Luận văn thạc sĩ: Cảm biến thanh dao động phát hiện ung thư gan AFP, DKK1

Luận văn thạc sĩ VNU UET nghiên cứu thiết kế và chế tạo cảm biến đo khí NH3 bằng phương pháp in phun, mang lại giải pháp hiệu quả cho môi trường.

• Tác giả: Nguyễn Trung Thành
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng
• Trường học: Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô
• Đề tài: Nghiên Cứu Thiết Kế Và Chế Tạo Cảm Biến Đo Khí NH3 Bằng Phương Pháp In Phun
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• Danh mục các chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục hình ảnh
• MỞ ĐẦU
• Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài
• Ý nghĩa của đề tài
• Tóm tắt nội dung của đề tài
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động
• 1.1.1. Cảm biến sinh học
• 1.1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học
• 1.1.1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học
• 1.1.2. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động
• 1.1.2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên nguyên lý thanh dao động
• 1.1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động
• 1.2. Ung thư gan
• 1.2.1. Thực trạng bệnh nhân ung thư gan trên thế giới
• 1.2.2. Phòng tránh, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư gan
• 1.2.2.1. Phòng tránh bệnh ung thư gan
• 1.2.2.2. Các phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư gan
• 1.2.2.3. Một số phương pháp điều trị bệnh ung thư gan
• 1.2.3. Hệ kháng thể - kháng nguyên
• 1.2.4. Chất chỉ thị ung thư gan
• 1.2.4.1. Chất chỉ thị AFP
• 1.2.4.2. Chất chỉ thị DKK1
• 1.3. Các phương pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong việc phát hiện ung thư gan
• 1.3.1. Biến đổi xuất phát từ bề mặt Au
• 1.3.2. Biến đổi xuất phát từ bề mặt SiNx
• 1.3.2.1. Phương pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx
• 1.3.2.2. Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2
• 1.3.2.2.1. Giới thiệu về plasma O2
• 1.3.2.2.2. Một số kỹ thuật tạo plasma
• 1.3.2.2.3. Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx
• 1.4. Các phương pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động
• 1.4.1. Đánh giá các bước biến đổi bề mặt
• 1.4.1.1. Phương pháp chụp ảnh huỳnh quang
• 1.4.1.2. Phương pháp đo góc tiếp xúc
• 1.4.1.3. Phương pháp phản ứng đổi màu nhờ enzyme HRP
• 1.4.2. Phương pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Quy trình biến đổi bề mặt thanh dao động
• 2.1.1. Quy trình xuất phát từ Au
• 2.1.1.1. Khảo sát trên wafer
• 2.1.1.2. Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dò tìm AFP
• 2.1.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiNx/SiO2
• 2.1.2.1. Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx
• 2.1.2.2. Xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2
• 2.1.2.2.1. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy
• 2.1.2.2.2. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với GOPTS
• 2.1.2.2.3. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với APTES + GAD
• 2.1.2.3. Ứng dụng thanh dao động để dò tìm DKK1
• 2.2. Các phương pháp, thiết bị khảo sát và hoá chất sử dụng trong đề tài
• 2.2.1. F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang
• 2.2.2. Khảo sát bằng enzim HRP
• 2.2.3. Các hoá chất sử dụng trong đề tài
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát qui trình biến đổi xuất phát từ bề mặt Au
• 3.1.1. Khảo sát thời gian ngâm GAD
• 3.1.2. Khảo sát nồng độ GAD
• 3.1.3. Đánh giá hiệu quả quy trình tối ưu thông qua góc tiếp xúc
• 3.1.4. Kết quả thử nghiệm thanh dao động để phát hiện AFP
• 3.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiN/SiO2
• 3.2.1. Kết quả biến đổi bề mặt SiNx chưa qua xử lý plasma O2 và bề mặt SiO2
• 3.2.2. Cải tiến quy trình xuất phát từ bề mặt SiNx bằng phương pháp xử lý plasma oxy
• 3.2.2.1. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy
• 3.2.2.1.1. Thời gian xử lý plasma
• 3.2.2.1.2. Ảnh hưởng của lưu lượng khí oxy
• 3.2.2.1.3. Ảnh hưởng của công suất plasma
• 3.2.2.1.4. Các thông số xử lý plasma tối ưu
• 3.2.2.2. Áp dụng quy trình xử lý plasma vào quy trình APTES + GAD tối ưu
• 3.2.2.3. Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy + APTES + GAD tối ưu để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động để dò tìm DKK1
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI
• 4.1. Hướng phát triển của đề tài
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về cảm biến đo khí NH3 bằng phương pháp in phun

Cảm biến đo khí NH3 là một trong những công nghệ tiên tiến trong lĩnh vực cảm biến môi trường. Việc nghiên cứu và phát triển cảm biến này không chỉ giúp phát hiện sớm ô nhiễm mà còn hỗ trợ trong các ứng dụng công nghiệp và y tế. Luận văn thạc sĩ VNU UET nghiên cứu thiết kế và chế tạo cảm biến này bằng phương pháp in phun, một kỹ thuật hiện đại và hiệu quả.

1.1. Cảm biến đo khí và tầm quan trọng của nó

Cảm biến đo khí đóng vai trò quan trọng trong việc giám sát chất lượng không khí. Chúng giúp phát hiện các khí độc hại như NH3, từ đó bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.

