CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN Tông quan Luận văn thạc sĩ 1. Tong quan về nhân tố kích thích dòng tế bao bạch cầu hat G-CSF 1. Giới thiệu hG-CSF (human Granulocyte Colony-Stimulating Factor) là một cytokine có ban chất là glycoprotein, bao gồm 174 amino axit, đóng vai trò quan trọng trong phát sinh tế bào máu, biệt hóa các tiền tế bào máu và hoạt hóa các tế bào bạch cầu hạt trung tính trưởng thành. G-CSF được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh giảm bach cầu do hóa tri.
G-CSF của chuột lần đầu tiên được nhận diện và tinh chế tại c vào năm 1983. Năm 1986, Nigata và cộng sự đã sử dụng mẫu dò oligonucleotide để thu nhận cDNA băng lai Southern Blot và sử dụng cDNA này làm khuôn dé dòng hóa và biểu hiện G-CSF, báo cáo nay đã mở ra thời ky sản xuất hG-CSF tái tổ hop với số lượng lớn. Có hai trình tự amino axit của G-CSF, một trình tự bao gồm 174 amino axit và một trình tự bao gồm 177 amino axit. Sự khác nhau cua hai trình tự này là do quá trình cắt bỏ các đoạn intron, một mRNA cắt bỏ còn 174 amino axit và một mRNA cắt bỏ còn 177 amino axit.
Nhiều nghiên cứu cho thấy phân tử G-CSF có trình tự bao gồm 177 amino axit có hoạt tính thấp hơn nhiều so với G-CSE có trình tự bao gồm 174 amino axit. Nguén gốc G-CSF cũng như các nhân tố tăng trưởng khác, được sản xuất ở nhiều loại mô và tế bào khác nhau trong cơ thể như nguyên bào sợi, đại thực bào, những tế bào nội mô và các té bào nền tủy xương qua trung gian là các cytokine (interleukine-l, interleukine-6) và các nhân tố TNFa qua con đường tín hiệu thứ 2. Tuy nhiên, các mô thông thường chỉ sản xuất G-CSF khi bị kích thích. [3] Sau khi G-CSF được tạo ra, chúng lập tức làm nhiệm vụ biệt hóa những tế bào gốc trong tủy xương thành tế bao bạch cầu hạt trung tính trưởng thành và đồng thời kích thích đưa chúng vào hệ máu ngoại vi để thực hiện nhiệm vụ của chúng.
[4] Ở điều kiện bình thường. nồng độ G-CSF trong huyết thanh của người ở mức không phát hiện được hoặc ở mức rất thấp (ít hon 100pg/ml). Tuy nhiên trong các đáp ứng Tông quan Luận văn thạc sĩ đối với sự xâm nhiễm, nông độ G-CSF tăng cao và có thể đạt đến 2000pg/ml, và chỉ hạ xuống mức bình thường sau khi phục hồi. [5] Tông quan Luận văn thạc sĩ Gan C Tủy xương Erythropoietin Thrombopoietin Erythropoietin Thrombopoietin Thrombopoietin Nguyên bào agi , Hinh 1.1: Cac té bao san sinh G-CSF [3] 1.
Vi tri hinh thai Gen mã hoá cho G-CSF của người tỒn tại ở dạng đơn bản sao, định vi ở vùng ql 1- 22 thuộc nhiễm sắc thé 17, dài khoảng 2,5Kb, bao gồm 5 exon và 4 intron. Trong đó, vùng 300bp ở đầu 5 của vị trí khởi sự phiên mã đóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện của gen g-csƒ. Đoạn trình tự giàu AU trong vùng 3 không mã hóa là vị trí cốt yếu làm mất tính 6n định của phân tử MRNA của G-CSF, ảnh hưởng đến sự biểu hiện ở mức độ phiên mã và hậu phiên mã. mRNA của G-CSF sau khi hình thành trải qua quá trình chế biến từ đó dịch mã thành 2 chuỗi polypeptide khác nhau từ Tông quan Luận văn thạc sĩ cùng một gen cau trúc.
