MỞ ĐẦU Việt Nam có kinh nghiệm từ lâu đời về việc sử dụng dược liệu và chế phẩm có nguồn gốc dược liệu để điều trị bệnh. Nhiều dược liệu đã được sử dụng từ rất lâu qua kinh nghiệm dân gian, kiến thức y học cổ truyền, bài thuốc gia truyền,. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae) là một trong những dược liệu được sử dụng rất phổ biến và đã được công nhận sử dụng chẳng những theo Y học Việt Nam mà còn khắp nơi trên thế giới với tác dụng chính là cải thiện chức năng gan ở các đối tượng viêm gan do nhiều nguyên nhân khác nhau, đặc biệt là viêm gan B [4], [21], [53], [56], [76], [100]. Tổ chức y tế thế giới và Dược điển các nước đều đã đưa ra các yêu cầu kiểm tra chất lượng các thuốc từ dược liệu phải dựa trên các kỹ thuật phân tích hiện đại, với việc sử dụng các chất đối chiếu phù hợp [103].
Dược điển Việt Nam V đã có chuyên luận Diệp hạ châu đắng và cao đặc Diệp hạ châu đắng [2]. Dược điển Mỹ hiện hành cũng đã có các chuyên luận dược liệu Diệp hạ châu đắng, bột Diệp hạ châu đắng [98]. Các chuyên luận trên đều có các chỉ tiêu định tính, định lượng sử dụng chất chuẩn đối chiếu là chất điểm chỉ phyllanthin. Hiện nay, trên thị trường nhiều sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng, chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu là cao toàn phần, với công dụng là có hiệu quả trong tác dụng bảo vệ gan.
Tất cả những sản phẩm này đều công bố chất lượng dựa trên tiêu chuẩn cơ sở tự xây dựng. Đa số, các tiêu chuẩn cơ sở của các thành phẩm được xây dựng chỉ dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần bằng phương pháp không đặc hiệu, không đưa được chỉ tiêu định lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cũng như chưa xác định mức hàm lượng cho các chất có hoạt tính trong liều điều trị do thiếu chất chuẩn đối chiếu và chưa có nghiên cứu về dược động học của các chất có hoạt tính sinh học cho các sản phẩm từ dược liệu này. Trong khi tác dụng sinh học của Diệp hạ châu đắng không chỉ do phyllanthin mà còn có hypophyllanthin và niranthin. Các chất này có vai trò hết sức quan trọng trong tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, chống ung thư [30], [67].
2 Bên cạnh đó, công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu hay sản phẩm từ dược liệu còn tương đối khó khăn và đang còn bỏ ngõ trong lĩnh vực kiểm nghiệm do thiếu phương pháp thử, chất chuẩn đối chiếu, cao chuẩn đối chiếu,. Mặt khác, các chất chuẩn đối chiếu chưa sẵn có và giá thành rất cao; phương pháp thử cũng cần xây dựng cho phù hợp với trình độ khoa học kỹ thuật chung của cả thế giới để nâng cao chất lượng các sản phẩm trên. Ngoài ra, nghiên cứu sinh khả dụng nhằm đánh giá các thông số dược động học của chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng sẽ giúp minh chứng hỗ trợ điều trị bảo vệ gan hiệu quả hơn. Do đó, việc phân lập các chất có hoạt tính sinh học làm chất đối chiếu, tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng cũng như xác định sinh khả dụng của chế phẩm để làm cơ sở cho việc kiểm tra chất lượng và ước định liều dùng cho các sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng là hết sức cần thiết.
Từ các lý do trên, đề tài “Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae)” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 1. Tên gọi, phân loại [1], [4] Tên thực vật: Diệp hạ châu đắng. Tên khác: Chó đẻ răng cưa, chó đẻ thân xanh, cam kiềm, kiền đắng, cỏ trân châu, rút đất, trân châu thảo, lão nha châu, diệp hòa thái.
Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan A. năm 2009 [94], cây Diệp hạ châu đắng có vị trí phân loại thực vật như sau: Giới (regnum) Plantae Ngành (division) Magnoliophyta (ngọc lan) Lớp (class) Magnoliopsida (ngọc lan) Bộ (ordo) Euphorbiales (thầu dầu) Họ (familia) Euphorbiaceae (thầu dầu) Chi (genus) Phyllanthus Loài (species) Phyllathus amarus Schum. Phân bố - sinh thái Euphorbiaceae là một họ thực vật lớn bao gồm khoảng 6.500 loài trong 300 chi.
