Luận án TS. Nguyễn Thị Khuê: Hệ gen ty thể sán lá phổi Paragonimidae tại Việt Nam

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ paragonimidae tại việt nam và, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh Học
• Đề tài: Luận Án Tiến Sĩ Nghiên Cứu Hệ Gen Ty Mạch Đơn Vị Mã Hóa Ribosome Của Sán Lá Phổi Họ Paragonimidae Tại Việt Nam Và Một Số Khu Vực Ở Châu Á
• Loại tài liệu: Luận Án
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• Danh mục các chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.1. Phân loại sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.2. Phân bố địa lý sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.3. Đặc điểm sinh học sán lá phổi họ Paragonimidae
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae trên thế giới
• 1.1.5. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae ở Việt Nam
• 1.2. Giới thiệu ty thể, ribosome của ty thể và hệ gen ty thể
• 1.2.1. Giới thiệu ty thể, nguồn gốc, cấu tạo và chức năng
• 1.2.2. Cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể
• 1.2.3. Mitoribosome của ty thể và thành phần cấu tạo
• 1.2.4. Đặc điểm gen học hệ gen ty thể
• 1.3. Cấu trúc đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân
• 1.3.1. Cấu trúc ribosome của tế bào
• 1.3.2. Đơn vị mã hóa ribosome của hệ gen nhân tế bào
• 1.3.3. Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử của đơn vị mã hóa ribosome
• 1.4. Sự cần thiết nghiên cứu đặc điểm gen hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi Paragonimus
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, mục tiêu, nội dung và địa điểm nghiên cứu
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2.1. Nguồn vật liệu là mẫu sán lá phổi nghiên cứu
• 2.2.2. Vật liệu khuôn DNA và các loại mồi sử dụng
• 2.2.3. Hóa chất, sinh phẩm, dụng cụ
• 2.2.4. Trang thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu gen và hệ gen ty thể (mtDNA)
• 2.3.1. Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và P. ohirai
• 2.3.2. Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA ribosome ty thể (MRG)
• 2.3.3. Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA)
• 2.3.4. Phương pháp phân tích vùng không mã hóa ở hệ gen ty thể
• 2.3.5. Phân tích phương thức sử dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch (skew/skewness) trong hệ gen ty thể
• 2.3.6. Phương pháp tính khoảng cách di truyền giữa các loài sán lá phổi dựa trên chuỗi nucleotide của hệ gen ty thể
• 2.3.7. Phương pháp phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã
• 2.3.8. Phương pháp phân tích phả hệ dựa trên chỉ thị cộng hợp toàn bộ 12 PCG của mtDNA
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu gen học đơn vị mã hóa ribosome (rTU)
• 2.4.1. Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á
• 2.4.2. Phương pháp xác định độ dài, đặc điểm gen/vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome
• 2.4.3. Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen 18S và 28S rRNA của Paragonimus heterotremus và P.
• 2.4.4. Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của Paragonimus heterotremus và sán lá phổi châu Á
• 2.4.5. Phương pháp phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị độ lệch (“skew”) trong đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 2.4.6. Phương pháp phân tích tương đồng nucleotide của gen 18S+28S rRNA và phần mã hóa ribosome (rTU*) của sán lá phổi họ Paragonimidae
• 2.4.7. Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích chuỗi gen 28S rRNA toàn phần
• 2.4.8. Phương pháp xác lập phả hệ dựa trên phân tích cộng hợp chuỗi gen 18S+28S rRNA toàn phần
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể của sán lá phổi châu Á Paragonimus heterotremus và P. ohirai họ Paragonimidae
• 3.1.1. Cấu trúc và sắp xếp hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus (mẫu Việt Nam) và P.
• 3.1.2. Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA ribosome của ty thể (MRG)
• 3.1.3. Phân tích đặc điểm và cấu trúc gen RNA vận chuyển ty thể (tRNA)
• 3.1.4. Phân tích vùng không mã hóa (NCR) ở hệ gen ty thể của P.
• 3.1.5. Phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) trong hệ gen ty thể của P. ohirai và sán lá phổi khác
• 3.1.6. Phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã ở hệ gen ty thể của P. ohirai và sán lá phổi châu Á
• 3.1.7. Khoảng cách di truyền giữa P. heterotremus và các loài sán lá phổi châu Á dựa trên chuỗi nucleotide phần mã hóa của hệ gen ty thể
• 3.1.8. Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu amino acid cộng hợp của 12 PCG
• 3.2. Kết quả nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae
• 3.2.1. Cấu trúc và sắp xếp gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á (P.
• 3.2.2. Độ dài gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi Paragonimus châu Á
• 3.2.3. Đặc điểm cấu trúc gen rRNA (18S và 28S rRNA) của loài P.
• 3.2.4. Đặc điểm cấu trúc vùng giao gen (ITS-1 và ITS-2) của loài P.
• 3.2.5. Kết quả phân tích phương thức sử dụng nucleotide và giá trị “độ lệch” (skew) ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 3.2.6. Kết quả phân tích tương đồng nucleotide của các gen rRNA và phần mã hóa ribosome của sán lá phổi họ Paragonimidae
• 3.2.7. Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu đơn gen 28S rRNA toàn phần
• 3.2.8. Phân tích phả hệ sán lá phổi họ Paragonimidae dựa trên dữ liệu cộng hợp gen 18S+28S rRNA toàn phần
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về nghiên cứu gen/hệ gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.1. Về thu nhận dữ liệu gen/hệ gen ty thể của Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.2. Về đặc điểm cấu trúc của gen và hệ gen ty thể sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.3. Về đặc điểm thành phần gen ty thể của sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai
• 4.1.4. Về ứng dụng mtDNA trong nghiên cứu phân loại và phả hệ tiến hóa của sán lá phổi châu Á
• 4.1.5. Về xây dựng cơ sở dữ liệu mtDNA của họ Paragonimidae
• 4.2. Về nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.1. Về thu nhận dữ liệu gen/vùng giao gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.2. Về đặc điểm cấu trúc của gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.3. Về đặc điểm thành phần gen của đơn vị mã hóa ribosome của sán lá phổi châu Á
• 4.2.4. Về ứng dụng đơn vị mã hóa ribosome trong nghiên cứu phân tích phả hệ
• 4.2.5. Về xây dựng cơ sở dữ liệu đơn vị mã hóa ribosome của họ Paragonimidae
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH SÁCH CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan nghiên cứu hệ gen sán lá phổi Paragonimidae

Bệnh sán lá phổi (paragonimiasis), do các loài thuộc họ Paragonimidae gây ra, là một bệnh ký sinh trùng từ động vật lây sang người (ĐVLSN) đang có xu hướng tái xuất hiện tại nhiều quốc gia châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Theo ước tính, khoảng 23 triệu người mắc bệnh và 292 triệu người có nguy cơ nhiễm. Tại châu Á, sự đa dạng về loài và di truyền của sán lá phổi (SLP) là rất lớn, tạo nên các phức hệ loài phức tạp, đặc biệt là ở Việt Nam và các khu vực lân cận. Việc phân loại chính xác các loài sán lá phổi như Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani gặp nhiều khó khăn khi chỉ dựa vào đặc điểm hình thái học. Do đó, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là phân tích hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome, trở nên cấp thiết. Nghiên cứu này tập trung vào việc giải trình tự gen sán lá phổi, phân tích đặc điểm ADN ty thể sán lá phổi và đơn vị mã hóa ribosome (rTU) của các loài thuộc họ Paragonimidae thu thập tại Việt Nam và một số vùng ở châu Á. Mục tiêu là xây dựng một cơ sở dữ liệu phân tử vững chắc, hỗ trợ cho công tác chẩn đoán, giám định, nghiên cứu dịch tễ học phân tử ký sinh trùng và hoạch định chiến lược phòng chống bệnh hiệu quả.

1.1. Thực trạng bệnh sán lá phổi ở Việt Nam và châu Á

Tại Việt Nam, bệnh sán lá phổi ở Việt Nam được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1906. Tuy nhiên, phải đến những năm gần đây, các nghiên cứu mới được đẩy mạnh. Loài Paragonimus heterotremus được xác định là tác nhân chính gây bệnh ở các tỉnh miền núi phía Bắc. Trong khi đó, Paragonimus westermani lại phổ biến ở các tỉnh miền Trung, với tỷ lệ nhiễm metacercaria ở cua suối rất cao. Thói quen ăn cua, tôm chưa nấu chín là con đường lây nhiễm chính. Bệnh thường gây ra các triệu chứng như ho ra máu, đau ngực, và có thể gây tử vong nếu sán ký sinh lạc chỗ ở não hoặc các cơ quan quan trọng khác. Sự phức tạp của các loài và biến chủng tại châu Á đòi hỏi các phương pháp định danh chính xác hơn, vượt qua những hạn chế của chẩn đoán lâm sàng và hình thái học truyền thống. Việc hiểu rõ sự phân bố và đặc điểm di truyền của các loài sán lá phổi là nền tảng cho việc kiểm soát dịch bệnh.

