I. Luận Văn Thạc Sĩ Tổng Quan Biểu Hiện Protein G CSF 58 ký tự
Luận văn thạc sĩ này tập trung vào nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp G-CSF trên E. coli và quy trình tinh sạch protein. G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor) là một cytokine quan trọng, kích thích tủy xương sản xuất bạch cầu hạt. Nhu cầu G-CSF ngày càng tăng, đặc biệt trong điều trị giảm bạch cầu ở bệnh nhân ung thư đang hóa trị. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất G-CSF hiệu quả, giá thành hợp lý là rất cần thiết. Nghiên cứu này hướng đến mục tiêu xây dựng quy trình biểu hiện và tinh sạch protein G-CSF tái tổ hợp hiệu quả, góp phần vào việc sản xuất thuốc giá rẻ, phục vụ bệnh nhân Việt Nam. Công trình được hoàn thành tại công ty TNHH CNSH Dược Nanogen.
1.1. Tổng Quan về Nhân Tố Kích Thích Dòng Tế Bào G CSF
G-CSF là một glycoprotein, có 174 amino axit, quan trọng trong sinh tế bào máu, biệt hóa tế bào máu và hoạt hóa tế bào bạch cầu hạt. G-CSF được dùng để điều trị giảm bạch cầu do hóa trị. Năm 1983, G-CSF ở chuột được nhận diện và tinh chế. Năm 1986, Nigata và cộng sự đã dùng mẫu dò oligonucleotide để thu nhận cDNA bằng lai Southern Blot, và dòng hóa, biểu hiện G-CSF. Nghiên cứu này mở ra thời kỳ sản xuất hG-CSF tái tổ hợp với số lượng lớn. Có hai trình tự amino axit của G-CSF, một trình tự có 174 amino axit và một trình tự có 177 amino axit. Nhiều nghiên cứu cho thấy phân tử G-CSF có trình tự 177 amino axit có hoạt tính thấp hơn nhiều so với G-CSF có trình tự 174 amino axit. G-CSF, cũng như các nhân tố tăng trưởng khác, được sản xuất ở nhiều loại mô và tế bào khác nhau như nguyên bào sợi, đại thực bào, những tế bào nội mô và các tế bào nền tủy xương qua trung gian là các cytokine (interleukine-l, interleukine-6) và các nhân tố TNFa qua con đường tín hiệu thứ 2.
1.2. Tầm Quan Trọng của G CSF Trong Y Học Hiện Đại
Trong điều kiện bình thường, nồng độ G-CSF trong huyết thanh người ở mức không phát hiện được hoặc rất thấp. Tuy nhiên, trong các đáp ứng đối với sự xâm nhiễm, nồng độ G-CSF tăng cao. Sau khi G-CSF được tạo ra, chúng biệt hóa những tế bào gốc trong tủy xương thành tế bào bạch cầu hạt trung tính trưởng thành và đồng thời kích thích đưa chúng vào hệ máu ngoại vi. Gen mã hóa cho G-CSF của người tồn tại ở dạng đơn bản sao, định vị ở vùng ql 1- 22 thuộc nhiễm sắc thể 17, dài khoảng 2,5Kb, bao gồm 5 exon và 4 intron. Trong đó, vùng 300bp ở đầu 5’ của vị trí khởi sự phiên mã đóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện của gen g-csƒ. Đoạn trình tự giàu AU trong vùng 3’ không mã hóa là vị trí cốt yếu làm mất tính ổn định của phân tử mRNA của G-CSF, ảnh hưởng đến sự biểu hiện ở mức độ phiên mã và hậu phiên mã. mRNA của G-CSF sau khi hình thành trải qua quá trình chế biến từ đó dịch mã thành 2 chuỗi polypeptide khác nhau từ cùng một gen cấu trúc.
II. Thách Thức Sản Xuất Protein G CSF Giá Rẻ Tại Việt Nam 60 ký tự
Hóa trị liệu ung thư là một trong những phương pháp điều trị ung thư chủ yếu ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng G-CSF để giảm thiểu các rủi ro gây ra do neutropenia trong quá trình điều trị là rất lớn. Sản phẩm G-CSF thương mại có mặt ở Việt Nam là Neupogen® do công ty Amgen sản xuất và được nhập chủ yếu từ hãng Hoffmann — La Roche. Chi phí điều trị là một mối lo hàng đầu của các bệnh nhân ung thư. Do đó việc sản xuất G-CSF giá thành rẻ là điều rất cần thiết ở Việt Nam. Trong định hướng sản xuất G-CSF với giá thành rẻ phục vụ cho bệnh nhân mắc bệnh neutropenia trong quá trình hóa trị ung thư, phòng nghiên cứu phát triển thuộc công ty trách nhiệm hữu hạn công nghệ sinh học dược Nanogen đã thực hiện các nghiên cứu tạo dòng tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp G-CSF phục vụ cho việc phát triển công nghệ sản xuất G-CSF làm thuốc.
2.1. Tổng Quan Tình Hình Sản Xuất G CSF Trên Thế Giới
Ở Việt Nam, tình hình ung thư đang ngày càng có xu hướng tăng cao, các bệnh nhân ung thư cần điều trị cũng ngày càng gia tăng. Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư máu trên 100.000 dân vào năm 2001-2004 được thống kê như sau: tại Hà Nội ghi nhận được 66 ca (30,8%), Hải Phòng 12 ca bằng số ca với u lympho ác tính (15,4%), Thái Nguyên 26 ca (46,4%), Thừa Thiên Huế 24 ca (30,1%), Cần Thơ 34 ca (30,9%). Hóa trị liệu ung thư hiện vẫn là một trong những phương pháp điều trị ung thư chủ yếu ở Việt Nam, do đó nhu cầu sử dụng G-CSF để giảm thiểu các rủi ro gây ra do neutropenia trong quá trình điều trị là rất lớn. Sản phẩm G-CSF thương mại có mặt ở Việt Nam là Neupogen® do công ty Amgen sản xuất và được nhập chủ yếu từ hãng Hoffmann — La Roche.
2.2. Nhu Cầu Sản Xuất G CSF Tái Tổ Hợp Tại Việt Nam
Ở bệnh nhân điều trị bằng phương pháp hóa trị bị mắc neutropenia, liều Neupogen được chỉ định dùng là 0. tiêm một lần trong ngày. Với một bệnh nhân 60kg. lượng thuốc cần dùng là 1 lọ Neupogen 30MUI (300mcg hay 0,3mg). Với giá thành một lọ tiêm 300mcg/ml Neupogen là 1.000 VND, điều trị trong 2 tuần với trường hợp bệnh nhân hóa trị ung thư không liên quan đến tủy. Như vậy thì chi phí điều trị là một mối lo hàng đầu của các bệnh nhân ung thư. Do đó việc sản xuất G-CSF giá thành rẻ là điều rất cần thiết ở Việt Nam. Trong định hướng sản xuất G-CSF với giá thành rẻ phục vụ cho bệnh nhân mắc bệnh neutropenia trong quá trình hóa trị ung thư, phòng nghiên cứu phát triển thuộc công ty trách nhiệm hữu hạn công nghệ sinh học dược Nanogen đã thực hiện các nghiên cứu tạo dòng tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp G-CSF phục vụ cho việc phát triển công nghệ sản xuất G-CSF làm thuốc.
III. Cách Tạo Dòng Biểu Hiện Protein Ngoại Lai Trong E
Để sản xuất protein tái tổ hợp G-CSF hiệu quả, việc tạo dòng và biểu hiện protein ngoại lai trong E. coli đóng vai trò then chốt. Nghiên cứu này sử dụng E. coli làm hệ thống biểu hiện, vì đây là một hệ thống phổ biến, dễ sử dụng và có chi phí thấp. Việc lựa chọn vector biểu hiện và chủng E. coli phù hợp, cùng với việc tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện, sẽ ảnh hưởng lớn đến hiệu quả biểu hiện và chất lượng protein tái tổ hợp thu được.
3.1. Tổng Quan Về Tạo Dòng Gen hg csf Vào Vector pET 26b
Trong giới hạn của luận văn này, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát biểu hiện protein tái tổ hợp G-CSF người trên E. Coli và nghiên cứu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF” với các nội dung như sau: Dòng hóa gen hg-csf mã hóa cho protein G-CSF của người vào vectơ biểu hiện pET26b(+) và tiến hành biểu hiện trên E.Coli Khảo sát điều kiện biểu hiện protein G-CSF xoanh quanh các nội dung: thời điểm biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng, lượng glucose bổ sung, số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng, thời gian cảm ứng. Lên men 5 lít để thu nhận G-CSF Tinh sạch protein G-CSF từ dịch tách chiết của 5 lít lên men. Kiểm tra độ tinh sạch bằng hệ thống HPLC.
3.2. Hệ Thống Vector Biểu Hiện pET 26b Chủng BL21 DE3
Hệ thống vector biểu hiện pET-26b(+) được sử dụng trong nghiên cứu này. Chủng BL21(DE3) là chủng biểu hiện được lựa chọn. Dựa vào đường cong sinh trưởng, khảo sát thời điểm biểu hiện IPTG cho kết quả biểu hiện cao nhất (Thí nghiệm 1) . Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2) . Khảo sát lượng glucose bổ sung trong quá trình nuôi cấy . Khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng . Khảo sát thời gian cảm ứng. Lên men thu nhận G-CSF quy mô 5 lít để tiến hành nghiên cứu quá trình tinh sạch.
IV. Phương Pháp Tối Ưu Hóa Biểu Hiện Protein G CSF Trên E
Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các điều kiện biểu hiện protein G-CSF trên E. coli, bao gồm thời điểm biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), lượng glucose bổ sung, số vòng lắc, nhiệt độ, và thời gian biểu hiện. Việc tối ưu hóa các điều kiện này giúp tăng hiệu quả biểu hiện protein và giảm thiểu các vấn đề liên quan đến sự không ổn định của protein.
4.1. Khảo Sát Ảnh Hưởng của Nồng Độ IPTG và Glucose
Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2). Khảo sát lượng glucose bổ sung trong quá trình nuôi cấy. Bảng 3. 3: Kết quả ELISA theo nồng độ glucose. Kết quả khảo sát nồng độ glucose bổ sung vào môi trường LB trước khi 601i. Khảo sát lượng glucose bổ sung trong quá trình nuôi cấy . Khao sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng .
4.2. Ảnh Hưởng của Thời Gian Nuôi Cấy và Nhiệt Độ
Khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng . Kết quả khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ cảm ứng. Khảo sát thời gian cảm ứng. Bang 3. 5: Kết quả ELISA theo thời gian cảm ứng. Lên men thu nhận G-CSF quy mô 5 lít để tiến hành nghiên cứu quá trình tinh sạch.
V. Quy Trình Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp G CSF Hiệu Quả 58 ký tự
Sau khi biểu hiện thành công protein G-CSF trong E. coli, bước tiếp theo là tinh sạch protein để loại bỏ các tạp chất và thu được protein có độ tinh khiết cao. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng một quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF hiệu quả, sử dụng các phương pháp như sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và sắc ký gel lọc.
5.1. Các Bước Cơ Bản Trong Tinh Sạch Protein G CSF
Tách chiết G-CSF. Tinh sạch G-CSIE. Quá trình tinh sạch protein G-CSF từ thể vùi của tế bào E.Coli có độ tinh sạch > 95% và protein tổng số thu được > Img/ml ở pH 3,5 — 4,0. Trọng lượng phân tử của protein G-CSF sau khi tinh sạch nằm trong khoảng 18 — 20 KDa, không có lẫn DNA của tế bào chủ, không có edotoxin và có hoạt tính sinh học.
5.2. Đánh Giá Độ Tinh Khiết và Hoạt Tính Sinh Học
Kiểm tra độ tinh sạch bằng hệ thống HPLC. Hình 3.16: Pho chạy kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế G-CSF bằng HPLC . protein tổng số thu được > Img/ml ở pH 3,5 — 4,0. Trọng lượng phân tử của protein G-CSF sau khi tinh sạch nằm trong khoảng 18 — 20 KDa, không có lẫn DNA của tế bào chủ, không có edotoxin và có hoạt tính sinh học.
VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Luận Văn Thạc Sĩ G CSF 57 ký tự
Luận văn này đã thành công trong việc xây dựng quy trình biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF trên E. coli. Kết quả nghiên cứu là cơ sở quan trọng cho việc phát triển quy trình sản xuất G-CSF quy mô lớn, phục vụ nhu cầu điều trị bệnh giảm bạch cầu tại Việt Nam. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình lên men và tinh sạch để tăng hiệu suất và giảm chi phí sản xuất.
6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Đạt Được
Dòng hóa gen hg-csf mã hóa cho protein G-CSF của người vào vectơ biểu hiện pET26b(+) và tiến hành biểu hiện trên E.Coli. protein tổng số thu được > Img/ml ở pH 3,5 — 4,0. Trọng lượng phân tử của protein G-CSF sau khi tinh sạch nằm trong khoảng 18 — 20 KDa, không có lẫn DNA của tế bào chủ, không có edotoxin và có hoạt tính sinh học.
6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo
Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình lên men và tinh sạch để tăng hiệu suất và giảm chi phí sản xuất. Nghiên cứu chuyên sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp G-CSF sau tinh sạch bằng phương pháp CD. Nghiên cứu độ ổn định của protein tái tổ hợp G-CSF trong các điều kiện bảo quản khác nhau.
