Luận án tiến sĩ thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus schum et thonn euphorbiaceae

Luận án tiến sĩ nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và xác định thông số dược động học từ cao chuẩn hóa diệp hạ châu đắng.

• Tác giả: Phạm Văn Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Ngọc Vinh
• Trường học: Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin, Niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae)
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• 2.1.1. Tên gọi, phân loại
• 2.1.2. Phân bố - sinh thái
• 2.1.3. Đặc diểm thực vật
• 2.1.4. Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái
• 2.1.5. Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng
• 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT LIGNAN TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT LIGNAN TRONG DIỆP HẠ CHÂU
• 2.4. TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA THUỐC
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
• 4.2. XÁC ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU
• 4.3. ĐIỀU CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• 4.4. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA CAO CHUẨN HÓA ĐIỀU CHẾ TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Luận án tiến sĩ tập trung vào việc thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin và Niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.), đồng thời đánh giá các thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ dược liệu này. Mục tiêu chính bao gồm chiết xuất, phân lập, tinh chế các hợp chất lignan, thiết lập chất đối chiếu, tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng, và xác định các thông số dược động học để hỗ trợ kiểm tra chất lượng và liều dùng.

1.1. Bối cảnh và ý nghĩa

Diệp hạ châu đắng là dược liệu được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và hiện đại, đặc biệt trong điều trị các bệnh về gan. Tuy nhiên, việc kiểm tra chất lượng các sản phẩm từ dược liệu này còn hạn chế do thiếu chất đối chiếu và phương pháp phân tích hiện đại. Nghiên cứu này nhằm khắc phục những hạn chế đó, góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng.

1.2. Mục tiêu cụ thể

Nghiên cứu hướng đến chiết xuất, phân lập Hypophyllanthin và Niranthin, thiết lập chất đối chiếu, tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng, và đánh giá các thông số dược động học như AUC, Cmax, Tmax để xác định sinh khả dụng của chế phẩm.

II. Tổng quan về Diệp hạ châu đắng

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.) thuộc họ Euphorbiaceae, là cây thảo sống ở vùng nhiệt đới. Dược liệu này chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như lignan, flavonoid, alkaloid, và tannin. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, và chống ung thư của Diệp hạ châu đắng, đặc biệt là các hợp chất Hypophyllanthin và Niranthin.

2.1. Thành phần hóa học

Thành phần chính của Diệp hạ châu đắng bao gồm lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin), flavonoid (quercetin, rutin), và alkaloid (securinin). Các hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong tác dụng dược lý của dược liệu.

2.2. Tác dụng sinh học

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Hypophyllanthin và Niranthin có tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, và chống ung thư. Điều này làm nổi bật tầm quan trọng của việc phân lập và thiết lập chất đối chiếu cho các hợp chất này.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để chiết xuất, phân lập, và xác định cấu trúc của Hypophyllanthin và Niranthin. Các thông số dược động học được đánh giá thông qua thí nghiệm trên động vật.

3.1. Chiết xuất và phân lập

Quy trình chiết xuất bao gồm sử dụng dung môi ethanol và methanol để thu được cao toàn phần. Sau đó, các hợp chất lignan được phân lập bằng sắc ký cột và tinh chế bằng HPLC.

3.2. Đánh giá dược động học

Các thông số dược động học như AUC, Cmax, và Tmax được xác định thông qua thí nghiệm trên thỏ. Kết quả cho thấy sinh khả dụng của cao chuẩn hóa từ Diệp hạ châu đắng.

IV. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin và Niranthin. Cao chuẩn hóa từ Diệp hạ châu đắng đạt tiêu chuẩn chất lượng với hàm lượng các hợp chất lignan ổn định. Các thông số dược động học cho thấy sinh khả dụng cao, hỗ trợ hiệu quả trong điều trị các bệnh về gan.

4.1. Thiết lập chất đối chiếu

Hypophyllanthin và Niranthin được phân lập với độ tinh khiết cao, đáp ứng yêu cầu làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu.

4.2. Đánh giá dược động học

Kết quả cho thấy cao chuẩn hóa có sinh khả dụng tốt, với AUC và Cmax đạt giá trị cao, hỗ trợ hiệu quả trong điều trị các bệnh về gan.

V. Kết luận và ứng dụng

Nghiên cứu đã cung cấp phương pháp hiệu quả để thiết lập chất đối chiếu Hypophyllanthin và Niranthin, đồng thời đánh giá các thông số dược động học của cao chuẩn hóa từ Diệp hạ châu đắng. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm dược liệu từ Diệp hạ châu đắng.

5.1. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu và sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng, hỗ trợ kiểm tra chất lượng và xác định liều dùng hiệu quả.

5.2. Hướng phát triển

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng và ứng dụng lâm sàng của các hợp chất lignan trong Diệp hạ châu đắng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae) là dược liệu được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền và y học hiện đại tại Việt Nam cũng như trên thế giới, với tác dụng chính là hỗ trợ điều trị các bệnh lý về gan và cải thiện chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan B. Nhóm hoạt chất chính quyết định tác dụng sinh học bảo vệ gan, kháng viêm và chống oxy hóa của cây là các hợp chất lignan, bao gồm phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin và phyltetralin.