1.2. Vai trò của sinh học phân tử ký sinh trùng trong phân loại

Sinh học phân tử ký sinh trùng cung cấp các công cụ mạnh mẽ để giải quyết những thách thức trong phân loại. Các chỉ thị phân tử từ hệ gen ty thể (mtDNA) và hệ gen nhân (nDNA), như các gen mã hóa protein (gen cox1 sán lá phổi, gen nad1 Paragonimus) hay các gen ribosome (gen ribosome 18S rRNA), cho phép phân biệt các loài, thậm chí là các quần thể khác nhau trong cùng một loài. Các dữ liệu trình tự DNA giúp xây dựng cây phát sinh chủng loại Paragonimus, làm sáng tỏ mối quan hệ tiến hóa và nguồn gốc địa lý của chúng. Việc này đặc biệt quan trọng đối với các loài "đồng hình" hoặc các dạng ấu trùng khó phân biệt. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) cho phép thu nhận toàn bộ hệ gen, mở ra hướng đi mới trong việc phát hiện các marker phân tử định danh loài và nghiên cứu đa dạng di truyền sán lá phổi một cách toàn diện.

II. Thách thức phân loại phân tử sán lá phổi ở châu Á

Việc xác định chính xác loài sán lá phổi họ Paragonimidae là một thách thức lớn đối với các nhà khoa học và y tế cộng đồng. Các phương pháp truyền thống dựa trên hình thái học của sán trưởng thành, trứng hay ấu trùng nang (metacercariae) thường không đủ độ tin cậy. Nguyên nhân là do sự tương đồng về hình thái giữa các loài gần gũi và sự biến đổi hình thái trong cùng một loài ở các khu vực địa lý khác nhau. Thêm vào đó, sự tồn tại của các dạng lưỡng bội (2n) và tam bội (3n), đặc biệt ở loài Paragonimus westermani, càng làm cho việc phân loại trở nên phức tạp. Sự đa dạng di truyền cao trong các quần thể sán lá phổi ở châu Á, cùng với hiện tượng lai tự nhiên, đòi hỏi phải có những phương pháp phân loại phân tử sán lá phổi hiệu quả. Việc thiếu một cơ sở dữ liệu gen hoàn chỉnh và được chuẩn hóa cho các loài Paragonimidae là một rào cản lớn, gây khó khăn trong việc so sánh và đối chiếu kết quả nghiên cứu giữa các phòng thí nghiệm và các quốc gia, ảnh hưởng trực tiếp đến công tác giám sát dịch tễ và phòng chống bệnh.

2.1. Hạn chế của phương pháp hình thái học truyền thống

Phân loại dựa trên hình thái học (HTH) gặp nhiều hạn chế. Ví dụ, kích thước và hình dạng trứng của các loài sán lá phổi khác nhau có thể trùng lắp, phụ thuộc vào dạng di truyền (lưỡng bội hay tam bội). Ấu trùng nang (metacercaria) của các loài trong giống Paragonimus cũng rất giống nhau. Ngay cả sán trưởng thành, các đặc điểm như hình dạng buồng trứng và tinh hoàn, mặc dù là tiêu chí phân loại quan trọng, cũng có thể biến đổi. Việc thu thập mẫu sán trưởng thành từ vật chủ cuối cùng (người hoặc động vật) là rất khó khăn. Do đó, các nhà nghiên cứu thường chỉ có thể tiếp cận được giai đoạn ấu trùng trong vật chủ trung gian sán lá phổi là cua hoặc tôm. Những hạn chế này nhấn mạnh sự cần thiết phải bổ sung dữ liệu sinh học phân tử ký sinh trùng để xác nhận và làm rõ vị trí phân loại của các mẫu vật.

2.2. Sự phức tạp về đa dạng di truyền sán lá phổi tại châu Á

Châu Á là một điểm nóng về đa dạng di truyền sán lá phổi. Các nghiên cứu đã chỉ ra sự tồn tại của nhiều phức hệ loài, chẳng hạn như phức hệ Paragonimus westermani và phức hệ Paragonimus heterotremus. Trong mỗi phức hệ, có nhiều kiểu gen (genotype) và biến chủng khác nhau. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể của cùng một loài đôi khi còn lớn hơn khoảng cách giữa các loài khác nhau. Hiện tượng lai tự nhiên giữa các loài, ví dụ giữa P. heterotremus và P. westermani, cũng đã được ghi nhận tại Việt Nam. Sự phức tạp này không chỉ gây khó khăn cho phân loại phân tử sán lá phổi mà còn có ý nghĩa quan trọng về mặt dịch tễ học, vì các biến chủng khác nhau có thể có khả năng gây bệnh và đáp ứng với điều trị khác nhau. Do đó, việc nghiên cứu sâu về phylogeny Paragonimidae là rất quan trọng.

III. Phương pháp phân tích ADN ty thể sán lá phổi chi tiết

Hệ gen ty thể (mtDNA) là một công cụ vô giá trong các nghiên cứu về phân loại và tiến hóa do các đặc tính ưu việt của nó. mtDNA ở động vật là một phân tử DNA vòng, khép kín, di truyền theo dòng mẹ và có tốc độ tiến hóa nhanh hơn hệ gen nhân. Điều này làm cho nó trở thành một chỉ thị nhạy để phân biệt các loài có quan hệ gần gũi. Trong nghiên cứu này, toàn bộ ADN ty thể sán lá phổi của các loài như Paragonimus heterotremus và Paragonimus ohirai đã được giải trình tự và phân tích. Cấu trúc hệ gen, sự sắp xếp của 12 gen mã hóa protein (PCG), 2 gen RNA ribosome ty thể (MRG) và 22 gen RNA vận chuyển (tRNA) đã được xác định. Các phân tích tập trung vào đặc điểm của các gen quan trọng như gen cox1 sán lá phổi và gen nad1 Paragonimus, cũng như các vùng không mã hóa (NCR). Dữ liệu này không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc về đặc điểm gen học của sán lá phổi mà còn là nền tảng để xác định các marker phân tử định danh loài và xây dựng cây phát sinh chủng loại Paragonimus một cách chính xác.

3.1. Cấu trúc và sắp xếp gen trong mtDNA Paragonimus

Hệ gen ty thể của sán lá phổi họ Paragonimidae có cấu trúc điển hình của ngành Sán dẹt, với kích thước khoảng 14-15 kb. Nó chứa 12 gen mã hóa protein (thiếu gen atp8), 2 gen RNA ribosome (rrnS và rrnL), và 22 gen RNA vận chuyển. Trình tự sắp xếp các gen này có mức độ bảo tồn cao trong họ Paragonimidae nhưng cũng có những khác biệt đặc trưng có thể dùng để phân loại. Ví dụ, nghiên cứu đã xác định được cấu trúc hoàn chỉnh của mtDNA Paragonimus heterotremus thu thập tại Việt Nam, cung cấp một hệ gen tham chiếu quan trọng. Phân tích so sánh cấu trúc và sự sắp xếp gen giữa các loài khác nhau giúp làm sáng tỏ mối quan hệ tiến hóa và các sự kiện tái sắp xếp gen trong lịch sử của nhóm ký sinh trùng này.

3.2. Vai trò của gen cox1 và gen nad1 như marker phân tử

Trong số các gen mã hóa protein của ty thể, gen cox1 sán lá phổi (cytochrome c oxidase subunit I) và gen nad1 Paragonimus (NADH dehydrogenase subunit 1) được sử dụng rộng rãi nhất làm marker phân tử. Gen cox1 thường được dùng làm "mã vạch DNA" (DNA barcoding) để định danh loài do có sự kết hợp giữa các vùng bảo thủ và các vùng biến đổi. Gen nad1 cũng cho thấy mức độ biến đổi cao giữa các loài, rất hữu ích cho các phân tích phát sinh chủng loại. Bằng cách phân tích trình tự nucleotide và amino acid của các gen này từ nhiều mẫu sán lá phổi khác nhau, nghiên cứu đã có thể xác định khoảng cách di truyền, phân biệt các loài chị em và các quần thể địa lý, góp phần vào việc phân loại phân tử sán lá phổi một cách chính xác và hiệu quả.

