch, sự xâm nhập của tế bào viêm dẫn tới thoái hóa sụn khớp, xói mòn xương và canxi hóa quanh khớp. Bệnh gây đau đớn, cứng khớp, tiến triển đến biến dạng khớp và mất khả năng vận động. Tỷ lệ mắc bệnh ước tính khoảng 0,5% đến 1% dân số thế giới. Năm 2020, toàn cầu ghi nhận khoảng 17,6 triệu người mắc VKDT và dự kiến sẽ tăng lên 31,7 triệu người vào năm 2050. Hiện nay, VKDT chưa thể chữa khỏi dứt điểm; các liệu pháp điều trị chủ yếu tập trung vào việc làm chậm tiến triển bệnh, giảm đau và hạn chế biến chứng. Các thuốc đường uống như thuốc chống viêm không steroid (NSAID), corticosteroid và nhóm chống thấp khớp tác dụng chậm (DMARD) thường đi kèm nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng khi dùng dài ngày hoặc không ngăn chặn được tổn thương sụn kéo dài.

Tiêm nội khớp (intra-articular injection) là phương thức đưa thuốc trực tiếp vào ổ khớp tổn thương, giúp đạt nồng độ điều trị tại chỗ cao, phát huy tác dụng nhanh và giảm độc tính toàn thân. Dẫu vậy, hạn chế lớn nhất của tiêm nội khớp dung dịch thông thường là sự thanh thải thuốc nhanh chóng qua hệ mao mạch và tuần hoàn bạch huyết quanh khớp, khiến thời gian lưu giữ hoạt chất tại đích ngắn.

Azithromycin (AZT) là kháng sinh nhóm macrolide, gần đây được phát hiện có đặc tính chống viêm khớp thông qua việc ức chế các cytokin tiền viêm, điều hòa thụ thể glucose-regulated protein 78 (GRP78) và giảm tổn thương tế bào màng hoạt dịch. Tuy nhiên, AZT thuộc nhóm II trong Hệ thống Phân loại Sinh dược học (BCS), có độ tan rất thấp trong nước, dẫn đến sinh khả dụng thấp. Để giải quyết các trở ngại trên, giải pháp tích hợp tiểu phân nano vào hệ hydrogel in situ nhạy nhiệt được đề xuất nhằm cải thiện độ tan của AZT, kéo dài thời gian lưu giữ tại ổ khớp và duy trì giải phóng dược chất có kiểm soát.

Khóa luận xác định hai nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano chứa azithromycin.
  2. Xây dựng được công thức bào chế hệ vận chuyển thuốc hydrogel in situ chứa nano azithromycin 0,1%.

Đối tượng nghiên cứu là dược chất Azithromycin dihydrat (nguyên liệu đạt tiêu chuẩn USP 41, hàm lượng hoạt chất 94,1%) và các hệ chất mang polyme, lipid, tá dược tạo gel (PLGA 50:50, Poloxamer 407, Acid Hyaluronic, D-manitol, PVA 205, Tween 80). Phạm vi thực nghiệm được tiến hành tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia và Khoa Bào chế - Công nghệ Dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội; hoàn thành vào tháng 5 năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình ứng dụng