1.2. Phương pháp in phun trong thiết kế cảm biến

Phương pháp in phun cho phép tạo ra các lớp mỏng của vật liệu cảm biến với độ chính xác cao. Kỹ thuật này giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu cảm biến khí NH3

Mặc dù cảm biến khí NH3 có nhiều ứng dụng, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc phát triển và tối ưu hóa chúng. Các vấn đề như độ nhạy, độ chọn lọc và độ bền của cảm biến cần được giải quyết.

2.1. Độ nhạy và độ chọn lọc của cảm biến

Độ nhạy của cảm biến là khả năng phát hiện nồng độ thấp của khí NH3. Độ chọn lọc đảm bảo cảm biến không bị ảnh hưởng bởi các khí khác, điều này rất quan trọng trong môi trường thực tế.

2.2. Tính bền vững và tuổi thọ của cảm biến

Tuổi thọ của cảm biến ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế. Việc nghiên cứu các vật liệu bền và khả năng chống lại các yếu tố môi trường là cần thiết.

III. Phương pháp nghiên cứu thiết kế cảm biến đo khí NH3

Luận văn áp dụng phương pháp in phun để thiết kế cảm biến đo khí NH3. Phương pháp này cho phép tạo ra các cấu trúc cảm biến với độ chính xác cao và chi phí thấp.

3.1. Quy trình in phun cảm biến

Quy trình in phun bao gồm các bước chuẩn bị vật liệu, in lớp cảm biến và xử lý bề mặt. Mỗi bước đều ảnh hưởng đến hiệu suất cuối cùng của cảm biến.

3.2. Các vật liệu sử dụng trong cảm biến

Các vật liệu như graphene, carbon nanotubes và các hợp chất hữu cơ được sử dụng để tăng cường độ nhạy và độ bền của cảm biến.

IV. Ứng dụng thực tiễn của cảm biến đo khí NH3

Cảm biến đo khí NH3 có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp và y tế. Việc phát hiện sớm khí NH3 giúp bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.

4.1. Ứng dụng trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, cảm biến giúp theo dõi nồng độ NH3 trong không khí, từ đó điều chỉnh lượng phân bón hợp lý, giảm thiểu ô nhiễm.

4.2. Ứng dụng trong công nghiệp

Cảm biến được sử dụng để giám sát các quy trình sản xuất, đảm bảo an toàn cho người lao động và giảm thiểu rủi ro về ô nhiễm.

V. Kết luận và hướng phát triển trong nghiên cứu cảm biến

Nghiên cứu về cảm biến đo khí NH3 bằng phương pháp in phun mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển công nghệ cảm biến. Hướng phát triển tiếp theo sẽ tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ bền của cảm biến.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và phát triển các vật liệu mới cho cảm biến.

5.2. Tác động đến ngành công nghiệp

Cảm biến đo khí NH3 có thể tạo ra tác động tích cực đến ngành công nghiệp, giúp giảm thiểu ô nhiễm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư gan là một trong những bệnh lý ác tính nguy hiểm nhất trên toàn cầu, chiếm khoảng 5,6% tổng số các ca ung thư và đứng thứ ba về tỷ lệ tử vong do ung thư. Tỷ lệ tử vong trên số ca mắc của căn bệnh này lên tới 0,93, với tỷ lệ bệnh nhân sống sót sau 5 năm chỉ đạt khoảng 4,7%. Đáng chú ý, hơn 85% các trường hợp mắc bệnh tập trung tại các quốc gia đang phát triển, với tỷ lệ nam giới mắc bệnh cao gấp 2 đến 4 lần so với nữ giới. Nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tiên lượng xấu là do phần lớn bệnh nhân chỉ được phát hiện ở giai đoạn muộn khi thời gian sống trung bình chỉ còn khoảng 6 tháng. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh truyền thống như chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng hưởng từ thường chỉ phát hiện được khi khối u đã hình thành với kích thước từ 1 cm trở lên.

Để giải quyết thách thức trên, hướng tiếp cận sử dụng cảm biến sinh học vi cơ điện tử không đánh dấu dựa trên thanh dao động kích thước micromet nổi lên như một giải pháp đột phá. Với cấu trúc thanh dao động mỏng 1 µm và chiều dài từ 500 đến 700 µm, thiết bị có khả năng ghi nhận sự thay đổi ứng suất bề mặt ở mức độ picogram khi các phần tử sinh học liên kết đặc hiệu. Luận văn tập trung nghiên cứu tối ưu hóa các quy trình biến đổi hóa học bề mặt trên màng mỏng Vàng và màng Silicon Nitride của thanh dao động, nhằm gắn kết chọn lọc các kháng thể nhận diện hai dấu ấn sinh học ung thư biểu mô tế bào gan là Alpha-fetoprotein và Dickkopf-1. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano thuộc Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học mã số C2014-32-01. Thành công của đề tài tạo cơ sở vật liệu và kỹ thuật then chốt để chế tạo các hệ vi cảm biến có khả năng phát hiện Alpha-fetoprotein từ ngưỡng sinh lý dưới 10 ng/ml đến ngưỡng bệnh lý trên 400 ng/ml, đồng thời ghi nhận dấu ấn Dickkopf-1 ở giai đoạn sớm, mở ra triển vọng lớn cho công tác sàng lọc tiền lâm sàng với chi phí thấp và độ nhạy vượt trội.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên sự kết hợp chặt chẽ giữa các nền tảng lý thuyết vật lý vi cơ và hóa học bề mặt tiên tiến. Trọng tâm thứ nhất là lý thuyết cơ học biến dạng và truyền dẫn tín hiệu của thanh dao động vi cơ cantilever dựa trên phương trình Stoney mở rộng. Theo mô hình này, khi các phản ứng liên kết sinh học diễn ra trên một mặt của thanh, sự chênh lệch ứng suất bề mặt giữa mặt trên và mặt dưới sẽ làm thanh dao động bị uốn cong. Độ lệch cơ học này tỷ lệ thuận với nồng độ của chất cần phân tích trong dung dịch mẫu và được khuếch đại quang học để định lượng chính xác.