IV. Bí quyết giải mã đơn vị ribosome của sán lá phổi

Bên cạnh hệ gen ty thể, đơn vị mã hóa ribosome (rTU) trong hệ gen nhân cũng là một nguồn cung cấp chỉ thị phân tử quan trọng. Mỗi đơn vị rTU bao gồm các gen mã hóa cho RNA ribosome (18S, 5.8S, 28S rRNA) và các vùng đệm được phiên mã bên trong (ITS1, ITS2). Do tồn tại dưới dạng nhiều bản sao lặp lại, các vùng này dễ dàng được nhân lên bằng PCR và giải trình tự. Các gen rRNA, đặc biệt là gen ribosome 18S rRNA và 28S rRNA, có tính bảo thủ cao, phù hợp cho việc nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa ở các bậc phân loại cao (họ, bộ). Ngược lại, vùng ITS2 và ITS1 có tốc độ tiến hóa nhanh hơn, rất hữu ích để phân biệt các loài gần gũi. Luận án này đã lần đầu tiên giải trình tự gen sán lá phổi và thu được dữ liệu gần như hoàn chỉnh của đơn vị rTU cho 6 chủng thuộc 5 loài sán lá phổi châu Á. Phân tích chi tiết về cấu trúc, độ dài, và thành phần nucleotide của các gen này đã cung cấp những hiểu biết mới và cơ sở dữ liệu quý giá cho các nghiên cứu phylogeny Paragonimidae trong tương lai.

4.1. Đặc điểm cấu trúc gen 18S rRNA và 28S rRNA

Các gen 18S và 28S rRNA của sán lá phổi họ Paragonimidae có độ dài và trình tự tương đối bảo thủ. Gen 18S rRNA có độ dài khoảng 2kb, trong khi gen 28S rRNA dài khoảng 3.8kb. Phân tích cấu trúc bậc hai của các phân tử RNA này cho thấy các vùng lõi chức năng được bảo tồn cao, xen kẽ với các vùng biến đổi (vùng D). Những vùng biến đổi này chứa thông tin hữu ích cho việc phân tích phát sinh chủng loại. Dữ liệu cộng hợp từ cả hai gen 18S và 28S rRNA cung cấp một bộ dữ liệu mạnh mẽ, cho phép xây dựng cây phát sinh chủng loại với độ tin cậy cao hơn so với việc chỉ sử dụng một gen đơn lẻ. Kết quả này giúp làm rõ vị trí của họ Paragonimidae trong phân bộ Troglotremata.

4.2. Phân tích vùng ITS2 như một chỉ thị phân tử quan trọng

Vùng ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2) nằm giữa gen 5.8S và 28S rRNA. Do không chịu áp lực chọn lọc ở mức protein, vùng này tích lũy đột biến nhanh hơn các vùng mã hóa, làm cho nó trở thành một marker phân tử định danh loài xuất sắc. Nghiên cứu đã phân tích trình tự và cấu trúc bậc hai của ITS2 từ nhiều loài Paragonimus. Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt về độ dài và trình tự nucleotide giữa các loài, ngay cả những loài có quan hệ gần. Cấu trúc bậc hai của ITS2, đặc biệt là các vòng và nhánh, cũng cho thấy các đặc điểm đặc trưng cho từng loài. Dữ liệu từ ITS2 đã được chứng minh là rất hiệu quả trong việc phân biệt Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani, cũng như các loài khác trong họ.

V. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại Paragonimus

Một trong những kết quả quan trọng nhất của nghiên cứu là việc xây dựng thành công các cây phát sinh chủng loại Paragonimus với độ phân giải cao, dựa trên cả dữ liệu hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome. Bằng cách sử dụng bộ dữ liệu cộng hợp từ 12 gen mã hóa protein của ty thể (12 PCG) hoặc từ hai gen 18S và 28S rRNA, các mối quan hệ tiến hóa trong họ Paragonimidae đã được làm sáng tỏ. Các cây phát sinh chủng loại cho thấy sự phân chia rõ ràng giữa các nhóm loài sán lá phổi ở châu Á, châu Mỹ và châu Phi. Đặc biệt, nghiên cứu đã xác định vị trí của các loài lưu hành tại Việt Nam như Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani trong bức tranh tiến hóa chung. Các kết quả này không chỉ có giá trị về mặt học thuật mà còn có ứng dụng thực tiễn trong dịch tễ học phân tử ký sinh trùng, giúp truy xuất nguồn gốc lây nhiễm và hiểu rõ hơn về sự lan truyền của bệnh. Việc xác định các marker phân tử định danh loài mới cũng mở đường cho việc phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh và chính xác.

5.1. Phân tích phylogeny Paragonimidae dựa trên dữ liệu cộng hợp

Phân tích phylogeny Paragonimidae dựa trên dữ liệu cộng hợp của nhiều gen mang lại kết quả đáng tin cậy hơn so với phân tích đơn gen. Khi sử dụng dữ liệu amino acid của 12 PCG từ mtDNA Paragonimus, cây phát sinh chủng loại đã phân tách rõ ràng các phức hệ loài chính. Tương tự, dữ liệu cộng hợp từ gen 18S và 28S rRNA cũng xác nhận các mối quan hệ này và cung cấp thêm thông tin về vị trí của họ Paragonimidae so với các họ sán lá khác. Các phân tích này khẳng định rằng P. heterotremus và P. westermani thuộc các nhánh tiến hóa riêng biệt nhưng có quan hệ gần gũi, phù hợp với sự phân bố địa lý của chúng. Những phát hiện này cung cấp một khung phân loại phân tử vững chắc cho họ Paragonimidae.

5.2. Ứng dụng trong dịch tễ học phân tử ký sinh trùng

Dữ liệu di truyền thu được có ý nghĩa to lớn đối với dịch tễ học phân tử ký sinh trùng. Việc xác định được các kiểu gen đặc trưng cho từng khu vực địa lý cho phép các nhà khoa học truy tìm nguồn gốc của các đợt bùng phát dịch. Ví dụ, bằng cách so sánh trình tự DNA của sán lá phổi từ một bệnh nhân với cơ sở dữ liệu, có thể xác định được khu vực mà bệnh nhân có khả năng bị nhiễm bệnh. Điều này rất quan trọng trong việc khoanh vùng dịch, tìm kiếm vật chủ trung gian sán lá phổi và đưa ra các biện pháp can thiệp y tế công cộng kịp thời. Hơn nữa, việc giám sát sự thay đổi di truyền trong các quần thể ký sinh trùng giúp phát hiện sự xuất hiện của các chủng mới hoặc sự lan rộng của các chủng có độc lực cao, góp phần nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh sán lá phổi ở Việt Nam.

VI. Hướng đi mới trong chẩn đoán phòng chống bệnh sán lá phổi

Các kết quả từ luận án này không chỉ đóng góp vào kho tàng kiến thức về sinh học phân tử ký sinh trùng mà còn mở ra những hướng đi mới đầy hứa hẹn trong việc chẩn đoán và phòng chống bệnh sán lá phổi. Việc xây dựng thành công cơ sở dữ liệu về ADN ty thể sán lá phổi và đơn vị mã hóa ribosome cho các loài Paragonimidae ở châu Á là một nguồn tài nguyên quý giá. Dựa trên các vùng gen có độ biến đổi cao đã được xác định, các nhà khoa học có thể thiết kế các mồi (primer) và đầu dò (probe) đặc hiệu cho từng loài. Điều này cho phép phát triển các phương pháp chẩn đoán phân tử như PCR, real-time PCR, hoặc LAMP, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với phương pháp soi kính hiển vi tìm trứng trong đờm hay phân. Các công cụ này sẽ giúp phát hiện sớm ca bệnh, ngay cả khi nhiễm với số lượng ký sinh trùng thấp, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu biến chứng, góp phần quan trọng vào chiến lược kiểm soát bệnh sán lá phổi ở Việt Nam và trên toàn thế giới.

6.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu mtDNA và rTU của họ Paragonimidae

Một trong những đóng góp lâu dài của nghiên cứu là việc xây dựng và bổ sung dữ liệu vào cơ sở dữ liệu công cộng như GenBank. Dữ liệu về hệ gen ty thể hoàn chỉnh và các đơn vị mã hóa ribosome của các loài sán lá phổi châu Á, đặc biệt là các chủng từ Việt Nam, là nguồn tham chiếu thiết yếu cho cộng đồng khoa học toàn cầu. Cơ sở dữ liệu này cho phép các nhà nghiên cứu khác so sánh, đối chiếu kết quả, thẩm định các phát hiện mới và thực hiện các phân tích tổng hợp (meta-analysis) quy mô lớn. Việc này thúc đẩy sự hợp tác quốc tế và đẩy nhanh tiến độ nghiên cứu về đa dạng di truyền sán lá phổi, giúp xây dựng một bức tranh toàn cảnh và chi tiết hơn về sự tiến hóa và dịch tễ của nhóm ký sinh trùng quan trọng này.

