Luận văn thạc sĩ: Xác định Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp LC-MS/MS

• Tác giả: Nguyễn Thị Hà Bình
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác Định Ochratoxin Trong Thực Phẩm Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Khối Phổ (LC-MS/MS)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu chung
• 1.2. Tính chất hóa lý của Ochratoxins
• 1.3. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MRL)
• 1.4. Các phương pháp xác định
• 1.4.1. Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• 1.4.2. Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography-GC)
• 1.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cột ái lực miễn dịch (IP)
• 1.4.4. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu
• 2.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
• 2.2.2.1. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
• 2.2.3. Phương tiện nghiên cứu
• 2.2.3.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.2.3.2. Dung môi, hóa chất
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS
• 3.1.1. Tối ưu các điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS
• 3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ và ion con
• 3.1.2. Tối ưu các điều kiện MS/MS
• 3.1.3. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• 3.1.3.1. Khảo sát thành phần pha động
• 3.1.3.2. Khảo sát tốc độ pha động
• 3.1.3.3. Chọn chương trình chạy gradient
• 3.2. Tối ưu quy trình xử lý mẫu
• 3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu
• 3.2.2. Khảo sát thể tích (số lần chiết) dung môi chiết
• 3.2.3. Chọn cột chiết pha
• 3.2.4. Khảo sát tốc độ qua cột chiết pha rắn
• 3.2.5. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải
• 3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng pH trong quá trình chiết mẫu
• 3.3. Tham định phương pháp phân tích
• 3.3.1. Tính đặc hiệu / chọn lọc
• 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.3.3. Xác định khoảng tuyến tính
• 3.3.4. Xây dựng đường chuẩn
• 3.4. Phân tích mẫu thực tế
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Ochratoxin Trong Thực Phẩm Luận Văn Thạc Sĩ

Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được quan tâm, đặc biệt là nguy cơ ngộ độc mycotoxin. Các vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng đã gây tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm, số vụ ngộ độc thực phẩm và số người mắc vẫn ở mức cao. Ochratoxin, một loại độc tố nấm mốc, được sinh ra bởi các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergillus ochraceus và Penicillium verrucusum, có tiềm năng gây ung thư và viêm thận. Độc tố này được phát hiện trên nhiều nông sản, bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng. Khi chúng ta ăn phải thức ăn bị nhiễm ochratoxin, nó không gây ngộ độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ thể, đe dọa sức khỏe. Theo FAO, khoảng 25% số ngũ cốc thế giới chứa mycotoxin ở một mức độ nào đó. Tại Việt Nam, tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc khá phổ biến. Để kiểm soát mức độ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm, nhiều phương pháp phân tích đã được nghiên cứu và ứng dụng, trong đó sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) được coi là phương pháp có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ ochratoxin ở lượng vết. Luận văn này tập trung vào xây dựng phương pháp nghiên cứu để xác định Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp LC-MS/MS.

1.1. Định Nghĩa Và Nguồn Gốc Của Độc Tố Ochratoxin A OTA

Ochratoxin, đặc biệt là Ochratoxin A (OTA), là sản phẩm chuyên hóa thứ cấp của một số loài nấm mốc, có mặt trong nhiều loại nông sản như ngũ cốc, cà phê, rượu vang. Ochratoxins được biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium. Ochratoxin A lần đầu tiên được tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam Phi. Các nghiên cứu đã chỉ ra sự hiện diện của Ochratoxin trong nhiều loại thực phẩm ở nhiều quốc gia khác nhau, bao gồm cả Việt Nam. Một nghiên cứu tại Việt Nam trên mẫu ngô cho thấy tỷ lệ nhiễm Ochratoxin A khá cao, vượt mức dư lượng cho phép theo quy định của Bộ Y tế. Hiện nay, đã phát hiện được 3 loại ochratoxin khác nhau, nhưng luận văn này tập trung nghiên cứu Ochratoxin A và Ochratoxin B.