Hiện nay, Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ (USP) đã ban hành các chuyên luận về dược liệu và chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng, nhưng các chỉ tiêu định tính và định lượng chủ yếu chỉ sử dụng một chất điểm chỉ là phyllanthin. Phần lớn các sản phẩm lưu hành trên thị trường được bào chế từ nguyên liệu cao toàn phần và công bố chất lượng dựa trên tiêu chuẩn cơ sở tự xây dựng. Các tiêu chuẩn này thường chỉ định lượng hỗn hợp toàn phần bằng phương pháp không đặc hiệu, chưa xây dựng được chỉ tiêu định lượng đồng thời cho các hoạt chất có tác dụng sinh học chính khác như hypophyllanthin và niranthin do thiếu nguồn chất chuẩn đối chiếu thương mại (giá thành cao, nguồn cung hạn chế). Đồng thời, các dữ liệu về dược động học và sinh khả dụng của các lignan trong cao chiết chuẩn hóa từ Diệp hạ châu đắng trên động vật thực nghiệm còn thiếu hụt, gây khó khăn cho việc kiểm soát chất lượng đồng nhất và ước định liều dùng điều trị tối ưu. Do đó, việc chiết xuất, phân lập, thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin, chuẩn hóa quy trình điều chế cao giàu hoạt chất và khảo sát các thông số dược động học in vivo là nhiệm vụ có tính cấp thiết cao.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản như sau:

1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae).
2. Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae).
3. Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae).
4. Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Toàn cây (trừ rễ) Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae) đã được thu hái, sơ chế và định danh thực vật; các hợp chất lignan phân lập được (hypophyllanthin, niranthin, phyllanthin, nirtetralin, phyltetralin); cao chiết chuẩn hóa từ Diệp hạ châu đắng; huyết tương thỏ thí nghiệm.
• Phạm vi không gian: Dược liệu thu hái tại tỉnh Vĩnh Long (tháng 4/2014) bởi Công ty TNHH Vạn Xuân (nhà máy đạt chuẩn GMP) dùng cho quy trình phân lập, thiết lập chất đối chiếu và điều chế cao; các mẫu dược liệu thu hái tại Cần Thơ, Trà Vinh, Cà Mau (tháng 4/2017) dùng để thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 4 lignan. Động vật thực nghiệm là thỏ khỏe mạnh (trọng lượng 2 ± 0,5 kg). Toàn bộ các thử nghiệm phân tích, phổ học và phân tích sinh học được thực hiện tại các khoa chuyên môn thuộc Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Công trình được hoàn thành và bảo vệ năm 2021.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm lại

Tác giả đã tổng hợp và phân tích hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến ba mảng nội dung chính:

Hướng nghiên cứu	Tác giả, năm công bố	Phương pháp và kết quả chính
Chiết xuất, phân lập lignan	Kassuya C. và cs (2003)	Chiết n-hexan từ bột lá P. amarus, sắc ký cột silica gel 60, phân lập nirtetralin, niranthin, hypophyllanthin, phyltetralin, phyllanthin.
	Maciel M. M. và cs (2007)	Chiết ngấm kiệt bằng methanol, phân lập 6 lignan: isolintetralin, demethylenedioxy-niranthin, 5-demethoxy-niranthin, niranthin, phyllanthin, hypophyllanthin.
	Srivastava V. và cs (2008)	Chiết ngấm kiệt bằng ethanol, sắc ký cột và tinh chế bằng kết tinh cùng HPLC điều chế thu được phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin.
	Parvathaneni M. và cs (2013)	Chiết Soxhlet bằng n-hexan, phân lập và tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế thu phyllanthin và hypophyllanthin (>95%).
	Yuandani và cs (2013)	Chiết methanol, sắc ký cột chân không (VLC) và sắc ký cột, kết tinh dung môi thu 115 mg phyllanthin và 235,5 mg hypophyllanthin độ tinh khiết >98%.
	Liu S. và cs (2014)	Chiết ethanol 80%, sắc ký cột thu 4,1 g niranthin độ tinh khiết 99% từ Phyllanthus niruri.
	Garg C. và cs (2016)	Tối ưu hóa chiết phyllanthin có hỗ trợ vi sóng (MAE) bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM).
	Noor M. và cs (2019)	Chiết ethanol, phân lập hypophyllanthin, niranthin, lintetralin bằng sắc ký điều chế pha đảo.
	Huỳnh Ngọc Thụy (2008)	Chiết cao toàn phần, phân lập nirurin, epibubbialin, phyllanthin, acid p-coumaric, acid gallic, uracil.
	Trần Anh Tuấn (2010)	Chiết methanol, phân lập quercetin, astragalin, quercitrin, isoquercitrin, pinoresinol, syringaresinol, hypophyllanthin.
	Lữ Thị Kim Chi, Nguyễn Ngọc Vinh (2012)	Chiết nóng dicloromethan quy mô 9 kg, sắc ký cột và kết tinh thu 890 mg phyllanthin tinh khiết làm chất đối chiếu.
Định lượng lignan trong dược liệu	Arvind K. và cs (2006); Dhalwal K. và cs (2006); Nayak S. và cs (2010); Khabiya R. và cs (2014)	Phát triển phương pháp HPTLC định lượng phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trên bản mỏng silica gel 60 F254.
	Murugaiyah V. và cs (2007)	Phương pháp HPLC đầu dò huỳnh quang (HPLC-FL) định lượng đồng thời 4 lignan trong P. niruri, cho giới hạn phát hiện thấp hơn phương pháp UV.
	Patel J. (2011); Alvari A. (2011); Kandavel D. (2015); Harikrishnan H. (2018)	Phát triển phương pháp HPLC-UV/PDA pha đảo định lượng phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin.
	Trần Thùy Trang, Huỳnh Ngọc Thụy (2010); Trần Thu Huyền và cs (2018)	Định lượng phyllanthin bằng HPLC-UV và UPLC đầu dò huỳnh quang.
Dược động học & Phân tích mẫu sinh học	Murugaiyah V. và cs (2007)	Định lượng bằng HPLC-FL trong huyết tương chuột; tính sinh khả dụng tuyệt đối của phyllanthin (0,62%), hypophyllanthin (1,52%), phyltetralin (4,01%), niranthin (2,66%).
	Fan H. và cs (2015)	HPLC-MS/MS định lượng 4 lignan trong huyết tương chuột sau khi uống dịch chiết P. urinaria, ghi nhận hiện tượng hấp thu kép (2 đỉnh Cmax).
	Nguyễn Văn Long (2019)	LC-MS/MS định lượng phyllanthin trong huyết tương chuột, so sánh dược động học giữa cao chiết chuẩn hóa P. amarus và phức hợp phospholipid.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có các công bố về chiết xuất và phân tích lignan, đa phần các nghiên cứu trong nước chỉ tập trung vào đơn chất phyllanthin. Việc thiết lập các chất đối chiếu thứ cấp có chứng chỉ phân tích đầy đủ cho hypophyllanthin và niranthin theo các tiêu chuẩn quốc tế (ISO, WHO, DĐVN) vẫn chưa được thực hiện hoàn chỉnh. Bên cạnh đó, các nghiên cứu dược động học trước đây chủ yếu thực hiện trên đối tượng chuột cống/chuột nhắt với các phân đoạn đơn lẻ hoặc dịch chiết thô, chưa có nghiên cứu đánh giá đồng thời hồ sơ dược động học của cả ba hoạt chất chính (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin) từ dạng cao chiết chuẩn hóa trên mô hình thỏ thực nghiệm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS/MS).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Phân loại thực vật học: Hệ thống phân loại của Takhtajan A. (2009) xếp Diệp hạ châu đắng thuộc loài Phyllanthus amarus Schum., chi Phyllanthus, họ Euphorbiaceae, bộ Euphorbiales.
• Hóa học các hợp chất tự nhiên: Các lignan trong Diệp hạ châu đắng thuộc nhóm dibenzylbutan và dẫn chất tetralin lignan, có tính phân cực trung bình - yếu, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như dicloromethan, cloroform, ethyl acetat, methanol.

