Nghiên Cứu Tạo Mô Sẹo Và Phát Sinh Hình Thái Cây Mướp Đắng Momordica Charantia Trong Nuôi Cấy In Vitro

• Tác giả: Trần Thị Phương Hạnh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Du Sanh
• Trường học: Trường Đại học Tây Nguyên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Tạo Mô Sẹo Và Phát Sinh Hình Thái Cây Mướp Đắng Momordica Charantia Trong Nuôi Cấy In Vitro
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2010
• Địa điểm: Buôn Ma Thuột

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về cây mướp đắng
• 1.2. Vị trí phân loại
• 1.3. Đặc tính sinh học
• 1.3.1. Mô tả hình thái
• 1.3.2. Điều kiện sống và phân bố
• 1.3.3. Thành phần và tác dụng các hợp chất tự nhiên của cây mướp đắng
• 1.4. Sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái
• 1.4.1. Sự tạo mô sẹo
• 1.4.2. Sự phát sinh hình thái
• 1.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
• 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.1.1. Thí nghiệm khử trùng mẫu cây
• 2.1.2. Thí nghiệm tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu của cây mướp đắng
• 2.1.3. Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo và tạo rễ từ những chồi thu nhận
• 2.1.4. Thí nghiệm khả năng thích ứng của cây con ngoài vườn ươm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ các chất khử trùng và thời gian khử trùng lên mẫu hạt
• 3.2. Sự tạo mô sẹo
• 3.2.1. Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ các nguồn mẫu
• 3.2.1.1. Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lá
• 3.2.1.2. Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lớp màng đất tơ diệp
• 3.2.1.3. Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lớp màng tơ diệp
• 3.2.1.4. Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lớp màng trải hạ diệp
• 3.2.2. Sự thay đổi hình thái trong quá trình tạo mô sẹo
• 3.2.3. Sự thay đổi cường độ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo được hình thành từ các nguồn mẫu
• 3.2.3.1. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo được hình thành từ lá
• 3.2.3.2. Sự thay đổi cường độ hô hấp
• 3.2.3.3. Sự thay đổi cường độ hô hấp
• 3.2.3.4. Sự gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo được hình thành từ các nguồn mẫu
• 3.2.4. Sự phát sinh chồi
• 3.2.4.1. Sự hình thành và tăng trưởng của các chồi từ mô sẹo
• 3.2.4.2. Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh chồi
• 3.2.5. Sự phát sinh rễ
• 3.2.5.1. Ảnh hưởng của AIA trong sự phát sinh rễ
• 3.2.5.2. Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ
• 3.2.5.3. Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ
• 3.2.5.4. Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Sự hình thành mô sẹo
• 4.1.1. Sự thay đổi hình thái trong quá trình tạo sẹo
• 4.1.2. Các biến đổi sinh lý trong quá trình hình thành mô sẹo
• 4.2. Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây mướp đắng
• 4.2.1. Sự thay đổi hình thái trong sự phát sinh chồi
• 4.2.2. Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi
• 4.3. Sự phát sinh rễ từ chồi mướp đắng
• 4.3.1. Ảnh hưởng của AIA trong sự phát sinh rễ
• 4.3.2. Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ
• 4.3.3. Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ
• 4.3.4. Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu chung về cây mướp đắng

Cây mướp đắng (Momordica charantia) là một loại cây thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), được trồng phổ biến ở các nước châu Á và Mỹ Latinh. Cây có giá trị dinh dưỡng cao và được sử dụng trong y học cổ truyền. Mướp đắng có khả năng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu nhiệt đới, đặc biệt là ở Việt Nam. Nghiên cứu về nuôi cấy in vitro của cây mướp đắng nhằm mục đích tạo ra giống cây đồng nhất, sạch bệnh và có năng suất cao.

1.1. Vị trí phân loại

Mướp đắng thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Cucurbitales, họ Cucurbitaceae, chi Momordica, loài Momordica charantia. Đây là loài cây dây leo, có tua cuốn và thân góc cạnh, lá chia thùy hình tim, hoa màu vàng nhạt, trái hình thoi với bề mặt gồ ghề.