1.2. Tính Chất Hóa Lý Của Các Dạng Ochratoxin OTA OTB

Ochratoxins là độc tố tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi hữu cơ phân cực. Chúng bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất và được sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ 20-25°C. Ochratoxins dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, trong môi trường kiềm hoặc chất tẩy rửa. Ochratoxin A phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm, có tính axit yếu. Ochratoxin B cũng có thể phát huỳnh quang màu xanh khi chiếu tia UV bước sóng 318 nm và có nhiệt độ nóng chảy khoảng 221°C. Cơ chế tác động của ochratoxins là ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tARN) và các axitamin, ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine - tARN ở gan, làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể.

1.3. Giới Hạn Tồn Dư Tối Đa MRL Ochratoxin A Tại Việt Nam

Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) là giới hạn dư lượng của một loại thuốc, được phép tồn tại về mặt pháp lý hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong nông sản, thức ăn mà không gây hại cho người sử dụng và vật nuôi. Theo quy định tại Việt Nam, mức dư lượng tối đa cho phép của Ochratoxin A khác nhau tùy theo loại thực phẩm. Ví dụ, ngũ cốc chưa qua chế biến là 5 µg/kg, hạt cà phê rang, cà phê bột là 5 µg/kg, rượu vang, nước nho ép là 2 µg/kg, và thực phẩm dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi là 0,5 µg/kg. Hiện chưa có quy định cụ thể nào về mức MRL cho Ochratoxin B kể cả trong nước và tiêu chuẩn Châu Âu (EN).

II. Thách Thức Trong Kiểm Nghiệm Ochratoxin Trong Thực Phẩm

Việc kiểm nghiệm ochratoxin trong thực phẩm đối mặt với nhiều thách thức do nồng độ ochratoxin thường rất thấp, yêu cầu phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chính xác cao. Sự phức tạp của ma trận thực phẩm cũng gây khó khăn cho quá trình chiết xuất ochratoxin và loại bỏ các chất gây nhiễu. Các phương pháp truyền thống như ELISA và HPLC có thể không đủ để phát hiện và định lượng ochratoxin ở nồng độ vết. Do đó, cần có các phương pháp phân tích hiện đại và hiệu quả hơn, như LC-MS/MS, để đảm bảo an toàn thực phẩm. Luận văn này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu và các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để cải thiện độ nhạy và độ chính xác của phương pháp xác định Ochratoxin.

2.1. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Phân Tích Ochratoxin Truyền Thống

Các phương pháp phân tích ochratoxin truyền thống như ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) và HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) có những hạn chế nhất định về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng xử lý mẫu phức tạp. Phương pháp ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, nhưng có thể xảy ra phản ứng chéo với các chất tương tự, dẫn đến kết quả dương tính giả. HPLC có thể gặp khó khăn trong việc tách ochratoxin khỏi các chất gây nhiễu trong ma trận thực phẩm. Vì vậy, các phương pháp này có thể không đủ để đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm khắt khe về an toàn thực phẩm.

2.2. Sự Cần Thiết Của Phương Pháp LC MS MS Độ Nhạy Cao

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép xác định ochratoxin ở nồng độ vết trong các mẫu thực phẩm phức tạp. LC-MS/MS kết hợp khả năng tách sắc ký của HPLC với khả năng phát hiện và định lượng chính xác của khối phổ, giúp giảm thiểu ảnh hưởng của các chất gây nhiễu và tăng độ tin cậy của kết quả. Do đó, LC-MS/MS được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để kiểm nghiệm ochratoxin trong thực phẩm.

III. LC MS MS Giải Pháp Xác Định Ochratoxin Hiệu Quả

Luận văn này tập trung vào việc xây dựng và tối ưu hóa phương pháp xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng LC-MS/MS. Mục tiêu là đạt được độ nhạy, độ chính xác và độ tin cậy cao, đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm an toàn thực phẩm. Nghiên cứu bao gồm các bước: khảo sát các điều kiện chạy máy LC-MS/MS, tối ưu quy trình xử lý mẫu (bao gồm chiết xuất ochratoxin và làm sạch mẫu), và tham định phương pháp (xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác, độ tin cậy). Phương pháp được xây dựng sẽ được ứng dụng để phân tích ochratoxin trong các mẫu thực phẩm thực tế như ngũ cốc, cà phê và rượu vang.

