Nghiên Cứu Mô Hình In Silico Để Sàng Lọc Các Phân Tử Nhỏ Ức Chế PD-L1

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Nghiên cứu xây dựng mô hình in silico để sàng lọc các phân tử nhỏ có khả năng ức chế pd l1 phối tử, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng

• Tác giả: Đoàn Lê Thùy Trâm
• Người hướng dẫn: GS. Thái Khắc Minh
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Dược Lý – Dược Lâm Sang
• Đề tài: Mô Hình In Silico Sàng Lọc Phân Tử Nhỏ Ức Chế PD-L1
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ dược học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. TỔNG QUAN VỀ CHỐT KIỂM SOÁT MIỄN DỊCH
• 1.1.2. TỔNG QUAN VỀ PD-L1 VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ PD-L1
• 1.1.3. THIẾT KẾ THUỐC HỢP LÝ
• 1.1.4. ỨNG DỤNG SÀNG LỌC ẢO
• 1.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 1.2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.3. KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE TRÊN PHỐI TỬ
• 1.4. KẾT QUẢ SÀNG LỌC IN SILICO
• 1.5. ĐÁNH GIÁ MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC HỌC
• 1.6. KẾT QUẢ TÍNH TOÁN NĂNG LƯỢNG TỰ DO
• 1.7. BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ SÀNG LỌC
• 1.8. SO SÁNH VỚI CÁC NGHIÊN CỨU KHÁC
• 1.9. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về mô hình in silico sàng lọc phân tử nhỏ ức chế PD L1

Mô hình in silico sàng lọc phân tử nhỏ ức chế PD-L1 đang trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu dược lý. PD-L1 là một protein có vai trò quan trọng trong việc điều hòa hệ miễn dịch, đặc biệt trong điều trị ung thư. Việc phát triển các chất ức chế PD-L1 bằng phương pháp in silico giúp tiết kiệm thời gian và chi phí trong quá trình nghiên cứu. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng mô hình 3D-pharmacophore để tìm kiếm các phân tử nhỏ có khả năng ức chế PD-L1.

1.1. Mô hình in silico và ứng dụng trong nghiên cứu dược lý

Mô hình in silico cho phép mô phỏng và phân tích các tương tác giữa phân tử và protein. Phương pháp này giúp xác định các đặc điểm cấu trúc của phân tử nhỏ có khả năng ức chế PD-L1, từ đó tối ưu hóa quá trình phát triển thuốc.

1.2. Tầm quan trọng của PD L1 trong điều trị ung thư

PD-L1 là một mục tiêu quan trọng trong liệu pháp miễn dịch. Sự gắn kết giữa PD-L1 và PD-1 giúp tế bào ung thư tránh khỏi sự tấn công của hệ miễn dịch. Do đó, việc phát triển các chất ức chế PD-L1 là cần thiết để nâng cao hiệu quả điều trị ung thư.

II. Thách thức trong việc phát triển chất ức chế PD L1

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong việc phát triển các chất ức chế PD-L1, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Các liệu pháp hiện tại thường gặp phải vấn đề về tác dụng phụ và hiệu quả không đồng đều. Việc tìm kiếm các phân tử nhỏ có khả năng ức chế PD-L1 mà không gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng là một thách thức lớn trong nghiên cứu dược lý.

2.1. Tác dụng phụ của liệu pháp kháng thể đơn dòng

Liệu pháp kháng thể đơn dòng có thể gây ra các tác dụng phụ liên quan đến miễn dịch (irAEs). Những tác dụng phụ này có thể làm giảm chất lượng cuộc sống của bệnh nhân và hạn chế khả năng điều trị.

2.2. Khó khăn trong việc tối ưu hóa cấu trúc phân tử

Việc tối ưu hóa cấu trúc của các phân tử nhỏ để đạt được hiệu quả ức chế PD-L1 mà không gây ra tác dụng phụ là một thách thức lớn. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ hơn về các tương tác giữa phân tử và PD-L1.

III. Phương pháp xây dựng mô hình in silico hiệu quả

Nghiên cứu sử dụng các cơ sở dữ liệu lớn như ZINC, MBHC và DrugBank để xây dựng mô hình in silico. Các phương pháp như docking phân tử và mô phỏng động lực học được áp dụng để đánh giá khả năng gắn kết của các phân tử nhỏ với PD-L1. Mô hình pharmacophore 3D được xây dựng để sàng lọc các chất tiềm năng.

3.1. Sử dụng cơ sở dữ liệu để tìm kiếm phân tử

Cơ sở dữ liệu chứa hàng triệu phân tử giúp nghiên cứu viên có thể tìm kiếm và sàng lọc các chất có khả năng ức chế PD-L1. Việc sử dụng các công cụ in silico giúp tiết kiệm thời gian và chi phí trong quá trình nghiên cứu.