Hợp chất	Công thức phân tử	Khối lượng phân tử ($g/mol$)	Hệ số $\log P_{ow}$	Điểm chảy ($^\circ\text{C}$) / Độ tan
Phyllanthin	$\text{C}{24}\text{H}{34}\text{O}_6$	$418{,}5$	$3{,}2$	$96^\circ\text{C}$; tan trong cloroform, methanol, ethanol; kém tan trong nước.
Hypophyllanthin	$\text{C}{24}\text{H}{30}\text{O}_7$	$430{,}5$	$3{,}6$	Tan trong dicloromethan, ethyl acetat, DMSO ($\sim 10\text{ mg/mL}$), DMF ($\sim 30\text{ mg/mL}$).
Niranthin	$\text{C}{24}\text{H}{32}\text{O}_7$	$432{,}5$	$4{,}1$	Tan trong cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, DMSO, aceton.
Nirtetralin	$\text{C}{24}\text{H}{30}\text{O}_7$	$430{,}5$	$3{,}6$	Tan trong cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, DMSO, aceton.
Phyltetralin	$\text{C}{24}\text{H}{32}\text{O}_6$	$416{,}5$	$3{,}8$	Tan trong cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, DMSO, aceton.

• Khung thẩm định phương pháp phân tích và thiết lập chất đối chiếu: Tuân thủ các hướng dẫn của Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa (ICH), Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ (USP).
• Khung thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinh học: So sánh và áp dụng các tiêu chí từ hướng dẫn của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US-FDA 2018) và Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA 2015).

Chỉ tiêu	Hướng dẫn US-FDA (2018)	Hướng dẫn EMA (2015)
Tính đặc hiệu	$\ge 6$ lô mẫu sinh học trắng. Đáp ứng tại LLOQ đạt độ đúng và độ chính xác.	$\ge 6$ lô mẫu trắng. Nhiễu nền tại pic chất phân tích $\le 20%$ LLOQ; tại pic IS $\le 5%$.
Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)	Điểm thấp nhất đường chuẩn; $\text{LLOQ} \le \text{C}_{\max}/20$; tín hiệu $\ge 5$ lần mẫu trắng; $\text{CV} \le 20%$, độ đúng $80 - 120%$.	Tương tự US-FDA; tín hiệu $\ge 5$ lần mẫu trắng; $\text{CV} \le 20%$, độ đúng $80 - 120%$.
Đường chuẩn & độ tuyến tính	Tối thiểu $6 - 8$ mức nồng độ; $\text{CV} \le 20%$ tại LLOQ và $\le 15%$ tại các mức khác; tối thiểu 3 đường chuẩn.	Tối thiểu 6 mức nồng độ; $\text{CV} \le 20%$ tại LLOQ và $\le 15%$ tại các mức khác.
Mẫu kiểm tra chất lượng (QC)	3 mức nồng độ (LQC, MQC, HQC); độc lập với mẫu đường chuẩn.	3 mức nồng độ (LQC, MQC, HQC); độc lập với mẫu đường chuẩn.
Độ đúng & độ chính xác	Thực hiện tối thiểu 3 mức nồng độ; $\text{CV} \le 20%$ (tại LLOQ) và $\le 15%$ (các mức khác); độ đúng $85 - 115%$ (tại LLOQ: $80 - 120%$).	Thực hiện 4 mức (LLOQ, $3\times\text{LLOQ}$, MQC, HQC); $\text{CV} \le 20%$ (LLOQ) và $\le 15%$ (mức khác).
Hiệu suất chiết	Khảo sát ở 3 mức LQC, MQC, HQC; yêu cầu ổn định và có tính tái lập.	Không quy định cụ thể mức giới hạn bắt buộc.
Ảnh hưởng nền mẫu (Matrix effect)	Đánh giá sự thay đổi đáp ứng của chất phân tích trên $\ge 6$ lô mẫu sinh học.	$\text{CV}$ của hệ số nền mẫu (MF) chuẩn hóa qua IS không vượt quá $15%$ trên 6 lô mẫu.
Lượng mẫu tồn dư (Carry-over)	Không đề cập cụ thể.	Tiêm mẫu trắng sau mẫu ULOQ: tồn dư $\le 20%$ tại LLOQ và $\le 5%$ đối với IS.