3.1. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Chạy Máy LC MS MS Để Phân Tích Ochratoxin

Việc tối ưu hóa điều kiện chạy máy LC-MS/MS là rất quan trọng để đạt được độ nhạy và độ phân giải cao trong phân tích ochratoxin. Điều này bao gồm việc lựa chọn cột sắc ký phù hợp, pha động thích hợp (thành phần, pH, tốc độ dòng), và các thông số khối phổ (điện áp ion hóa, nhiệt độ, năng lượng va chạm). Khảo sát và tối ưu hóa các thông số này giúp cải thiện khả năng ion hóa, tách và phát hiện ochratoxin, từ đó nâng cao độ nhạy của phương pháp.

3.2. Quy Trình Xử Lý Mẫu Tối Ưu Để Chiết Xuất Ochratoxin Hiệu Quả

Quy trình xử lý mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích ochratoxin. Quy trình này bao gồm các bước: chiết xuất ochratoxin từ ma trận thực phẩm, làm sạch mẫu để loại bỏ các chất gây nhiễu, và cô đặc mẫu để tăng nồng độ ochratoxin. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc khảo sát và lựa chọn các dung môi chiết xuất, phương pháp làm sạch mẫu (ví dụ: sử dụng cột SPE - solid phase extraction), và các điều kiện chiết xuất tối ưu (thời gian, nhiệt độ, pH) để đạt được hiệu suất chiết xuất ochratoxin cao nhất.

3.3. Tham Định Phương Pháp LC MS MS LOD LOQ Độ Chính Xác

Tham định phương pháp là quá trình đánh giá và xác nhận tính phù hợp của phương pháp LC-MS/MS để xác định ochratoxin trong thực phẩm. Quá trình này bao gồm việc xác định các thông số: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác (độ lặp lại, độ tái lặp), độ thu hồi, và khoảng tuyến tính. Kết quả tham định phương pháp sẽ chứng minh rằng phương pháp LC-MS/MS đã được xây dựng có độ tin cậy và độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm an toàn thực phẩm.

IV. Ứng Dụng LC MS MS Phân Tích Ochratoxin Trong Các Loại Thực Phẩm

Sau khi xây dựng và tham định phương pháp LC-MS/MS, nghiên cứu sẽ ứng dụng phương pháp này để phân tích ochratoxin trong các mẫu thực phẩm thực tế được thu thập từ thị trường, như ngũ cốc (ngô, gạo), cà phê, rượu vang, trái cây sấy khô và gia vị. Mục tiêu là đánh giá mức độ nhiễm ochratoxin trong các loại thực phẩm này và so sánh với các quy định về giới hạn dư lượng tối đa (MRL) của Bộ Y tế. Kết quả phân tích sẽ cung cấp thông tin quan trọng để đánh giá rủi ro ochratoxin và đưa ra các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát thích hợp.

4.1. Phân Tích Ochratoxin Trong Ngũ Cốc Ngô Gạo Bằng Phương Pháp LC MS MS

Ngũ cốc (ngô, gạo) là một trong những loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm ochratoxin cao do điều kiện bảo quản không tốt. Nghiên cứu sẽ sử dụng phương pháp LC-MS/MS đã được xây dựng để phân tích ochratoxin trong các mẫu ngô, gạo được thu thập từ các chợ và siêu thị. Kết quả phân tích sẽ cho biết tỷ lệ mẫu nhiễm ochratoxin, nồng độ ochratoxin trung bình, và số lượng mẫu vượt quá MRL của Bộ Y tế.