  • Cơ chế tác dụng của Azithromycin trong VKDT: AZT tác động làm suy yếu các tầng tín hiệu liên quan đến tổng hợp cholesterol và lipid thông qua đích điều hòa GRP78, ức chế yếu tố hoại tử u alpha (TNF-α) tương đương hoạt chất sinh học etanercept, đồng thời kích thích quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào tương tự nguyên bào sợi màng hoạt dịch.
  • Hệ phân phối nano polyme PLGA: Poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) là polyme phân hủy sinh học, tương thích sinh học cao, có khả năng bao gói dược chất kỵ nước, kiểm soát tốc độ hòa tan và bảo vệ dược chất.
  • Hệ hydrogel nhạy nhiệt Poloxamer 407 (P407) kết hợp Acid Hyaluronic (HA): P407 là triblock copolymer lưỡng tính (PEO-PPO-PEO) có đặc tính chuyển pha sol-gel đảo ngược theo nhiệt độ dựa trên cơ chế micell hóa. Khi tăng nhiệt độ đến mức sinh lý (~37°C), các chuỗi kỵ nước tương tác tạo mạng tinh thể gel. HA là glycosaminoglycan tự nhiên của dịch khớp, giúp tăng độ bền cơ học của gel, cải thiện độ bám dính sinh học và đóng vai trò như chất bôi trơn nhân tạo bảo vệ bề mặt sụn. D-manitol đóng vai trò là chất chống oxy hóa bảo vệ khung phân tử HA khỏi sự giáng hóa bởi gốc tự do.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Bào chế tiểu phân nano:
    • Nano polyme: Bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi. Pha dầu gồm AZT và PLGA hòa tan trong 2,5 ml aceton. Pha nước gồm dung dịch đệm phosphat pH 7,6 chứa chất diện hoạt (PVA 0,5% hoặc Tween 80 1%). Quá trình nhũ hóa thực hiện bằng máy siêu âm cầm tay (Vibra Cell) công suất biên độ 100% trong 5 phút ở nhiệt độ 5–10°C, sau đó khuấy từ 12 giờ để bay hơi hoàn toàn aceton.
    • Nano lipid (SLN): Bào chế bằng phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi, hòa tan lipid (GMS, dầu dừa, Lipoid S45) và AZT trong ethanol 96% ở 60–70°C, nhũ hóa vào pha nước ở 60–65°C dưới tác động của siêu âm cầm tay trong 5 phút, khuấy từ 12 giờ để loại bỏ ethanol.
  • Phương pháp định lượng AZT:
    • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống Agilent 1260; cột C18 (4,6 × 150 mm, 5 µm); detector UV đặt ở bước sóng 210 nm.
    • Pha động gồm Acetonitril và dung dịch A (0,52 g K2HPO4 trong 300 ml nước cất, pH ~ 9,2) với tỷ lệ 80:20 (thể tích/thể tích). Tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm 25 µl, thời gian lưu của AZT khoảng 3,4 phút.
  • Phương pháp đánh giá tiểu phân nano AZT:
    • Kích thước tiểu phân (KTTP) và chỉ số đa phân tán (PDI) xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Zetasizer Nano ZS90 / Zetasizer Ultra Malvern ở 25°C, góc đo 173°.
    • Hiệu suất nano hóa (EE) và tỷ lệ dược chất nano (LC) xác định bằng cách ly tâm qua màng siêu lọc 10.000 Da (5.000 vòng/phút trong 30 phút) để tách AZT tự do và định lượng song song AZT toàn phần bằng HPLC.
    • Tương tác hóa học xác định bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trong dải số sóng 4000–400 cm⁻¹ trên mẫu đông khô (thiết bị đông khô -50°C, áp suất 0,1 mbar, 24 giờ với tá dược manitol 10%).
    • Đánh giá giải phóng in vitro bằng phương pháp màng thẩm tích (14.000 Da) trong 10 ml đệm phosphat salin (PBS) pH 7,4 ở 37 ± 0,5°C, tốc độ lắc 100 vòng/phút.
  • Phương pháp đánh giá hệ hydrogel:
    • Nhiệt độ chuyển sol-gel ($T_{sol-gel}$) xác định bằng phương pháp nghiêng lọ ở dải gia nhiệt 0,5°C/2 phút từ 10°C.
    • Đo pH bằng máy đo Mettler Toledo (pha loãng gel 10 lần với nước cất).
    • Khảo sát đặc tính lưu biến học trên máy Discovery Hybrid Rheometer HR-1 sử dụng hệ hình học côn - đĩa (đường kính 40 mm, góc nghiêng 4°1'08''). Đánh giá độ nhớt tĩnh $\eta_0$ (chế độ flow sweep, tốc độ trượt 0–100 s⁻¹, ngoại suy theo mô hình Cross), độ nhớt ở tốc độ trượt 250 s⁻¹, và tính xúc biến (thixotropy) ở chế độ trượt liên tục 3 giai đoạn.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này hệ thống hóa các tài liệu khoa học về cơ chế bệnh sinh của viêm khớp dạng thấp, phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp can thiệp hiện hành và luận chứng tính ưu việt của đường tiêm nội khớp. Tác giả phân tích cấu trúc giải phẫu dịch khớp, sụn khớp bình thường so với khớp thoái hóa, vai trò của áp lực cơ học và tình trạng viêm phá hủy sụn. Chương 1 làm rõ vai trò của công nghệ nano trong khắc phục nhược điểm sinh dược học của nhóm thuốc tan kém (BCS II), tổng quan các nghiên cứu nano điều trị khớp (sử dụng PLGA, tristearin, chitosan). Đồng thời, tác giả tổng thuật các đặc tính của Poloxamer 407, Acid Hyaluronic và cơ sở lý thuyết của lưu biến học trong đánh giá chế phẩm bù nhớt dịch khớp (viscosupplementation).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc 22 loại nguyên vật liệu hóa chất và 15 thiết bị chuyên dụng; chuẩn hóa quy trình định lượng AZT bằng HPLC; thiết kế quy trình hai bước gồm: (1) Bào chế và tối ưu hóa hệ tiểu phân nano AZT (khảo sát bản chất chất mang polyme/lipid, tỷ lệ dược chất:tá dược mang, nồng độ chất diện hoạt Tween 80 và PVA); (2) Bào chế và đánh giá hệ hydrogel in situ nhạy nhiệt phối hợp nano AZT (sàng lọc nồng độ P407 từ 10% đến 20%, nồng độ HA từ 0,5% đến 2%, và nồng độ D-manitol từ 5% đến 15%). Quy chuẩn các công thức tính toán EE, LC, lượng dược chất giải phóng tích lũy và các quy trình vận hành thiết bị lưu biến.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