1.2. Đặc điểm sinh học

Mướp đắng là cây ưa ẩm, ưa sáng và không chịu được ngập úng. Cây có khả năng sinh trưởng mạnh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới. Trái mướp đắng chứa nhiều hợp chất có giá trị dược liệu như charantin và momordicin, có tác dụng hạ đường huyết và kháng khuẩn.

II. Tạo mô sẹo và phát sinh hình thái

Tạo mô sẹo và phát sinh hình thái là hai quá trình quan trọng trong nuôi cấy in vitro của cây mướp đắng. Mô sẹo được hình thành từ các tế bào không phân hóa, có khả năng phân chia mạnh. Quá trình này phụ thuộc vào sự kết hợp giữa auxin và cytokinin. Phát sinh hình thái bao gồm sự hình thành các cơ quan mới như chồi và rễ từ mô sẹo.

2.1. Tạo mô sẹo

Mô sẹo được tạo ra từ các mô non như lá, thân và rễ trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Sự hình thành mô sẹo phụ thuộc vào nồng độ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Các tế bào nhu mô và tế bào tượng tầng là nguồn chính để tạo mô sẹo.

2.2. Phát sinh hình thái

Phát sinh hình thái là quá trình hình thành các cơ quan mới từ mô sẹo. Quá trình này bao gồm sự phân hóa tế bào và hình thành chồi, rễ. Sự phối hợp giữa auxin và cytokinin đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình này.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu về tạo mô sẹo và phát sinh hình thái của cây mướp đắng được thực hiện thông qua các thí nghiệm nuôi cấy in vitro. Các phương pháp bao gồm khử trùng mẫu cấy, tạo mô sẹo từ các nguồn mô khác nhau, và đánh giá khả năng thích ứng của cây con trong vườn ươm.

3.1. Khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng với nồng độ và thời gian khác nhau. Quá trình này đảm bảo mẫu cấy sạch vi khuẩn và nấm, tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành mô sẹo.

3.2. Tạo mô sẹo

Mô sẹo được tạo ra từ các nguồn mô như lá, thân và rễ. Môi trường nuôi cấy được bổ sung auxin và cytokinin để kích thích sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo.

IV. Kết quả và ứng dụng

Nghiên cứu đã xác định được môi trường nuôi cấy tối ưu cho tạo mô sẹo và phát sinh hình thái của cây mướp đắng. Kết quả cho thấy sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có ảnh hưởng lớn đến quá trình hình thành chồi và rễ. Nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn trong việc nhân giống cây mướp đắng sạch bệnh và đồng nhất.

4.1. Ứng dụng trong nhân giống

Nuôi cấy in vitro cây mướp đắng giúp tạo ra giống cây đồng nhất, sạch bệnh và có năng suất cao. Phương pháp này có thể áp dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp và dược liệu.

4.2. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học về quá trình tạo mô sẹo và phát sinh hình thái của cây mướp đắng, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực sinh học thực vật và công nghệ sinh học.

Tổng quan nghiên cứu

Cây mướp đắng (Momordica charantia L.) là một loại cây dây leo có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được trồng phổ biến ở nhiều vùng miền Việt Nam và các nước châu Á, Mỹ Latinh. Theo ước tính, trong 100g trái mướp đắng chứa 0,10g chất béo, 0,90g chất đạm, 4,70g chất bột đường cùng các khoáng chất như K 250mg, Ca 22mg, Mg 16mg, Fe 0,9mg và Zn 0,1g. Ngoài ra, cây còn chứa các hợp chất sinh học quan trọng như charantin, momordicin, polyphenol và flavonoid có tác dụng hạ đường huyết, kháng khuẩn, chống viêm và hỗ trợ phòng chống ung thư.

