Nghiên Cứu Tạo Chủng Bacillus Subtilis Đột Biến Có Khả Năng Sinh Protease Cao Bằng Chiếu Xạ Gamma

Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến sinh protease cao qua chiếu xạ gamma và xử lý kháng sinh, mở ra ứng dụng trong công nghiệp.

• Tác giả: Hoàng Đăng Sáng
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Huyền
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Tạo Chủng Bacillus Subtilis Đột Biến Có Khả Năng Sinh Protease Cao Bằng Chiếu Xạ Gamma Kết Hợp Với Xử Lý Kháng Sinh
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Bacillus Subtilis Sinh Protease Cao

Protease là một nhóm enzyme quan trọng, có khả năng phân giải liên kết peptide trong protein, tạo ra các amino acid. Ứng dụng của protease rất đa dạng, từ công nghiệp đến y học, thu hút sự quan tâm của giới khoa học và các công ty hóa dược. Theo thống kê, protease chiếm 65% thị phần enzyme thương mại toàn cầu, với doanh thu ước tính đạt 2.767 triệu bảng Anh vào năm 2019. Vi sinh vật, đặc biệt là Bacillus subtilis, là nguồn cung cấp protease lý tưởng nhờ khả năng sản xuất dễ dàng, nuôi cấy đơn giản và tính ổn định của enzyme trong điều kiện khắc nghiệt. Tuy nhiên, các chủng Bacillus subtilis tự nhiên thường có năng suất sinh protease không cao, do đó việc tạo ra các chủng đột biến có năng suất vượt trội là một hướng đi đầy tiềm năng.

1.1. Giới Thiệu Về Enzyme Protease và Ứng Dụng

Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide giữa các amino acid của phân tử protein tạo thành các amino acid đơn lẻ. Protease đã được nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu trên thế giới, trong đó protease tiêu hoá được nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học người Pháp, Reaumur đã bắt đầu nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày và sau đó Schwann đã gọi chất này là pepsin. Năm 1857, Corvisart đã tách được trypsin, loại protease thứ hai từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận được ở dạng chế phẩm.

1.2. Vì Sao Cần Nghiên Cứu Đột Biến Bacillus Subtilis

Các chủng Bacillus subtilis tự nhiên thường cho năng suất sinh protease không cao. Việc tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh sản phẩm thứ cấp vượt trội là một lựa chọn lý tưởng cho ngành công nghiệp sản xuất protease. Trong tự nhiên, tỷ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10^-10 đến 10^-6. Tỷ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10^-5 đến 10^-1.

II. Thách Thức Nâng Cao Năng Suất Protease Từ Bacillus Subtilis

Mặc dù Bacillus subtilis là một nguồn protease tiềm năng, năng suất sinh protease tự nhiên của chúng thường không đáp ứng được nhu cầu công nghiệp. Các phương pháp truyền thống như chọn lọc tự nhiên thường cho hiệu quả thấp và tốn thời gian. Do đó, cần có những phương pháp đột phá để tạo ra các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao hơn. Các phương pháp đột biến thực nghiệm, đặc biệt là sử dụng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh, đang được nghiên cứu để giải quyết thách thức này. Mục tiêu là tạo ra các chủng đột biến ổn định, có khả năng sinh protease vượt trội và ứng dụng được trong quy trình sản xuất công nghiệp.

2.1. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Chọn Lọc Truyền Thống

Các phương pháp truyền thống như chọn lọc tự nhiên thường cho hiệu quả thấp và tốn thời gian. Tỷ lệ đột biến tự nhiên rất thấp, đòi hỏi quá trình sàng lọc quy mô lớn và kéo dài. Điều này gây khó khăn cho việc cải thiện năng suất sinh protease của Bacillus subtilis một cách hiệu quả.