• Lý thuyết dược động học: Sử dụng phương pháp phân tích phi ngăn (non-compartmental analysis) để tính toán các thông số: diện tích dưới đường cong ($\text{AUC}{0-t}$, $\text{AUC}{0-\infty}$), nồng độ đỉnh trong huyết tương ($\text{C}{\max}$), thời gian đạt nồng độ đỉnh ($\text{T}{\max}$), thời gian bán thải ($\text{T}_{1/2}$) và hằng số tốc độ thải trừ ($\text{K}_e$).

Phương pháp thực nghiệm

• Chiết xuất và phân lập: Chiết nóng, ngấm kiệt, sắc ký cột cổ điển (silica gel cỡ hạt $40 - 60\ \mu\text{m}$), sắc ký điều chế pha thuận (cột HiQ Sil-10 KYATECH $21{,}2 \times 250\text{ mm}$, $10\ \mu\text{m}$) và pha đảo (cột Prep-C18 $21{,}2 \times 250\text{ mm}$, $10\ \mu\text{m}$) trên hệ thống Shimadzu LC-20A.
• Xác định cấu trúc hóa học và độ tinh khiết:
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) trên máy Bruker Avance 500 MHz.
  • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên máy Nicolet Magna 760; phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis (Shimadzu UV-1800).
  • Phân tích nhiệt vi sai DSC trên máy TGA/DSC 1 Stare System.
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC) và HPLC đầu dò dãy diod quang (PDA Shimadzu UFLC SPD-M20A).
• Thử nghiệm in vivo và phân tích dịch sinh học:
  • Cho thỏ uống cao chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng; lấy máu tĩnh mạch tai thỏ tại các thời điểm xác định ($0$ đến $24\text{ giờ}$); bảo quản mẫu huyết tương ở $-70^\circ\text{C}$.
  • Xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi $n$-hexan; sử dụng diazepam/carbamazepin làm chuẩn nội (IS).
  • Định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần Shimadzu LC-MS/MS 8040 ở chế độ ghi nhận ion phân mảnh đa phản ứng (MRM).

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tổng quan bối cảnh sử dụng Diệp hạ châu đắng trong điều trị bệnh gan tại Việt Nam, sự cần thiết phải kiểm soát chất lượng bằng các kỹ thuật phân tích hiện đại, lý do lựa chọn đề tài và xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể của luận án.

Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp các dữ liệu khoa học về:

• Đặc điểm thực vật học, nguồn gốc, phân bố sinh thái, kỹ thuật gieo trồng, thu hái và thành phần hóa học của cây Phyllanthus amarus (chứa các nhóm hợp chất: alkaloid, flavonoid, lignan, ellagitannin, sterol, terpenoid).
• Tính chất lý hóa và công thức cấu tạo của 5 lignan chính: phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin, phyltetralin.
• Tổng hợp các bằng chứng thực nghiệm về tác dụng dược lý: bảo vệ tế bào gan, kháng virus viêm gan B, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, hạ đường huyết, hạ huyết áp; dữ liệu an toàn độc tính cấp cho thấy dịch chiết không gây độc tính trên chuột ở liều uống lên đến $5000\text{ mg/kg}$.
• Phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp chiết xuất (dung môi hữu cơ, chiết siêu tới hạn SFE, chiết hỗ trợ vi sóng MAE, chiết dưới áp suất cao PLE) và các phương pháp định lượng lignan trong dược liệu và dịch sinh học (TLC, HPTLC, HPLC-UV/PDA, HPLC-FL, GC-MS, LC-MS/MS).
• Cơ sở lý luận về thiết lập cao đối chiếu theo tiêu chuẩn USP và các nguyên tắc đánh giá sinh khả dụng, thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US-FDA và EMA.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết:

• Dược liệu nghiên cứu, chất chuẩn đối chiếu (phyllanthin, diazepam, carbamazepin, cao chuẩn P. amarus USP), hóa chất, dung môi phân tích và các hệ thống trang thiết bị phân tích hiện đại.
• Thiết kế thực nghiệm chiết xuất, phân lập và tinh chế các lignan từ cao dicloromethan qua các cột sắc ký và hệ thống sắc ký điều chế.
• Quy trình thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết, đánh giá liên phòng thí nghiệm và ấn định giá trị chất đối chiếu cho hypophyllanthin và niranthin.
• Quy trình khảo sát thông số chiết xuất ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm cao khô chuẩn hóa (độ ẩm, tro toàn phần, kim loại nặng, giới hạn vi sinh vật, hàm lượng lignan).
• Phương pháp thẩm định quy trình định lượng LC-MS/MS trong huyết tương thỏ và quy trình lấy mẫu đánh giá dược động học in vivo.

Kết quả nghiên cứu

Nội dung chương Kết quả nghiên cứu được tổ chức thành 4 phần chính tương ứng với 4 mục tiêu:

1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc, độ tinh khiết của các chất phân lập được

Từ dịch chiết cao dicloromethan của Diệp hạ châu đắng, thông qua sắc ký cột silica gel và sắc ký điều chế, tác giả đã phân lập và tinh chế thành công các hợp chất lignan:

• Hợp chất PA2 (niranthin), PA3 (nirtetralin), PA4 (hypophyllanthin), PA5 (phyltetralin) và PA6 (phyllanthin).
• Cấu trúc hóa học của các chất được xác định chính xác thông qua phân tích dữ liệu phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT và các phổ tương quan 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) đối chiếu với các công trình chuẩn đã công bố.
• Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được bằng SKLM, HPLC và phân tích nhiệt vi sai (DSC).