Tuy nhiên, việc nhân giống cây mướp đắng truyền thống bằng gieo hạt gặp nhiều hạn chế do cây con dễ nhiễm bệnh, năng suất và chất lượng không ổn định. Do đó, nuôi cấy mô in vitro được xem là giải pháp hiệu quả để tạo ra giống cây sạch bệnh, đồng đều và năng suất cao. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu quá trình tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng trong nuôi cấy mô, xác định môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp để tối ưu hóa quá trình nhân giống.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh và Đại học Tây Nguyên trong khoảng thời gian từ tháng 11/2009 đến tháng 9/2010. Kết quả nghiên cứu góp phần xây dựng quy trình nhân giống mô cây mướp đắng hiệu quả, hỗ trợ phát triển sản xuất giống sạch bệnh, nâng cao giá trị kinh tế và bảo tồn nguồn gen cây dược liệu quý.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sinh học thực vật về nuôi cấy mô và phát sinh hình thái, bao gồm:

• Lý thuyết tạo mô sẹo (callus formation): Mô sẹo là khối tế bào không phân hóa, có khả năng phân chia mạnh, được hình thành từ các mô thực vật trong điều kiện nuôi cấy in vitro với sự tác động của auxin và cytokinin. Quá trình tạo mô sẹo gồm phân hóa tế bào nhu mô, phân chia tế bào tương tầng và xáo trộn mô phân sinh sơ khai.

• Lý thuyết phát sinh hình thái (morphogenesis): Quá trình phát triển các cơ quan thực vật như chồi, rễ từ mô sẹo hoặc mô phân sinh, bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh cơ quan (organogenesis) và phát sinh phôi (embryogenesis). Sự cân bằng giữa auxin và cytokinin quyết định hướng phát sinh chồi hay rễ.

• Khái niệm về các chất điều hòa sinh trưởng: Auxin (2,4-D, AIA), cytokinin (BA), gibberellin, acid abscisic (ABA), ethylen và vai trò phối hợp của chúng trong điều khiển sự phân chia, kéo dài và phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Hạt giống mướp đắng có độ sạch ≥ 98%, tỷ lệ nảy mầm ≥ 80%, được cung cấp bởi công ty GINO Seed & Agriculture TP. Hồ Chí Minh. Mẫu mô lấy từ các bộ phận khác nhau của cây in vitro gồm lá non, lớp màng đất tơ diệp, lớp màng tơ diệp, lớp màng trụ diệp.

• Phương pháp phân tích: Thí nghiệm khử trùng hạt bằng các dung dịch calcium hypochlorite, javel và thủy ngân chlorite với các nồng độ và thời gian khác nhau để xác định điều kiện khử trùng tối ưu. Thí nghiệm tạo mô sẹo trên môi trường MS bổ sung các nồng độ auxin (2,4-D, AIA) và cytokinin (BA) khác nhau, theo dõi sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo qua 2-5 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm tạo chồi và rễ từ mô sẹo, khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần sử dụng 10 mẫu mô. Mẫu được chọn ngẫu nhiên từ các bộ phận cây in vitro 6-7 ngày tuổi.

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 11/2009 đến tháng 9/2010, theo dõi các chỉ số sinh trưởng mô sẹo, chồi, rễ trong vòng 2-5 tuần nuôi cấy.

• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để xử lý thống kê, so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) giữa các nhóm thí nghiệm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Điều kiện khử trùng hạt tối ưu: Dung dịch thủy ngân chlorite 0,1% xử lý 10-15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất, đạt 86,67-93,33%, vượt trội so với calcium hypochlorite (66,67-90%) và javel (66,67-86,67%).

2. Tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu: Mô sẹo hình thành trên tất cả các nguồn mẫu (lá non, lớp màng đất tơ diệp, lớp màng tơ diệp, lớp màng trụ diệp) khi nuôi trên môi trường MS bổ sung auxin 2,4-D hoặc AIA, có hoặc không kết hợp cytokinin BA. Mô sẹo xuất hiện rõ rệt sau 1 tuần, tăng trưởng mạnh qua các tuần tiếp theo.