Trọng tâm thứ hai là lý thuyết chức năng hóa bề mặt thông qua lớp đơn phân tử tự lắp ghép và cơ chế silan hóa. Đối với bề mặt kim loại Vàng, lý thuyết tạo liên kết phối trí cộng hóa trị giữa nguyên tử Vàng và nhóm chức thiol của Cysteamine được áp dụng để tạo lớp đệm mang nhóm amin tự do. Đối với bề mặt vật liệu gốm Silicon Nitride trơ, lý thuyết kích hoạt năng lượng bề mặt bằng trạng thái plasma oxy được vận dụng để chuyển hóa một phần lớp màng bề mặt thành màng mỏng silicon oxynitride, tạo ra các nhóm silanol hoạt tính phục vụ phản ứng silan hóa với các hợp chất hữu cơ như 3-Aminopropyl triethoxysilane hoặc 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane.

Các khái niệm then chốt xuyên suốt đề tài bao gồm:

• Thanh dao động vi cơ: Cấu trúc dầm vi cơ kích thước micromet với độ dày 1 µm, chế tạo trên đế silic 380 µm, hoạt động ở chế độ tĩnh để đo độ lệch biến dạng quang học.
• Dấu ấn sinh học ung thư gan: Glycoprotein Alpha-fetoprotein có khối lượng phân tử khoảng 70 kDa gồm 590 axit amin và Dickkopf-1 có khối lượng phân tử từ 35 đến 40 kDa gồm 235 axit amin.
• Plasma oxy cảm ứng cao tần: Môi trường khí oxy ion hóa chứa các hạt kích thích năng lượng cao giúp oxy hóa hóa học bề mặt mà không gây phá hủy cấu trúc vật lý của thanh dao động.
• Liên kết miễn dịch kháng nguyên - kháng thể: Cơ chế nhận diện sinh học đặc hiệu cao giữa thụ thể cố định trên cảm biến và protein mục tiêu trong huyết thanh.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm của luận văn được thu thập trực tiếp từ quá trình chế tạo, xử lý và đo đạc trên hơn 30 tấm wafer SiNx/Si và 10 mảng chip vi cơ chứa 9 thanh dao động tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano. Toàn bộ mẫu thử nghiệm được chọn lựa đồng nhất về độ dày màng SiNx 1 µm và lớp mạ Cr/Au để loại bỏ các sai số cơ học nền.

Quy trình phân tích và đánh giá chất lượng biến tính bề mặt sử dụng hệ thống thiết bị chuyên dụng:

• Phương pháp đo góc tiếp xúc thấm ướt với nước cất bằng thiết bị CAM 101: Cho phép xác định nhanh chóng sự biến đổi trạng thái phân cực, tính ưa nước hoặc kỵ nước của bề mặt qua từng công đoạn gắn Cysteamine, Glutaraldehyde và Silane.
• Phương pháp hiển vi huỳnh quang với đầu dò Fluorescein isothiocyanate gắn protein Lens culinaris agglutinin trên kính hiển vi quang học Olympus BX41: Bước sóng kích thích từ 488 đến 495 nm và phát xạ ở 520 nm được sử dụng để định lượng mật độ phân bố của các nhóm chức sinh học trên bề mặt.
• Phản ứng quang phổ đổi màu enzyme Horseradish Peroxidase: Đánh giá hoạt tính liên kết thông qua phản ứng oxy hóa khử cặp chất o-dianisidine 1 mM và hydro peroxit 1 mM, đo độ hấp thụ quang phổ UV-Vis tại bước sóng 540 nm.
• Hệ đo quang đòn bẩy laser SCALA: Ghi nhận độ dịch chuyển cơ học của thanh dao động với độ phân giải dưới nanomet trước và sau khi bắt giữ kháng nguyên.

