MỞ ĐẦU Protease là nhóm enzyme có chức năng phân giải các liên kết peptide của protein để tạo thành các amino acid đơn lẻ. Với tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực đời sống nên protease đang thu hút mối quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng nhƣ các công ty hóa dƣợc lớn trên thế giới. Theo thống kê, hiện nay protease chiếm đến 65% sản phẩm enzyme thƣơng mại toàn cầu và doanh thu ƣớc tính có thể đạt 2.767 triệu bảng Anh vào năm 2019.uk/news-releases/protease-enzymes-market). Vi sinh vật, đặc biệt là chủng vi khuẩn Bacillus là nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất protease ở quy mô công nghiệp nhờ việc thu nhận sản phẩm dễ dàng, nuôi cấy đơn giản và đặc biệt protease của chủng vi khuẩn này có hoạt tính ổn định ở các điều kiện pH, nhiệt độ cao (Olajuyigbe và Ajele, 2005).
Tuy nhiên, các chủng Bacillus tự nhiên thƣờng cho năng suất sinh protease không cao và vì thế việc tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh sản phẩm thứ cấp vƣợt trội là một lựa chọn lý tƣởng cho ngành công nghiệp sản xuất protease. Trong tự nhiên, tỷ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tỷ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia , notron có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao.
Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vật (Awan, 2011). Nhiều nghiên cứu cho thấy một số thể đột biến kháng kháng sinh ở vi sinh vật có thể tăng cƣờng sản xuất sản phẩm thứ cấp nhƣ enzyme, sắc tố, kháng sinh (Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013) cũng nhƣ tăng khả năng chịu hợp chất độc hại (Hosokawa và cs, 2002). Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng streptomycin làm tăng lƣợng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lƣợng sản phẩm cũng tăng từ 1,5 đến 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin (Kurosawa và cs, 2006).
Cơ chế phân tử liên quan đƣợc phân tích, đánh giá trong nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đƣờng chính là gây đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã hóa cho tiểu phần β của RNAP (Lai và cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013; 1 Wang và cs, 2008). Đây cũng là cơ sở cho sự ra đời của công nghệ ribosome (Ribosome Engineering), một kỹ thuật khá mới sử dụng khả năng kháng kháng sinh làm gia tăng hoạt tính của các ribosome tham gia dịch mã tăng sinh tổng hợp protein. Nhƣ vậy gen đích không hề bị cải biến nhƣng khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của gen đƣợc tăng lên nhờ các đột biến liên quan đến bộ máy tổng hợp ribosome. Kỹ thuật này đã chứng minh đƣợc tính hiệu quả, có thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp lên hàng chục, thậm chí hàng trăm lần.
Trong khi, theo báo cáo của một số công ty công nghệ sinh học trên thế giới, đa số các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có năng suất cao hơn chủng tự nhiên không quá vài lần, một số ít trƣờng hợp đạt đƣợc vài chục lần (Ochi và cs, 2013). Ngoài ra, một số sản phẩm dùng để sản xuất thực phẩm hoặc dùng vào mục đích bảo quản thực phẩm chƣa cho phép sử dụng các protein tái tổ hợp. Việc áp dụng công nghệ ribosome sẽ giúp khắc phục những hạn chế này. Rõ ràng, kỹ thuật sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng là tƣơng đối đơn giản, hiệu quả và đặc biệt chi phí thấp so với công nghệ gen.
Tuy nhiên, thời gian sàng lọc đột biến ribosome khá dài, tốn nhiều công sức vì vậy việc sử dụng kết hợp kháng sinh với xử lý chiếu xạ đƣợc xem là một giải pháp nhằm làm tăng áp lực chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc, tăng tần suất thu đƣợc thể đột biến mong muốn, đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật (De Groot và cs, 2005; Al-Sudany và cs, 2010). Nhƣ vậy, việc kết hợp giữa gây đột biến gen bằng phóng xạ và sử dụng kháng sinh có thể giúp tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao hơn chủng tự nhiên nhiều lần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh” Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Sàng lọc một số chủng Bacillus subtilis nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính sinh protease từ một số phòng thí nghiệm trong nƣớc. Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả của xử lí chiếu xạ tới chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và khả năng sinh tổng hợp protease của chúng.1: Xử lý chiếu xạ các chủng Bacillus subtilis từ nội dung 1.2: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ với tốc độ sinh trƣởng.3: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ và khả năng sinh protease.4: Xác định liều chiếu xạ thích hợp để có đƣợc tỷ lệ đột biến sinh protease cao.