3.2. Đánh giá khả năng gắn kết của phân tử

Phương pháp docking phân tử cho phép đánh giá khả năng gắn kết của các phân tử nhỏ với PD-L1. Kết quả từ docking giúp xác định các chất tiềm năng cho nghiên cứu tiếp theo.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu đã xác định được nhiều phân tử nhỏ có khả năng ức chế PD-L1 thông qua mô hình in silico. Kết quả cho thấy một số chất có khả năng gắn kết tốt với PD-L1, mở ra hướng đi mới trong phát triển thuốc điều trị ung thư. Các chất này cần được thử nghiệm thêm để đánh giá hoạt tính sinh học.

4.1. Các chất tiềm năng từ mô hình sàng lọc

Nghiên cứu đã chọn ra 7 chất có điểm số docking cao để tiến hành mô phỏng động lực học. Những chất này cho thấy tiềm năng lớn trong việc ức chế PD-L1 và cần được thử nghiệm thêm.

4.2. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Các chất ức chế PD-L1 tiềm năng có thể được phát triển thành thuốc điều trị ung thư. Việc áp dụng các chất này trong lâm sàng có thể cải thiện hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu mô hình in silico sàng lọc phân tử nhỏ ức chế PD-L1 đã mở ra nhiều cơ hội mới trong phát triển thuốc điều trị ung thư. Các kết quả đạt được từ nghiên cứu này có thể được tiếp tục thử nghiệm để tìm ra các chất thực sự hiệu quả trong điều trị. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong lĩnh vực dược lý.

5.1. Tương lai của các chất ức chế PD L1

Các chất ức chế PD-L1 tiềm năng có thể trở thành một phần quan trọng trong liệu pháp điều trị ung thư. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả thực tế của các chất này.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa cấu trúc của các phân tử nhỏ và đánh giá khả năng gắn kết của chúng với PD-L1. Việc phát triển các phương pháp mới trong nghiên cứu sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Liệu pháp miễn dịch nhắm vào chốt kiểm soát miễn dịch PD-1/PD-L1 đã tạo ra bước đột phá mang tính cách mạng trong điều trị ung thư, minh chứng qua việc Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê duyệt 6 kháng thể đơn dòng chủ lực như pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab và durvalumab. Mặc dù đem lại tỷ lệ đáp ứng điều trị tích cực, các thuốc sinh học dạng kháng thể đơn dòng vẫn bộc lộ nhiều rào cản lớn: thời gian bán thải kéo dài gây tích lũy độc tính, nguy cơ gặp các biến cố bất lợi liên quan đến miễn dịch (irAEs) cao, khả năng thâm nhập mô khối u bị hạn chế và chi phí điều trị vượt quá 100.000 USD mỗi năm đối với đa số bệnh nhân. Trước thực trạng đó, việc phát triển các thuốc hóa dược phân tử nhỏ (SMPPII) có khả năng ức chế trực tiếp tương tác PD-1/PD-L1 nổi lên như một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn nhờ sinh khả dụng đường uống vượt trội, quy trình tổng hợp kinh tế và khả năng điều chỉnh liều linh hoạt.

Luận văn thạc sĩ dược học chuyên ngành Dược lý – Dược lâm sàng (Mã số: 8720205) của tác giả Đoàn Lê Thùy Trâm, dưới sự hướng dẫn khoa học của Giáo sư Thái Khắc Minh tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (hoàn thành năm 2021), được thực hiện nhằm giải quyết bài toán cấp thiết này. Mục tiêu tổng quát của đề tài là xây dựng một quy trình sàng lọc ảo (in silico) đa tầng, tích hợp chặt chẽ từ mô hình 3D-pharmacophore, đánh giá dược động học ADME, gắn kết phân tử (molecular docking) cho đến mô phỏng động lực học phân tử (MDs) và tính toán năng lượng tự do liên kết MM-PBSA. Nghiên cứu hướng đến việc sàng lọc kho dữ liệu khổng lồ với hơn 21,8 triệu phân tử từ 3 cơ sở dữ liệu chuẩn quốc tế (ZINC, DrugBank, Maybridge) để tìm kiếm các cấu trúc phân tử nhỏ mới có ái lực gắn kết cao và đặc hiệu với protein PD-L1. Đây là công trình tiên phong tại Việt Nam ứng dụng hệ thống tính toán sinh dược học toàn diện vào phát hiện thuốc ức chế chốt kiểm soát miễn dịch ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên các nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và hóa tin học tiên tiến:

• Lý thuyết chốt kiểm soát miễn dịch và tương tác PD-1/PD-L1: Phân tử PD-L1 (kích thước 40 kDa, gồm 290 acid amin, mã hóa bởi gen CD274 trên nhiễm sắc thể số 9) liên kết với thụ thể PD-1 trên tế bào T, truyền tín hiệu ức chế miễn dịch làm khối u trốn thoát khỏi sự giám sát của hệ miễn dịch. Việc chèn phân tử nhỏ vào khoang tương tác của dimer PD-L1 (đặc biệt tại các acid amin Tyr56, Asp122, Lys124 và khe kỵ nước Ile134) sẽ khóa con đường truyền tín hiệu ức chế này.
• Mô hình 3D-Pharmacophore dựa trên phối tử (Ligand-based Pharmacophore): Theo định nghĩa chuẩn của IUPAC, pharmacophore là tập hợp các đặc tính không gian và điện tử cần thiết để đảm bảo sự tương tác tối ưu với đích sinh học. Mô hình tổng hợp các yếu tố tương tác gồm tâm cho/nhận liên kết hydro, nhóm kỵ nước, vòng thơm và tâm tích điện.
• Quy tắc sàng lọc dược động học (Drug-likeness & ADMET): Ứng dụng tích hợp các bộ tiêu chuẩn kinh điển gồm luật Lipinski, Ghose (Amgen), Veber (GSK), Egan (Pharmacia), Muegge (Bayer), bộ lọc độc tính PAINS, cấu trúc kém bền Brenk và mô hình BOILED-Egg nhằm đánh giá khả năng hấp thu thụ động qua ruột (GI) cùng tính an toàn chuyển hóa qua 5 enzyme Cytochrome P450.
• Lý thuyết mô phỏng động học và nhiệt động học phân tử: Áp dụng định luật II Newton mô tả chuyển động nguyên tử theo thời gian thực kết hợp phương pháp MM-PBSA để tính toán năng lượng tự do liên kết trong dung môi nước sinh lý.

Phương pháp nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được triển khai theo hệ thống phương pháp chặt chẽ:

• Nguồn dữ liệu và kích thước tập mẫu:
  • Cấu trúc protein đích: Tinh thể PD-L1 đồng kết tinh với phân tử BMS-1001 được truy xuất từ Protein Data Bank (PDB ID: 5NIU) ở độ phân giải cao.
  • Tập hợp chất hoạt tính: Thu thập 58 chất ức chế PD-L1 đã được kiểm chứng hoạt tính bằng phương pháp huỳnh quang đồng nhất HTRF từ 5 bằng sáng chế quốc tế. Trong đó, chọn 10 chất có hoạt tính ức chế mạnh nhất ($IC_{50} < 10\text{ nM}$) làm tập xây dựng mô hình (training set).
  • Tập đối chứng âm (Decoy): Tạo lập 259 phân tử decoy có tính chất hóa lý tương đồng nhưng cấu trúc không hoạt tính bằng phần mềm DecoyFinder 2.0 (tỷ lệ khoảng 26 decoy/chất hoạt tính).
  • Thư viện sàng lọc quy mô lớn: Tổng cộng 21.800.167 hợp chất từ 3 cơ sở dữ liệu gồm DrugBank (9.074 chất), Maybridge HitCreator (14.000 chất) và cơ sở dữ liệu thương mại ZINC Purchasable (hơn 21,7 triệu cấu dạng phân tử).
• Quy trình phân tích và công cụ thực hiện:
  • Xây dựng và kiểm định Pharmacophore: Sử dụng công cụ Pharmacophore Elucidation trên phần mềm MOE 2015.10 với độ che phủ hoạt tính cài đặt 90% (active coverage 0,9). Kiểm định chất lượng mô hình thông qua độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp), độ chính xác (ACC) và điểm số chọn lọc $GH > 0,7$.
  • Đánh giá ADME: Chuyển đổi cấu trúc sang định dạng SMILES và sàng lọc trực tuyến qua máy chủ SwissADME.
  • Gắn kết phân tử (Molecular Docking): Thực hiện trên phần mềm LeadIT 2.8 với thuật toán FlexX. Xác định vị trí khoang gắn kết quanh phân tử chuẩn BMS-1001 với bán kính mở rộng 10 Å. Đánh giá độ tin cậy bằng phương pháp tái gắn kết (re-docking) với độ lệch RMSD dưới 1,5 Å.
  • Mô phỏng động lực học phân tử (MDs): Thực hiện trên GROMACS 2020.2 trong 50 nanosecond (50 ns) với trường lực CHARMM27, mô hình nước TIP3P, trung hòa điện tích bằng dung dịch NaCl 0,15 M, cân bằng 2 pha NVT và NPT trong 100 picosecond (100 ps) tại nhiệt độ 300 K và áp suất 1 bar.
  • Tính toán năng lượng tự do MM-PBSA: Áp dụng công cụ g_mmpbsa 5 để phân tích các thành phần năng lượng cơ học phân tử và năng lượng solvat hóa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc ảo đa bước đã mang lại những kết quả định lượng ấn tượng:

• Thiết lập mô hình 3D-Pharmacophore tối ưu: Đã xây dựng thành công mô hình pharmacophore 5 điểm (A001) bao gồm 2 vòng thơm (Aro), 2 nhóm kỵ nước (Hyd) và 1 trung tâm mang điện tích dương (Cat). Mô hình đạt độ nhạy $Se > 85%$, độ đặc hiệu $Sp > 95%$ và chỉ số chất lượng phân loại $GH > 0,72$, chứng minh năng lực vượt trội trong việc nhận diện chính xác các phân tử có hoạt tính ức chế mạnh.
• Hiệu suất thu hẹp thư viện hợp chất: Từ tổng số 21.800.167 hợp chất ban đầu, sau khi quét qua mô hình pharmacophore 5 điểm và áp dụng các tiêu chuẩn loại trừ khắt khe của SwissADME (0 vi phạm quy tắc PAINS, 0 cảnh báo Brenk, đáp ứng tiêu chí BOILED-Egg hấp thu qua ruột cao, không ức chế 5 phân họ CYP450), số lượng phân tử tiềm năng được thu hẹp về 2.668 chất. Quy trình đã sàng lọc và loại bỏ hơn 99,98% các hợp chất không đạt yêu cầu sinh dược học.
• Kết quả gắn kết phân tử và năng lượng docking: Toàn bộ 2.668 chất được docking thành công vào khoang gắn kết của dimer PD-L1 (PDB ID: 5NIU). Năng lượng gắn kết phân tử dao động trong khoảng từ -45,3840 kJ/mol đến -13,1230 kJ/mol. Dựa trên phân bố điểm docking, cấu dạng không gian và tương tác liên kết hydro, nghiên cứu đã chọn lọc ra 7 ứng viên xuất sắc nhất gồm: ZINC90632186, DB03916, ZINC89864841, ZINC91312677, ZINC84604166, ZINC78262976 và ZINC39356574.
• Độ ổn định động học và năng lượng tự do MM-PBSA: Phân tích mô phỏng MD 50 ns cho thấy cả 7 phức hợp đều duy trì trạng thái ổn định cao với giá trị RMSD trung bình duy trì dưới ngưỡng 3,0 Å và độ dao động acid amin RMSF phần lớn dưới 2,0 Å. Trong đó, hợp chất ZINC90632186 thể hiện năng lượng tự do gắn kết âm nhất và ổn định nhất, tạo liên kết bền vững với các acid amin chốt như Tyr56 và Asp122 với tần suất xuất hiện liên kết hydro đạt trên 70% toàn thời gian mô phỏng.

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa rõ ràng qua bảng tổng hợp điểm docking và biểu đồ dao động RMSD theo thời gian. Sự phân bố năng lượng docking cho thấy các phân tử nhỏ đạt ái lực cao đều sở hữu khung cấu trúc đối xứng hoặc bán đối xứng, có khả năng lấp đầy hai túi kỵ nước đối diện nhau trên dimer PD-L1. Đặc biệt, tương tác xếp chồng $\pi-\pi$ giữa vòng thơm của phối tử với chuỗi bên của Tyr56, kết hợp với liên kết tĩnh điện hoặc liên kết hydro tạo với Asp122 và Lys124, đóng vai trò then chốt trong việc duy trì cấu dạng dimer nhân tạo không hoạt tính của PD-L1, từ đó ngăn chặn hoàn toàn khả năng tiếp xúc với thụ thể PD-1.

Khi đặt trong tương quan so sánh với các công bố quốc tế như nghiên cứu của Ganesan (2019) hay Lung (2020), công trình của Đoàn Lê Thùy Trâm có tính hoàn thiện vượt bậc. Trong khi các nghiên cứu trước đây chỉ dừng lại ở bước docking tĩnh hoặc khảo sát một nhóm dẫn chất đơn lẻ (như dẫn chất imidazopyridine của Butera năm 2021), luận văn này đã xây dựng chuỗi liên hoàn từ pharmacophore đa điểm, bộ lọc ADME toàn diện đến mô phỏng MDs 50 ns trong môi trường dung môi rõ ràng và định lượng năng lượng tự do bằng g_mmpbsa. Kết quả tìm ra ZINC90632186 không chỉ khẳng định độ tin cậy của thuật toán in silico mà còn cung cấp một khung phân tử mới (novel scaffold) đầy tiềm năng cho ngành hóa dược.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm tính toán, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị và giải pháp hành động cụ thể:

1. Triển khai thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro: Đề nghị các phòng thí nghiệm Hóa Dược và Dược lý thuộc Đại học Y Dược TP.HCM và các viện nghiên cứu chuyên ngành tiến hành đặt mua hoặc tổng hợp hóa học 7 dẫn chất hàng đầu (đặc biệt là ZINC90632186) để đánh giá hoạt tính ức chế PD-1/PD-L1 thông qua thử nghiệm HTRF và ELISA trong khung thời gian 6 đến 12 tháng, với mục tiêu đạt giá trị $IC_{50} < 50\text{ nM}$.
2. Tối ưu hóa cấu trúc hóa dược (Lead Optimization): Nhóm nghiên cứu thiết kế thuốc cần tiến hành biến tính cấu trúc tại các vị trí tiếp xúc với rãnh nông quanh vùng Asp122–Arg125, đưa thêm các nhóm thế cho/nhận liên kết hydro nhằm nâng cao ái lực liên kết tự do thêm 15% đến 20% trong giai đoạn 12 đến 18 tháng tới.
3. Đánh giá độc tính tế bào và tính thấm sinh học: Thực hiện thử nghiệm độc tính tế bào (cytotoxicity assay) trên các dòng tế bào lympho lành và tế bào ung thư phổi/ung thư hạch, kết hợp khảo sát tính thấm qua màng tế bào Caco-2 trong vòng 18 tháng để xác nhận khả năng hấp thu đường uống thực tế.
4. Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình sàng lọc ảo: Đề xuất Khoa Dược xây dựng quy trình in silico 5 bước (Pharmacophore - ADME - Docking - GROMACS MDs - MM-PBSA) thành học phần thực hành tiêu chuẩn cho học viên cao học và nghiên cứu sinh, giúp tiết kiệm 60% đến 70% kinh phí nghiên cứu ban đầu so với phương pháp thử nghiệm ngẫu nhiên truyền thống.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình luận văn thạc sĩ này là nguồn tài liệu tham khảo giá trị cao cho các nhóm đối tượng:

• Nhà nghiên cứu và học viên cao học chuyên ngành Hóa Dược, Dược lý: Cung cấp tài liệu mẫu mực về phương pháp thiết kế thuốc hợp lý (rational drug design), hướng dẫn chi tiết từng bước xây dựng pharmacophore trên MOE và xử lý dữ liệu phức hợp trên phần mềm LeadIT.
• Kỹ sư Tin sinh học (Bioinformatics) và Hóa tin học (Chemoinformatics): Nắm bắt quy trình thiết lập mô phỏng động lực học phân tử trên GROMACS với trường lực CHARMM27, phương pháp phân tích RMSD, RMSF và kỹ thuật tính toán năng lượng tự do MM-PBSA qua công cụ g_mmpbsa.
• Bộ phận R&D tại các công ty dược phẩm và sinh học phân tử: Ứng dụng quy trình sàng lọc ảo để rút ngắn chu kỳ nghiên cứu tiền lâm sàng, giảm thiểu rủi ro thất bại do kém hấp thu hoặc độc tính chuyển hóa ở pha 1 thử nghiệm lâm sàng.
• Bác sĩ và chuyên gia Ung bướu, Miễn dịch học: Cập nhật kiến thức chuyên sâu về cơ chế chốt kiểm soát miễn dịch PD-1/PD-L1 và triển vọng tương lai của các thuốc phân tử nhỏ dùng đường uống trong điều trị ung thư biểu mô và ung thư hạch.

Câu hỏi thường gặp

Thuốc phân tử nhỏ ức chế PD-L1 có ưu điểm gì vượt trội so với kháng thể đơn dòng hiện nay?
Kháng thể đơn dòng thường có giá thành rất cao (hàng chục nghìn USD mỗi liệu trình), phải dùng đường tiêm tĩnh mạch và dễ gây tác dụng phụ miễn dịch kéo dài do thời gian bán thải lớn. Ngược lại, phân tử nhỏ có thể bào chế dưới dạng viên uống tiện lợi, giá thành sản xuất thấp hơn nhiều lần, tính thấm vào khối u đặc tốt hơn và dễ kiểm soát độc tính nhờ thời gian đào thải nhanh.

Mô hình 3D-Pharmacophore xây dựng trong luận văn có những đặc tính cấu trúc nào?
Mô hình pharmacophore tối ưu A001 gồm 5 điểm đặc trưng không gian: 2 vòng thơm (Aro) đóng vai trò tạo liên kết $\pi-\pi$ với Tyr56, 2 tâm kỵ nước (Hyd) tương tác với khe kỵ nước chứa Ile134 và Ile126, cùng 1 trung tâm tích điện dương (Cat) tạo liên kết tĩnh điện và liên kết hydro với các acid amin tích điện âm như Asp122.

Tại sao cần thực hiện mô phỏng động lực học MDs 50 ns sau khi đã có điểm docking tốt?
Molecular docking chỉ phản ánh trạng thái liên kết tĩnh của phân tử trong môi trường chân không với protein bị cố định. Mô phỏng MDs 50 ns trên GROMACS đặt phức hợp vào môi trường nước và ion NaCl 0,15 M chuyển động liên tục theo thời gian, giúp kiểm chứng độ bền thực tế, sự ổn định RMSD (< 3,0 Å) và tần suất duy trì liên kết hydro trong điều kiện sinh lý.

Hợp chất nào được xác định là ứng viên tiềm năng nhất trong toàn bộ nghiên cứu?
Hợp chất mang mã số ZINC90632186 từ cơ sở dữ liệu ZINC được xác định là ứng viên sáng giá nhất. Chất này đạt điểm docking vượt trội, năng lượng tự do MM-PBSA thấp nhất, đồng thời duy trì liên kết hydro và tương tác kỵ nước bền bỉ với hai acid amin cốt lõi Tyr56 và Asp122 trong suốt 50 ns mô phỏng.

Bộ lọc ADME trên SwissADME đã giúp loại bỏ những yếu tố nguy cơ nào của thuốc?
SwissADME đã giúp loại bỏ hoàn toàn các hợp chất mang cấu trúc gây dương tính giả (0 vi phạm PAINS), các nhóm chức kém bền hoặc gây độc tế bào (0 cảnh báo Brenk), các chất không có khả năng hấp thu qua niêm mạc ruột (nằm ngoài vùng lòng trắng mô hình BOILED-Egg), và các chất ức chế 5 phân họ Cytochrome P450 nhằm tránh tương tác bất lợi giữa các thuốc khi dùng chung.

