MỞ ĐẦU Thuốc kháng sinh là một trong những phát minh quan trọng nhất trong nghiên cứu y sinh. Với sự phát hiện ra penicillin của Alexander Fleming vào năm 1928, “kỷ nguyên kháng sinh” và nghiên cứu về thuốc kháng sinh đã được bắt đầu. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc chống nhiễm trùng trong bệnh viện và công nghiệp đã làm phát sinh và gia tăng số lượng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc. Các thuốc kháng sinh đang mất dần hiệu lực, vì vậy hướng nghiên cứu tìm kiếm các chất có tính kháng khuẩn, đặc biệt là kháng lại một số dòng vi khuẩn kháng kháng sinh là một nhu cầu cấp thiết của xã hội.
Các peptide kháng khuẩn đã được nghiên cứu và cho thấy tiềm năng trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, nấm. Hiện nay, các peptide trong nọc độc của các loài động vật/côn trùng đang được quan tâm nghiên cứu ngày càng nhiều cho những ứng dụng phát triển chất kháng sinh mới. Trong số đó, mastoparan là ứng cử viên được quan tâm nhiều nhất. Vespa velutina là một trong những loài ong vò vẽ nguy hiểm có xuất xứ từ các nước Đông Nam Á.
Đây là loài côn trùng có nọc độc cực mạnh, có thể tái tạo nọc độc nhiều lần. Nọc ong là một hỗn hợp phức tạp trong thành phần có chứa các enzyme có bản chất là protein (hyaluronidase, phospholipase A và B, phosphatase acid, các protease, esterase và glucidase); các peptide nhỏ (apamin là chất độc thần kinh, melittin là chất độc gây tan máu, MCD peptide - Mast cell degranulating peptide, kinin, bradykinin, kháng nguyên 5, mastoparan); và cuối cùng là các phân tử nhỏ khác như các amin gây viêm (histamin, noradrenalin, dopamin, serotonin, acetylcholine). Chúng đã được phát hiện có tiềm năng trong việc điều trị nhiều loại bệnh như một số bệnh rối loạn thần kinh, bảo vệ phóng xạ, chống đột biến, chống viêm, chống kích hoạt đau, và còn có khả năng sử dụng cho mục đích khác như kháng ung thư, kháng khuẩn,. Từ những cơ sở dữ liệu đầu tiên về thành phần các protein/peptide có trong nọc ong Vespa velutina thu thập ở Việt Nam, mastoparan đã được nhận diện trong tổng số hơn 80 protein và peptide từ cơ sở dữ liệu này.
Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh chế và xác định hoạt tính 4 kháng khuẩn của peptide mastoparan từ nọc ong Vespa velutina thu ở Việt Nam” với mong muốn phát hiện một loại mastoparan mới từ loài ong này và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của peptide này trên một số chủng vi khuẩn nhằm tìm kiếm khả năng ứng dụng của trong y dược của chúng, phục vụ đời sống con người như một chất kháng sinh mới. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ONG Vespa velutina Ong bắt mồi chân vàng, Vespa velutina (Hình 1.1) là một loài ong có nguồn gốc từ các nước khu vực Châu Á [1] và đã xâm nhập vào một số khu vực của Châu Âu, lần đầu tiên xuất hiện ở Pháp vào năm 2004 [1]. Như một kẻ săn mồi nói chung, chúng là một loài gây hại cho ong mật và là mối quan tâm chính của nhiều người nuôi ong.1 Ong Vespa velutina (Lepeletier) [1] 6 1.1 Phân loại khoa học Giới (regnum) : Animalia Ngành (phylum) : Arthropoda Lớp (class) : Insecta Bộ (ordo) : Hymenoptera Họ (familia) : Vespidae Phân họ (subfamilia) : Vespinae Chi (genus) : Vespa Loài (species) : V.2 Phân bố của ong Vespa velutina Vespa velutina có nguồn gốc từ Châu Á, là loài bản địa ở Đông Nam Á, xuất hiện ở Hàn Quốc [1], Trung Quốc [2] và Nhật Bản [3] và mốt số quốc gia Châu Á khác. Nó được du nhập vào Pháp vào năm 2004, rất có thể thông qua việc nhập khẩu các chậu cây cảnh [2].
Loài này có khả năng xâm lấn rất cao và dễ dàng lây lan sang các khu vực châu Âu khác như Ý [4], Anh [5], Quần đảo Balearic [6] và miền bắc nước Đức [7] Phân bố của loài ong Vespa velutina ở Việt Nam Loài ong Vespa velutina có thể được tìm thấy ở các tỉnh của Việt Nam như: Hà Giang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, v.3 Hình thái của ong Vespa velutina V. velutina rất đa dạng về màu sắc và 10 phân loài đã được xác định [8], [9], [10]. Villemant (Bảo tàng Lịch sử Tự nhiên Quốc gia, Paris, thông tin cá nhân của Pháp, 2013) mô tả Vespa velutina nigrithorax (Hình 1.3) như sau: 7 Ong cái: Đầu và ngực nhọn, có lông tơ mịn mọc rải rác, bụng có rãnh. Cơ thể màu nâu sẫm, mặt và miệng có màu cam (trừ răng sẫm màu); râu màu nâu ở mặt lưng, màu cam ở bụng.
Mặt lưng của các đoạn bụng màu nâu với các rìa đỉnh rõ ràng hơn: một dải mỏng màu vàng ở đoạn thứ nhất và dải mỏng màu cam ở đoạn thứ hai và thứ ba; đoạn bụng thứ tư gần như hoàn toàn màu cam với một vạch đen hình tam giác ở giữa, thường không nhìn thấy khi ong bắp cày còn sống; đoạn bụng thứ năm và thứ sáu có màu nâu cam nhiều hơn hoặc ít hơn. Phần bụng màu nâu, đỉnh hình tam giác thường nhạt hơn; phân đoạn thứ hai và thứ ba màu vàng toàn thân với một vạch đen ở giữa. Chân màu nâu trừ tarsi vàng; cánh màu nâu xám. Không có sự khác biệt rõ rệt về hình thái giữa con cái (ong thợ) hữu tính và bất dục.
Một số ong thợ nhỏ hơn (đặc biệt là vào mùa xuân) nhưng vào mùa thu, nhiều ong thợ lớn như những ong chúa tương lai. Bên trong đàn, có thể nhận ra ong chúa đẻ trứng bằng phần bụng căng phồng và vào cuối mùa, đôi cánh bị hư hại.2 Ong Vespa velutina nigrithorax cái mặt lưng (phía trên) và bụng (phía dưới) [11] 8 Con đực: rất giống con cái về kích thước và màu sắc, râu dài hơn. Mặt bụng của bụng màu nâu, đỉnh cụt có một đôi đốm vàng. Ong đực và ong cái có thể phân biệt với nhau bằng các râu của chúng, với các râu ong cái có vẻ mỏng hơn và chiều dài ngắn hơn so với râu của ong đực.
Như với tất cả các Bộ cánh màng, con cái có ngòi độc còn con đực thì không.3 Ong Vespa velutina nigrithorax cái (bên trái) và đực (bên phải) [12] 1.2 GIỚI THIỆU VỀ NỌC ONG Các sinh vật sử dụng nọc độc như một thứ vũ khí hoá học hiệu quả để tự vệ và săn bắt con mồi, vì vậy nọc của chúng được tiến hoá theo hướng đặc trưng cho loài và độc tính cao. Bên cạnh đó, nọc độc cũng là nguồn dự trữ các hợp chất có hoạt tính sinh học quý, mang lại nhiều hứa hẹn trong việc tìm tòi và phát triển các loại thuốc chữa bệnh (Hình 1.4 Nọc ong săn mồi như một nguồn của các hợp chất có hoạt tính sinh học và các ứng dụng của chúng [13].1 Các thành phần của nọc ong Nọc ong là một hỗn hợp phức tạp chứa 3 nhóm chất chính: gồm các enzyme có bản chất là protein (hyaluronidase, phospholipase A và B, phosphatase acid, các protease, esterase và glucidase); các peptide nhỏ (apamin là chất độc thần kinh, melittin là chất độc gây tan máu, MCD peptide - Mast cell degranulating peptide, kinin, bradykinin, kháng nguyên 5, mastoparan); và cuối cùng gồm các phân tử nhỏ khác như các amin gây viêm (histamin, noradrenalin, dopamin, serotonin, acetylcholine) (Bảng 1. 10 Hyaluronidase Phospholipase A2 Melittin Mastoparan Hình 1.5 Một số hợp chất trong thành phần trong nọc ong 11 1.1 Các enzyme Hyaluronidase và Phospholipase là hai enzyme chính có trong nọc độc của các loài ong. Hai enzyme này có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch, bằng cách cảm ứng IgE gây ra các phản ứng quá mẫn dẫn đến phá huỷ lớp lipid kép trong màng tế bào, gây độc tế bào hoặc kích thích miễn dịch đối với các loại tế bào khác [15], [16].
Hyaluronidase thuỷ phân và cắt đặc hiệu acid hyaluronic, có thể được sử dụng như các tác nhân gây mê, giảm đau, chống ung thư và cũng hỗ trợ sự phân tán thuốc trong mô [17]. Phospholipase A-2 (PLA2) là thành phần chủ yếu thứ 2 của nọc ong, chiếm 10-12% trọng lượng khô của nọc. PLA2 là một enzyme phụ thuộc vào canxi mà thủy phân sn-2 este của glycerophospholipids để tạo ra một acid béo và một lysophospholipid. Nó có thể phá hủy phospholipids, phá vỡ tính toàn vẹn của lớp lipid kép, do đó làm cho các tế bào dễ bị suy thoái hơn.
Trên thực tế, các sản phẩm phản ứng PLA2, chẳng hạn như lysophosphatidylcholine, acid lysophosphatidic và sphingosine 1- phosphate, có thể có tác dụng gây độc tế bào hoặc kích thích miễn dịch trên các loại tế bào khác nhau, gây viêm và phản ứng miễn dịch [16] 1.2 Các peptide MCD peptide (Mast cell degranulating peptide) là một peptide tích điện dương gồm 22 amino acid chứa 2 cầu disulfide giữa Cys3 và Cys15, Cys5 và Cys19, có cấu trúc giống như apamin, [18]. Peptide này có tiềm năng kháng viêm, tuy nhiên khi ở nồng độ thấp MCD peptide lại là chất trung gian mạnh của quá trình phân rã tế bào mast và giải phóng chủ động histamine từ các tế bào mast, mà được hiện diện trong việc truyền máu và trong tất cả các cô được truyền dịch bằng máu [19]. Bradykinin là peptide thuộc nhóm protein kinin, tác động vào hai thụ thể được ký hiệu là B1 và B2 gây đau và làm giảm huyết áp [19]. Đối với thụ thể B1 chỉ được biểu hiện do tổn thương mô và nó được cho là có vai trò gây đau mãn tính.
Ngược lại, thụ thể B2 được biểu hiện chủ yếu, tham gia vào quá trình 12 giãn mạch thông qua việc giải phóng prostacyclin, oxit nitric, và yếu tố tăng phân cực có nguồn gốc nội mô, do đó góp phần làm giảm huyết áp [19], [20]. Adolapin là peptide đầu tiên được tinh sạch từ nọc ong trong thập kỷ 80, ức chế hoạt động của protstaglandin gây ra hiệu quả giảm đau và kháng viêm mạnh khi thử nghiệm trên chuột [21], [22]. Melittin là peptide độc hoà tan trong nước chiếm 50% trọng lượng khô của nọc. Đây là peptide xoắn lưỡng phần ( một phân tử có cả tính chất ưa nước và kỵ nước ) bao gồm 26 gốc amino acid và trong đó cùng đầu N chủ yếu kỵ nước và vùng đầu C là ưa nước.
Melittin là thành phần hoạt động chính của nọc ong (apitoxin) và chịu trách nhiệm phá vỡ và giết các tế vào. Khi một số peptide melittin tích tụ trong màng tế bào, quá trình đóng gói phospholipid bị phá vỡ nghiêm trọng, do đó dẫn đến ly giải tế bào [23]. Melittin và phospholipase A-2 ức chế sự tăng sinh tế bào khối u và do đó có giá trị tiềm năng cho chữa trị ung thư và giảm khả năng nhiễm HIV-1 [24].