2. Xác định chất lượng và thiết lập chất đối chiếu

• Thẩm định phương pháp HPLC xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin, niranthin và nirtetralin (đạt các tiêu chí về tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian).
• Đánh giá liên phòng thí nghiệm tại các phòng kiểm nghiệm đạt chuẩn GLP/ISO.
• Thiết lập và ấn định giá trị hàm lượng/độ tinh khiết cho chất đối chiếu hypophyllanthin và chất đối chiếu niranthin dùng trong kiểm nghiệm dược phẩm.

3. Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng

• Khảo sát các điều kiện chiết xuất ảnh hưởng đến hàm lượng lignan: loại dung môi chiết, thời gian ngâm chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi, số lần chiết ở cả quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot.
• Xây dựng quy trình điều chế cao khô giàu lignan đồng nhất và ổn định.
• Thẩm định phương pháp HPLC-PDA định lượng đồng thời 4 hợp chất lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin/phyltetralin) trong dược liệu và các mẫu cao chiết:
  • Khảo sát tính phù hợp của hệ thống ($n = 6$, $\text{RSD} < 2%$).
  • Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
  • Khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng (độ thu hồi nằm trong khoảng quy định).
• Kiểm nghiệm toàn diện các chỉ tiêu chất lượng của cao khô Diệp hạ châu đắng: mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn và hàm lượng hoạt chất lignan. Ứng dụng định lượng hàm lượng 4 lignan trên các mẫu dược liệu thu hái tại Cần Thơ, Trà Vinh, Cà Mau.

4. Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng

• Xây dựng và thẩm định đầy đủ quy trình định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trong huyết tương thỏ bằng LC-MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA:
  • Tối ưu hóa điều kiện ion hóa phun điện (ESI) và các thế phân mảnh ở chế độ MRM; lựa chọn pha động đệm amoni format $5\text{ mM}$ và acetonitril; tối ưu hóa nhiệt độ cột, tốc độ dòng và thể tích tiêm.
  • Tối ưu hóa kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương bằng chiết lỏng - lỏng với dung môi $n$-hexan, đạt hiệu suất chiết cao và loại bỏ ảnh hưởng nền mẫu.
  • Kết quả thẩm định đạt yêu cầu về tính chọn lọc, LLOQ, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày, độ ổn định mẫu và lượng mẫu tồn dư.
• Cho thỏ uống liều chỉ định của cao chuẩn hóa, lấy máu tai tại các thời điểm xác định và phân tích nồng độ thuốc theo thời gian:
  • Xây dựng đường cong nồng độ trung bình trong huyết tương theo thời gian của phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin.
  • Xác định các thông số dược động học trung bình ($\text{C}{\max}$, $\text{T}{\max}$, $\text{AUC}{0-t}$, $\text{AUC}{0-\infty}$, $\text{T}_{1/2}$, $\text{K}_e$) cho từng hoạt chất lignan trong chế phẩm cao chuẩn hóa trên thỏ thực nghiệm.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về lý luận và khoa học

1. Phân lập và nhận danh cấu trúc đầy đủ: Đã phân lập, tinh chế và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của các lignan chính trong Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.) gồm hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin, phyltetralin và phyllanthin bằng tổ hợp các phương pháp phổ học hiện đại ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, MS).
2. Thiết lập chất đối chiếu theo chuẩn quốc tế: Thiết lập thành công 02 chất đối chiếu cấp quốc gia/ngành là hypophyllanthin và niranthin với đầy đủ dữ liệu thẩm định độ tinh khiết, kiểm tra liên phòng thí nghiệm và ấn định giá trị hàm lượng chuẩn xác, giải quyết tình trạng phụ thuộc vào chất chuẩn ngoại nhập đắt tiền.
3. Phương pháp phân tích đồng thời: Phát triển và thẩm định quy trình sắc ký lỏng (HPLC-PDA) định lượng đồng thời 4 lignan trong dược liệu và cao chiết, nâng cao tính đặc hiệu so với các phương pháp định lượng đơn lẻ trước đây.
4. Hồ sơ dược động học in vivo bằng LC-MS/MS: Xây dựng và thẩm định thành công quy trình phân tích siêu vết đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật LC-MS/MS đạt tiêu chuẩn US-FDA và EMA; lần đầu tiên công bố bộ dữ liệu đầy đủ về các thông số dược động học ($\text{C}{\max}$, $\text{T}{\max}$, $\text{AUC}$, $\text{T}_{1/2}$) của 3 lignan chính sau khi thỏ uống cao chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng 02 chất đối chiếu hypophyllanthin và niranthin đã thiết lập vào công tác kiểm nghiệm thường quy tại các viện kiểm nghiệm và trung tâm kiểm nghiệm trên toàn quốc.
• Bổ sung chỉ tiêu định lượng đồng thời các hợp chất lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin) vào chuyên luận Diệp hạ châu đắng và các chế phẩm liên quan trong Dược điển Việt Nam các lần xuất bản tiếp theo.
• Ứng dụng quy trình chiết xuất và tiêu chuẩn cơ sở của cao khô giàu lignan vào quy mô sản xuất công nghiệp tại các doanh nghiệp dược phẩm nhằm đảm bảo tính đồng nhất giữa các lô sản xuất.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các thông số dược động học trong luận án được thu thập trên mô hình động vật thực nghiệm (thỏ), do đó chưa phản ánh hoàn toàn các biến thiên dược động học, tỷ lệ gắn kết protein huyết tương và chuyển hóa bước đầu trên cơ thể người.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục mở rộng đánh giá dược động học lâm sàng và sinh khả dụng của viên thành phẩm chứa cao chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng trên người tình nguyện khỏe mạnh.
  • Nghiên cứu các dạng bào chế hiện đại (hệ tự nhũ hóa, phức hợp phospholipid/phytosome) nhằm cải thiện độ tan và nâng cao sinh khả dụng đường uống của các hoạt chất lignan kém tan.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc, Hóa dược - Hợp chất tự nhiên: Luận án là tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp luận phân lập, tinh chế hợp chất tự nhiên, kỹ thuật giải phổ NMR/MS phức tạp và quy trình thiết lập chất đối chiếu theo chuẩn GLP/ISO.
• Đối với chuyên viên phân tích sinh học và Dược động học: Quy trình xử lý mẫu huyết tương và phương pháp thẩm định LC-MS/MS theo hướng dẫn kết hợp US-FDA/EMA là tài liệu thực hành có giá trị cao cho các nghiên cứu tương đương sinh học (BA/BE).
• Đối với các nhà quản lý dược, Hội đồng Dược điển và cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu: Cung cấp cơ sở khoa học thực chứng để nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng các chế phẩm Diệp hạ châu đắng lưu hành trên thị trường.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tác giả đã thiết lập các chất đối chiếu nào và bằng các phương pháp nào?