Phyllanthus cũng là một chi lớn, có khoảng 200 loài ở Mỹ, 100 loài ở Châu Phi, 70 loài ở Madagascar, phần còn lại ở châu Á và châu Úc. Diệp hạ châu đắng là cây ưa sáng, ưa ẩm nhưng không chịu được ngập úng. Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa.) pH từ 5,0 đến 6,5. Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25-30 oC.
Cây ra hoa quả nhiều, tái sinh tốt từ hạt, vòng đời kéo dài 3-5 tháng. Trong tự nhiên, cây thường mọc trên đất ẩm ở ven đồi, trên nương rẫy, bãi hoang hay ven đường đi và quanh làng bản, ở cả miền núi lẫn trung du và đồng bằng [21]. Đặc diểm thực vật Cây thảo cao 40-80 cm, thân tròn, bóng, màu xanh, phân nhánh đều, nhiều. Lá mọc so le xếp thành hai dãy sít nhau trông như lá kép hình lông chim.
Phiến lá hình bầu dục, dài từ 5 mm đến 10 mm, rộng 3 mm đến 6 mm, màu xanh thẫm ở mặt trên, 4 màu xanh nhạt ở mặt dưới. Hoa đực và hoa cái mọc thành cụm. Hoa đực có cuống ngắn 1 mm đến 2 mm, đài 5, có tuyến mật, nhị 3, chỉ nhị dính nhau. Hoa cái có cuống dài hơn hoa đực.
Quả nang, nhẵn, hình cầu, đường kính 1,8 mm đến 2 mm, có đài tồn tại. Quả chứa 6 hạt hình tam giác, đường kính 1 mm, hạt có sọc dọc ở lưng [1]. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiacea (trái) và hoa (phải) Diệp hạ châu đắng Hình 1. Mặt dưới của lá (trái) và các quả (phải) Diệp hạ châu đắng 1.
Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái [4]. Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Phyllanthi amari Gieo trồng: Gieo hạt ở vườn ươm: tháng 1-2, trồng cây con: tháng 2-3, thu hoạch: tháng 4-5 (sau khi trồng 45-50 ngày). Nhìn chung, thời vụ trồng Diệp hạ châu đắng kéo dài cả mùa khô, tận dụng trời nắng để phơi. Thu hái: Sau khi trồng khoảng 45-50 ngày, cây Diệp hạ châu đắng cao 60-70 cm là thu hoạch.
Năng suất đạt 10-12 tấn tươi/ha/vụ. Một năm có thể trồng 2 vụ. Diệp hạ châu đắng là cây thuốc dễ trồng, cây không kén đất. Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Thành phần hóa học của Phyllanthus amarus bao gồm: lignan, alkaloid, flavonoid, tannin thủy phân (Ellagitannin), polyphenol, triterpen, sterol và tinh dầu, như bảng liệt kê trong Bảng 1.
Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Nhóm Hoạt chất Tài liệu Alkaloid Epibubbialin, isobubbialin, norsecurinin, securinin, securinol, [8], [46] 4-methoxy-nor-securinin, dihydrosecurinin, allo-securin, tetrahydrosecurinin, 4-methoxy dihydrosecurinin, 4-hydrosecurinin, 4-methoxy tetrahydrosecurinin Flavonoid Quercetin, rhamnocitrin, rutin, apigenin, luteolin, kaempferol, [5], [47], allocatechin, astragalin, quercetin-3-O-glucosid, quercitrin, [89] 4′,5,7-triethoxy-3,3′,6-trimethoxy flavon, phyllanthusiin Lignan Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, phyltetralin, [10], [53], nirtetralin, isonirtetralin, hinokinin, lintetralin, isolintetralin, [54], [81], demethylenedioxy niranthin, 5-demethoxy-niranthin, 7′- [84], [85], oxocubebin dimethyl ether, (3-(3,4-dimethoxybenzyl)-4-(7- [90], methoxybenzo[1,3]dioxol-5-yl-methyl)-dihydrofuran-2-on, và [91]. Sterol Amarosterol A, amarosterol B, cycloeucalenyl acetat, [47] macdougallin, ergosta-5,7,22-trien-3-ol acetat, 17-(1,5- dimethylhexyl)-6-hydroxy-5-methylestr-9-en-3-yl acetat, stigmasterol, β-sitosterol, daucosterol, stigmast-5-en-3-ol oleat, 6,7-epoxypregn-4-en-9,11,18-triol-3,20-dion, 11,18-diacetat, bufalin, 3-acetoxy-7,8-epoxylanostan-11-ol Tannin và Amariin, acid amariinic, amarulon, corilagin, geraniin, acid [47] phenol geranic, furosin, phyllanthusiin A, B, C và D, acid ellagic, acid repandusinic, elaeocarpusin, acid 4-galloyl quinic, acid gallic, gallocatechin, 1,6-digalloylglucopyranose, acid 4-O- galloylquinic, acid quicnic, acid geraniinic B, cidrepandusinic A, isocorilagin, melatonin. Terpenoid Phyllanosid, 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, [47], [56] linalool, phytol, olean-13(18)-en, methyl ursolat, barringenol R1, Phenazin và dẫn chất phenazin 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, lupeol, phyllanthenol, phyllanthenon, phyllantheol, acid oleanolic, acid ursolic Nhóm Acid cinnamic, acid 4-hydroxy-3-methoxy-benzoic, acid [47] khác brevifolin carboxylic, rhodopin 1. Tính chất lý hóa một số hợp chất lignan 1.
Phyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H34O6 Phyllanthin (IUPAC): 4-[(2S,3S)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-1,2-dimethoxybenzen CAS: 10351-88-9 Khối lượng phân tử: 418,5 g/mol 6 Hệ số log Pow: 3,2 Tính tan: tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, methanol, ethanol, kém tan trong nước Điểm chảy: 96 C 1. Hypophyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Hypophyllanthin (IUPAC): (7R,8R,9S)-9-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy- 7,8-bis(methoxymethyl)-6,7,8,9-tetrahydrobenzo[g][1,3]benzodioxol CAS: 33676-00-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,6 Tính tan: Tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton ~ 0,2 trong ethanol, ~10 mg/mL trong dimethylsulfoxid, ~ 30 mg/mL trong dimethylformamid. Niranthin [105] Công thức phân tử: C24H32O7. Niranthin (IUPAC): 6-[(2R,3R)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-4-methoxy-1,3-benzodioxol.
CAS: 50656-77-4 Khối lượng phân tử: 432,5 g/mol Hệ số log Pow: 4,1 Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. Nirtetralin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Nirtetralin (IUPAC): (5R,6S,7S)-5-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy-6,7- bis(methoxymethyl)-5,6,7,8-tetrahydrobenzo[f][1,3]benzodioxol CAS: 50656-78-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,6 7 Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. Phyltetralin [105] Công thức phân tử: C24H32O6 Phyltetralin (IUPAC): ((1R,2S,3S)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-dimethoxy- 2,3-bis(methoxymethyl)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen CAS: 123048-17-9 Khối lượng phân tử: 416,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,8 Tính tan: Tan trong: cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. MeO OMe OMe MeO OMe OMe Phyllanthin Hypophyllanthin O MeO O OMe OMe OMe OMe OMe OMe O O MeO OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe Niranthin Nirtetralin Phyltetralin Hình 1.
Công thức hóa học của một số lignan 1. Tác dụng sinh học Diệp hạ châu đắng là một thảo dược đã được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Thành phần hóa học của cây rất phong phú, đa dạng, có chứa nhiều nhóm chất như alkaloid, flavonoid, lignan, tannin thủy phân (ellagitannin), polyphenol, triterpen, 8 sterol và tinh dầu. Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng dược lý có ích trong điều trị bệnh, đã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Diệp hạ châu đắng như tác dụng bảo vệ tế bào gan, trị viêm gan, hoạt tính kháng khối u, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và ký sinh trùng.
Ngoài ra, còn có hoạt tính kháng HIV, chống oxy hóa, hạ đường huyết và cholesterol trong máu. Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của Phyllanthus amarus trong nước cũng như trên thế giới, có thể liệt kê trong bảng sau: Bảng 1.