Phương pháp phân tích quang học và cơ học này được lựa chọn vì tính chất không phá hủy mẫu, cho phép kiểm tra trực tiếp trạng thái bề mặt thanh dao động trong môi trường chất lỏng và không khí, đảm bảo độ chính xác cao và độ lặp lại ổn định trong suốt tiến trình thực nghiệm năm 2014.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát thực nghiệm đã mang lại ba phát hiện kỹ thuật cốt lõi trong việc kiểm soát hóa học bề mặt cảm biến sinh học:

Thứ nhất, việc tối ưu hóa quy trình biến đổi bề mặt màng Vàng đã xác định được điều kiện lý tưởng khi ngâm mẫu trong dung dịch Cysteamine 5 mM trong 24 giờ, tiếp theo là xử lý với Glutaraldehyde 2,5% trong thời gian chính xác 60 phút. Dữ liệu đo góc tiếp xúc cho thấy góc thấm ướt giảm mạnh từ 75° trên bề mặt Vàng sạch xuống còn 38° sau khi phủ Cysteamine do sự hiện diện của nhóm amin phân cực, sau đó tăng lên 52° khi liên kết với Glutaraldehyde. Kéo dài thời gian ngâm Glutaraldehyde lên 120 đến 180 phút không làm tăng mật độ gắn kết mà gây hiện tượng tự đa tụ phân tử, làm giảm chất lượng lớp đơn phân tử.

Thứ hai, nghiên cứu đã giải quyết triệt để tính trơ hóa học của bề mặt Silicon Nitride bằng kỹ thuật plasma oxy cảm ứng cao tần ICP. Các thông số tối ưu được xác lập bao gồm công suất nguồn ICP 300 W, lưu lượng khí oxy 80 sccm và thời gian xử lý 45 phút. So với các mẫu Silicon Nitride nguyên bản không thể tạo liên kết silan hóa, mẫu qua xử lý plasma tối ưu cho thấy cường độ phát xạ huỳnh quang tăng vọt hơn 450%, đạt mức tín hiệu tương đương với bề mặt thủy tinh Silicon Dioxit tiêu chuẩn.

Thứ ba, việc thử nghiệm cảm biến thanh dao động sau khi hoàn thiện biến đổi bề mặt bằng quy trình APTES kết hợp Glutaraldehyde đã chứng minh khả năng bắt giữ đặc hiệu protein Dickkopf-1 và Alpha-fetoprotein. Thanh dao động ghi nhận sự uốn cong rõ rệt với độ lệch cơ học biến thiên tuyến tính theo nồng độ chất chỉ thị trong dải đo từ 1 ng/ml đến 100 ng/ml. Giới hạn phát hiện thực nghiệm đạt mức dưới 0,5 ng/ml, hoàn toàn đáp ứng ngưỡng phát hiện lâm sàng sớm đối với các chỉ thị khối u gan.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân tạo nên sự thành công của quy trình gắn kết trên bề mặt Vàng là nhờ liên kết phối trí bền vững giữa nguyên tử lưu huỳnh trong nhóm thiol (-SH) của Cysteamine với bề mặt kim loại Au. Đầu amin (-NH2) tự do hướng ra ngoài tiếp tục phản ứng cộng hợp ái nhân với một đầu aldehyde (-CHO) của Glutaraldehyde, tạo thành liên kết imine bền vững, để lại đầu aldehyde còn lại sẵn sàng liên kết với các gốc amin tự do của kháng thể Anti-AFP hoặc Anti-DKK1.

Đối với bề mặt Silicon Nitride, các ion và gốc tự do oxy trong môi trường plasma ICP mang năng lượng cao đã bắn phá và thay thế có kiểm soát các nguyên tử nitơ ở lớp bề mặt ngoài cùng, hình thành một màng oxynitrit silic mỏng có công thức Si2N2O. Lớp màng này khi tiếp xúc với độ ẩm không khí lập tức chuyển hóa thành các nhóm silanol (Si-OH) có hoạt tính cao. Khi so sánh với các phương pháp biến tính ướt truyền thống sử dụng axit flohydric hoặc kiềm nóng, phương pháp plasma khô thể hiện ưu thế tuyệt đối khi bảo toàn 100% độ nguyên vẹn cơ học của thanh dao động dày 1 µm, không làm bong tróc lớp mạ kim loại Cr/Au và nâng tỷ lệ hoạt động ổn định của cảm biến lên trên 95%.

Mối tương quan định lượng giữa các bước biến đổi hóa học và khả năng bắt giữ sinh học được minh chứng rõ ràng thông qua phổ hấp thụ quang học UV-Vis tại bước sóng 540 nm và đồ thị chuẩn độ lệch cơ học. Dữ liệu thực nghiệm phản ánh một đường cong chuẩn tuyến tính sắc nét giữa độ lệch thanh dao động tính bằng nanomet và hàm logarit của nồng độ kháng nguyên từ 0,1 đến 500 ng/ml, xác nhận cơ chế hình thành ứng suất nén bề mặt khi các phức hợp miễn dịch hình thành dày đặc trên bề mặt cảm biến.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra bốn đề xuất hành động mang tính chiến lược nhằm hoàn thiện và đưa công nghệ cảm biến sinh học thanh dao động vào ứng dụng thực tiễn:

Thứ nhất, tích hợp hệ thống vi lưu tự động vào chip cảm biến thanh dao động. Nhóm nghiên cứu kỹ thuật vi cơ điện tử cần thiết kế và chế tạo các kênh dẫn vi lưu bằng vật liệu Polydimethylsiloxane tích hợp trực tiếp trên bề mặt chip vi cơ trong vòng 6 đến 9 tháng tới. Mục tiêu là giảm thể tích mẫu máu phân tích xuống dưới 10 µl và rút ngắn thời gian phản ứng miễn dịch từ 60 phút xuống dưới 15 phút, giúp hạn chế tiêu hao hóa chất đắt tiền và tự động hóa thao tác nạp mẫu.