Tác giả đã phân lập, tinh chế và thiết lập 02 chất đối chiếu là hypophyllanthin và niranthin (cùng việc kiểm tra chất lượng nirtetralin và sử dụng chất chuẩn phyllanthin). Quy trình xác định độ tinh khiết và ấn định giá trị được thực hiện bằng sự kết hợp của sắc ký lớp mỏng (TLC), HPLC đầu dò PDA, phân tích nhiệt vi sai (DSC) và đánh giá liên phòng thí nghiệm theo các quy định của DĐVN và hướng dẫn quốc tế.

2. Sự khác biệt chính giữa hướng dẫn thẩm định mẫu sinh học của US-FDA (2018) và EMA (2015) được luận án phân tích là gì?

Luận án đã so sánh chi tiết: EMA (2015) đưa ra các tiêu chí định lượng rất cụ thể đối với mức độ nhiễu nền tại đáp ứng của chất phân tích ($\le 20%$ LLOQ) và chất chuẩn nội ($\le 5%$), yêu cầu đánh giá hệ số ảnh hưởng nền mẫu (Matrix Factor) chuẩn hóa qua IS trên 6 lô mẫu với $\text{CV} \le 15%$, và quy định chặt chẽ về lượng mẫu tồn dư (Carry-over $\le 20%$ LLOQ). Trong khi đó, US-FDA (2018) nhấn mạnh yêu cầu LLOQ phải $\le \text{C}_{\max}/20$ và khảo sát độ ổn định mẫu ở các điều kiện bảo quản dài hạn, đông - rã đông và sau xử lý mẫu ở 3 mức QC.

3. Kỹ thuật nào được sử dụng để định lượng đồng thời các hoạt chất trong huyết tương thỏ?

Tác giả sử dụng hệ thống sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ LC-MS/MS (Shimadzu LC-MS/MS 8040) với đầu dò ion hóa phun điện (ESI) ở chế độ ghi nhận ion phân mảnh đa phản ứng (MRM). Mẫu huyết tương thỏ được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng sử dụng dung môi $n$-hexan và sử dụng chất chuẩn nội (IS) phù hợp để định lượng đồng thời phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin.

4. Cao chiết Diệp hạ châu đắng trong luận án được tiêu chuẩn hóa theo những chỉ tiêu nào?

Cao khô Diệp hạ châu đắng được kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa theo các chỉ tiêu: cảm quan, mất khối lượng do làm khô (độ ẩm), tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn (vi sinh vật), định tính bằng SKLM/HPLC đối chiếu với cao chuẩn Phyllanthus amarus USP, và định lượng đồng thời hàm lượng 4 hợp chất lignan chính bằng HPLC-PDA.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Văn Sơn là công trình nghiên cứu toàn diện và có hệ thống thuộc chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, giải quyết thành công các vấn đề then chốt trong việc kiểm soát chất lượng Diệp hạ châu đắng. Đề tài đã phân lập và thiết lập thành công 02 chất đối chiếu có độ tinh khiết cao là hypophyllanthin và niranthin, hoàn thiện quy trình điều chế và tiêu chuẩn hóa cao khô giàu lignan ở quy mô pilot. Đồng thời, luận án đã xây dựng phương pháp LC-MS/MS hiện đại đạt tiêu chuẩn quốc tế để xác định chính xác các thông số dược động học của cao chuẩn hóa trên động vật thực nghiệm, đóng góp dữ liệu khoa học quan trọng cho công tác kiểm nghiệm và phát triển thuốc từ dược liệu tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam có kinh nghiệm từ lâu đời về việc sử dụng dược liệu và chế phẩm có nguồn gốc dược liệu để điều trị bệnh. Nhiều dược liệu đã được sử dụng từ rất lâu qua kinh nghiệm dân gian, kiến thức y học cổ truyền, bài thuốc gia truyền,. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae) là một trong những dược liệu được sử dụng rất phổ biến và đã được công nhận sử dụng chẳng những theo Y học Việt Nam mà còn khắp nơi trên thế giới với tác dụng chính là cải thiện chức năng gan ở các đối tượng viêm gan do nhiều nguyên nhân khác nhau, đặc biệt là viêm gan B [4], [21], [53], [56], [76], [100]. Tổ chức y tế thế giới và Dược điển các nước đều đã đưa ra các yêu cầu kiểm tra chất lượng các thuốc từ dược liệu phải dựa trên các kỹ thuật phân tích hiện đại, với việc sử dụng các chất đối chiếu phù hợp [103].