2.2. Tại Sao Cần Phương Pháp Đột Phá Để Cải Thiện Enzyme

Cần có những phương pháp đột phá để tạo ra các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao hơn. Các phương pháp đột biến thực nghiệm, đặc biệt là sử dụng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh, đang được nghiên cứu để giải quyết thách thức này. Mục tiêu là tạo ra các chủng đột biến ổn định, có khả năng sinh protease vượt trội và ứng dụng được trong quy trình sản xuất công nghiệp.

III. Chiếu Xạ Gamma Giải Pháp Đột Biến Protease Hiệu Quả

Chiếu xạ gamma là một phương pháp gây đột biến vật lý hiệu quả, sử dụng các tia phóng xạ để tác động lên DNA của vi sinh vật. Các tia này có khả năng ion hóa và xuyên sâu cao, gây ra các đứt gãy, thay đổi cấu trúc DNA hoặc hình thành các hợp chất không ổn định, dẫn đến đột biến. Chiếu xạ gamma có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định, giúp cải thiện hoạt tính của vi sinh vật. Phương pháp này hứa hẹn tạo ra các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao hơn, mở ra tiềm năng ứng dụng lớn trong công nghiệp.

3.1. Cơ Chế Tác Động Của Chiếu Xạ Gamma Lên Vi Sinh Vật

Các tác nhân vật lý như: các tia X, tia , notron có bước sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao. Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vật.

3.2. Ưu Điểm Của Phương Pháp Chiếu Xạ Gamma Trong Tạo Đột Biến

Chiếu xạ gamma có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu cho thấy một số thể đột biến kháng kháng sinh ở vi sinh vật có thể tăng cường sản xuất sản phẩm thứ cấp như enzyme, sắc tố, kháng sinh cũng như tăng khả năng chịu hợp chất độc hại.

IV. Kết Hợp Chiếu Xạ Gamma và Kháng Sinh Bí Quyết Đột Phá

Nhiều nghiên cứu cho thấy các thể đột biến kháng kháng sinh có thể tăng cường sản xuất các sản phẩm thứ cấp như enzyme. Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng streptomycin làm tăng lượng enzyme α-amylase, và đột biến kháng rifampicin cũng làm tăng sản lượng. Cơ chế phân tử liên quan chủ yếu là do đột biến gen rpsL (mã hóa protein ribosome S12) và gen rpoB (mã hóa tiểu phần β của RNAP). Việc kết hợp chiếu xạ gamma với xử lý kháng sinh giúp tăng áp lực chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc và tăng tần suất thu được thể đột biến mong muốn.

4.1. Cơ Chế Tăng Cường Sản Xuất Enzyme Nhờ Đột Biến Kháng Kháng Sinh

Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng streptomycin làm tăng lượng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lượng sản phẩm cũng tăng từ 1,5 đến 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin. Cơ chế phân tử liên quan được phân tích, đánh giá trong nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đường chính là gây đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã hóa cho tiểu phần β của RNAP.

4.2. Lợi Ích Của Việc Kết Hợp Chiếu Xạ và Kháng Sinh

Việc kết hợp chiếu xạ gamma với xử lý kháng sinh giúp tăng áp lực chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc và tăng tần suất thu được thể đột biến mong muốn. Đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật. Việc kết hợp giữa gây đột biến gen bằng phóng xạ và sử dụng kháng sinh có thể giúp tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao hơn chủng tự nhiên nhiều lần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Tiềm Năng Phát Triển Protease

Việc tạo ra các chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn trong các ngành công nghiệp khác nhau. Protease được sử dụng rộng rãi trong sản xuất chất tẩy rửa, chế biến thực phẩm, sản xuất dược phẩm và nhiều lĩnh vực khác. Nghiên cứu này có tiềm năng đóng góp vào việc phát triển các quy trình sản xuất enzyme protease hiệu quả hơn, giảm chi phí và tăng tính cạnh tranh cho các doanh nghiệp. Hơn nữa, việc áp dụng công nghệ sinh học tiên tiến như công nghệ ribosome có thể giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất và tạo ra các sản phẩm protease chất lượng cao.