Kết luận

• Luận văn đã xây dựng thành công mô hình 3D-pharmacophore 5 điểm đặc trưng (2 vòng thơm, 2 nhóm kỵ nước, 1 tâm tích điện dương) với độ đặc hiệu $Sp > 95%$ và chỉ số chọn lọc $GH > 0,72$.
• Thiết lập quy trình sàng lọc ảo in silico hiệu năng cao, thu hẹp hiệu quả kho dữ liệu từ 21.800.167 hợp chất xuống còn 2.668 chất đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn khắt khe về dược động học ADME.
• Thực hiện docking phân tử chính xác và sàng lọc ra 7 ứng viên phân tử nhỏ hàng đầu có điểm năng lượng liên kết trải dài từ -45,3840 kJ/mol đến -13,1230 kJ/mol.
• Mô phỏng động lực học phân tử GROMACS 50 ns và tính toán MM-PBSA đã xác định ZINC90632186 là phân tử tiềm năng nhất, có khả năng gắn kết bền vững vào khoang dimer PD-L1 qua tương tác then chốt với Tyr56 và Asp122.
• Công trình mở ra hướng phát triển thuốc trúng đích đường uống đầy hứa hẹn, sẵn sàng cho các bước kiểm chứng hoạt tính sinh học in vitro và in vivo trong vòng 6 đến 12 tháng tới.

Quý độc giả, nhà khoa học và các đơn vị nghiên cứu quan tâm có thể khai thác trực tiếp quy trình tính toán và dữ liệu phân tử trong luận văn để đẩy nhanh tiến độ phát triển các liệu pháp điều trị ung thư thế hệ mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hệ miễn dịch đƣợc xem nhƣ một hàng rào bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây bệnh cho cơ thể, đặc biệt trong bệnh lý ung thƣ. PD-L1 (programmed death ligand) là protein xuyên màng loại 1 có kích thƣớc 40 kDa liên quan đến ức chế miễn dịch. PD-L1 biểu hiện ở mức độ thấp trong một số loại tế bào nhƣ tế bào trình diện kháng nguyên, tế bào B, tế bào T, đại thực bào, tế bào mast, cũng nhƣ một số loại tế bào biểu mô và nội mô [39]. Tuy nhiên, PD-L1 có thể biểu hiện ở mức độ cao trong khối u và các tế bào miễn dịch sau khi tiếp xúc với các cytokin nhƣ interferon gamma.

Trong ung thƣ, sự gắn kết giữa PD-L1 của tế bào ung thƣ với PD-1 của bạch cầu T giúp bảo vệ các tế bào ác tính khỏi sự đào thải của hệ thống miễn dịch. Hiện nay chỉ có các kháng thể đơn dòng đƣợc FDA chấp thuận trong điều trị, cho phép hệ thống miễn dịch nhắm vào các tế bào ác tính. Tuy nhiên, liệu pháp miễn dịch bằng kháng thể đơn dòng vẫn có một số nhƣợc điểm nhƣ thời gian bán hủy rất dài, gây tác dụng phụ liên quan đến miễn dịch (irAEs), tính thấm thấp, quá trình sản xuất phức tạp và chi phí điều trị cao [2], [18], [46], [56]. Do đó, phát triển các chất ức chế phân tử nhỏ thay thế các kháng thể đơn dòng để chặn đƣờng PD-1/PD-L1 là lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc.

Hiện nay, chƣa có nghiên cứu nào trong nƣớc đƣợc công bố về sàng lọc ảo các chất ức chế PD-L1. Ở nƣớc ngoài, số lƣợng nghiên cứu trong lĩnh vực này chƣa nhiều, nổi bật là nghiên cứu của Ganesan [17] năm 2019, của Lung [26] năm 2020 và gần nhất là nghiên cứu sàng lọc trên các dẫn chất imidazopyridin của Butera [43] năm 2021. Tuy nhiên, chƣa có một nghiên cứu sàng lọc có hệ thống từ pharmacophore đến mô phỏng động lực học và tính toán năng lƣợng tự do. Dựa trên cấu trúc của PD-L1 và khoang gắn kết đã đƣợc xác định trong nghiên cứu của Skalniak và cộng sự [47] năm 2017 và Almahmoud và Zhong [64] năm 2019, nghiên cứu xây dựng mô hình in silico các phân tử nhỏ có khả năng ức chế PD-L1 thực hiện với mục tiêu tổng quát là tìm kiếm các cấu trúc phân tử nhỏ mới và có tác dụng ức chế thụ thể này.

Các mục tiêu cụ thể của nghiên cứu bao gồm:. Thu thập cơ sở dữ liệu cấu trúc và hoạt tính của các chất ức chế PD-L1 từ 5 bằng sáng chế 2. Xây dựng các mô hình 3D-pharmacophore dựa trên các chất có hoạt tính ức chế mạnh để làm công cụ sàng lọc ảo. Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking để khảo sát sự gắn kết của các chất ức chế PD-L1.