Nội dung 3: Xử lí chiếu xạ kết hợp sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng tới các gen mã cho sản phẩm liên quan đến quá trình sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis + 3.1: Sàng lọc các chủng sau chiếu xạ có khả năng chống chịu kháng sinh do bị đột biến trên các gen tham gia tổng hợp ribosome.2: Sàng lọc các chủng Bacillus subtilis chịu bức xạ và kháng kháng sinh có khả năng sinh protease.3: Xác định liều chiếu xạ và nồng độ kháng sinh thích hợp để thu đƣợc dòng đột biến có khả năng tăng sinh tổng hợp protease cao. Nội dung 4: Xác định đột biến trên các gen rpoB và rpsL ở các chủng vi sinh có khả năng sinh protease cao hơn chủng gốc. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide giữa các amino acid của phân tử protein tạo thành các amio acid đơn lẻ (Hình 1.
Protease đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu trên thế giới, trong đó protease tiêu hoá đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp, Reaumur đã bắt đầu nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày và sau đó Schwann đã gọi chất này là pepsin. Năm 1857, Corvisart đã tách đƣợc trypsin, loại protease thứ hai từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998).
Vị trí hoạt động và phân loại exopeptidase (http://protease. Phân loại protease Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase (López-Otín, 2007). * Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại: - Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu amine tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các amino acid đơn lẻ, các dipeptide hoặc tripeptide. - Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu carboxyl của chuỗi polypeptide và giải phóng ra amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide.
4 * Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, exopeptidase đƣợc chia thành 5 nhóm (http://protease.org): - Serine protease là những protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là –OH của serine. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastase (López-Otín, 2007). Nhóm subtilisin gồm hai loại enzyme là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN (Carter, 1989).
Các serine protease thƣờng hoạt động mạnh ở pH 9 – 11 và có tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng. - Cysteine protease là các protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là cysteine. Nhóm này bao gồm các protease thực vật nhƣ papayin, bromelin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng (López-Otín, 2007). Các cysteine protease thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
- Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin (López-Otín, 2007). Các aspartic protease thƣờng có hai gốc aspactic acid bảo thủ tham gia xúc tác nằm trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH axit. - Threonine protease: Các threonine protease tƣơng tự nhƣ serine protease nhƣng chúng chứa gốc xúc tác là amino acid threonine trong trung tâm hoạt động.
Threonine protease chỉ đƣợc biết đến từ sau năm 1995, cơ chế phân cắt các liên kết peptide của chúng dựa trên việc tạo ái lực với protein thông qua các amino acid quan trọng trong trung tâm hoạt động tạo ra các amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide (López-Otín, 2007). - Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Phân biệt với các enzyme khác, các metallo protease chỉ hoạt động khi liên kết với ion kim loại, chủ yếu là kẽm nên còn có tên là zinc metallo protease. Số ít protease khác thuộc nhóm này liên kết với coban thay vì kẽm khi tham gia phản ứng xúc tác.
Các metallo protease hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA (Fox, 1991). Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Acidic protease: là các protease hoạt động ở pH 2–4; chúng có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhƣng ít thấy ở vi khuẩn (Fox, 1991). 5 Protease trung tính là các protease hoạt động ở pH 7–8 nhƣ papain từ đu đủ, bromelain từ dứa, và hầu hết protease có nguồn gốc động vật. Protease kiềm là các protease hoạt động ở pH 9–11 nhƣ alkaline protease, serine protease, protease đƣợc sản xuất bởi Bacillus sp.
Nguồn thu protease Protease là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng, từ động vật, thực vật, tới vi sinh vật. Ở động vật, protease thƣờng có ở hệ tiêu hóa nhƣ tuyến tụy, niêm mạc dạ dày, niêm mạc ruột non (Shafee và cs, 2005). Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá… đƣợc sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa. Rennin ở ngăn thứ tƣ của dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi có khả năng làm đông tụ sữa, đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat.