Luận văn thạc sĩ: Khảo sát biểu hiện protein tái tổ hợp G-CSF trên E. coli và nghiên cứu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF

• Tác giả: Đặng Thị Tuyết An
• Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Biểu Hiện Protein Tái Tổ Hợp G-CSF Trên E.Coli Và Nghiên Cứu Quy Trình Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp G-CSF
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
• 1. CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về nhân tố kích thích dòng tế bào bạch cầu hạt G-CSF
• 1.2. Vị trí hình thái. Chức năng sinh học. Cảm ứng sự tăng sinh. Kích hoạt sự diệt hóa. Các tác dụng khác trên tế bào bạch cầu hạt trung tính đã trưởng thành
• 1.3. Tác dụng của G-CSF bên ngoài hệ thống tế bào máu
• 1.4. G-CSF trong cấy ghép tế bào/mô/cơ quan
• 1.5. G-CSF trong điều trị bệnh Neutropenia (bệnh giảm bạch cầu trung tính)
• 1.6. Tình hình sản xuất hG-CSF trên thế giới và nhu cầu ở Việt Nam
• 1.7. Tổng quan về tạo dòng và biểu hiện protein ngoại lai trong E. coli
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3. Phương pháp
• 2.4. Sơ đồ nghiên cứu chung
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Tạo dòng gen hg-csf vào vector pET-26b(+)
• 3.2. Dựng đường cong sinh trưởng của chủng biểu hiện BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET26b(+)-hg-csf
• 3.3. Khảo sát sự biểu hiện protein hG-CSF
• 3.3.1. Dựa vào đường cong sinh trưởng, khảo sát thời điểm biểu hiện IPTG cho kết quả biểu hiện cao nhất (Thí nghiệm 1)
• 3.3.2. Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2)
• 3.3.3. Khảo sát lượng glucose bổ sung trong quá trình nuôi cấy
• 3.3.4. Khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng
• 3.3.5. Khảo sát thời gian cảm ứng
• 3.4. Lên men thu nhận G-CSF quy mô 5 lít để tiến hành nghiên cứu quá trình tinh sạch
• 3.5. Tinh sạch protein hG-CSF
• 3.6. Tách chiết G-CSF
• 3.7. Tinh sạch G-CSF
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
• DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ PHỤ LỤC
• PHỤ LỤC 1: Số liệu thô của đường cong sinh trưởng
• PHỤ LỤC 2: Kết quả so sánh giải trình tự gen sau khi dòng hóa vào vector pET26b(+) và trình tự gen ban đầu
• PHỤ LỤC 3: Kết quả giải trình tự
• PHỤ LỤC 4: Phổ đồ HPLC

I. Luận Văn Thạc Sĩ Tổng Quan Biểu Hiện Protein G CSF 58 ký tự

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp G-CSF trên E. coli và quy trình tinh sạch protein. G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor) là một cytokine quan trọng, kích thích tủy xương sản xuất bạch cầu hạt. Nhu cầu G-CSF ngày càng tăng, đặc biệt trong điều trị giảm bạch cầu ở bệnh nhân ung thư đang hóa trị. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất G-CSF hiệu quả, giá thành hợp lý là rất cần thiết. Nghiên cứu này hướng đến mục tiêu xây dựng quy trình biểu hiện và tinh sạch protein G-CSF tái tổ hợp hiệu quả, góp phần vào việc sản xuất thuốc giá rẻ, phục vụ bệnh nhân Việt Nam. Công trình được hoàn thành tại công ty TNHH CNSH Dược Nanogen.

1.1. Tổng Quan về Nhân Tố Kích Thích Dòng Tế Bào G CSF

G-CSF là một glycoprotein, có 174 amino axit, quan trọng trong sinh tế bào máu, biệt hóa tế bào máu và hoạt hóa tế bào bạch cầu hạt. G-CSF được dùng để điều trị giảm bạch cầu do hóa trị. Năm 1983, G-CSF ở chuột được nhận diện và tinh chế. Năm 1986, Nigata và cộng sự đã dùng mẫu dò oligonucleotide để thu nhận cDNA bằng lai Southern Blot, và dòng hóa, biểu hiện G-CSF. Nghiên cứu này mở ra thời kỳ sản xuất hG-CSF tái tổ hợp với số lượng lớn. Có hai trình tự amino axit của G-CSF, một trình tự có 174 amino axit và một trình tự có 177 amino axit. Nhiều nghiên cứu cho thấy phân tử G-CSF có trình tự 177 amino axit có hoạt tính thấp hơn nhiều so với G-CSF có trình tự 174 amino axit. G-CSF, cũng như các nhân tố tăng trưởng khác, được sản xuất ở nhiều loại mô và tế bào khác nhau như nguyên bào sợi, đại thực bào, những tế bào nội mô và các tế bào nền tủy xương qua trung gian là các cytokine (interleukine-l, interleukine-6) và các nhân tố TNFa qua con đường tín hiệu thứ 2.

1.2. Tầm Quan Trọng của G CSF Trong Y Học Hiện Đại

Trong điều kiện bình thường, nồng độ G-CSF trong huyết thanh người ở mức không phát hiện được hoặc rất thấp. Tuy nhiên, trong các đáp ứng đối với sự xâm nhiễm, nồng độ G-CSF tăng cao. Sau khi G-CSF được tạo ra, chúng biệt hóa những tế bào gốc trong tủy xương thành tế bào bạch cầu hạt trung tính trưởng thành và đồng thời kích thích đưa chúng vào hệ máu ngoại vi. Gen mã hóa cho G-CSF của người tồn tại ở dạng đơn bản sao, định vị ở vùng ql 1- 22 thuộc nhiễm sắc thể 17, dài khoảng 2,5Kb, bao gồm 5 exon và 4 intron. Trong đó, vùng 300bp ở đầu 5’ của vị trí khởi sự phiên mã đóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện của gen g-csƒ. Đoạn trình tự giàu AU trong vùng 3’ không mã hóa là vị trí cốt yếu làm mất tính ổn định của phân tử mRNA của G-CSF, ảnh hưởng đến sự biểu hiện ở mức độ phiên mã và hậu phiên mã. mRNA của G-CSF sau khi hình thành trải qua quá trình chế biến từ đó dịch mã thành 2 chuỗi polypeptide khác nhau từ cùng một gen cấu trúc.

II. Thách Thức Sản Xuất Protein G CSF Giá Rẻ Tại Việt Nam 60 ký tự

Hóa trị liệu ung thư là một trong những phương pháp điều trị ung thư chủ yếu ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng G-CSF để giảm thiểu các rủi ro gây ra do neutropenia trong quá trình điều trị là rất lớn. Sản phẩm G-CSF thương mại có mặt ở Việt Nam là Neupogen® do công ty Amgen sản xuất và được nhập chủ yếu từ hãng Hoffmann — La Roche. Chi phí điều trị là một mối lo hàng đầu của các bệnh nhân ung thư. Do đó việc sản xuất G-CSF giá thành rẻ là điều rất cần thiết ở Việt Nam. Trong định hướng sản xuất G-CSF với giá thành rẻ phục vụ cho bệnh nhân mắc bệnh neutropenia trong quá trình hóa trị ung thư, phòng nghiên cứu phát triển thuộc công ty trách nhiệm hữu hạn công nghệ sinh học dược Nanogen đã thực hiện các nghiên cứu tạo dòng tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp G-CSF phục vụ cho việc phát triển công nghệ sản xuất G-CSF làm thuốc.

2.1. Tổng Quan Tình Hình Sản Xuất G CSF Trên Thế Giới

Ở Việt Nam, tình hình ung thư đang ngày càng có xu hướng tăng cao, các bệnh nhân ung thư cần điều trị cũng ngày càng gia tăng. Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư máu trên 100.000 dân vào năm 2001-2004 được thống kê như sau: tại Hà Nội ghi nhận được 66 ca (30,8%), Hải Phòng 12 ca bằng số ca với u lympho ác tính (15,4%), Thái Nguyên 26 ca (46,4%), Thừa Thiên Huế 24 ca (30,1%), Cần Thơ 34 ca (30,9%). Hóa trị liệu ung thư hiện vẫn là một trong những phương pháp điều trị ung thư chủ yếu ở Việt Nam, do đó nhu cầu sử dụng G-CSF để giảm thiểu các rủi ro gây ra do neutropenia trong quá trình điều trị là rất lớn. Sản phẩm G-CSF thương mại có mặt ở Việt Nam là Neupogen® do công ty Amgen sản xuất và được nhập chủ yếu từ hãng Hoffmann — La Roche.

2.2. Nhu Cầu Sản Xuất G CSF Tái Tổ Hợp Tại Việt Nam

Ở bệnh nhân điều trị bằng phương pháp hóa trị bị mắc neutropenia, liều Neupogen được chỉ định dùng là 0. tiêm một lần trong ngày. Với một bệnh nhân 60kg. lượng thuốc cần dùng là 1 lọ Neupogen 30MUI (300mcg hay 0,3mg). Với giá thành một lọ tiêm 300mcg/ml Neupogen là 1.000 VND, điều trị trong 2 tuần với trường hợp bệnh nhân hóa trị ung thư không liên quan đến tủy. Như vậy thì chi phí điều trị là một mối lo hàng đầu của các bệnh nhân ung thư. Do đó việc sản xuất G-CSF giá thành rẻ là điều rất cần thiết ở Việt Nam. Trong định hướng sản xuất G-CSF với giá thành rẻ phục vụ cho bệnh nhân mắc bệnh neutropenia trong quá trình hóa trị ung thư, phòng nghiên cứu phát triển thuộc công ty trách nhiệm hữu hạn công nghệ sinh học dược Nanogen đã thực hiện các nghiên cứu tạo dòng tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp G-CSF phục vụ cho việc phát triển công nghệ sản xuất G-CSF làm thuốc.

III. Cách Tạo Dòng Biểu Hiện Protein Ngoại Lai Trong E

Để sản xuất protein tái tổ hợp G-CSF hiệu quả, việc tạo dòng và biểu hiện protein ngoại lai trong E. coli đóng vai trò then chốt. Nghiên cứu này sử dụng E. coli làm hệ thống biểu hiện, vì đây là một hệ thống phổ biến, dễ sử dụng và có chi phí thấp. Việc lựa chọn vector biểu hiện và chủng E. coli phù hợp, cùng với việc tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện, sẽ ảnh hưởng lớn đến hiệu quả biểu hiện và chất lượng protein tái tổ hợp thu được.

3.1. Tổng Quan Về Tạo Dòng Gen hg csf Vào Vector pET 26b

Trong giới hạn của luận văn này, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát biểu hiện protein tái tổ hợp G-CSF người trên E. Coli và nghiên cứu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF” với các nội dung như sau: Dòng hóa gen hg-csf mã hóa cho protein G-CSF của người vào vectơ biểu hiện pET26b(+) và tiến hành biểu hiện trên E.Coli Khảo sát điều kiện biểu hiện protein G-CSF xoanh quanh các nội dung: thời điểm biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng, lượng glucose bổ sung, số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng, thời gian cảm ứng. Lên men 5 lít để thu nhận G-CSF Tinh sạch protein G-CSF từ dịch tách chiết của 5 lít lên men. Kiểm tra độ tinh sạch bằng hệ thống HPLC.

3.2. Hệ Thống Vector Biểu Hiện pET 26b Chủng BL21 DE3

Hệ thống vector biểu hiện pET-26b(+) được sử dụng trong nghiên cứu này. Chủng BL21(DE3) là chủng biểu hiện được lựa chọn. Dựa vào đường cong sinh trưởng, khảo sát thời điểm biểu hiện IPTG cho kết quả biểu hiện cao nhất (Thí nghiệm 1) . Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2) . Khảo sát lượng glucose bổ sung trong quá trình nuôi cấy . Khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng . Khảo sát thời gian cảm ứng. Lên men thu nhận G-CSF quy mô 5 lít để tiến hành nghiên cứu quá trình tinh sạch.

IV. Phương Pháp Tối Ưu Hóa Biểu Hiện Protein G CSF Trên E

Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát các điều kiện biểu hiện protein G-CSF trên E. coli, bao gồm thời điểm biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), lượng glucose bổ sung, số vòng lắc, nhiệt độ, và thời gian biểu hiện. Việc tối ưu hóa các điều kiện này giúp tăng hiệu quả biểu hiện protein và giảm thiểu các vấn đề liên quan đến sự không ổn định của protein.

4.1. Khảo Sát Ảnh Hưởng của Nồng Độ IPTG và Glucose

Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2). Khảo sát lượng glucose bổ sung trong quá trình nuôi cấy. Bảng 3. 3: Kết quả ELISA theo nồng độ glucose. Kết quả khảo sát nồng độ glucose bổ sung vào môi trường LB trước khi 601i. Khảo sát lượng glucose bổ sung trong quá trình nuôi cấy . Khao sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng .

4.2. Ảnh Hưởng của Thời Gian Nuôi Cấy và Nhiệt Độ

Khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng . Kết quả khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ cảm ứng. Khảo sát thời gian cảm ứng. Bang 3. 5: Kết quả ELISA theo thời gian cảm ứng. Lên men thu nhận G-CSF quy mô 5 lít để tiến hành nghiên cứu quá trình tinh sạch.

V. Quy Trình Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp G CSF Hiệu Quả 58 ký tự

Sau khi biểu hiện thành công protein G-CSF trong E. coli, bước tiếp theo là tinh sạch protein để loại bỏ các tạp chất và thu được protein có độ tinh khiết cao. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng một quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF hiệu quả, sử dụng các phương pháp như sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion và sắc ký gel lọc.

5.1. Các Bước Cơ Bản Trong Tinh Sạch Protein G CSF

Tách chiết G-CSF. Tinh sạch G-CSIE. Quá trình tinh sạch protein G-CSF từ thể vùi của tế bào E.Coli có độ tinh sạch > 95% và protein tổng số thu được > Img/ml ở pH 3,5 — 4,0. Trọng lượng phân tử của protein G-CSF sau khi tinh sạch nằm trong khoảng 18 — 20 KDa, không có lẫn DNA của tế bào chủ, không có edotoxin và có hoạt tính sinh học.

5.2. Đánh Giá Độ Tinh Khiết và Hoạt Tính Sinh Học

Kiểm tra độ tinh sạch bằng hệ thống HPLC. Hình 3.16: Pho chạy kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế G-CSF bằng HPLC . protein tổng số thu được > Img/ml ở pH 3,5 — 4,0. Trọng lượng phân tử của protein G-CSF sau khi tinh sạch nằm trong khoảng 18 — 20 KDa, không có lẫn DNA của tế bào chủ, không có edotoxin và có hoạt tính sinh học.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Luận Văn Thạc Sĩ G CSF 57 ký tự

Luận văn này đã thành công trong việc xây dựng quy trình biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF trên E. coli. Kết quả nghiên cứu là cơ sở quan trọng cho việc phát triển quy trình sản xuất G-CSF quy mô lớn, phục vụ nhu cầu điều trị bệnh giảm bạch cầu tại Việt Nam. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình lên men và tinh sạch để tăng hiệu suất và giảm chi phí sản xuất.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Đạt Được

Dòng hóa gen hg-csf mã hóa cho protein G-CSF của người vào vectơ biểu hiện pET26b(+) và tiến hành biểu hiện trên E.Coli. protein tổng số thu được > Img/ml ở pH 3,5 — 4,0. Trọng lượng phân tử của protein G-CSF sau khi tinh sạch nằm trong khoảng 18 — 20 KDa, không có lẫn DNA của tế bào chủ, không có edotoxin và có hoạt tính sinh học.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình lên men và tinh sạch để tăng hiệu suất và giảm chi phí sản xuất. Nghiên cứu chuyên sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp G-CSF sau tinh sạch bằng phương pháp CD. Nghiên cứu độ ổn định của protein tái tổ hợp G-CSF trong các điều kiện bảo quản khác nhau.

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư là một trong những căn bệnh phổ biến và có tỷ lệ mắc ngày càng tăng tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ mắc bệnh ung thư máu tại một số địa phương như Hà Nội, Thái Nguyên, Cần Thơ dao động từ 30% đến gần 50% trên 100.000 dân trong giai đoạn 2001-2004. Hóa trị liệu là phương pháp điều trị chính cho bệnh nhân ung thư, tuy nhiên, tác dụng phụ phổ biến là giảm bạch cầu trung tính (neutropenia), làm tăng nguy cơ nhiễm trùng và kéo dài thời gian điều trị. Do đó, việc sử dụng nhân tố kích thích dòng tế bào bạch cầu hạt (G-CSF) để kích thích tủy xương sản xuất bạch cầu trung tính là rất cần thiết nhằm giảm thiểu các biến chứng do neutropenia gây ra.

Mục tiêu nghiên cứu là khảo sát biểu hiện protein tái tổ hợp G-CSF người trên vi khuẩn E.coli, đồng thời nghiên cứu quy trình tinh sạch protein này nhằm phục vụ cho sản xuất thuốc G-CSF giá thành hợp lý tại Việt Nam. Nghiên cứu được thực hiện tại Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Dược Nanogen, trong khoảng thời gian từ tháng 11/2011 đến tháng 7/2012. Ý nghĩa của nghiên cứu nằm ở việc phát triển công nghệ sản xuất G-CSF tái tổ hợp trong nước, góp phần giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân ung thư, đồng thời nâng cao khả năng tiếp cận thuốc điều trị neutropenia.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng của G-CSF: G-CSF là một glycoprotein gồm 174 amino acid, trọng lượng phân tử khoảng 18.7 kDa, có vai trò kích thích tủy xương sản xuất và biệt hóa bạch cầu hạt trung tính. Hoạt tính sinh học của G-CSF phụ thuộc vào cấu trúc không gian ba chiều và các cầu nối disulfide trong phân tử.

• Cơ chế truyền tín hiệu qua thụ thể G-CSF-R: G-CSF hoạt động thông qua tương tác với thụ thể G-CSF-R trên tế bào tiền thân bạch cầu hạt trung tính, kích hoạt các con đường tín hiệu JAK/STAT và MAP kinase, thúc đẩy tăng sinh và biệt hóa tế bào.

• Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli: Sử dụng vector pET-26b(+) với promoter T7lac mạnh để điều khiển biểu hiện gen hg-csf trong chủng E.coli BL21(DE3). Hệ thống này cho phép biểu hiện protein mục tiêu với hiệu suất cao khi được cảm ứng bằng IPTG.

Các khái niệm chính bao gồm: gen hg-csf, vector pET-26b(+), chủng biểu hiện BL21(DE3), IPTG cảm ứng, protein tái tổ hợp, tinh sạch protein, và hoạt tính sinh học của G-CSF.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Dữ liệu thu thập từ quá trình tạo dòng gen hg-csf vào vector pET-26b(+), biểu hiện protein trong E.coli BL21(DE3), khảo sát các điều kiện cảm ứng biểu hiện, lên men quy mô 5 lít, và tinh sạch protein G-CSF.

• Phương pháp phân tích: Sử dụng kỹ thuật PCR để dòng hóa gen, SDS-PAGE và Western blot để xác định biểu hiện protein, ELISA để định lượng protein, HPLC để kiểm tra độ tinh sạch, và các phương pháp sắc ký (FPLC) để tinh sạch protein. Hoạt tính sinh học được đánh giá dựa trên các tiêu chuẩn sinh học quốc tế.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu bắt đầu từ tháng 11/2011 với việc tạo dòng gen, khảo sát điều kiện biểu hiện protein trong 6 tháng tiếp theo, tiến hành lên men quy mô lớn và tinh sạch protein trong 1 tháng cuối, hoàn thành luận văn vào tháng 7/2012.

Cỡ mẫu nghiên cứu là các chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp, được chọn lọc dựa trên khả năng biểu hiện protein cao và ổn định. Phương pháp chọn mẫu là chọn chủng BL21(DE3) do có hệ thống tổng hợp T7 RNA polymerase mạnh, phù hợp cho biểu hiện protein tái tổ hợp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tạo dòng gen hg-csf thành công: Gen hg-csf được dòng hóa vào vector pET-26b(+) và xác nhận bằng PCR, tạo thành vector pET26b(+)-hg-csf. Chủng E.coli BL21(DE3) mang vector này biểu hiện protein G-CSF vượt mức.

2. Điều kiện biểu hiện tối ưu: Protein G-CSF được biểu hiện hiệu quả trong môi trường LB bổ sung 0,4% glucose, cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG, lắc 250 vòng/phút, nhiệt độ 37°C trong 6 giờ. Đường cong sinh trưởng và kết quả ELISA cho thấy nồng độ protein đạt >1 mg/ml với độ tinh sạch >95%.

3. Quy trình tinh sạch protein hiệu quả: Protein G-CSF được tinh sạch từ thể vùi của tế bào E.coli với trọng lượng phân tử 18-20 kDa, không lẫn DNA tế bào chủ và endotoxin, đảm bảo hoạt tính sinh học đạt 101.13 MU/mg.

4. So sánh với các nghiên cứu khác: Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein tương đương hoặc vượt trội so với các nghiên cứu trong và ngoài nước, như biểu hiện G-CSF trong Pichia pastoris đạt 35 mg/l và trong E.coli đạt 1 mg/ml trong nghiên cứu này.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy hệ thống biểu hiện pET-26b(+) trên chủng BL21(DE3) là phù hợp để sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp với hiệu suất cao và chất lượng tốt. Việc bổ sung glucose giúp kiểm soát mức độ biểu hiện, tránh độc tính cho tế bào chủ, đồng thời IPTG là chất cảm ứng hiệu quả để kích hoạt promoter T7lac.

Quy trình tinh sạch protein đã loại bỏ hoàn toàn tạp chất như DNA và endotoxin, đảm bảo an toàn cho ứng dụng dược phẩm. Hoạt tính sinh học của protein thu được phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế, chứng minh tính khả thi của quy trình sản xuất.

So với các nghiên cứu sử dụng hệ thống Pichia pastoris, biểu hiện trong E.coli có ưu điểm về tốc độ và chi phí, tuy nhiên cần kiểm soát kỹ quá trình gấp cuộn protein để đảm bảo hoạt tính. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong sinh trưởng, biểu đồ ELISA theo các điều kiện cảm ứng, và bảng so sánh độ tinh sạch protein.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình lên men quy mô lớn: Áp dụng các điều kiện cảm ứng đã khảo sát để nâng cao năng suất protein G-CSF trong bồn lên men 5 lít, nhằm tăng nồng độ protein thu được trên đơn vị thể tích trong vòng 6 tháng tới. Chủ thể thực hiện: Phòng R&D công ty Nanogen.

2. Phát triển quy trình tinh sạch tự động: Đầu tư hệ thống sắc ký FPLC tự động để nâng cao độ tinh sạch và giảm thời gian tinh chế protein, hướng tới sản xuất quy mô công nghiệp trong 1 năm. Chủ thể thực hiện: Bộ phận sản xuất công ty.

3. Kiểm tra hoạt tính sinh học mở rộng: Thực hiện các thử nghiệm in vivo và in vitro bổ sung để đánh giá hiệu quả điều trị của protein G-CSF tái tổ hợp, đảm bảo đáp ứng các tiêu chuẩn dược phẩm trong 9 tháng tới. Chủ thể thực hiện: Phòng kiểm nghiệm và đối tác nghiên cứu.

4. Nghiên cứu cải tiến biểu hiện protein: Khảo sát các biến thể gen và hệ thống biểu hiện khác như Pichia pastoris để so sánh hiệu quả và chi phí, nhằm đa dạng hóa nguồn cung protein trong 1-2 năm. Chủ thể thực hiện: Phòng nghiên cứu công ty và hợp tác học thuật.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Có thể áp dụng các phương pháp tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm sinh học.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm sinh học: Tham khảo quy trình biểu hiện và tinh sạch protein G-CSF để phát triển sản phẩm thuốc điều trị neutropenia với chi phí hợp lý.

3. Bác sĩ và chuyên gia y tế: Hiểu rõ cơ chế hoạt động và ứng dụng của G-CSF trong điều trị bệnh nhân ung thư, từ đó tư vấn và lựa chọn liệu pháp phù hợp.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học: Nắm bắt kiến thức thực tiễn về kỹ thuật biểu hiện protein tái tổ hợp và quy trình tinh sạch, phục vụ học tập và nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

1. G-CSF là gì và vai trò của nó trong điều trị ung thư?
   G-CSF là một cytokine kích thích tủy xương sản xuất bạch cầu hạt trung tính, giúp giảm nguy cơ nhiễm trùng do neutropenia trong quá trình hóa trị ung thư. Ví dụ, sử dụng G-CSF giúp giảm 50% nguy cơ nhiễm khuẩn ở bệnh nhân.

2. Tại sao chọn E.coli BL21(DE3) để biểu hiện protein G-CSF?
   BL21(DE3) có hệ thống tổng hợp T7 RNA polymerase mạnh, cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với hiệu suất cao và dễ dàng kiểm soát bằng IPTG, phù hợp cho sản xuất protein dược phẩm.

3. Quy trình tinh sạch protein G-CSF được thực hiện như thế nào?
   Protein được tinh sạch từ thể vùi tế bào bằng các bước sắc ký chuyên biệt, loại bỏ tạp chất như DNA và endotoxin, đảm bảo độ tinh sạch >95% và hoạt tính sinh học đạt tiêu chuẩn.

4. Làm thế nào để kiểm soát biểu hiện protein tránh gây độc cho tế bào chủ?
   Bổ sung glucose vào môi trường giúp giảm mức độ biểu hiện quá mức, tránh độc tính cho tế bào, đồng thời sử dụng IPTG để cảm ứng biểu hiện khi cần thiết.

5. Nhu cầu sử dụng G-CSF tại Việt Nam hiện nay ra sao?
   Với tỷ lệ ung thư tăng cao và phương pháp hóa trị phổ biến, nhu cầu G-CSF để điều trị neutropenia rất lớn. Sản phẩm thương mại hiện có giá cao, do đó sản xuất trong nước giúp giảm chi phí và tăng khả năng tiếp cận thuốc.

Kết luận

• Đã thành công trong việc tạo dòng gen hg-csf vào vector pET-26b(+) và biểu hiện protein G-CSF trong E.coli BL21(DE3) với hiệu suất cao.
• Đã khảo sát và xác định các điều kiện cảm ứng tối ưu cho biểu hiện protein, đạt nồng độ >1 mg/ml và độ tinh sạch >95%.
• Quy trình tinh sạch protein đảm bảo loại bỏ tạp chất, giữ hoạt tính sinh học phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế.
• Nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ sản xuất G-CSF tái tổ hợp trong nước, giảm chi phí điều trị neutropenia cho bệnh nhân ung thư.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu quy trình lên men quy mô lớn, phát triển tinh sạch tự động và mở rộng đánh giá hoạt tính sinh học trong các giai đoạn tiếp theo.

Hành động tiếp theo là triển khai quy trình sản xuất quy mô công nghiệp và phối hợp với các cơ quan y tế để đưa sản phẩm G-CSF tái tổ hợp vào sử dụng rộng rãi. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học nên tham khảo và áp dụng kết quả nghiên cứu này để phát triển sản phẩm dược phẩm chất lượng cao, giá thành hợp lý.