6.2. Triển vọng tương lai cho công tác phòng chống ký sinh trùng

Hướng nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc áp dụng các phát hiện này vào thực tiễn. Cần phát triển và chuẩn hóa các bộ kit chẩn đoán phân tử dựa trên các marker phân tử định danh loài đã được xác định. Các nghiên cứu sâu hơn về bộ gen và bộ phiên mã (transcriptome) sẽ giúp tìm ra các gen liên quan đến độc lực, khả năng kháng thuốc và tương tác vật chủ-ký sinh trùng. Điều này có thể dẫn đến việc phát hiện các mục tiêu mới cho việc phát triển thuốc điều trị và vắc-xin. Ngoài ra, việc kết hợp các công cụ dịch tễ học phân tử ký sinh trùng với các chương trình giáo dục sức khỏe cộng đồng, nhằm thay đổi thói quen ăn uống nguy cơ cao và kiểm soát vật chủ trung gian sán lá phổi, sẽ tạo ra một chiến lược phòng chống bệnh toàn diện và bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) do các loài giun sán thuộc giống Paragonimus (họ Paragonimidae, phân bộ Troglotremata, lớp Trematoda) gây ra là một trong những bệnh truyền lây từ động vật sang người (zoonosis) bị lãng quên nghiêm trọng, đang tái xuất hiện tại nhiều quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo ước tính dịch tễ học, "có khoảng 23 triệu người mắc bệnh, 292 triệu ở nguy cơ nhiễm" trên toàn cầu, phân bố tập trung tại châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Tại Việt Nam và khu vực châu Á, quần thể sán lá phổi tồn tại dưới các phức hệ (species complexes) có tính đa dạng di truyền nội loài và ngoại loài cực kỳ phức tạp. Việc định loại hình thái học truyền thống đối với các giai đoạn phát triển trung gian như trứng và ấu trùng nang (metacercariae) gặp rào cản lớn do tính trạng tương đồng cao hoặc biến thiên hình thái chồng chéo giữa các loài đồng hình (cryptic species), loài đa hình (polymorphic species) và hiện tượng lai chéo loài (introgressive hybridization).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cấp thiết đặt ra là sự thiếu hụt trầm trọng dữ liệu toàn diện về hệ gen ty thể (mitochondrial genome - mtDNA) và đơn vị mã hóa ribosome (ribosomal transcription unit - rTU) của các loài sán lá phổi lưu hành tại Việt Nam và châu Á. Trước nghiên cứu này, cơ sở dữ liệu quốc tế như GenBank và GOBASE chỉ ghi nhận dữ liệu mtDNA toàn phần của 80–90 chủng thuộc 60–70 loài sán lá nói chung, trong đó họ Paragonimidae hầu như chưa có chuỗi rTU hoàn chỉnh ngoài đoạn phân đoạn 5.338 bp của Paragonimus kellicotti (Mỹ).

Nghiên cứu giải quyết ba câu hỏi khoa học cốt lõi:

1. RQ1: Cấu trúc phân tử, trật tự sắp xếp gen, đặc điểm thiên vị mã di truyền (codon usage bias) và độ lệch nucleotide (AT/GC skew) của mtDNA hoàn chỉnh ở loài sán lá phổi gây bệnh chính tại Việt Nam (Paragonimus heterotremus) và đại diện châu Á (Paragonimus ohirai) có những đặc tính phân tử tiến hóa đặc thù nào?
2. RQ2: Cấu trúc chuỗi đầy đủ và mô hình cấu trúc bậc hai (secondary structure) của rTU (bao gồm gen 18S rRNA, 28S rRNA và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2) biến thiên như thế nào giữa các loài và các dạng bội thể (2n, 3n) của sán lá phổi châu Á?
3. RQ3: Việc tích hợp tập dữ liệu chuỗi concatenated 12 gen mã hóa protein (PCG) ty thể và tổ hợp 18S+28S rRNA nhân có giải quyết triệt để được mối quan hệ phát sinh chủng loại (phylogenetic relationships) và vị trí phân loại của họ Paragonimidae trong phân bộ Troglotremata hay không?

Các giả thuyết nghiên cứu được thiết lập:

• H1: mtDNA của họ Paragonimidae có sự bảo tồn trật tự gen đặc trưng của sán lá, thiếu vắng gen atp8, phiên mã đa gen (polysistronic transcript) với các tRNA hoạt động như tín hiệu phân cắt.
• H2: Vùng giao gen ITS-1 và ITS-2 chứa các đơn vị cấu trúc lặp liền kề (tandem repeat units - TRU) đóng vai trò chỉ thị phân tử đặc hiệu giúp phân biệt chính xác mức độ loài, phân loài và nguồn gốc địa lý.
• H3: Phân tích phát sinh loài đa locus ở mức hệ gen (mtDNA và rTU hoàn chỉnh) cung cấp độ phân giải vượt trội so với các đoạn gen đơn lẻ, tái định vị chính xác cấu trúc tiến hóa của phức hệ Paragonimus.

Nghiên cứu được neo giữ trên ba khung lý thuyết phân tử nền tảng: Thuyết nội cộng sinh (Endosymbiotic Theory của Lynn Margulis), Thuyết tiến hóa trung tính ở mức phân tử (Neutral Theory of Molecular Evolution của Motoo Kimura) và Mô hình phân cắt dấu chấm câu tRNA (tRNA Punctuation Model của Ojala et al.). Phạm vi nghiên cứu khảo sát toàn diện mẫu sán lá phổi thu thập từ các ổ dịch trọng điểm tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam (Lai Châu, Quảng Trị) cùng các mẫu chuẩn quốc tế từ Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ (gồm P. heterotremus, P. ohirai, P. westermani 2n và 3n, P. iloktsuenensis, P. miyazakii), tạo nên bước đột phá quyết định về hệ thống học phân tử cho ký sinh trùng học khu vực.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu hệ thống học sán lá phổi khởi đầu từ mô tả Paragonimus westermani của Kerbert (1878), sau đó Miyazaki (1939, 1974) và Chen & Hsia (1964) đã hoàn thiện các tiêu chí phân loại dựa trên cơ quan sinh dục (phân nhánh tinh hoàn, buồng trứng) và cấu trúc giác bám. Tuy nhiên, các tranh luận học thuật kéo dài về tính hợp lệ của phân loại hình thái nổi lên khi Blair et al. (1998, 1999) và Agatsuma et al. (2004, 2007) phát hiện tính đa dạng di truyền cực kỳ lớn giữa các quần thể địa lý. Điển hình là cuộc tranh luận giữa hai trường phái: một trường phái cho rằng các biến thể hình thái như Paragonimus pseudoheterotremus tại Thái Lan (Waikagul, 2007) hay P. sadoensis, P. szechuanensis là các loài độc lập; trong khi trường phái sinh học phân tử (Doanh et al., 2007; Le Thanh Hoa et al., 2012) chứng minh chúng chỉ là các biến chủng hình thái hoặc đồng danh (synonyms) của P. heterotremus, P. ohirai và P. skrjabini.

Về vị trí phân loại cấp cao, hệ thống phân loại tích hợp (ITIS) và NCBI Taxonomy từng tồn tại sự không đồng nhất kéo dài giữa việc xếp Paragonimus vào họ Troglotrematidae (phân bộ Xiphidiata) hay tách riêng thành họ độc lập Paragonimidae thuộc phân bộ Troglotremata (Schell, 1980). Các nghiên cứu quốc tế trước đây như phân tích hệ gen ty thể của P. westermani tại Nhật Bản (Agatsuma et al., 2004) hay đoạn gen rTU cục bộ của P. kellicotti ở Bắc Mỹ (Fischer et al., 2013) mới chỉ cung cấp các mảnh ghép rời rạc, chưa giải trình tự hoàn chỉnh đồng thời cả mtDNA lẫn rTU trên cùng một hệ thống mẫu phân bố xuyên suốt châu Á.

Nghiên cứu này định vị chính xác vào khoảng trống đó bằng cách cung cấp chuỗi hoàn chỉnh mtDNA (15,2 kb ở P. heterotremus Việt Nam; 14.818 bp ở P. ohirai Nhật Bản, GenBank: KX756277) và đơn vị rTU toàn phần (7.292 bp – 8.616 bp trên 6 chủng đại diện). Khi so sánh trực tiếp với các công trình quốc tế, nghiên cứu không chỉ đối chiếu với chủng P. westermani tam bội (Bogil, Hàn Quốc) và lưỡng bội (Meghalaya, Ấn Độ), mà còn liên hệ trực tiếp với các loài phân bố tại Tân thế giới (P. kellicotti, P. mexicanus) và châu Phi (P. africanus, P. uterobilateralis). Sự kết hợp này mang lại bước tiến vượt bậc, chuyển đổi căn bản từ phân loại học mô tả hình thái sang phân loại học phát sinh loài phân tử chính xác.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Nghiên cứu mở rộng và kiểm chứng thực nghiệm sâu sắc thuyết tiến hóa phân tử trung tính của Motoo Kimura thông qua việc định lượng tỷ lệ đột biến thay thế nucleotide và áp lực chọn lọc biểu hiện qua hệ số thiên vị codon (RSCU - Relative Synonymous Codon Usage) trên 12 gen PCG ty thể. Kết quả chứng minh quá trình tiến hóa hệ gen ty thể của sán lá phổi chịu sự chi phối mạnh mẽ của áp lực đột biến định hướng làm giàu nucleotide A+T, dẫn tới sự biến đổi cấu trúc bậc hai của tRNA (hiện tượng mất nhánh DHU hoặc thay thế bằng vòng DHU-replacement loop).

Đồng thời, nghiên cứu củng cố mô hình "dấu chấm câu tRNA" (tRNA Punctuation Model) của Ojala et al. (1981) trên sinh vật ký sinh bậc cao, chỉ ra rằng 22 gen tRNA phân bố xen kẽ giữa các PCG và MRG đóng vai trò như các vị trí nhận diện cắt chính xác cho các enzyme endonuclease nội sinh để phân tách bản phiên mã đa gen (polysistronic primary transcript) thành các mRNA, tRNA và rRNA đơn lẻ có đuôi polyA hoàn chỉnh. Về mặt hệ thống học tiến hóa, nghiên cứu hỗ trợ khái niệm loài phát sinh loài (Phylogenetic Species Concept của Cracraft) bằng chứng cứ phân tử rõ ràng, xác nhận họ Paragonimidae là một dòng tiến hóa đơn ngành (monophyletic clade) tách biệt hoàn toàn khỏi họ Troglotrematidae, Collyriclidae và Nanophyetidae trong phân bộ Troglotremata.

Khung phân tích độc đáo

Nghiên cứu thiết lập khung phân tích sinh học phân tử tích hợp đa tầng (integrated multi-tier molecular framework), kết hợp chặt chẽ ba chiều dữ liệu:

Phương pháp phân tích cấu trúc bậc hai dựa trên năng lượng tự do tối thiểu (Minimum Free Energy - MFE) được áp dụng đồng thời cho RNA ribosome ty thể (12S, 16S), 22 phân tử tRNA ty thể, 18S rRNA, 28S rRNA và các vùng ITS-1, ITS-2. Khung phân tích xác định rõ điều kiện biên: tốc độ biến đổi nhanh gấp 10–15 lần của mtDNA so với nDNA phục vụ phân định các biến chủng nội loài, quần thể địa lý và dạng bội thể; trong khi các gen bảo tồn cao như 18S và 28S rRNA cung cấp độ phân giải tối ưu cho quan hệ phân loại ở cấp độ giống, họ và phân bộ.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận dụng triết lý thực chứng (positivism) với thiết kế thực nghiệm phân tử đa mức độ (multi-level molecular design). Phương pháp tiếp cận kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử chuẩn hóa, giải trình tự Sanger độ bao phủ cao và công nghệ tin sinh học tiên tiến.

Đối tượng nghiên cứu chính xác gồm các chủng sán lá phổi tiêu biểu:

• Paragonimus heterotremus chủng LC (Lai Châu, Việt Nam): phân lập từ vật chủ trung gian cua đá suối (Potamiscus spp.) và thực nghiệm trên động vật nuôi;
• Paragonimus ohirai chủng Kino (Kinosaki, Nhật Bản): phân lập từ cua Chiromantes dehaani;
• Paragonimus iloktsuenensis chủng Amami (Amami, Nhật Bản);
• Paragonimus miyazakii chủng OkuST1 (Nhật Bản);
• Paragonimus westermani chủng Megha (2n, Meghalaya, Ấn Độ);
• Paragonimus westermani chủng Bogil (3n, đảo Bogil, Hàn Quốc).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu mẫu và thực nghiệm phân tử tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối chứng quốc tế:

1. Thu thập và định danh sơ bộ: Bắt cua suối tại các ổ dịch tự nhiên, bóc tách cơ và phủ tạng để thu nhận metacercariae. Đánh giá đặc điểm hình thái kích thước vỏ nang (vỏ ngoài, vỏ trong), giác miệng, giác bụng dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử. Gây nhiễm thực nghiệm trên chuột cống trắng hoặc chuột lang để thu nhận sán trưởng thành sau 42–70 ngày.
2. Tách chiết DNA: DNA tổng số (bao gồm mtDNA và nDNA) được chiết xuất từ mô sán trưởng thành đơn lẻ bằng phương pháp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol hoặc bộ kit thương mại (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen), kiểm tra độ tinh sạch qua đo quang phổ OD 260/280 và điện di gel agarose 1%.
3. Khuếch đại phân tử (Long-PCR và Standard PCR): Sử dụng các cặp mồi thoái hóa (degenerate primers) và mồi đặc hiệu thiết kế dựa trên các vùng gen bảo tồn cao. Kỹ thuật Long-PCR (LPCR) với enzyme Taq polymerase chịu nhiệt có độ trung thực cao (high-fidelity) được sử dụng để nhân bản các đoạn phân đoạn dài 3–7 kb của mtDNA và toàn bộ cụm rTU (7–9 kb).
4. Giải trình tự và đối soát chéo: Toàn bộ sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp hai chiều (primer walking sequencing) trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI 3500/3730xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Data và phân tích

Dữ liệu chuỗi thô được xử lý, lắp ráp (contig assembly) bằng phần mềm BioEdit v7.2 và DNASTAR Lasergene.

• Phân tích chú giải gen: Xác định 12 PCG, 2 MRG (rrnS, rrnL) và 22 tRNA bằng công cụ DOGMA, MITOS và đối chiếu thủ công qua ngân hàng gen NCBI-BLAST.
• Phân tích cấu trúc bậc hai: Mô hình hóa cấu trúc cuộn gập của 22 tRNA, 18S rRNA, 28S rRNA và các vùng ITS-1, ITS-2 sử dụng phần mềm RNAstructure v6.0 và mfold dựa trên thuật toán tối thiểu hóa năng lượng tự do Gibbs ($\Delta G$, kcal/mol).
• Tính toán độ lệch nucleotide và thiên vị codon: Xác định thành phần A, T, G, C và tính toán độ lệch theo công thức: $$\text{AT-skew} = \frac{A - T}{A + T}$$ $$\text{GC-skew} = \frac{G - C}{G + C}$$ Phân tích tỷ lệ sử dụng bộ ba mã hóa (RSCU) bằng MEGA X và DnaSP v6.
• Xây dựng cây phả hệ: Thực hiện căn chỉnh đa chuỗi (multiple sequence alignment) bằng ClustalX và MUSCLE. Phân tích phát sinh loài dựa trên hai phương pháp chính: Maximum Likelihood (ML) với mô hình thay thế nucleotide/amino acid tối ưu (GTR+G+I cho nucleotide, MtREV/WAG+G+I cho amino acid) và Bayesian Inference (BI) trên phần mềm MrBayes v3.2 (chạy $2 \times 10^6$ thế hệ MCMC, lấy mẫu mỗi 100 thế hệ, loại bỏ 25% burn-in). Giá trị bootstrap được kiểm tra với 1.000 lần lặp lại để bảo đảm độ tin cậy thống kê tuyệt đối.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Nghiên cứu mang lại 5 phát hiện mang tính đột phá về cấu trúc phân tử và tiến hóa hệ gen:

1. Giải mã toàn diện kiến trúc mtDNA hoàn chỉnh của P. heterotremus và P. ohirai: mtDNA của P. heterotremus (mẫu Việt Nam) có kích thước xấp xỉ 15,2 kb và P. ohirai (Nhật Bản, KX756277) có kích thước 14.818 bp. Cả hai hệ gen đều là phân tử DNA vòng khép kín, bảo tồn trật tự 36 gen gồm: 12 PCG (cox1-3, nad1-6, nad4L, cob, atp6), 2 gen ribosome ty thể (rrnS, rrnL), 22 gen tRNA và một vùng không mã hóa phân tách thành tiểu vùng ngắn (SNR) và tiểu vùng dài (LNR). Đặc biệt, hệ gen hoàn toàn thiếu vắng gen atp8, xác nhận đây là dấu hiệu phân tử cấu trúc chung cho toàn bộ ngành giun sán dẹp.

2. Quy luật sử dụng codon và độ lệch nucleotide âm đặc trưng: Toàn bộ hệ gen ty thể của các loài sán lá phổi họ Paragonimidae thể hiện sự thiên vị rõ rệt đối với nucleotide Thymine (T) và Guanine (G). Giá trị AT-skew trên toàn bộ 12 gen PCG mang giá trị âm sâu (dao động từ -0.28 đến -0.45), trong khi GC-skew mang giá trị dương. Bộ mã khởi đầu dịch mã chủ yếu là ATG và GTG; bộ mã kết thúc là TAG hoặc TAA, kèm theo sự hiện diện của các bộ mã kết thúc khuyết thiếu (chỉ có T-- hoặc TA-), được hoàn thiện thành TAA thông qua quá trình gắn đuôi polyadenyl hóa ở đầu 3' sau phiên mã.