1. Thẩm định sơ bộ phương pháp định lượng AZT

Phương pháp HPLC thể hiện tính tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ AZT trong dải nồng độ từ 0,01 đến 0,40 mg/ml, với phương trình hồi quy đạt hệ số tương quan $R^2 = 0,9999$.

2. Kết quả xây dựng và tối ưu hóa hệ tiểu phân nano AZT

  • Khảo sát hệ nano polyme PLGA: Tăng tỷ lệ PLGA khiến KTTP tăng dần. PVA 0,5% cho kích thước hạt nhỏ và hệ phân tán đồng nhất hơn so với Tween 80 1%.
  • Khảo sát hệ nano lipid (SLN): Dầu dừa tạo tiểu phân có KTTP lớn (> 469 nm). GMS và Lipoid S45 cho KTTP nhỏ hơn (< 240 nm) nhưng PDI biến động rộng.
  • Lựa chọn công thức: Công thức P2.1 (tỷ lệ PLGA:AZT = 2:1, PVA 0,5%) đạt KTTP 94,74 nm, EE 45,53%, LC 21,25%. Khi tăng nồng độ dược chất nhằm nâng cao tải lượng (công thức P7: 30 mg AZT, 60 mg PLGA, 0,5% PVA), hệ đạt KTTP 125,2 nm, PDI 0,13, EE 48,39% và LC 24,38%. Nếu tăng tải lượng AZT lên 35 mg (P8), hiện tượng kết tụ tiểu phân xảy ra do thiếu chất diện hoạt.
Mã công thức AZT (mg) PLGA (mg) Chất diện hoạt Cảm quan KTTP (nm) PDI EE (%) LC (%)
P1.1 10 10 PVA 0,5% Hỗn dịch đục mờ, ánh xanh 91,2 0,26 32,15 18,40
P2.1 10 20 PVA 0,5% Hỗn dịch đục mờ, ánh xanh 107,0 0,24 45,53 21,25
P3.1 10 30 PVA 0,5% Hỗn dịch đục mờ, ánh xanh 167,2 0,46 41,20 15,30
P1.2 10 10 Tween 80 1% Trắng đục 306,6 0,21 28,40 12,10
P2.2 10 20 Tween 80 1% Trắng đục 647,3 0,51 35,60 14,20
P3.2 10 30 Tween 80 1% Trắng đục 675,1 0,57 37,80 11,50
P7 30 60 PVA 0,5% Hỗn dịch đục mờ, ánh xanh 125,2 0,13 48,39 24,38
  • Phổ hồng ngoại FT-IR: Phổ của AZT nguyên liệu biểu hiện pic đặc trưng tại 1052 cm⁻¹ (ete béo đối xứng), 1721 cm⁻¹ (C=O este), 2950 cm⁻¹ (C-H), 3496 và 3561 cm⁻¹ (O-H). Phổ của tiểu phân nano AZT ghi nhận các đỉnh đặc trưng của PLGA và sự suy giảm cường độ pic AZT, chứng minh hoạt chất đã được phân tán đồng nhất vào cấu trúc lõi polyme PLGA mà không xuất hiện tương tác hóa học bất lợi.
  • Đặc tính giải phóng in vitro từ hệ nano P7: Hệ hỗn dịch nano AZT (HDNN) giải phóng 29,82 ± 4,88% hoạt chất ở giờ đầu tiên và đạt 80,72 ± 3,80% sau 24 giờ. Đường cong biểu diễn động học 2 pha: pha giải phóng nhanh trong 10 giờ đầu (đạt 73,50 ± 5,39%) và pha giải phóng chậm kéo dài đến 24 giờ. Trong khi đó, hệ chứa dược chất tự do (HCDC) chỉ giải phóng 11,78 ± 0,43% ở 1 giờ đầu và đạt 68,78 ± 0,48% sau 24 giờ do AZT tan kém bị kết tủa trong môi trường thử.