4.2. Xác Định Ochratoxin Trong Cà Phê Bằng LC MS MS Đánh Giá Nguy Cơ

Cà phê cũng là một loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm ochratoxin, đặc biệt là trong quá trình thu hoạch, chế biến và bảo quản. Nghiên cứu sẽ sử dụng phương pháp LC-MS/MS để phân tích ochratoxin trong các mẫu cà phê rang xay và cà phê hòa tan. Kết quả phân tích sẽ giúp đánh giá nguy cơ phơi nhiễm ochratoxin từ cà phê và đưa ra các khuyến nghị cho người tiêu dùng và nhà sản xuất.

4.3. Phân Tích Ochratoxin Trong Rượu Vang Bằng LC MS MS Rủi Ro Tiềm Ẩn

Rượu vang có thể bị nhiễm ochratoxin từ nho bị nấm mốc trong quá trình sản xuất. Nghiên cứu sẽ sử dụng phương pháp LC-MS/MS để phân tích ochratoxin trong các mẫu rượu vang khác nhau. Kết quả phân tích sẽ giúp đánh giá rủi ro phơi nhiễm ochratoxin từ rượu vang và so sánh với các tiêu chuẩn quốc tế.

V. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Ochratoxin Trong Tương Lai

Luận văn này đã xây dựng và tối ưu hóa phương pháp LC-MS/MS để xác định ochratoxin trong thực phẩm, đồng thời ứng dụng phương pháp này để phân tích ochratoxin trong một số loại thực phẩm phổ biến. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về mức độ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm và giúp đánh giá rủi ro ochratoxin đối với sức khỏe người tiêu dùng. Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu để mở rộng phạm vi phân tích ochratoxin trong nhiều loại thực phẩm khác, đồng thời phát triển các phương pháp phòng ngừa và kiểm soát sự nhiễm ochratoxin trong quá trình sản xuất và bảo quản thực phẩm.

5.1. Đánh Giá Ưu Điểm Và Hạn Chế Của Phương Pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS đã chứng minh được ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng xử lý mẫu phức tạp trong phân tích ochratoxin. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số hạn chế, như chi phí đầu tư và vận hành cao, yêu cầu kỹ thuật viên có trình độ chuyên môn cao, và thời gian phân tích có thể kéo dài. Cần có các nghiên cứu để cải tiến và đơn giản hóa phương pháp LC-MS/MS để giảm chi phí và tăng tính ứng dụng.

5.2. Hướng Phát Triển Các Phương Pháp Kiểm Soát Ochratoxin Hiệu Quả

Để giảm thiểu nguy cơ phơi nhiễm ochratoxin từ thực phẩm, cần có các biện pháp kiểm soát hiệu quả trong suốt chuỗi cung ứng thực phẩm, từ sản xuất, thu hoạch, chế biến, bảo quản, đến phân phối. Các biện pháp này bao gồm: sử dụng giống cây trồng kháng nấm mốc, kiểm soát điều kiện bảo quản để ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc, và áp dụng các phương pháp xử lý thực phẩm để loại bỏ hoặc giảm hàm lượng ochratoxin.

Tổng quan nghiên cứu

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề được quan tâm hàng đầu do ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm, trong giai đoạn 2009-2013, số vụ ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam dao động từ 147 đến 175 vụ mỗi năm, với hàng nghìn người mắc và nhiều trường hợp tử vong. Trong đó, ngộ độc do mycotoxin, đặc biệt là độc tố ochratoxin, gây ra những hậu quả nghiêm trọng do tính tích lũy và độc tính mãn tính. Ochratoxin là độc tố sinh ra bởi các chủng nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium verrucosum, có khả năng gây ung thư và tổn thương thận, gan ở người và động vật. Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) ước tính khoảng 25% ngũ cốc thế giới bị nhiễm mycotoxin, trong đó ochratoxin là một trong những độc tố phổ biến nhất, đặc biệt tại các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng và tham định phương pháp xác định hàm lượng ochratoxin trong thực phẩm, bao gồm ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc và rượu lên men, bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Nghiên cứu tập trung tối ưu các điều kiện phân tích trên hệ thống LC-MS/MS, quy trình xử lý mẫu, và áp dụng phương pháp để đánh giá mức độ nhiễm độc trong các mẫu thực phẩm thu thập tại các chợ nội thành Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An trong năm 2013. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát an toàn thực phẩm, giảm thiểu nguy cơ ngộ độc do ochratoxin, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho các cơ quan quản lý trong việc xây dựng tiêu chuẩn và quy định về mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của độc tố này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tích hóa học hiện đại, bao gồm:

• Lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Quá trình tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau giữa pha tĩnh (cột C18 pha đảo) và pha động (dung môi phân cực như methanol, amoni acetate). Phương pháp này cho phép tách các hợp chất có tính phân cực đa dạng với độ phân giải cao.

• Lý thuyết khối phổ (Mass Spectrometry - MS): Phân tích dựa trên việc ion hóa mẫu, tách các ion theo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z) và phát hiện tín hiệu ion. Phương pháp LC-MS/MS sử dụng bộ phân tích tứ cực ba lần (triple quadrupole) để tăng độ chọn lọc và độ nhạy, cho phép định lượng chính xác các chất phân tích ở nồng độ rất thấp.

• Khái niệm chính:

  • Ochratoxin A và B: Các độc tố nấm mốc có cấu trúc hóa học đặc trưng, gây độc cho gan, thận và hệ miễn dịch.
  • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Các chỉ số quan trọng đánh giá độ nhạy của phương pháp phân tích.
  • Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL): Giới hạn pháp lý về hàm lượng độc tố được phép tồn tại trong thực phẩm.
  • Chiết pha rắn (SPE): Phương pháp chuẩn bị mẫu nhằm làm giàu và tinh sạch chất phân tích trước khi phân tích LC-MS/MS.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu thực phẩm gồm ngũ cốc (ngô, lạc, đỗ, gạo) và các loại rượu lên men được thu thập ngẫu nhiên tại các chợ nội thành Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An trong năm 2013. Khối lượng mẫu từ 100 đến 500 g mỗi mẫu.

• Phương pháp phân tích:

  • Chuẩn bị mẫu bằng phương pháp chiết dung môi chloroform kết hợp với chiết pha rắn trên cột C18 để làm sạch mẫu.
  • Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng với cột C18, pha động gồm amoni acetate 10 mM và methanol theo chương trình gradient, tốc độ dòng 1,0 ml/phút.
  • Ion hóa mẫu bằng kỹ thuật phun điện tử (ESI) ở chế độ ion âm.
  • Phân tích trên hệ thống LC-MS/MS Shimadzu AB Sciex Triplequad 5500, xác định ion mẹ và ion con đặc trưng của ochratoxin A (m/z 402/166,9) và ochratoxin B (m/z 368/220).
  • Tham định phương pháp bao gồm đánh giá độ đặc hiệu, LOD, LOQ, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ đúng và độ chụm).

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2013, bao gồm các giai đoạn thu thập mẫu, tối ưu hóa phương pháp, phân tích mẫu và xử lý số liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu điều kiện LC-MS/MS:

   • Ion mẹ và ion con của ochratoxin A và B được xác định rõ ràng với các thông số DP, CE, CXP tối ưu, cho tín hiệu sắc nét và độ nhạy cao.
   • Tốc độ dòng pha động 1,0 ml/phút được chọn là tối ưu, cân bằng giữa độ phân giải sắc ký và tuổi thọ cột.
   • Chương trình gradient pha động với amoni acetate 10 mM và methanol cho diện tích pic lớn nhất, thời gian phân tích khoảng 10 phút.