5.1. Các Lĩnh Vực Ứng Dụng Protease Trong Công Nghiệp

Protease được sử dụng rộng rãi trong sản xuất chất tẩy rửa, chế biến thực phẩm, sản xuất dược phẩm và nhiều lĩnh vực khác. Với tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực đời sống nên protease đang thu hút mối quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như các công ty hóa dược lớn trên thế giới.

5.2. Tiềm Năng Phát Triển Quy Trình Sản Xuất Protease Hiệu Quả

Nghiên cứu này có tiềm năng đóng góp vào việc phát triển các quy trình sản xuất enzyme protease hiệu quả hơn, giảm chi phí và tăng tính cạnh tranh cho các doanh nghiệp. Hơn nữa, việc áp dụng công nghệ sinh học tiên tiến như công nghệ ribosome có thể giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất và tạo ra các sản phẩm protease chất lượng cao.

VI. Kết Luận Hướng Đi Mới Cho Nghiên Cứu Protease Tương Lai

Nghiên cứu về tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh là một hướng đi đầy hứa hẹn. Phương pháp này không chỉ giúp cải thiện năng suất sinh protease mà còn mở ra cơ hội ứng dụng công nghệ ribosome để tối ưu hóa quá trình sản xuất. Trong tương lai, các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế đột biến, di truyền học vi sinh vật và sinh học phân tử sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về quá trình sinh tổng hợp protease và phát triển các chủng vi sinh vật có năng suất vượt trội.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu và Đóng Góp

Nghiên cứu về tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh là một hướng đi đầy hứa hẹn. Phương pháp này không chỉ giúp cải thiện năng suất sinh protease mà còn mở ra cơ hội ứng dụng công nghệ ribosome để tối ưu hóa quá trình sản xuất.

6.2. Hướng Nghiên Cứu và Phát Triển Trong Tương Lai

Trong tương lai, các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế đột biến, di truyền học vi sinh vật và sinh học phân tử sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về quá trình sinh tổng hợp protease và phát triển các chủng vi sinh vật có năng suất vượt trội. Cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chiếu xạ gamma, lựa chọn kháng sinh phù hợp và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định và phân tích các đột biến có lợi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Protease là nhóm enzyme có chức năng phân giải các liên kết peptide của protein để tạo thành các amino acid đơn lẻ. Với tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực đời sống nên protease đang thu hút mối quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng nhƣ các công ty hóa dƣợc lớn trên thế giới. Theo thống kê, hiện nay protease chiếm đến 65% sản phẩm enzyme thƣơng mại toàn cầu và doanh thu ƣớc tính có thể đạt 2.767 triệu bảng Anh vào năm 2019.uk/news-releases/protease-enzymes-market). Vi sinh vật, đặc biệt là chủng vi khuẩn Bacillus là nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất protease ở quy mô công nghiệp nhờ việc thu nhận sản phẩm dễ dàng, nuôi cấy đơn giản và đặc biệt protease của chủng vi khuẩn này có hoạt tính ổn định ở các điều kiện pH, nhiệt độ cao (Olajuyigbe và Ajele, 2005).

Tuy nhiên, các chủng Bacillus tự nhiên thƣờng cho năng suất sinh protease không cao và vì thế việc tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh sản phẩm thứ cấp vƣợt trội là một lựa chọn lý tƣởng cho ngành công nghiệp sản xuất protease. Trong tự nhiên, tỷ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của vi sinh vật và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tỷ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Các tác nhân vật lý nhƣ: các tia X, tia , notron có bƣớc sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao.

Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy DNA, thay đổi cấu trúc của DNA hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi DNA. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt tính của vi sinh vật (Awan, 2011). Nhiều nghiên cứu cho thấy một số thể đột biến kháng kháng sinh ở vi sinh vật có thể tăng cƣờng sản xuất sản phẩm thứ cấp nhƣ enzyme, sắc tố, kháng sinh (Ochi, 2007; Wang và cs, 2008; Ochi và Hosaka, 2013) cũng nhƣ tăng khả năng chịu hợp chất độc hại (Hosokawa và cs, 2002). Ở Bacillus subtilis, đột biến kháng streptomycin làm tăng lƣợng sản phẩm enzyme α – amylase lên 20 – 30% và lƣợng sản phẩm cũng tăng từ 1,5 đến 2 lần với thể đột biến kháng rifampicin (Kurosawa và cs, 2006).

Cơ chế phân tử liên quan đƣợc phân tích, đánh giá trong nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đƣờng chính là gây đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã hóa cho tiểu phần β của RNAP (Lai và cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013; 1 Wang và cs, 2008). Đây cũng là cơ sở cho sự ra đời của công nghệ ribosome (Ribosome Engineering), một kỹ thuật khá mới sử dụng khả năng kháng kháng sinh làm gia tăng hoạt tính của các ribosome tham gia dịch mã tăng sinh tổng hợp protein. Nhƣ vậy gen đích không hề bị cải biến nhƣng khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của gen đƣợc tăng lên nhờ các đột biến liên quan đến bộ máy tổng hợp ribosome. Kỹ thuật này đã chứng minh đƣợc tính hiệu quả, có thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp lên hàng chục, thậm chí hàng trăm lần.

Trong khi, theo báo cáo của một số công ty công nghệ sinh học trên thế giới, đa số các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có năng suất cao hơn chủng tự nhiên không quá vài lần, một số ít trƣờng hợp đạt đƣợc vài chục lần (Ochi và cs, 2013). Ngoài ra, một số sản phẩm dùng để sản xuất thực phẩm hoặc dùng vào mục đích bảo quản thực phẩm chƣa cho phép sử dụng các protein tái tổ hợp. Việc áp dụng công nghệ ribosome sẽ giúp khắc phục những hạn chế này. Rõ ràng, kỹ thuật sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng là tƣơng đối đơn giản, hiệu quả và đặc biệt chi phí thấp so với công nghệ gen.

Tuy nhiên, thời gian sàng lọc đột biến ribosome khá dài, tốn nhiều công sức vì vậy việc sử dụng kết hợp kháng sinh với xử lý chiếu xạ đƣợc xem là một giải pháp nhằm làm tăng áp lực chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc, tăng tần suất thu đƣợc thể đột biến mong muốn, đặc biệt là tăng khả năng kháng với kháng sinh của vi sinh vật (De Groot và cs, 2005; Al-Sudany và cs, 2010). Nhƣ vậy, việc kết hợp giữa gây đột biến gen bằng phóng xạ và sử dụng kháng sinh có thể giúp tạo ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao hơn chủng tự nhiên nhiều lần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng Bacillus subtilis đột biến có khả năng sinh protease cao bằng chiếu xạ gamma kết hợp với xử lý kháng sinh” Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Sàng lọc một số chủng Bacillus subtilis nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính sinh protease từ một số phòng thí nghiệm trong nƣớc. Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả của xử lí chiếu xạ tới chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và khả năng sinh tổng hợp protease của chúng.1: Xử lý chiếu xạ các chủng Bacillus subtilis từ nội dung 1.2: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ với tốc độ sinh trƣởng.3: Nghiên cứu mối tƣơng quan giữa liều chiếu xạ và khả năng sinh protease.4: Xác định liều chiếu xạ thích hợp để có đƣợc tỷ lệ đột biến sinh protease cao.