3. Xây dựng công thức hydrogel in situ nhạy nhiệt

  • Nồng độ P407: Nồng độ P407 tỷ lệ nghịch với nhiệt độ tạo gel. Ở nồng độ 15% P407 trong môi trường hỗn dịch nano, $T_{sol-gel}$ đạt 38°C, gần với nhiệt độ cơ thể.
  • Nồng độ HA: Nồng độ HA tăng làm giảm $T_{sol-gel}$ và giảm pH của gel. Nồng độ 1% HA phối hợp cùng 15% P407 (công thức G4) cho $T_{sol-gel} = 37^\circ\text{C}$ và $\text{pH} = 7,43$.
  • Nồng độ D-manitol: Bổ sung 5% manitol vào công thức G4 tạo ra hệ gel G7 có $T_{sol-gel} = 37^\circ\text{C}$ và $\text{pH} = 7,38$, duy trì trong khoảng pH sinh lý dịch khớp (7,35–7,45). Khi nồng độ manitol tăng lên 10% và 15%, nhiệt độ tạo gel giảm sâu xuống 29°C và 25°C, không còn đảm bảo trạng thái lỏng ở nhiệt độ phòng.

4. Đánh giá đặc tính lưu biến của hydrogel

  • Tính trượt mỏng (shear-thinning): Cả ba công thức G0 (không chứa HA), G4 (15% P407 + 1% HA) và G7 (15% P407 + 1% HA + 5% manitol) đều có độ nhớt giảm mạnh khi tăng tốc độ trượt từ 0 đến 100 s⁻¹. Độ nhớt của hệ ở 37°C cao hơn rõ rệt so với ở 25°C. Việc tích hợp tiểu phân nano AZT vào gel không làm mất tính trượt mỏng.
  • Tính xúc biến: Thử nghiệm trượt 3 chu kỳ cho thấy các mẫu gel nề và gel tải nano có diện tích vòng trễ không đáng kể, biểu hiện tính xúc biến rất nhỏ hoặc không có tính xúc biến.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Xác lập được công thức tối ưu cho hệ tiểu phân nano AZT (công thức P7): Tỷ lệ PLGA:AZT là 2:1, chất diện hoạt PVA 0,5%. Hệ nano thu được có kích thước hạt trung bình $125,2 \pm 28,52\text{ nm}$, chỉ số đa phân tán hẹp $\text{PDI} = 0,13 \pm 0,03$, hiệu suất nano hóa $\text{EE} = 48,39 \pm 8,21%$ và tỷ lệ dược chất nano $\text{LC} = 24,38 \pm 5,14%$.
  • Hệ hydrogel in situ nhạy nhiệt mang tiểu phân nano AZT 0,1% được hoàn thiện với hai công thức tối ưu: G4 (15% P407, 1% HA) và G7 (15% P407, 1% HA, 5% D-manitol). Cả hai công thức tồn tại ở trạng thái lỏng ở nhiệt độ phòng (25°C), chuyển sang trạng thái gel đồng nhất tại nhiệt độ sinh lý (37°C), có pH tương thích sinh lý (7,38–7,43).
  • Kết quả lưu biến khẳng định hệ hydrogel thể hiện tính trượt mỏng điển hình của chế phẩm bù nhớt thay thế dịch khớp, giúp dễ tiêm qua kim ở trạng thái lỏng và nhanh chóng đông đặc thành khối gel đàn hồi tại ổ khớp để giải phóng thuốc kéo dài.

Giải pháp và đóng góp của đề tài

  • Giải quyết bài toán độ tan kém của Azithromycin (BCS nhóm II), biến một kháng sinh macrolide đường uống thành hoạt chất tiềm năng cho điều trị viêm khớp tại chỗ.
  • Cung cấp giải pháp kết hợp hai bậc: "tiểu phân nano trong hydrogel nhạy nhiệt", khắc phục nhược điểm kép của việc tiêm hạt nano đơn lẻ (dễ bị thực bào và đào thải nhanh) cũng như hydrogel thông thường (giải phóng ồ ạt ban đầu và cơ tính kém).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các hạn chế và định hướng phát triển thực tế từ văn bản nghiên cứu:

  • Hạn chế: Hiệu suất nano hóa của AZT trong PLGA mới đạt khoảng 48,39%, một phần dược chất vẫn tồn tại ở dạng phân tử tự do bên ngoài hạt. Hiện tượng giải phóng nhanh trong 10 giờ đầu vẫn còn tương đối cao (đạt 73,50%), do sự khuếch tán của lượng dược chất hấp phụ lỏng lẻo trên bề mặt tiểu phân.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Cần tiếp tục nghiên cứu nâng cao hiệu suất nano hóa (EE) và tỷ lệ tải dược chất (LC); khảo sát sâu hơn về độ ổn định vật lý và hóa học của hệ hydrogel theo thời gian bảo quản; triển khai các thử nghiệm giải phóng kéo dài trong thời gian trên 24 giờ; đánh giá tính tương thích sinh học, độc tính tế bào và kiểm tra tác dụng kháng viêm trên mô hình động vật sống (in vivo).

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo: Tài liệu là nguồn tư liệu hữu ích cho sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Dược lâm sàng, và các nhà nghiên cứu về hệ dẫn thuốc nano/hydrogel thông minh.
  • Nội dung giá trị nhất: Quy trình công nghệ bào chế nhũ hóa bốc hơi dung môi cho hệ nano PLGA mang kháng sinh tan kém; quy trình sàng lọc tỷ lệ tá dược tạo gel nhạy nhiệt P407 - HA - Manitol; phương pháp đánh giá đặc tính lưu biến học (rheology) bằng thiết bị côn - đĩa để kiểm soát các thông số trượt mỏng và tính xúc biến của thuốc tiêm nội khớp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại lựa chọn Azithromycin để bào chế thuốc tiêm nội khớp điều trị viêm khớp dạng thấp?

Azithromycin không chỉ là kháng sinh mà còn có tác dụng chống viêm khớp độc lập: làm giảm đáng kể các cytokin tiền viêm, điều hòa thụ thể GRP78, ngăn ngừa phá hủy xương và ức chế TNF-α hiệu quả tương đương etanercept trong mô hình viêm khớp do collagen gây ra. Việc chuyển sang dạng tiêm tại chỗ giải quyết nhược điểm độ tan kém và sinh khả dụng thấp của AZT đường uống.

2. Thành phần và thông số chất lượng của công thức tiểu phân nano AZT tối ưu (P7) là gì?

Công thức P7 gồm 30 mg AZT, 60 mg PLGA (tỷ lệ 1:2), phân tán trong pha nước chứa PVA 0,5% (kl/tt). Thông số chất lượng đạt được: KTTP là $125,2 \pm 28,52\text{ nm}$, PDI là $0,13 \pm 0,03$, hiệu suất nano hóa EE là $48,39 \pm 8,21%$ và tỷ lệ dược chất nano LC là $24,38 \pm 5,14%$.

3. Thành phần công thức hydrogel G7 gồm những gì và vì sao lại thêm D-manitol?

Công thức G7 gồm 15% Poloxamer 407, 1% Hyaluronic acid và 5% D-manitol (kl/kl), phối hợp hỗn dịch nano để đạt nồng độ AZT 0,1%. D-manitol được bổ sung như một tác nhân chống oxy hóa nhằm bảo vệ chuỗi HA khỏi sự phân hủy của các gốc tự do trong ổ khớp, kéo dài thời gian lưu của HA và tăng độ ổn định thể chất cho hệ gel.

4. Hệ hydrogel bào chế thể hiện hành vi lưu biến học như thế nào?

Hệ hydrogel thể hiện rõ tính chất trượt mỏng (shear-thinning), tức là độ nhớt của hệ giảm mạnh khi tăng tốc độ trượt. Độ nhớt tại 37°C cao hơn nhiều so với tại 25°C do quá trình tạo mạng lưới gel khi gặp nhiệt độ cơ thể. Hệ không có tính xúc biến hoặc tính xúc biến rất nhỏ.

Kết luận

Khóa luận đã nghiên cứu thành công quy trình bào chế hệ tiểu phân nano PLGA mang Azithromycin có kích thước hạt $125,2\text{ nm}$ và tích hợp vào hệ hydrogel in situ nhạy nhiệt Poloxamer 407 - Acid Hyaluronic - Manitol. Chế phẩm đạt nồng độ hoạt chất 0,1%, có khả năng chuyển pha sol-gel tại nhiệt độ sinh lý 37°C, pH tương thích sinh học và thể hiện đặc tính lưu biến trượt mỏng phù hợp cho đường tiêm nội khớp. Đây là tiền đề thực nghiệm quan trọng mở ra hướng tiếp cận mới trong việc phát triển hệ phân phối thuốc tại chỗ tác dụng kéo dài cho bệnh nhân viêm khớp dạng thấp.