Những mRNA nay mã hóa cho hai protein tiền chất lần lượt dài 204 và 207 amino acid. Đầu N của chúng có chứa trình tự leader ưa nước dài 30 amino acid đặc trưng ở các protein tiết, khi bị cắt sẽ tạo nên hai phân tử protein trưởng thành với 174 va 177 amino acid. Phân tử G-CSF dài 174 amino acid là phân tử chiếm ứu thế và có hoạt tính mạnh hơn so với phân tử 177 amino acid. [6] Nhiễm sắc thê 17 1;ag11-22 Gen tee i al —n nv —ti——— —| L 2,5kb 1 hG-CSF RNA 7 ae Vùng 3' khong nhiên ma Hình 1.2: Cau trúc gen g-csf, MRNAG-CSF và protein G-CSF [6] 1.
Cau tric hG-CSF trưởng thành có 174 amino axit, nặng 18.7 kDa, có 5 gốc cystein: Cys17, Cys36, Cys42, Cys64, Cys74 tạo thành 2 cau nối disulfide Cys36-Cys42, Cys64- Cys74 và 1 cystein tự do ở vi trí Cys[l7. hG-CSF tự nhiên không có vi trí N- glycosyl nhưng có một vị trí O-glycosyl hóa tại vi trí Thr133 nhằm bảo vệ hG-CSF khỏi sự kết tủa ở pH trung tính và đảm bảo tính 6n định cho hG-CSF, nhưng nó không can thiết cho hoạt tính sinh học. hG-CSF tái tổ hợp trong E. coli được tổ chức thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ chứng minh răng chúng có thể được sử dụng như một lọai thuốc trong điều trị bệnh giảm bạch cầu cấp.
Tông quan Luận văn thạc sĩ Docs ISEREVAL (ao) 60 EQOQOOBOOOGGOSHOOGSGOOSGHEOEY “G9690 110 2 130 POOOOSCTOTSSSOCOSSOST OSE SSO mara! SOOOSOOODOOOCOOCOO 160 170 Hình 1.3: Trinh tự amino acid cua protein G-CSF [2| Trong cau trúc không gian 3 chiều, G-CSF là một bó 4 xoắn ơ nam đối song với nhau, 4 xoăn được đánh kí hiệu từ A-D bắt đầu từ đầu N. Ngoài bốn xoắn chính, cầu trúc G-CSF còn có thêm một xoăn phụ E nhỏ hơn nối xoăn A và xoắn B. Hai cầu nối disulfide Cys36 — Cys42 và Cys64 — Cys74 năm đối diện nhau trong vòng nôi giữa xoăn A và xoăn B.4: Cau trúc protein G-CSF [2| A. Mô hình cấu trúc phắng B.
Cấu trúc không gian Hoạt tính sinh học của G-CSF được quyết định bởi tính toàn vẹn cau trúc của phân tử. Sự phá vỡ một hoặc cả hai cầu nối disulfide làm mất cấu trúc gap cuộn vi thé làm giảm hoạt tinh G-CSF một cách đáng kể. Tương tự, các đột biến mat đoạn hay lặp lại các đoạn nhỏ trong cấu trúc protein nằm trong vùng amino acid 18 đến đầu C (từ amino acid 165 đến 174) làm biến đổi căn bản cấu trúc bậc 4 đều dẫn đến mat Tông quan Luận văn thạc sĩ hoạt tính G-CSF. Ngược lại, khi loại bỏ 11 amino acid đầu tiên không làm ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học.
Đột biến ở Cys17 thành Ser17 đã được chứng minh là tăng hoạt tính sinh học và làm ôn định cau trúc protein. Các đột biến điểm tại Leu35 va Glu46 cũng làm mat chức năng cua G-CSF. Tam quan trọng cua vung lân cận hai bên những axit amin nay cũng đã được nghiên cứu. Kháng thể trung hoà G-CSF gắn với G-CSF tại vùng axit amin 20 — 46 bao gồm đầu C của xoăn A và phần vòng nối AB chứa cầu nối disulfide đầu tiên và phần xoăn phụ.
Vung 20 — 46 này cùng với vung 165 — 174 được xem là vùng tạo nên vi trí gan với thụ thé của G-CSF. Các đột biến tại Leu35 và Glu46 sẽ làm mat chức năng của G-CSF, tam quan trọng của vùng lân cận hai bên các amino acid này cũng đã được làm rõ. Người ta nhận thay dang G-CSF 177 amino acid chứa thêm ba amino acid nam giữa Leu35 va Cys36 đã làm giảm đáng kế hoạt tinh sinh học của nó. Các kháng thé của G-CSF gan voi G-CSF tại vùng amino acid 20-46.