2. Quy trình xử lý mẫu tối ưu:

   • Quy trình chiết mẫu bằng chloroform kết hợp chiết pha rắn C18 cho hiệu suất thu hồi ochratoxin A đạt khoảng 84%, ochratoxin B khoảng 78%, cao hơn so với các quy trình dùng ethyl acetate hoặc NaHCO3.
   • Chiết lặp 2 lần với thể tích 15 ml dung môi mỗi lần là tối ưu, đảm bảo hiệu suất chiết trên 80% mà tiết kiệm dung môi.
   • Tốc độ rửa giải trên cột chiết pha rắn 1 ml/phút và thể tích dung môi rửa giải 2 ml MeOH-acid acetic (99,5:0,5) cho hiệu suất thu hồi cao nhất.

3. Ảnh hưởng của pH chiết mẫu:

   • pH môi trường chiết ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất chiết ochratoxin, với pH 1-2 (môi trường axit) cho diện tích pic lớn nhất, do ochratoxin tồn tại ở dạng không ion hóa, dễ hòa tan trong dung môi hữu cơ.

4. Phân tích mẫu thực tế:

   • Trong số các mẫu ngũ cốc và rượu lên men thu thập tại các địa phương, có khoảng 40% mẫu ngô phát hiện có ochratoxin A, trong đó khoảng 1,6% vượt mức dư lượng tối đa cho phép theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam.
   • Mức dư lượng ochratoxin trong các mẫu rượu và sản phẩm từ ngũ cốc đều nằm trong giới hạn an toàn, tuy nhiên vẫn cần giám sát chặt chẽ.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp LC-MS/MS với quy trình xử lý mẫu tối ưu có độ nhạy và độ chính xác cao, phù hợp để phát hiện ochratoxin ở mức vết trong thực phẩm. Việc lựa chọn cột C18 và điều kiện ion hóa ESI âm giúp tăng khả năng phân tích các hợp chất có tính axit yếu như ochratoxin. So với các phương pháp truyền thống như ELISA hay HPLC huỳnh quang, LC-MS/MS cho kết quả chính xác hơn, giảm thiểu sai số do nền mẫu phức tạp.

Hiệu suất thu hồi trên 80% và giới hạn phát hiện thấp (LOD khoảng 0,3 ng/ml) đáp ứng yêu cầu pháp lý và nghiên cứu khoa học. Mức độ nhiễm ochratoxin trong ngũ cốc tại Việt Nam tương đồng với các báo cáo quốc tế ở các vùng khí hậu nhiệt đới, phản ánh đặc điểm khí hậu và điều kiện bảo quản nông sản. Việc phát hiện một số mẫu vượt MRL cảnh báo nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là nhóm nhạy cảm như trẻ em dưới 36 tháng tuổi.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu nhiễm ochratoxin theo địa phương, bảng so sánh hiệu suất thu hồi của các quy trình xử lý mẫu, và đồ thị phụ thuộc diện tích pic vào pH chiết mẫu để minh họa ảnh hưởng của điều kiện chiết.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong kiểm nghiệm thực phẩm:

   • Đào tạo kỹ thuật viên và trang bị hệ thống LC-MS/MS tại các phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm trong vòng 12 tháng.
   • Mục tiêu nâng cao năng lực phát hiện ochratoxin với độ nhạy cao, giảm thiểu sai số trong phân tích.

2. Xây dựng quy trình chuẩn quốc gia về lấy mẫu và xử lý mẫu ngũ cốc, rượu lên men:

   • Áp dụng quy trình chiết chloroform kết hợp chiết pha rắn C18 đã tối ưu để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại.
   • Thời gian hoàn thiện quy trình chuẩn trong 6 tháng, phối hợp với các cơ quan quản lý.

3. Tăng cường giám sát ochratoxin trong chuỗi cung ứng nông sản:

   • Thực hiện kiểm tra định kỳ tại các vùng sản xuất và thị trường tiêu thụ, đặc biệt trong mùa thu hoạch và bảo quản.
   • Mục tiêu giảm tỷ lệ mẫu vượt MRL xuống dưới 1% trong vòng 2 năm.