Dược điển Việt Nam V đã có chuyên luận Diệp hạ châu đắng và cao đặc Diệp hạ châu đắng [2]. Dược điển Mỹ hiện hành cũng đã có các chuyên luận dược liệu Diệp hạ châu đắng, bột Diệp hạ châu đắng [98]. Các chuyên luận trên đều có các chỉ tiêu định tính, định lượng sử dụng chất chuẩn đối chiếu là chất điểm chỉ phyllanthin. Hiện nay, trên thị trường nhiều sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng, chủ yếu được bào chế từ nguyên liệu là cao toàn phần, với công dụng là có hiệu quả trong tác dụng bảo vệ gan.

Tất cả những sản phẩm này đều công bố chất lượng dựa trên tiêu chuẩn cơ sở tự xây dựng. Đa số, các tiêu chuẩn cơ sở của các thành phẩm được xây dựng chỉ dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần bằng phương pháp không đặc hiệu, không đưa được chỉ tiêu định lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học cũng như chưa xác định mức hàm lượng cho các chất có hoạt tính trong liều điều trị do thiếu chất chuẩn đối chiếu và chưa có nghiên cứu về dược động học của các chất có hoạt tính sinh học cho các sản phẩm từ dược liệu này. Trong khi tác dụng sinh học của Diệp hạ châu đắng không chỉ do phyllanthin mà còn có hypophyllanthin và niranthin. Các chất này có vai trò hết sức quan trọng trong tác dụng bảo vệ gan, kháng viêm, chống ung thư [30], [67].

2 Bên cạnh đó, công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu hay sản phẩm từ dược liệu còn tương đối khó khăn và đang còn bỏ ngõ trong lĩnh vực kiểm nghiệm do thiếu phương pháp thử, chất chuẩn đối chiếu, cao chuẩn đối chiếu,. Mặt khác, các chất chuẩn đối chiếu chưa sẵn có và giá thành rất cao; phương pháp thử cũng cần xây dựng cho phù hợp với trình độ khoa học kỹ thuật chung của cả thế giới để nâng cao chất lượng các sản phẩm trên. Ngoài ra, nghiên cứu sinh khả dụng nhằm đánh giá các thông số dược động học của chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng sẽ giúp minh chứng hỗ trợ điều trị bảo vệ gan hiệu quả hơn. Do đó, việc phân lập các chất có hoạt tính sinh học làm chất đối chiếu, tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng cũng như xác định sinh khả dụng của chế phẩm để làm cơ sở cho việc kiểm tra chất lượng và ước định liều dùng cho các sản phẩm từ Diệp hạ châu đắng là hết sức cần thiết.

Từ các lý do trên, đề tài “Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae)” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. - Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 1. Tên gọi, phân loại [1], [4] Tên thực vật: Diệp hạ châu đắng. Tên khác: Chó đẻ răng cưa, chó đẻ thân xanh, cam kiềm, kiền đắng, cỏ trân châu, rút đất, trân châu thảo, lão nha châu, diệp hòa thái.

Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan A. năm 2009 [94], cây Diệp hạ châu đắng có vị trí phân loại thực vật như sau: Giới (regnum) Plantae Ngành (division) Magnoliophyta (ngọc lan) Lớp (class) Magnoliopsida (ngọc lan) Bộ (ordo) Euphorbiales (thầu dầu) Họ (familia) Euphorbiaceae (thầu dầu) Chi (genus) Phyllanthus Loài (species) Phyllathus amarus Schum. Phân bố - sinh thái Euphorbiaceae là một họ thực vật lớn bao gồm khoảng 6.500 loài trong 300 chi.

Phyllanthus cũng là một chi lớn, có khoảng 200 loài ở Mỹ, 100 loài ở Châu Phi, 70 loài ở Madagascar, phần còn lại ở châu Á và châu Úc. Diệp hạ châu đắng là cây ưa sáng, ưa ẩm nhưng không chịu được ngập úng. Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa.) pH từ 5,0 đến 6,5. Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25-30 oC.

Cây ra hoa quả nhiều, tái sinh tốt từ hạt, vòng đời kéo dài 3-5 tháng. Trong tự nhiên, cây thường mọc trên đất ẩm ở ven đồi, trên nương rẫy, bãi hoang hay ven đường đi và quanh làng bản, ở cả miền núi lẫn trung du và đồng bằng [21]. Đặc diểm thực vật Cây thảo cao 40-80 cm, thân tròn, bóng, màu xanh, phân nhánh đều, nhiều. Lá mọc so le xếp thành hai dãy sít nhau trông như lá kép hình lông chim.

Phiến lá hình bầu dục, dài từ 5 mm đến 10 mm, rộng 3 mm đến 6 mm, màu xanh thẫm ở mặt trên, 4 màu xanh nhạt ở mặt dưới. Hoa đực và hoa cái mọc thành cụm. Hoa đực có cuống ngắn 1 mm đến 2 mm, đài 5, có tuyến mật, nhị 3, chỉ nhị dính nhau. Hoa cái có cuống dài hơn hoa đực.

Quả nang, nhẵn, hình cầu, đường kính 1,8 mm đến 2 mm, có đài tồn tại. Quả chứa 6 hạt hình tam giác, đường kính 1 mm, hạt có sọc dọc ở lưng [1]. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiacea (trái) và hoa (phải) Diệp hạ châu đắng Hình 1. Mặt dưới của lá (trái) và các quả (phải) Diệp hạ châu đắng 1.

Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái [4]. Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Phyllanthi amari Gieo trồng: Gieo hạt ở vườn ươm: tháng 1-2, trồng cây con: tháng 2-3, thu hoạch: tháng 4-5 (sau khi trồng 45-50 ngày). Nhìn chung, thời vụ trồng Diệp hạ châu đắng kéo dài cả mùa khô, tận dụng trời nắng để phơi. Thu hái: Sau khi trồng khoảng 45-50 ngày, cây Diệp hạ châu đắng cao 60-70 cm là thu hoạch.