3. Ảnh hưởng nồng độ auxin 2,4-D đến mô sẹo từ lá: Tăng trọng lượng tươi mô sẹo từ 0,02g (không auxin) lên 0,98g sau 5 tuần với 1mg/l 2,4-D, tăng trưởng mô sẹo có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

4. Phát sinh chồi và rễ: Môi trường MS bổ sung BA và AIA kích thích hình thành chồi và rễ từ mô sẹo. Tỷ lệ tái sinh chồi đạt 75% khi sử dụng 2,4-D 1,0 mg/l kết hợp BA 1,0 mg/l. Rễ phát triển tốt với AIA 0,5 mg/l.

5. Khả năng thích ứng cây con in vitro: Cây con nuôi cấy mô có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển ra vườn ươm, cho thấy tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong nhân giống.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy dung dịch thủy ngân chlorite 0,1% là lựa chọn hiệu quả nhất để khử trùng hạt mướp đắng, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về khử trùng hạt cây dược liệu. Việc tạo mô sẹo thành công trên nhiều nguồn mẫu chứng tỏ tính linh hoạt của phương pháp nuôi cấy mô, đồng thời nồng độ auxin 2,4-D 1mg/l là điều kiện tối ưu để kích thích phân chia tế bào và tăng trưởng mô sẹo.

Sự phối hợp giữa auxin và cytokinin đóng vai trò quyết định trong việc định hướng phát sinh hình thái, phù hợp với lý thuyết về cân bằng auxin/cytokinin trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ tái sinh chồi và rễ cao cho thấy quy trình nuôi cấy mô có thể áp dụng để nhân giống nhanh cây mướp đắng sạch bệnh, đồng thời giảm thiểu rủi ro biến dị di truyền so với phương pháp gieo hạt truyền thống.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng trọng lượng tươi mô sẹo theo thời gian và bảng so sánh tỷ lệ tái sinh chồi, rễ giữa các nồng độ auxin và cytokinin khác nhau, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của từng điều kiện nuôi cấy.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng dung dịch thủy ngân chlorite 0,1% trong khử trùng hạt: Thực hiện xử lý trong 10-15 phút để đảm bảo tỷ lệ mẫu sạch và sống cao, giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn trong nuôi cấy mô.

2. Sử dụng môi trường MS bổ sung 2,4-D 1mg/l kết hợp BA 1mg/l: Để tối ưu hóa quá trình tạo mô sẹo và phát sinh chồi, rễ trong nuôi cấy mô cây mướp đắng, nâng cao hiệu quả nhân giống.

3. Xây dựng quy trình nhân giống mô chuẩn: Từ khâu lấy mẫu, khử trùng, nuôi cấy mô sẹo đến phát sinh chồi, rễ và chuyển cây con ra vườn ươm, đảm bảo cây giống sạch bệnh, đồng đều về chất lượng.

4. Theo dõi và đánh giá khả năng thích ứng cây con ngoài vườn ươm: Thực hiện trong vòng 4-6 tuần sau chuyển cây để đảm bảo tỷ lệ sống sót và phát triển ổn định, từ đó điều chỉnh kỹ thuật chăm sóc phù hợp.

5. Chủ thể thực hiện: Các trung tâm nghiên cứu nông nghiệp, viện nghiên cứu cây dược liệu, doanh nghiệp sản xuất giống cây trồng có thể áp dụng quy trình này để nâng cao năng suất và chất lượng giống mướp đắng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học thực nghiệm: Có thể sử dụng kết quả nghiên cứu để phát triển các đề tài liên quan đến nuôi cấy mô, nhân giống cây dược liệu và cây trồng có giá trị kinh tế.