Ứng dụng mô hình 3D-pharmacophore, SwissADME và docking để sàng lọc ảo qua thƣ viện hóa học lớn (DrugBank, ZINC và MBHC) để tìm kiếm các chất mới có tiềm năng ức chế PD-L1. Mô phỏng động lực học phân tử và tính năng lƣợng liên kết cho các chất có hoạt tính tiềm năng nhất trong kết quả sàng lọc, để đánh giá sâu hơn khả năng gắn kết của chất đó lên PD-L1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ CHỐT KIỂM SOÁT MIỄN DỊCH Các chốt kiểm soát miễn dịch – Immune Checkpoint (ICP) là các liên kết đặc biệt giữa thụ thể trên bề mặt của tế bào miễn dịch với nhau, giữa tế bào trình diện kháng nguyên và tế bào T, hoặc giữa tế bào T và tế bào ung thƣ.

Các kết nối này điều hòa đáp ứng miễn dịch, đảm bảo rằng hệ miễn dịch có thể đáp ứng đủ mạnh trƣớc những tác nhân ngoại lai nhƣng cũng tránh hoạt động quá mức có thể gây hại cho các tế bào khỏe mạnh hoặc các mô khỏe mạnh. Tuy nhiên, cũng chính các chốt này đã trở thành ―tử huyệt‖ của hệ miễn dịch khi các nhà khoa học phát hiện thấy nhiều loại virus gây bệnh nhƣ HIV, viêm gan B, viêm gan C và đặc biệt là ung thƣ đã ―lợi dụng‖ điểm này để ―dập tắt‖ hoạt động của tế bào T. Qua đó, chúng có thể khoát khỏi sự phát hiện và tiêu diệt của hệ miễn dịch [38].1 tóm tắt các đặc điểm và con đƣờng tín hiệu của các phân tử chốt kiểm soát miễn dịch chính. Hiện nay, các thuốc trị ung thƣ sử dụng cơ chế này chủ yếu tác động lên 2 loại thụ thể: CTLA-4 và PD-1/PD-L1.

Một số kháng thể đơn dòng theo cơ chế này đã đƣợc nghiên cứu và FDA chấp thuận sử dụng điều trị một số loại ung thƣ (da, máu, ung thƣ phổi không tế bào nhỏ  NSCLC, bàng quang, tuyến tiền liệt,…) nhƣ ipilimumab, tremelimumab (anti-CTLA4); pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab (anti-PD1); atezolizumab, durvalumab (anti-PDL1). Các phân tử chốt kiểm soát miễn dịch chính Protein chốt Tên khác Tế bào biểu hiện Phối tử kiểm miễn dịch Chốt kiểm ức chế miễn dịch CTLA-4 CD152 Chủ yếu là tế bào T CD80 (B7-1) hoặc + + CD4 và CD8 chƣa CD86 (B7-2) trƣởng thành, tế bào Treg PD-1 CD279 Các tế bào T đƣợc kích PD-L1 (CD274, B7- hoạt trong mô ngoại vi, tế H1) và PD-L2 (CD273, bào B, APC biệt hóa, tế B7-DC) bào NK LAG-3 CD223 Tế bào T, tế bào NK hoạt MHC loại II động TIM-3 HAVcr2 Các tế bào T hoạt động Chủ yếu Galectin-9, và mô nhƣ gan, ruột non, cũng nhƣ Phosphatidyl tuyến ức, lách, phổi, cơ, serin và HMGB1 mô não KIRs CD158 Chủ yếu tế bào NK, Phân tử MHC nhóm I APCs và u biểu hiện (HLAs) CTLs Chốt kiểm kích thích miễn dịch 4-1BB CD137 CD4+ và CD8+ hoạt 4-1BB-L động, Treg, tế bào NK hoạt động, DCs, bạch cầu trung tính GITR CD357 Tregs, CD4+ và CD8+ GITRL hoạt động. TỔNG QUAN VỀ PD-L1 VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ PD-L1 1. Hoạt tính dƣợc lý của PD-L1 PD-L1 (còn đƣợc gọi là B7-H1 hoặc CD274) và PD-L2 (còn đƣợc gọi là B7- DC hoặc CD273) là hai phối tử của PD-1 [15], [30].Chen và cộng sự đã xác định và nhân bản gen B7-H1 của ngƣời vào năm 1999 và nhận ra phân tử có tác dụng ức chế trên các tế bào T bằng cách tạo ra IL-10 [10].

Với việc phát hiện ra sự tƣơng tác của phân tử PD-1 và B7-H1, nó đƣợc đổi tên thành PD-L1 (Programmed cell death - ligand 1) [15]. Protein đƣợc biểu hiện trên nhiều loại tế bào, bao gồm tế bào trình diện kháng nguyên (APCs), tế bào T, tế bào B, tế bào đơn nhân và tế bào biểu mô. PD-L1 thể hiện hai chức năng chính trong bệnh lý ung thƣ. Đầu tiên, PD-L1 là một phân tử ức chế miễn dịch mạnh, làm bất hoạt các tế bào T đặc hiệu của khối u bằng cách liên kết với thụ thể ức chế PD-1.