Cau trúc không gian của vùng amino acid 20-46 bao gồm dau C của xoăn A và phan vòng nối AB (loop AB) chứa cầu nối disulfide đầu tiên và phần xoắn phụ E. Vùng 20-46 cùng với vùng 165-174 được chứng minh là tạo nên vi trí gan với thu thé của G-CSF. Chức nang sinh học 1. Cảm ứng sự tăng sinh Cảm ứng sự tăng sinh là một hoạt tính đặc trưng cua G-CSF.
Khi thử nghiệm nuôi cây không phân đoạn các tế bao tủy người và chuột trên môi trường nuôi cay có bồ sung G-CSF, kết quả cho thấy G-CSF kích thích hình thành lượng nhỏ các dòng bach cau hạt trung tính. Các nha nghiên cứu cho rang G-CSF đã kích thích sự tăng sinh của các tế bao băng cách chuyển các tế bào ở giai đoạn nghỉ (giai đoạn Go) vào chu trình tế bào dé tiếp tục quá trình phân chia. Tuy nhiên, khả năng cảm ứng tăng sinh của G-CSF không giới hạn trong phạm vi tiền bạch cầu hạt trung tính. Các nghiên cứu in vitro đã cho thay G-CSF còn có hoạt tính tăng sinh các tiền bào của Tông quan Luận văn thạc sĩ các dòng tế bao máu khác.
Đối với những dòng tế bao này, dường như G-CSF hoạt động trong một mô hình kết hợp với các nhân tổ tăng trưởng khác để thúc day sự tăng sinh của các tế bào tiền khởi. Kích hoạt sự biệt hóa Sau vài lần kích thích phân chia tăng sinh, G-CSF kích hoạt sự biệt hóa các tế bào tiền khởi tạo nên các dạng tế bào bạch cầu hạt trung tính. Với hoạt tính này cùng với khả năng kích thích sự tăng sinh, G-CSF đóng một vai trò quan trọng trong sự duy trì ôn định lượng bạch cầu hạt trung tính trong máu, cũng như điều hòa sự tạo thành bach cầu hạt trung tinh trong các trường hợp khẩn cấp. Thực nghiệm đã chứng minh, khi thiếu G-CSF sẽ dẫn tới sự suy giảm của tế bào bạch cau hạt trung tính trong máu xuống 20% so với bình thường, trong các trường hợp khan cấp như các đáp ứng đối với sự nhiễm trùng hay đáp ứng miễn dịch, lượng G-CSF tăng lên rất nhiều và nhanh chóng (hình 1.
G-CSF cũng có vai trò đôi với sự biệt hoa của các tê bào tạo máu khác. Tuy nhiên, sự có mặt của G-CSF là chưa đủ cho sự biệt hóa các dòng tê bào này mà cân có sự kết hợp với các nhân tô khác. Trong khi đôi với dòng tê bao bạch cau hạt chỉ riêng G-CSF là đủ cho sự tăng sinh và biệt hoá. [8] Tông quan Luận văn thạc sĩ | Tiểu cầu q @ Bạch cầu đơn nhân \NA ¿- 3 } Té bao B i Hong cau Bach cầu trung tinh, Té bào giết tự nhiên ưa axit, ưa kiềm Hình 1.5: Vai trò của G-CSF trong việc hình thành tế bào máu [8] 1.
Các tác dụng khác trên tế bào bạch câu hạt trung tính đã trưởng thành Trong điều kiện in vitro, sự có mặt của G-CSF tăng cường thời gian sống sót của các bạch cầu hạt trung tính. Các dữ liệu thực nghiệm cho thay G-CSF đóng vai trò như là một nhân tố chống lai sự phân huỷ tế bào theo chu trình chết của tế bao dẫn đến việc tăng khả năng sống sót của các bạch cầu hạt trung tính cũng như các tiền bào ở tuỷ xương. Một loạt các chức năng của bạch cầu hạt trung tính cũng được tăng cường bởi G-CSF. Đặc biệt, G-CSF làm tăng các quá trình chế biến trong tế bào liên quan đến việc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của các vi sinh vật, bang cách làm cho các tế bào bạch cầu hat trung tinh trở nên phản ứng nhanh đối với nhiều tác nhân kích thích.