3. Khám phá cấu trúc đơn vị rTU hoàn chỉnh đầu tiên của sán lá phổi châu Á: Chiều dài rTU dao động mạnh từ 7.292 bp ở P. westermani (3n, Hàn Quốc), 7.422 bp ở P. ohirai, 7.543 bp ở P. iloktsuenensis, 7.661 bp ở P. heterotremus (Việt Nam) đến 8.616 bp ở P. westermani (2n, Ấn Độ). Sự biến thiên kích thước này hoàn toàn do số lượng đơn vị cấu trúc lặp liền kề (TRU) tại vùng giao gen ITS-1 quyết định:

• P. heterotremus (Việt Nam): chứa 7,7 TRU;
• P. ohirai (Nhật Bản): chứa 5,7 TRU;
• P. iloktsuenensis (Nhật Bản): chứa 6,7 TRU;
• P. westermani (Bogil 3n, Hàn Quốc): chứa 4,7 TRU;
• P. westermani (Megha 2n, Ấn Độ): chứa tới 15,7 TRU.

Ngược lại, gen 18S rRNA (~2.000 bp), 5.8S rRNA (157–160 bp) và 28S rRNA (~3.800–3.900 bp) có mức độ tương đồng nucleotide rất cao (>96–99% giữa các loài trong họ).

4. Định lượng khoảng cách di truyền giải quyết các tranh cãi về phức hệ loài: Khoảng cách di truyền (KCDT) tính toán trên chuỗi nucleotide phần mã hóa mtDNA (mtDNA*) giữa P. heterotremus và các loài khác trong họ Paragonimidae đạt mức sai khác từ 12,4% đến 18,6%. Phân tích so sánh giữa chủng P. westermani lưỡng bội (2n) và tam bội (3n) cho thấy khoảng cách di truyền nội loài giữa các vùng địa lý ở châu Á (Bắc Á vs Nam Á) thậm chí vượt quá khoảng cách di truyền ngoại loài giữa một số loài độc lập trong cùng giống, chứng minh P. westermani thực chất là một phức hệ đa loài đang trong quá trình phân kỳ tiến hóa mạnh mẽ.

5. Tái thiết lập cây phát sinh chủng loại vững chắc của phân bộ Troglotremata: Cây phả hệ xây dựng từ tập dữ liệu amino acid cộng hợp của 12 PCG ty thể và dữ liệu cộng hợp gen nhân 18S+28S rRNA toàn phần đồng thuận khẳng định vị trí độc lập của họ Paragonimidae. Các nhánh tiến hóa tách biệt rõ ràng các nhóm loài châu Á (P. heterotremus, P. ohirai, P. westermani, P. miyazakii) khỏi các đại diện Bắc Mỹ (P. kellicotti) với chỉ số tin cậy nhánh tuyệt đối (Bootstrap support = 100%, Posterior probability = 1.0).

Implications đa chiều

• Về lý thuyết: Cung cấp hệ thống bằng chứng phân tử chuẩn mực để hoàn thiện cây tiến hóa sinh giới ngành Platyhelminthes, làm sáng tỏ cơ chế đồng tiến hóa giữa hệ gen ty thể và hệ gen nhân trong sinh vật ký sinh.
• Về phương pháp luận: Thiết lập quy chuẩn vàng (gold standard protocol) cho việc giải trình tự toàn bộ cụm gen ribosome rTU và mtDNA của giun sán bằng sự kết hợp giữa Long-PCR và phân tích cấu trúc bậc hai tin sinh học, có thể chuyển giao áp dụng cho các họ sán lá gây bệnh khác như Fasciolidae, Opisthorchiidae và Schistosomatidae.
• Về thực tiễn y tế & kiểm soát bệnh: Cung cấp tập hợp chỉ thị mã vạch phân tử (DNA barcodes) siêu nhạy dựa trên các locus cox1, nad1 và vùng ITS-1/ITS-2. Các chỉ thị này cho phép phát triển kit chẩn đoán phân tử PCR/Real-time PCR để giám định chính xác mầm bệnh từ mẫu đờm, phân bệnh nhân, hoặc phát hiện sớm metacercariae trong vật chủ trung gian (cua, ốc) tại thực địa mà không cần dựa vào phương pháp mổ đắp tìm sán trưởng thành phức tạp.
• Về chính sách y tế công cộng: Cung cấp căn cứ dịch tễ học phân tử xác thực giúp Bộ Y tế và Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng quy hoạch các vùng nguy cơ cao tại miền núi phía Bắc và Bắc Trung Bộ, định hướng chiến lược can thiệp thay đổi hành vi ăn cua/tôm sống trong cộng đồng dân tộc thiểu số.

Limitations và Future Research

Nghiên cứu thẳng thắn ghi nhận 3 hạn chế chính:

1. Giới hạn mẫu loài toàn cầu: Mặc dù đã bao phủ các loài sán lá phổi chủ chốt ở châu Á, nghiên cứu chưa thể giải trình tự mtDNA và rTU hoàn chỉnh của các loài phân bố độc thung lũng tại châu Phi (Paragonimus africanus, P. uterobilateralis) và Trung/Nam Mỹ (Paragonimus mexicanus) do khó khăn trong việc tiếp cận nguồn sinh phẩm tươi.
2. Độ bao phủ quần thể nội địa: Số lượng mẫu P. westermani và P. skrjabini thu thập tại miền Trung và Bắc Trung Bộ Việt Nam còn ở mức thăm dò, chưa đánh giá hết mức độ đa dạng haplotype ty thể trên diện rộng địa lý.
3. Vùng bản lề IGS chưa hoàn tất 100%: Do chứa các đoạn lặp nucleotide phức tạp và độ dài lớn (>2–3 kb), cấu trúc toàn vẹn của vùng liên gen IGS nối giữa các đơn vị rTU mới chỉ được xác định ở các vùng biên cận kề ETS.

Chương trình nghiên cứu 5–10 năm tới cần tập trung vào:

• Mở rộng giải mã toàn bộ hệ gen nhân (nuclear whole genome sequencing) của P. heterotremus để phân tích hệ gen chức năng (functional genomics) và các gen mã hóa kháng nguyên phục vụ phát triển vaccine;
• Khảo sát sâu hiện tượng lai chéo tự nhiên (natural introgressive hybridization) giữa P. heterotremus và các loài sympatric khác tại vùng Tây Bắc Việt Nam;
• Phát triển hệ thống giám sát dịch tễ học metagenomics ty thể (mito-metagenomics barcoding) trên các loài ốc và giáp xác nước ngọt nhằm dự báo sớm nguy cơ bùng phát bệnh.

Tác động và ảnh hưởng

Công trình tạo ra những giá trị tác động sâu rộng:

• Ảnh hưởng học thuật: Đăng ký hàng loạt chuỗi gen chuẩn độ dài lớn lên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank (NCBI), đóng góp dữ liệu cốt lõi cho mạng lưới nghiên cứu sán lá phổi toàn cầu, ước tính thu hút hàng trăm trích dẫn từ các nghiên cứu sinh học phân tử ký sinh trùng quốc tế.
• Chuyển đổi y tế dự phòng: Cung cấp quy trình giám định phân tử chuẩn xác cho mạng lưới y tế cơ sở tại các tỉnh miền núi (Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Yên Bái, Hà Giang), loại bỏ hoàn toàn tình trạng chẩn đoán nhầm bệnh sán lá phổi thành bệnh lao phổi mạn tính kéo dài gây lãng phí điều trị và nguy cơ tử vong do biến chứng tràn mủ màng phổi/ho ra máu sét đánh.
• Đóng góp quốc tế: Hoàn thiện bản đồ dịch tễ học phân tử của phân họ Paragonimidae tại khu vực Đông Nam Á và châu Á - Thái Bình Dương, nâng cao năng lực và vị thế học thuật của sinh học phân tử Việt Nam trên trường quốc tế.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học trẻ: Tiếp cận phương pháp luận mẫu mực về giải trình tự hệ gen ty thể và phân tích cấu trúc bậc hai của RNA; kế thừa các cặp mồi Long-PCR tối ưu.
• Giảng viên & Chuyên gia Ký sinh trùng học: Sở hữu hệ thống phân loại học phân tử cập nhật, chính xác để giảng dạy và hiệu chỉnh các tài liệu chuyên khảo về giun sán truyền lây từ động vật sang người.
• Bác sĩ lâm sàng & Cán bộ xét nghiệm y tế: Ứng dụng các chỉ thị gen đặc hiệu (ITS-2, cox1) để xây dựng quy trình chẩn đoán phân biệt nhanh chóng, chính xác giữa nhiễm sán lá phổi và tổn thương lao phổi.
• Cơ quan hoạch định chính sách y tế (Bộ Y tế, Cục Y tế Dự phòng): Sử dụng bằng chứng khoa học vững chắc về chu kỳ sinh học và phân bố vật chủ trung gian để phân bổ nguồn lực phòng chống bệnh ký sinh trùng lãng quên một cách hiệu quả nhất.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của công trình là gì? Đóng góp lý thuyết nổi bật nhất là việc mở rộng Thuyết tiến hóa trung tính phân tử của Kimura và Mô hình dấu chấm câu tRNA của Ojala trên hệ thống phân loại họ Paragonimidae. Công trình chứng minh rằng sự tiến hóa của mtDNA ở sán lá phổi chịu sự thiên vị cực độ về đột biến $A+T$, dẫn tới sự biến đổi co cụm cấu trúc bậc hai của tRNA nhưng vẫn duy trì hoàn hảo chức năng xử lý bản phiên mã đa gen. Đồng thời, dữ liệu đa locus khẳng định họ Paragonimidae là một đơn vị phân loại đơn ngành độc lập thuộc phân bộ Troglotremata, bác bỏ các giả thuyết sáp nhập trước đây vào họ Troglotrematidae.

2. Cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu tiền nhiệm quốc tế? So với công trình của Agatsuma et al. (2004) chỉ giải trình tự từng phần mtDNA của P. westermani và Fischer et al. (2013) chỉ khảo sát đoạn ngắn rTU của P. kellicotti, nghiên cứu này thiết lập quy trình giải trình tự Long-PCR đồng thời toàn bộ mtDNA (14,8–15,2 kb) và toàn bộ rTU (7,2–8,6 kb). Điểm cải tiến vượt trội là việc kết hợp giải mã chuỗi với mô hình hóa cấu trúc bậc hai tự do tối thiểu (MFE) cho 22 tRNA, 2 MRG, 18S, 28S và toàn bộ các vùng lặp TRU của ITS-1/ITS-2, cung cấp hệ dữ liệu đối chiếu đa chiều chưa từng có.

3. Phát hiện bất ngờ nhất được hỗ trợ bởi dữ liệu thực nghiệm là gì? Phát hiện bất ngờ nhất là cấu trúc vùng giao gen ITS-1 của sán lá phổi châu Á chứa các đơn vị cấu trúc lặp liền kề (TRU) với số lượng biến thiên cực lớn giữa các loài và giữa các dạng bội thể: từ 4,7 TRU ở P. westermani tam bội (3n) đến 15,7 TRU ở P. westermani lưỡng bội (2n), và 7,7 TRU ở P. heterotremus Việt Nam. Điều này chỉ ra rằng kích thước rTU không cố định mà co giãn mạnh mẽ do cơ chế trượt mạch sao chép (replication slippage) của các vi vệ tinh TRU trong nhân.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản đối chứng (replication protocol) đầy đủ không? Có. Toàn bộ thông số thực nghiệm, danh mục trình tự các cặp mồi Standard-PCR và Long-PCR, thành phần chu trình nhiệt độ luân nhiệt, hóa chất giải trình tự ABI BigDye Terminator, phần mềm phân tích và mã truy cập GenBank của các chuỗi hoàn chỉnh (như KX756277 cho P. ohirai) đều được cung cấp chi tiết, cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử chuẩn mực nào trên thế giới cũng có thể lặp lại và kiểm chứng độc lập.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tới được phác thảo như thế nào? Chương trình nghiên cứu dài hạn xác định lộ trình 3 giai đoạn: (1) Chuyển đổi từ gen ty thể sang giải mã toàn bộ hệ gen nhân (whole nuclear genome) và hệ phiên mã (transcriptome) của P. heterotremus; (2) Nghiên cứu cơ chế phân tử điều hòa miễn dịch của sán lá phổi đối với vật chủ người; (3) Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới NGS và giải trình tự đơn phân tử dài (PacBio/Nanopore) để phát triển hệ thống giám sát dịch tễ học kỹ thuật số toàn diện tại Đông Nam Á.

Kết luận

1. Nghiên cứu đã giải mã hoàn chỉnh và chú giải chi tiết cấu trúc hệ gen ty thể của Paragonimus heterotremus (15,2 kb, mẫu Việt Nam) và Paragonimus ohirai (14.818 bp, Nhật Bản, GenBank: KX756277), chứng minh tính bảo tồn của 36 gen và sự vắng mặt đặc trưng của gen atp8.
2. Lần đầu tiên công bố cấu trúc đầy đủ của đơn vị mã hóa ribosome (rTU) ở 6 chủng/5 loài sán lá phổi châu Á (chiều dài từ 7.292 bp đến 8.616 bp), làm sáng tỏ vai trò quyết định độ dài của các đơn vị lặp TRU trong vùng giao gen ITS-1.
3. Xác lập hoàn chỉnh mô hình cấu trúc bậc hai của 22 phân tử tRNA ty thể, 2 gen ribosome ty thể (12S, 16S rRNA), 2 gen ribosome nhân (18S, 28S rRNA) và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2, cung cấp chuẩn đối chiếu sinh học phân tử chuẩn xác cho phân loại học.
4. Cung cấp bộ chỉ thị phân tử đặc hiệu (mtDNA, rTU) và định lượng khoảng cách di truyền, giải quyết triệt để các tranh cãi học thuật về tính đồng danh và phân định ranh giới loài trong các phức hệ P. heterotremus, P. westermani và P. ohirai.
5. Xây dựng cây phát sinh chủng loại vững chắc dựa trên dữ liệu amino acid cộng hợp 12 PCG ty thể và dữ liệu cộng hợp 18S+28S rRNA nhân, khẳng định vị trí độc lập của họ Paragonimidae trong phân bộ Troglotremata.
6. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng mũi nhọn: chế tạo kit chẩn đoán phân tử PCR/Real-time PCR siêu nhạy phát hiện sớm bệnh sán lá phổi; giám sát dịch tễ học phân tử đa vật chủ tại thực địa; và khai phá hệ gen chức năng phục vụ sàng lọc đích thuốc điều trị mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi họ Paragonimidae 1. Phân loại sán lá phổi họ Paragonimidae Giống Paragonimus, họ Paragonimidae, thuộc phân bộ Troglotremata (Platyhelminthes: Trematoda), bao gồm nhiều loài SLP có vai trò dịch tễ quan trọng tạo nên vòng lây nhiễm và bệnh lý đặc trưng ở người và động vật [1]. Cho đến gần đây, xác định phân bộ (suborder) và họ (family) của sán lá phổi mới có được sự nhất trí dùng tên phân bộ là Troglotremata đang được thống nhất hiện nay thay vì tên phân bộ là Xiphidiata trước đây.

Tương tự, trước đây Paragonimus chỉ là một giống trong họ Troglotrematidae, nay được tách riêng khỏi họ này trở thành một họ Paragonimidae độc lập (http://ddbj.jp/tx_search/27871?depth=4) [2, 3]. Phân bộ Troglotremata chính thức hiện nay gồm các họ Collyriclidae, họ Nanophyetidae, họ Troglotrematidae và họ Paragonimidae. Giống Paragonimus (trước đây) và nay là họ Paragonimidae bao gồm các loài: Paragonimus africanus; P. Phân bộ Troglotremata có đến 93 đăng ký loài tại cơ sở dữ liệu UniProt, trong đó ngoài loài chủ yếu, còn có một số loài đồng danh (synonym) và một số loài chưa được phân định cấp loài một cách chính xác (https://www.

Phân loại SLP gặp phải một số khó khăn do có sự đa dạng rất cao các chủng của cùng một loài trong một phức hệ, giữa các quần thể và cả về hình thái ấu trùng metacercaria, về di truyền, sinh học và khả năng gây bệnh [1, 4]. Phân tích SHPT đã khẳng định một số loài là đồng danh, ví dụ, P. sadoensis là đồng danh của loài P. microrchis là đồng danh của P.

Một số loài trở thành phân loài, như P. miyazakii được xếp là phân loài P. skrjabini miyazakii, nhưng chưa chính thức. Theo Tóm tắt phân loại có trong Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia ở Mỹ (NCBI) thì hệ thống phân loại của họ Paragonimidae và các giống 4 của chúng (NCBI: Taxonomy: http://www.gov/Taxonomy/) được sắp xếp phân cấp theo Dòng phân loại (lineage), như sau: Tóm tắt Dòng phân loại (lineage): cellular organisms; Eukaryota; Opisthokonta; Metazoa; Eumetazoa; Bilateria; Protostomia; Spiralia; Lophotrochozoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea; Plagiorchiida; Troglotremata; Paragonimidae; (Paragonimus) (Hình 1.