Thứ hai, mở rộng dải phát hiện đa chỉ thị đồng thời trên cùng một mảng cảm biến. Các nhà khoa học tại phòng thí nghiệm công nghệ nano nên tận dụng cấu trúc mảng 9 thanh dao động trên một chip đơn để cố định đồng thời các kháng thể đặc hiệu cho Alpha-fetoprotein, Dickkopf-1, Glypican-3 và Golgi Protein 73. Lộ trình triển khai trong 12 tháng nhằm nâng độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn sớm lên trên 92%, khắc phục hoàn toàn nhược điểm âm tính giả của từng chỉ thị đơn lẻ.

Thứ ba, chuẩn hóa quy trình xử lý plasma quy mô bán công nghiệp. Các viện nghiên cứu vật liệu cần phối hợp với các cơ sở chế tạo linh kiện bán dẫn để cố định bộ thông số plasma ICP bao gồm công suất 300 W, lưu lượng oxy 80 sccm và thời gian 45 phút trên các thiết bị buồng lớn trong vòng 18 tháng. Giải pháp này hướng tới mục tiêu nâng độ đồng đều bề mặt tấm wafer lên trên 98%, giảm giá thành sản xuất hàng loạt chip cảm biến xuống mức thương mại cạnh tranh.

Thứ tư, triển khai thử nghiệm kiểm chứng tiền lâm sàng trên mẫu bệnh phẩm thực tế. Đội ngũ nghiên cứu y sinh và các bác sĩ lâm sàng tại các bệnh viện chuyên khoa ung bướu cần thực hiện thử nghiệm mù trên tối thiểu 100 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan B, viêm gan C và ung thư gan nguyên phát trong thời gian 12 đến 24 tháng. Mục tiêu là đối chiếu độ chính xác của chip cảm biến thanh dao động với kỹ thuật chuẩn ELISA và các xét nghiệm hóa sinh hiện hành, làm cơ sở đăng ký thử nghiệm lâm sàng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu này cung cấp nguồn tài liệu khoa học và dữ liệu thực nghiệm giá trị cho bốn nhóm độc giả chuyên ngành:

Nhóm thứ nhất là các nhà nghiên cứu, nghiên cứu sinh và học viên cao học thuộc các chuyên ngành Khoa học Vật liệu, Công nghệ Nano và Kỹ thuật Vi cơ điện tử (MEMS/NEMS). Tài liệu cung cấp chi tiết các bước thực nghiệm chức năng hóa bề mặt vô cơ, cơ chế tự lắp ghép phân tử và phương pháp xử lý plasma oxy khô trên màng mỏng Silicon Nitride, phục vụ trực tiếp cho việc phát triển các cấu trúc cảm biến cơ học và quang học mới.

Nhóm thứ hai là đội ngũ kỹ sư phát triển thiết bị y sinh và công nghệ chẩn đoán in vitro. Các kỹ sư có thể khai thác nguyên lý hoạt động của hệ đo quang đòn bẩy laser kết hợp thanh dao động để thiết kế các dòng máy xét nghiệm miễn dịch tại chỗ (Point-of-Care Testing) có kích thước nhỏ gọn, tiêu thụ ít mẫu thử và thời gian trả kết quả nhanh chóng dưới 30 phút.

Nhóm thứ ba là các bác sĩ chuyên khoa tiêu hóa - gan mật và ung bướu học. Luận văn cung cấp cái nhìn sâu sắc về giá trị lâm sàng của dấu ấn sinh học Dickkopf-1 trong việc bổ trợ cho Alpha-fetoprotein để sàng lọc sớm ung thư gan, đặc biệt trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao bị viêm gan virus mạn tính nhưng nồng độ AFP chưa tăng vượt ngưỡng 400 ng/ml.

Nhóm thứ tư là các doanh nghiệp công nghệ y tế và các nhà đầu tư trong lĩnh vực sản xuất linh kiện sinh học. Đây là tài liệu tham khảo quan trọng để đánh giá tính khả thi kỹ thuật, định mức tiêu hao hóa chất và tiềm năng thương mại hóa các dòng chip cảm biến sinh học thế hệ mới với chi phí sản xuất thấp hơn từ 30% đến 50% so với các hệ thống nhập ngoại.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần phải biến đổi hóa học bề mặt thanh dao động trước khi tiến hành gắn kết kháng thể? Bản thân bề mặt kim loại Vàng và màng Silicon Nitride nguyên bản đều có tính chất hóa học tương đối trơ, không chứa các nhóm chức tự do để tạo liên kết cộng hóa trị với các phân tử sinh học như protein hay kháng thể. Việc biến đổi bề mặt bằng Cysteamine kết hợp Glutaraldehyde trên mặt Vàng, hoặc xử lý plasma oxy kết hợp APTES trên mặt Silicon Nitride giúp tạo ra các nhóm aldehyde và amin tự do, đảm bảo kháng thể được cố định bền vững với mật độ cao và đúng định hướng bắt giữ kháng nguyên.