Năng suất đạt 10-12 tấn tươi/ha/vụ. Một năm có thể trồng 2 vụ. Diệp hạ châu đắng là cây thuốc dễ trồng, cây không kén đất. Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Thành phần hóa học của Phyllanthus amarus bao gồm: lignan, alkaloid, flavonoid, tannin thủy phân (Ellagitannin), polyphenol, triterpen, sterol và tinh dầu, như bảng liệt kê trong Bảng 1.

Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Nhóm Hoạt chất Tài liệu Alkaloid Epibubbialin, isobubbialin, norsecurinin, securinin, securinol, [8], [46] 4-methoxy-nor-securinin, dihydrosecurinin, allo-securin, tetrahydrosecurinin, 4-methoxy dihydrosecurinin, 4-hydrosecurinin, 4-methoxy tetrahydrosecurinin Flavonoid Quercetin, rhamnocitrin, rutin, apigenin, luteolin, kaempferol, [5], [47], allocatechin, astragalin, quercetin-3-O-glucosid, quercitrin, [89] 4′,5,7-triethoxy-3,3′,6-trimethoxy flavon, phyllanthusiin Lignan Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, phyltetralin, [10], [53], nirtetralin, isonirtetralin, hinokinin, lintetralin, isolintetralin, [54], [81], demethylenedioxy niranthin, 5-demethoxy-niranthin, 7′- [84], [85], oxocubebin dimethyl ether, (3-(3,4-dimethoxybenzyl)-4-(7- [90], methoxybenzo[1,3]dioxol-5-yl-methyl)-dihydrofuran-2-on, và [91]. Sterol Amarosterol A, amarosterol B, cycloeucalenyl acetat, [47] macdougallin, ergosta-5,7,22-trien-3-ol acetat, 17-(1,5- dimethylhexyl)-6-hydroxy-5-methylestr-9-en-3-yl acetat, stigmasterol, β-sitosterol, daucosterol, stigmast-5-en-3-ol oleat, 6,7-epoxypregn-4-en-9,11,18-triol-3,20-dion, 11,18-diacetat, bufalin, 3-acetoxy-7,8-epoxylanostan-11-ol Tannin và Amariin, acid amariinic, amarulon, corilagin, geraniin, acid [47] phenol geranic, furosin, phyllanthusiin A, B, C và D, acid ellagic, acid repandusinic, elaeocarpusin, acid 4-galloyl quinic, acid gallic, gallocatechin, 1,6-digalloylglucopyranose, acid 4-O- galloylquinic, acid quicnic, acid geraniinic B, cidrepandusinic A, isocorilagin, melatonin. Terpenoid Phyllanosid, 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, [47], [56] linalool, phytol, olean-13(18)-en, methyl ursolat, barringenol R1, Phenazin và dẫn chất phenazin 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, lupeol, phyllanthenol, phyllanthenon, phyllantheol, acid oleanolic, acid ursolic Nhóm Acid cinnamic, acid 4-hydroxy-3-methoxy-benzoic, acid [47] khác brevifolin carboxylic, rhodopin 1. Tính chất lý hóa một số hợp chất lignan 1.

Phyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H34O6 Phyllanthin (IUPAC): 4-[(2S,3S)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-1,2-dimethoxybenzen CAS: 10351-88-9 Khối lượng phân tử: 418,5 g/mol 6 Hệ số log Pow: 3,2 Tính tan: tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, methanol, ethanol, kém tan trong nước Điểm chảy: 96 C 1. Hypophyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Hypophyllanthin (IUPAC): (7R,8R,9S)-9-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy- 7,8-bis(methoxymethyl)-6,7,8,9-tetrahydrobenzo[g][1,3]benzodioxol CAS: 33676-00-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,6 Tính tan: Tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton ~ 0,2 trong ethanol, ~10 mg/mL trong dimethylsulfoxid, ~ 30 mg/mL trong dimethylformamid. Niranthin [105] Công thức phân tử: C24H32O7. Niranthin (IUPAC): 6-[(2R,3R)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-4-methoxy-1,3-benzodioxol.

CAS: 50656-77-4 Khối lượng phân tử: 432,5 g/mol Hệ số log Pow: 4,1 Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. Nirtetralin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Nirtetralin (IUPAC): (5R,6S,7S)-5-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy-6,7- bis(methoxymethyl)-5,6,7,8-tetrahydrobenzo[f][1,3]benzodioxol CAS: 50656-78-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,6 7 Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. Phyltetralin [105] Công thức phân tử: C24H32O6 Phyltetralin (IUPAC): ((1R,2S,3S)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-dimethoxy- 2,3-bis(methoxymethyl)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen CAS: 123048-17-9 Khối lượng phân tử: 416,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,8 Tính tan: Tan trong: cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. MeO OMe OMe MeO OMe OMe Phyllanthin Hypophyllanthin O MeO O OMe OMe OMe OMe OMe OMe O O MeO OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe Niranthin Nirtetralin Phyltetralin Hình 1.

Công thức hóa học của một số lignan 1. Tác dụng sinh học Diệp hạ châu đắng là một thảo dược đã được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Thành phần hóa học của cây rất phong phú, đa dạng, có chứa nhiều nhóm chất như alkaloid, flavonoid, lignan, tannin thủy phân (ellagitannin), polyphenol, triterpen, 8 sterol và tinh dầu. Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng dược lý có ích trong điều trị bệnh, đã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Diệp hạ châu đắng như tác dụng bảo vệ tế bào gan, trị viêm gan, hoạt tính kháng khối u, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và ký sinh trùng.

Ngoài ra, còn có hoạt tính kháng HIV, chống oxy hóa, hạ đường huyết và cholesterol trong máu. Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của Phyllanthus amarus trong nước cũng như trên thế giới, có thể liệt kê trong bảng sau: Bảng 1.