2. Chuyên gia và kỹ thuật viên trong lĩnh vực nông nghiệp công nghệ cao: Áp dụng quy trình nuôi cấy mô để sản xuất giống cây mướp đắng sạch bệnh, đồng thời nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo tồn nguồn gen.

3. Doanh nghiệp sản xuất giống cây trồng: Sử dụng phương pháp nhân giống mô để cung cấp giống chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường về cây mướp đắng sạch bệnh, năng suất cao.

4. Người làm vườn và nông dân trồng mướp đắng: Tham khảo kỹ thuật nhân giống mô để áp dụng trong sản xuất, giúp giảm thiểu sâu bệnh, tăng năng suất và chất lượng sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Nuôi cấy mô là gì và tại sao lại quan trọng trong nhân giống cây mướp đắng?
   Nuôi cấy mô là kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng cách nuôi tế bào hoặc mô thực vật trong môi trường vô trùng và điều kiện kiểm soát. Phương pháp này giúp tạo ra cây giống sạch bệnh, đồng đều và nhân nhanh số lượng cây, khắc phục hạn chế của phương pháp gieo hạt truyền thống.

2. Tại sao cần sử dụng auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô?
   Auxin và cytokinin là hai loại hormone thực vật điều hòa sự phân chia và phân hóa tế bào. Auxin chủ yếu kích thích tạo rễ, còn cytokinin kích thích tạo chồi. Tỷ lệ cân bằng giữa hai hormone này quyết định hướng phát sinh hình thái của mô sẹo.

3. Dung dịch khử trùng nào hiệu quả nhất cho hạt mướp đắng?
   Theo kết quả nghiên cứu, dung dịch thủy ngân chlorite 0,1% xử lý trong 10-15 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và sống cao nhất, đạt trên 86%, hiệu quả hơn so với calcium hypochlorite và javel.

4. Làm thế nào để chuyển cây con nuôi cấy mô ra môi trường ngoài vườn ươm?
   Cây con sau khi phát triển đủ chồi và rễ được chuyển sang giá thể ươm có độ ẩm và ánh sáng phù hợp, tưới nước đều đặn, theo dõi tỷ lệ sống sót và điều chỉnh điều kiện chăm sóc để cây phát triển ổn định.

5. Quy trình nuôi cấy mô có thể áp dụng cho các loại cây khác không?
   Quy trình cơ bản có thể áp dụng cho nhiều loại cây trồng và cây dược liệu khác nhau, tuy nhiên cần điều chỉnh nồng độ hormone và điều kiện môi trường phù hợp với từng loài để đạt hiệu quả tối ưu.

Kết luận

• Nghiên cứu đã xác định được dung dịch thủy ngân chlorite 0,1% là điều kiện khử trùng hạt mướp đắng hiệu quả nhất với tỷ lệ mẫu sạch và sống đạt trên 86%.
• Môi trường MS bổ sung auxin 2,4-D 1mg/l kết hợp cytokinin BA 1mg/l tối ưu cho quá trình tạo mô sẹo và phát sinh chồi, rễ trong nuôi cấy mô cây mướp đắng.
• Tỷ lệ tái sinh chồi đạt 75%, rễ phát triển tốt với AIA 0,5 mg/l, cho thấy khả năng nhân giống mô hiệu quả và ổn định.
• Cây con in vitro có khả năng thích ứng cao khi chuyển ra vườn ươm, mở ra triển vọng ứng dụng thực tiễn trong sản xuất giống sạch bệnh.
• Đề xuất xây dựng quy trình nhân giống mô chuẩn, áp dụng trong các trung tâm nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất giống để nâng cao năng suất và chất lượng cây mướp đắng.

Next steps: Triển khai thử nghiệm quy mô lớn quy trình nuôi cấy mô, đánh giá hiệu quả kinh tế và khả năng nhân rộng trong sản xuất thực tế.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực nông nghiệp công nghệ cao nên phối hợp ứng dụng kết quả nghiên cứu để phát triển nguồn giống cây mướp đắng chất lượng cao, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.