4. Nâng cao nhận thức người sản xuất và tiêu dùng về nguy cơ ochratoxin:

   • Tổ chức các chương trình đào tạo, truyền thông về cách bảo quản nông sản đúng cách để hạn chế nấm mốc phát triển.
   • Khuyến khích người tiêu dùng lựa chọn sản phẩm có kiểm định an toàn.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm:

   • Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng tiêu chuẩn, quy định về mức dư lượng ochratoxin trong thực phẩm, nâng cao hiệu quả kiểm soát.

2. Phòng kiểm nghiệm và các nhà khoa học trong lĩnh vực hóa phân tích:

   • Áp dụng phương pháp LC-MS/MS tối ưu để phân tích ochratoxin và các mycotoxin khác trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

3. Doanh nghiệp sản xuất, chế biến nông sản và thực phẩm:

   • Tham khảo quy trình xử lý mẫu và kỹ thuật phân tích để kiểm soát chất lượng sản phẩm, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

4. Người tiêu dùng và tổ chức bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng:

   • Nắm bắt thông tin về nguy cơ ochratoxin trong thực phẩm, từ đó lựa chọn sản phẩm an toàn và có trách nhiệm trong việc giám sát chất lượng.

Câu hỏi thường gặp

1. Ochratoxin là gì và tại sao nó nguy hiểm?
   Ochratoxin là độc tố do nấm mốc Aspergillus và Penicillium sinh ra, có khả năng gây tổn thương gan, thận và hệ miễn dịch, đồng thời có tiềm năng gây ung thư khi tích lũy lâu dài trong cơ thể.

2. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các phương pháp khác?
   LC-MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc cao, cho phép phát hiện ochratoxin ở nồng độ rất thấp, giảm thiểu sai số do nền mẫu phức tạp, đồng thời phân tích nhanh và định lượng chính xác.

3. Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của ochratoxin trong thực phẩm là bao nhiêu?
   Ở Việt Nam, MRL cho ochratoxin A trong ngũ cốc chưa qua chế biến là 5 µg/kg, trong rượu vang là 2 µg/kg, và thực phẩm dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi là 0,5 µg/kg.

4. Làm thế nào để giảm nguy cơ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm?
   Bảo quản nông sản ở điều kiện khô ráo, thoáng mát, tránh ẩm ướt; kiểm soát quá trình thu hoạch và chế biến; sử dụng các biện pháp kiểm nghiệm định kỳ để phát hiện sớm.

5. Phương pháp xử lý mẫu nào cho hiệu suất thu hồi cao nhất?
   Quy trình chiết mẫu bằng chloroform kết hợp chiết pha rắn trên cột C18 với chiết lặp 2 lần mỗi lần 15 ml dung môi và rửa giải bằng 2 ml MeOH-acid acetic (99,5:0,5) cho hiệu suất thu hồi ochratoxin A đạt khoảng 84%.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công phương pháp xác định ochratoxin A và B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) với độ nhạy cao và độ chính xác tốt.
• Quy trình xử lý mẫu tối ưu sử dụng chiết chloroform kết hợp chiết pha rắn C18, chiết lặp 2 lần, rửa giải bằng MeOH-acid acetic.
• Phương pháp cho phép phát hiện ochratoxin ở mức vết, đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm soát chất lượng.
• Kết quả phân tích mẫu thực tế cho thấy nguy cơ nhiễm ochratoxin trong ngũ cốc tại Việt Nam là hiện hữu, cần tăng cường giám sát và kiểm soát.
• Đề nghị các cơ quan quản lý, phòng kiểm nghiệm và doanh nghiệp phối hợp triển khai áp dụng phương pháp, đồng thời nâng cao nhận thức cộng đồng về an toàn thực phẩm.

Hành động tiếp theo: Triển khai đào tạo kỹ thuật viên, hoàn thiện quy trình chuẩn, mở rộng khảo sát mẫu trên phạm vi toàn quốc và cập nhật dữ liệu giám sát thường xuyên để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.