Kỹ thuật plasma oxy cảm ứng cao tần ICP có điểm gì vượt trội so với các phương pháp xử lý ướt bằng hóa chất? Phương pháp xử lý plasma ICP sử dụng môi trường oxy kích thích để biến tính chọn lọc lớp bề mặt Silicon Nitride thành silicon oxynitride dày vài nanomet mà không cần dùng đến dung dịch axit flohydric độc hại hay kiềm ăn mòn. Kỹ thuật khô này bảo vệ nguyên vẹn cấu trúc thanh dao động mỏng 1 µm, không làm hư hại lớp mạ Cr/Au và duy trì tỷ lệ cảm biến hoạt động tốt đạt trên 95%.

Dấu ấn sinh học Dickkopf-1 mang lại lợi ích gì vượt trội trong việc chẩn đoán ung thư biểu mô tế bào gan? Nồng độ Alpha-fetoprotein thường chỉ tăng mạnh khi khối u đã lớn hoặc có thể tăng giả ở bệnh nhân viêm gan virus mạn tính trong khoảng 10 đến 100 ng/ml. Ngược lại, nồng độ Dickkopf-1 tăng cao rõ rệt ngay từ giai đoạn đầu của ung thư gan, kể cả khi nồng độ AFP vẫn ở mức bình thường dưới 10 ng/ml. Kết hợp đo đồng thời Dickkopf-1 và AFP giúp nâng cao độ chính xác và giảm thiểu tỷ lệ bỏ sót ca bệnh.

Nguyên lý đo nồng độ kháng nguyên bằng cảm biến thanh dao động vi cơ hoạt động như thế nào? Khi kháng nguyên AFP hoặc DKK1 trong dung dịch mẫu liên kết đặc hiệu với kháng thể gắn trên bề mặt thanh dao động, sự thay đổi khối lượng và tương tác đẩy hoặc hút giữa các phân tử sẽ sinh ra ứng suất cơ học bề mặt. Ứng suất này làm thanh dao động vi cơ bị uốn cong. Hệ quang đòn bẩy laser SCALA ghi nhận sự dịch chuyển của chùm phản xạ với độ nhạy cỡ nanomet, từ đó suy ra chính xác nồng độ kháng nguyên tương ứng.

Làm thế nào để loại bỏ hiện tượng hấp phụ không đặc hiệu của các protein lạ trong mẫu thử lên bề mặt cảm biến? Sau khi đã gắn kết kháng thể bắt giữ lên các nhóm aldehyde của Glutaraldehyde, bề mặt cảm biến được ngâm ủ trong dung dịch Bovine Serum Albumin nồng độ 1%. Các phân tử BSA có kích thước nhỏ sẽ lấp đầy toàn bộ các vị trí aldehyde còn trống và các vùng bề mặt chưa được chức năng hóa, ngăn chặn hoàn toàn việc các protein khác trong huyết thanh bám dính giả, đảm bảo độ đặc hiệu phân tích tối đa.

Kết luận

• Luận văn đã hoàn thiện thành công quy trình chức năng hóa bề mặt màng Vàng bằng Cysteamine 5 mM kết hợp Glutaraldehyde 2,5% với thời gian ủ tối ưu 60 phút, tạo lớp đệm đồng nhất cho liên kết sinh học.
• Đã giải quyết triệt để tính trơ của màng Silicon Nitride bằng công nghệ plasma oxy cảm ứng cao tần ICP với các thông số tối ưu: công suất 300 W, lưu lượng oxy 80 sccm, thời gian 45 phút, giúp tăng hiệu quả gắn kết huỳnh quang lên hơn 450%.
• Ứng dụng thành công hệ vi cảm biến thanh dao động để phát hiện định lượng hai chỉ thị ung thư gan then chốt là Alpha-fetoprotein và Dickkopf-1 với dải đo tuyến tính từ 1 đến 100 ng/ml và giới hạn phát hiện dưới 0,5 ng/ml.
• Đóng góp giải pháp công nghệ xét nghiệm miễn dịch không đánh dấu có độ nhạy cao, kích thước micromet, độ lặp lại trên 95% và chi phí chế tạo thấp cho nền y sinh học trong nước.
• Định hướng lộ trình 12 đến 24 tháng tới tập trung tích hợp hệ vi lưu tự động và kiểm chuẩn lâm sàng diện rộng để chuyển giao công nghệ sản xuất chip chẩn đoán ung thư gan sớm.

Công trình là tài liệu tham khảo nền tảng cho các nhóm nghiên cứu trong lĩnh vực vi cơ điện tử y sinh và công nghệ nano; quý độc giả và các nhà khoa học quan tâm có thể khai thác chi tiết các thông số thực nghiệm trong toàn văn luận văn để ứng dụng vào các nghiên cứu cảm biến sinh học chuyên sâu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở đầu 1. Giới thiệu Ung thư gan là 1 trong 9 bệnh ung thư hay gặp nhất trên toàn thế giới, chiếm 5,6% trong tổng số các bệnh ung thư và là bệnh có tiên lượng xấu. Thời gian sống trung bình từ khi phát hiện khoảng 6 tháng, chỉ có khoảng 4,7% có khả năng sống sót sau 5 năm [26]. Thật nguy hiểm hơn khi ngày càng ảnh hưởng mạnh từ mặt trái của sự phát triển như, ôi nhiễm môi trường, lạm dụng hóa chất trong bảo quản thực phẩm, uống rượu bia,… làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư.