Thứ hai, chức năng PD-L1 phụ thuộc vào việc cung cấp các tín hiệu nội bào giúp tăng cƣờng sự sống của tế bào ung thƣ, điều chỉnh các phản ứng căng thẳng và tạo ra sự đề kháng đối với các kích thích gây độc, nhƣ interferon. PD-L1 thƣờng đƣợc biểu hiện quá mức trong nhiều khối u, đƣợc hỗ trợ nhờ sự điều hòa sao chép bởi IFNs [55]. Do đó, biểu hiện PD-L1 của khối u cao đã đƣợc chứng minh là dấu hiệu tiên lƣợng xấu đối với nhiều ngƣời nhƣng không phải tất cả các loại ung thƣ. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự biểu hiện PD-L1 trong các tế bào khối u là đủ để đánh giá sự tiến triển của ung thƣ [28], tuy nhiên nghiên cứu khác cho rằng cần ghi nhận thêm biểu hiện của PD-L1 trong các loại tế bào thâm nhiễm miễn dịch bên trong khối u nhƣ đại thực bào, bạch cầu trung tính, tế bào nội mô và nguyên bào sợi mới có thể đƣa ra kết luận [31].

Việc đo lƣờng nồng độ PD-L1 ở các tế bào ung thƣ giúp đánh giá đƣợc cơ chế gây bệnh, từ đó quyết định bệnh nhân có thể sử dụng liệu pháp miễn dịch để điều trị ung thƣ hay không. Ngày nay, xét nghiệm PD-L1 đƣợc áp dụng rộng rãi, để đánh giá chính xác hơn cơ chế gây ung thƣ, hƣớng đến điều trị nhắm mục tiêu. Một số loại ung thƣ có biểu hiện PD-L1 cao nhƣ ung thƣ phổi không tế bào nhỏ (NSCLC), ung thƣ hạch, ung thƣ bàng quang, ung thƣ thận, ung thƣ vú. Cấu trúc PD-L1 Cấu trúc PD-L1 là một thụ thể protein có 290 acid amin, đƣợc mã hóa bởi gen CD274, bao gồm 7 exon và nằm trên nhiễm sắc thể 9 ở ngƣời [15], [25], [30].

Protein này bao gồm 1 trình tự tín hiệu, 2 miền ngoại bào là miền tƣơng tự IgV và IgC; một miền xuyên màng; và miền tế bào chất (nội bào). Miền nội bào của PD-L1 gồm 30 acid amin và không có chức năng (Hình 1. Cấu trúc của PD-L1 (PDB ID: 5 NIU) “Nguồn: Skalniak, 2017” [47] Nghiên cứu của Zak và cộng sự vào năm 2015 chỉ ra rằng trong bề mặt tƣơng tác PD-1 và PD-L1, đã xác định đƣợc ba điểm chính, hai trong số đó đƣợc dự kiến có thể phát triển công thức hóa dƣợc (Hình 1. - Đầu tiên là khe hở sâu nhất kỵ nƣớc chứa Ile134.

Khe này bao gồm các chuỗi bên của Tyr56, Glu58, Arg113, Met115 và Tyr123, và có kích thƣớc cũng nhƣ tính chất hoàn hảo để chứa một vòng thơm sáu cạnh [55]. - Điểm thứ hai nằm ngay gần đó và chứa Ile126. Khe này bao gồm Met115, Ala121 và Tyr123, có thể liên kết hydro ở oxy carbonyl của Ala121 [55]. - Điểm thứ ba là một rãnh mở rộng chứa Tyr68, Gln75 và Thr76, đƣợc hình thành bởi chuỗi chính và chuỗi bên kéo dài từ Asp122 đến Arg125, và đƣợc bao quanh bởi chuỗi bên của Asp26.

Nhiều liên kết hydro có sẵn trong rãnh, tuy nhiên, tƣơng đối nông và có thể khó nhắm đích hiệu quả với các cấu trúc phân tử nhỏ. Mô hình tƣơng tác giữa PD-1 và PD-L1 “Nguồn: Zak, 2015” [55] Trên cơ sở đó, năm 2019, Almahmoud và Zhong đã công bố Tyr56, Asp122 và Lys124 đóng vai trò quan trọng trong thiết kế các chất ức chế PD-L1 trong đó Tyr56 và Asp122 là đặc biệt quan trọng. Vai trò của Tyr56 khi tạo liên kết  -  với hai vòng thơm của phối tử cũng đƣợc kì vọng trong cấu trúc của các phân tử nhỏ ức chế PD-L1 mới [64]. Đây cũng là cơ sở để lựa chọn đối tƣợng nghiên cứu phù hợp cho luận văn.

Các chất ức chế PD-L1 1. Tổng quát về các thuốc ức chế PD-L1 Sự gắn PD-L1 vào thụ thể ngăn cản sự di chuyển, phát triển và thải trừ chất trung gian gây độc của tế bào T, đồng thời hạn chế sự giết tế bào khối u [40]. Hiện nay, đã có các chất ức chế PD-1/PD-L1 đƣợc đƣa vào điều trị và chúng đều là kháng thể đơn dòng (protein tái tổ hợp).