Nội dung 3: Xử lí chiếu xạ kết hợp sử dụng kháng sinh gây đột biến định hƣớng tới các gen mã cho sản phẩm liên quan đến quá trình sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis + 3.1: Sàng lọc các chủng sau chiếu xạ có khả năng chống chịu kháng sinh do bị đột biến trên các gen tham gia tổng hợp ribosome.2: Sàng lọc các chủng Bacillus subtilis chịu bức xạ và kháng kháng sinh có khả năng sinh protease.3: Xác định liều chiếu xạ và nồng độ kháng sinh thích hợp để thu đƣợc dòng đột biến có khả năng tăng sinh tổng hợp protease cao. Nội dung 4: Xác định đột biến trên các gen rpoB và rpsL ở các chủng vi sinh có khả năng sinh protease cao hơn chủng gốc. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung Protease là enzyme thủy phân liên kết peptide giữa các amino acid của phân tử protein tạo thành các amio acid đơn lẻ (Hình 1.

Protease đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ rất lâu trên thế giới, trong đó protease tiêu hoá đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp, Reaumur đã bắt đầu nghiên cứu khả năng tiêu hoá thịt trong dạ dày và sau đó Schwann đã gọi chất này là pepsin. Năm 1857, Corvisart đã tách đƣợc trypsin, loại protease thứ hai từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998).

Vị trí hoạt động và phân loại exopeptidase (http://protease. Phân loại protease Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase (López-Otín, 2007). * Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại: - Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu amine tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra các amino acid đơn lẻ, các dipeptide hoặc tripeptide. - Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu carboxyl của chuỗi polypeptide và giải phóng ra amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide.

4 * Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, exopeptidase đƣợc chia thành 5 nhóm (http://protease.org): - Serine protease là những protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là –OH của serine. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastase (López-Otín, 2007). Nhóm subtilisin gồm hai loại enzyme là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN (Carter, 1989).

Các serine protease thƣờng hoạt động mạnh ở pH 9 – 11 và có tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng. - Cysteine protease là các protease có gốc xúc tác trong trung tâm hoạt động là cysteine. Nhóm này bao gồm các protease thực vật nhƣ papayin, bromelin, một vài protease động vật và protease ký sinh trùng (López-Otín, 2007). Các cysteine protease thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

- Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin (López-Otín, 2007). Các aspartic protease thƣờng có hai gốc aspactic acid bảo thủ tham gia xúc tác nằm trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH axit. - Threonine protease: Các threonine protease tƣơng tự nhƣ serine protease nhƣng chúng chứa gốc xúc tác là amino acid threonine trong trung tâm hoạt động.

Threonine protease chỉ đƣợc biết đến từ sau năm 1995, cơ chế phân cắt các liên kết peptide của chúng dựa trên việc tạo ái lực với protein thông qua các amino acid quan trọng trong trung tâm hoạt động tạo ra các amino acid đơn lẻ hoặc các dipeptide (López-Otín, 2007). - Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Phân biệt với các enzyme khác, các metallo protease chỉ hoạt động khi liên kết với ion kim loại, chủ yếu là kẽm nên còn có tên là zinc metallo protease. Số ít protease khác thuộc nhóm này liên kết với coban thay vì kẽm khi tham gia phản ứng xúc tác.

Các metallo protease hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA (Fox, 1991). Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: Acidic protease: là các protease hoạt động ở pH 2–4; chúng có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhƣng ít thấy ở vi khuẩn (Fox, 1991). 5 Protease trung tính là các protease hoạt động ở pH 7–8 nhƣ papain từ đu đủ, bromelain từ dứa, và hầu hết protease có nguồn gốc động vật. Protease kiềm là các protease hoạt động ở pH 9–11 nhƣ alkaline protease, serine protease, protease đƣợc sản xuất bởi Bacillus sp.

Nguồn thu protease Protease là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tƣợng, từ động vật, thực vật, tới vi sinh vật. Ở động vật, protease thƣờng có ở hệ tiêu hóa nhƣ tuyến tụy, niêm mạc dạ dày, niêm mạc ruột non (Shafee và cs, 2005). Pepsin từ niêm mạc dạ dày và dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát, cá… đƣợc sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa. Rennin ở ngăn thứ tƣ của dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi có khả năng làm đông tụ sữa, đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất phomat.