Để tăng khả năng điều trị bệnh ung thư thì yêu cầu cốt yếu là phát hiện bệnh sớm và chính xác. Nhiều thập niên qua, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ra nhiều phương pháp để chuẩn đoán sớm bệnh ung thư như, chụp cộng hưởng từ (MRI), chụp cắt lớp đồng vị phóng xạ phát positron, chụp cắt lớp, nội soi,…[27]. Các phương pháp trên chủ yếu là chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã phát triển thành khối u. Một phương pháp có khả năng phát hiện được bệnh sớm hơn, đơn giản, chi phí thấp là phương pháp dùng chất chỉ thị thông qua cảm biến sinh học.

Các thanh dao động với kích thước micromet được ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị ung thư được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Với độ dày của thanh dao động khoảng 1µm, dài khoảng 500-700µm, nhiều tính chất vật lý của thanh sẽ thay đổi rõ rệt khi một lượng nhỏ chất chỉ thị (chất cần phân tích) bám lên bề mặt thanh. Đo tín hiệu điện hoá, ứng suất bề mặt, độ lệch hoặc sự thay đổi của tần số dao động của thanh thì ta thu được nhiều thông tin chính xác phục vụ cho quá trình phân tích và chẩn đoán bệnh. Hình 1 mô tả sự thay đổi của thanh dao động trước và sau khi gắn kết chất chỉ thị.

a) b) Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động nhận kháng nguyên.[1] Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc rất lớn vào khả năng cố định các phần tử sinh học lên bề mặt của thanh dao động. Do đó, việc nghiên cứu phương pháp tăng khả năng gắn kết các thụ thể sinh học lên bề mặt thanh dao động là rất cần thiết. Các thanh dao động ứng dụng trong cảm biến sinh học thường làm từ vật liệu SiNx và được phủ lên một lớp vàng và crom mỏng. Bản thân Au và SiNx không phản ứng trực tiếp với các thụ thể nên để gắn kết các thụ thể này lên bề mặt thì chúng ta phải biến đổi bề mặt của thanh dao động.

Đề tài này nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động nhằm tăng khả năng gắn kháng thể lên bề mặt thanh dao động hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát hiện chỉ thị ung thư gan AFP và DKK1. Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài 2. Mục tiêu Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động được phủ lớp Au, SiNx hướng ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị AFP và DKK1. Ý nghĩa của đề tài Sử dụng cảm biến thanh dao động để phát hiện các chất chỉ thị ung thư gan là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch không đánh dấu, đơn giản, chi phí thấp và đặc biệt là có thể phát hiện được bệnh ung thư gan ở giai đoạn đầu.

Điều này sẽ giúp tăng khả năng điều trị hiệu quả bệnh ung thư gan. Ở nước ta, đây là một đề tài khá mới mẻ. Nghiên cứu này có thể mở ra những hướng nghiên cứu mới về xét nghiệm miễn dịch nhằm chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan. Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Tóm tắt nội dung của đề tài Nội dung chính của đề tài bao gồm:  Khảo sát thí nghiệm biến đổi bề mặt Au của thanh dao động thông qua cysteamine, GAD. Xây dựng quy trình dò tìm AFP.  Khảo sát phương pháp biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động thông qua GOPTS, APTES, GAD. Xây dựng quy trình dò tìm DKK1.

Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1. Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động 1. Cảm biến sinh học 1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học Sự phát triển của cảm biến sinh học đầu tiên gắn liền với cái tên L.

Clark, người đầu tiên đề xuất đầu dò oxy (1956) cho việc xác định oxy trong máu và sau đó được coi là “enzyme electrode” gồm có đầu dò enzim và hai màng lọc máu kèm theo một phần nhỏ dung dịch glucose oxidase giữa chúng (hình 1.1: “enzyme electrode” đầu tiên. Enzim xúc tác sự oxi hoá chuyển đổi glucose thành axít gluconic. Vì vậy, lượng oxy bị phân giải gần bề mặt điện cực tương ứng với nồng độ glucose. Sau này, một thiết bị tương tự với glucose oxidase được giữ trong gel polyacrylamide đã được mô tả bởi Updike và Hicks (1967).

Tuy nhiên, ứng dụng phân tích đầu tiên của cố định enzim đã được tạo ra vào năm 1962 (Guilbault et al. Guilbault đã đề xuất hệ thống cảnh báo cho việc phát hiện sớm chất độc thần kinh. Nó bao gồm 2 điện cực lưới Pt với một thanh xốp hấp thụ chứa các enzim cholinesterase cố định. Năm 1969, cảm biến enzyme potentiometric đầu tiên dựa trên điện cực NH3 chọn lọc và urease cho việc kiểm tra u-rê trong nước tiếu (Guilbault và Montalvo 1969).

Năm 1970, Bergveld đã phát minh transistor hiệu ứng trường chọn lọc ion (ISFET). Năm 1972, cảm biến sinh học thương mại đầu tiên được sản xuất. Nó là thiết bị kiểm tra đường huyết, có dạng cây bút sử dụng một điện cực. Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 Năm 1975, Janata phát minh ra cảm biến miễn dịch đầu tiên dự trên một bộ phân thế (potentiometric transducer).

Năm 1976, ra đời cảm biến miễn dịch amperometric đầu tiên (Aizawa et al. Cũng trong năm này, Karube phát mình ra cảm biến sinh học vi khuẩn (microbial biosensor) dựa trên tốc độ hô hấp như là một tín hiệu đặc trưng trong tổng lượng vật chất hữu cơ có thể oxi hoá trong nước. Năm 1980, Peterson phát minh ra cảm biến pH sợi quang đầu tiên trong khí huyết cơ thể. Năm 1982, lần đầu tiên ra đời cảm biến sinh học glucose dựa trên cơ sở sợi quang.

Năm 1983, lần đầu ra đời cảm biên miễn dịch cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt (surface plasmon reconance-SPR). Năm 1984, ra đời cảm biến sinh học đo dòng gián tiếp đầu tiên. Ferrocene được sử dụng với glucose oxidase cho việc thu nhận glucose. Năm 1987, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết MediSense ExacTechTM (mô hình dải/bút và dùng một lần).

Năm 1990, ra mắt Pharmacia BIACore SPR dựa trên hệ thống cảm biến sinh học. Năm 1992, i-STAT ra mắt thiết bị phân tích máu cầm tay. Năm 1996, Glucocard được ra mắt. Năm 1998, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết LifeScan FastTake.

Năm 2001, LifeScan đã mua hệ thống kinh doanh thiết bị kiểm tra glucose của Inverness Medical’s với giá 1,3 tỷ đô. Từ năm 1999-nay, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng một số kỹ thuật như BioNMES, Quantum dots, nanopartivles, Nanocantilever, Nanowire và Nanotube vào cảm biến sinh học [2], [3]. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học Cấu tạo cơ bản của một cảm biến sinh học được mô ta ở hình 1.2 [5]: Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học. Một cảm biến sinh học bao gồm 3 phần chính: (1) các thụ thể (kháng thể, bộ dò DNA, cell receptor…) có thể bắt giữ các phần tử sinh học (như là kháng nguyên, DNA đích, cell…); (2) bề mặt cảm biến, nơi gắn các thụ thể đồng thời cũng là nơi sinh ra các tín hiệu vật lý (độ lệch, điện trở, chiết suất…) hoặc hóa học thay đổi khi các thụ thể bắt giữ được các phần tử sinh học, (3) thiết bị điện tử có nhiệm vụ biến các tín hiệu vật lý, hóa học từ cảm biến và chuyển thành tin hiệu chuyển về hệ thống máy tính để xử lý và hiển thị kết quả.

Nguyên tắc hoạt động cơ bản của cảm biến sinh học: bề mặt cảm biến được biến đổi và cố định các thụ thể lên đó, khi tiếp xúc với môi trường cần phân tích, các thụ thể này sẽ bắt giữ các chất cần phân tích dẫn đến làm thay đổi một số tính chất hóa, lý của bề mặt (độ lệch, điện trở, chiết suất…). Sau đó, thông qua bộ chuyển đổi, những thay đổi này được chuyển sang các tín hiệu quang, điện, cơ,.và nhờ bộ phận xử lý tín hiệu (vi xử lý, thiết bị điện tử) khuếch đại, đo lường các tín hiệu này và cho ta biết được thông tin về chất phân tích. Phân loại cảm biến sinh học Việc phân loại cảm biến sinh học thông thường dựa vào nguồn gốc các bộ phận chính của chúng (bảng 1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học. Thành phần sinh hoá Bộ phận truyền dẫn Thành phần phân tích Enzim Điện hoá Thuốc và chất chuyển hoá của chúng Kháng thể Quang Chất chỉ thị sinh học Axít nucleic Vi cơ điện Vitamin và các chất chống oxi hoá Chất cảm thụ Mass sensitive Các chất chuyển đổi Mô Enthalpiemetric Chất ô nhiễm môi trường Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 Tế bào Công nghiệp hoá mỹ phẩm Cảm biến sinh học enzim (còn gọi là cảm biến enzim, hay điện cực enzim) sử dụng các enzim làm công cụ trên bề mặt của lớp chuyển đổi.

Cảm biến miễn dịch (immunosensors) sử dụng các thành phần tương tác miễn dịch, như là các kháng thể hay kháng nguyên. Cảm biến DNA bao gồm đầu dò DNA và các aptamer. Một đầu dò DNA là một chuỗi oligonucleotide ngắn sao chép lại một phần của gen. Những cảm biến sinh học dựa trên chuỗi này và được mong đợi thu nhận những đoạn DNA đặc trưng cho những gen thích hợp còn được gọi là genosensors (Yang và McGovern 1997).

Các aptamer cũng bao gồm các nucleotide nhưng không có cấu trúc tương tự như DNA tự nhiên. Những aptamer được tổng hợp bằng phương pháp trùng hợp và được lựa chọn bằng phép ghi sắc mô phỏng đối chiếu với một mục tiêu phân tích. Những aptamer có thể dựa trên một thư viên RNA, trong khi đó các phần tử RNA tự nhiên vẫn chưa được sử dụng trong cảm biến sinh học.