Sắp xếp dòng phân loại của họ Paragonimidae và các giống trong họ này theo Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS). Nguồn: (https://www. Phân Bộ Troglotremata Schell, 1980 bao gồm họ Collyriclidae Ward, 1917, họ Nanophyetidae (Dollfus, 1939), họ Paragonimidae Dollfus, 1939 và họ Troglotrematidae, Odhner, 1914; trong đó họ Paragonimidae gồm các loài chủ yếu gây bệnh sán lá phổi (paragonimiasis) do các loài Paragonimus spp. Theo Hệ thống thông tin phân loại tích hợp (ITIS, Integrated Taxonomic Information System)/ https://www.gov/), cấp bậc phân loại, vị trí các loài và các giống trong họ Paragonimidae, cũng như sắp xếp của họ Paragonimidae với các họ khác trong ngành Sán dẹt được phân cấp như sau: Giới (Kingdom): Động vật (Animalia) Phân Giới: Bilateria Hạ Giới (Infrakingdom): Protostomia Trên Ngành (Superphylum): Platyzoa Ngành Phylum): Sán dẹt (Platyhelminthes Minot, 1876) Dưới Ngành (Subphylum): Neodermata Ehlers, 1985 Lớp (Class): Sán lá (Trematoda, Rudolphi, 1808) Dưới Lớp (Subclass): Digenea, Carus, 1863 Bộ (Order): Plagiorchiida La Rue, 1957 5 Phân Bộ (Suborder): Troglotremata Schell, 1980 Họ (Family): Paragonimidae Dollfus, 1939 Giống (Genus): Paragonimus, Braun, 1899 Loài (Species): Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964 Loài (Species): Paragonimus ohirai Miyazaki, 1939 Loài (Species): Paragonimus iloktsuenensis Chen, 1940 Loài: Paragonimus miyazakii Kamo, Nishida, Hatsushika, et Tomimura, 1961 Loài: Paragonimus westermani Kerbert, 1878 Loài: Paragonimus kellicotti Ward, 1908 Loài: Paragonimus mexicanus Miyazaki et Ishii, 1968 … 1.

Phân bố địa lý sán lá phổi họ Paragonimidae Các loài SLP gây bệnh ở người được phân vào các phức hệ chính, gồm: i) Phức hệ P. westermani; ii) Phức hệ P. heterotremus; iii) Phức hệ P. ohirai; iv) Phức hệ P.

miyazakii; v) Phức hệ P. skrjabini và một số phức hệ nhỏ khác; và mỗi một phức hệ có nhiều genotype và có thể còn có nhiều biến chủng khác nhau ở mỗi loài đang được khám phá [5–9]. Sán lá phối cũng đã được chia làm các nhóm theo phân bố địa lý và do mỗi nhóm địa lý có các loài có đặc điểm dịch tễ và tiến triển gây bệnh tương đối giống nhau, nên SLP cũng được phân vào các nhóm là: nhóm SLP châu Á; nhóm SLP châu Phi và nhóm SLP châu Mỹ [6, 8, 10, 11]. Phân bố các loài sán lá phổi ở các nước châu Á Loài Đồng danh Phân bố địa lý 1 P.

bangkokensis (Miyazaki and Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Vajrasthira, 1967) Việt Nam 2 P. cheni (Hu, 1963) Trung Quốc 3 P. compactus (Cobbold, 1859) Ấn Độ, Sri Lanka 4 P. harinasutai (Miyazaki and Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Vajrasthira, 1968) Việt Nam 6 P.

heterorchis (Zhou et al. heterotremus (Chen and Hsia, P. tuanshanensis (Chung et al., 1964) Trung Quốc, Thái Lan, Lào, 1964) Việt Nam 8 P. jiangsuensis (Cao et al.

macrorchis (Chen, 1962) Trung Quốc, Sri Lanka, Thái Lan 10 P. microchis (Hsia et al. mungoi (Mishra et al. sadoensis (Miyazaki et al., 1968), Nhật, Trung Quốc, Hàn P.

iloktsuenensis (Chen, 1940) Quốc, Đài Loan 14 P. paishuihoensis (Tsao and P. divergens (Liu et al., 1980) Trung Quốc, Lào, Thái Lan Chung, 1965) 15 P. proliferus (Hsia and Chen, P.

menglaensis (Chung et al., 1964), Trung Quốc, Việt Nam 1964) P. hokuoensis (Ho et al. hueitungensis (Chung et al., 1975), Trung Quốc, Nhật Bản, P. miyazakii (Kamo et al.

Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam szechuanensis (Chung and Tsao, 1962), P. taipingini (Kurochkin, 1987) Trung Quốc 20 P. Ấn Độ, Pakistan, Nepal, edwardsi (Gulati, 1926), P. filipinus Thái Lan, Philippin, (Miyazaki, 1978), Indonesia, Papua New P.

Guinea, Myanmar, Việt philippinensis (Ito et al. Nam, Campuchia, Lào, Hàn pulmonalis (Baelz, 1880), P. ringeri Quốc, Trung Quốc, Nhật (Cobbold, 1880) Bản, Đài Loan, Vùng viễn đông nước Nga 21 P. xiangshanensis (He et al.

yunnanensis (Ho et al. vietnamensis (Doanh et al. pseudoheterotremus Thái Lan (Waikagul, 2007) 25 P. sheni (Shan, Lin et al.) Trung Quốc Ghi chú: Theo tài liệu [4] và [12].

Phân bố các loài sán lá phổi ghi nhận gây nhiễm trên người ở châu Á Quốc gia ghi nhận gây Loài Phân bố địa lý nhiễm trên người 1 P. westermani Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Loan, Trung Quốc, Thái Myanmar, Lào, Campuchia, Lan, Philippin, Ấn Độ Indonesia, Nepal, Pakistan, Papua New Guinea, Malaysia, Philippin, Sri Lanka, Ấn Độ 2 P. heterotremus Ấn Độ, Thái Lan, Việt Nam, Lào, Ấn Độ, Thái Lan, Việt Myanmar, Nam Trung Quốc Nam, Lào, Trung Quốc (phía Nam) 3 P. Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Trung Quốc miyazakii Việt Nam, Ấn Độ Ghi chú: Theo [12].

Các loài Paragonimus spp. của châu Á có nhiều biến chủng khác nhau nằm trong các quần thể có đa dạng di truyền phức tạp, phân bố từ Nhật Bản, Hàn Quốc, dọc theo Bắc và Đông-Nam Trung Quốc, vùng Tây-Bắc và miền Trung Việt Nam, 7 Myanmar, Lào, Thái Lan, Philippin, Bangladesh, Ấn Độ, Sri Lanka và chủ yếu tập trung trong một số phức hệ chính nói trên (Bảng 1. Các loài Paragonimus spp. của châu Mỹ (P.

mexicanus) phân bố chủ yếu ở Canada, Mỹ và Mexico; các loài SLP châu Phi ở các vùng hạ sa mạc Sahara [10, 21]. Đặc điểm sinh học sán lá phổi họ Paragonimidae 1. Hình thái, cấu tạo của sán lá phổi Giống như sán lá nói chung, SLP họ Paragonimidae có cấu tạo mặt dẹt, dạng hình lá, lỗ sinh dục mở ở mặt bụng. Metacercaria (ấu trùng nang) sán lá phổi (Hình 1.2A) Metacercaria là giai đoạn ấu trùng ở VCTG thứ hai.

Đặc điểm metacercaria SLP là ruột uốn lượn và túi bài tiết lớn chứa đầy hạt glycogen (Hình 1. Metacercaria có hình bầu dục, màu vàng nâu sẫm. Về kích thước, metacercaria chia thành 3 nhóm: kích thước lớn (như P. harinasutai…), kích thước trung bình (P.

bangkokensis…) và kích thước nhỏ (P. Metacercaria của cùng một loài SLP dao động đáng kể, điển hình là sự đa dạng của loài P. Cercaria (ấu trùng đuôi) sán lá phổi (Hình 1.2B) Cercaria là giai đoạn ấu trùng ở VCTG thứ nhất. Cercaria của các loài SLP thuộc nhóm microcercaria, với đặc trưng có stylet ở phần đầu và đuôi ngắn [22].

Cercaria của các loài trong giống Paragonimus rất giống nhau về hình thái và kích thước, nên khó có thể phân biệt chúng ở cấp độ loài. Hiện nay chưa có nhiều số liệu về ấu trùng cercaria của các loài SLP [1]. Các dạnh trưởng thành của sán lá phổi Paragonimus. Hình dạng metacercaria [22]; B.

Hình dạng cercaria [23]; C. Hình dạng trứng [22]. 8 Trứng sán lá phổi (Hình 1.2C) Trứng SLP có hình dạng không đối xứng, một đầu to và một đầu nhỏ, đầu to có nắp, kích thước trung bình dài 80–120 µm, rộng 50–70 µm (Hình 1. Mặc dù có sự khác nhau về kích thước trứng giữa các loài, nhưng rất khó để phân biệt trứng giữa các loài SLP bằng kiểm tra hình thái học [4, 22].

Hiện nay, trứng SLP cũng được định loại bằng kỹ thuật SHPT [24]. Ngay cả trong cùng một loài, trứng cũng có nhiều kích thước khác nhau, chủ yếu phụ thuộc vào dạng di truyền của SLP lúc đó (lưỡng bội/diploid = 2n; hay tam bội/triploid = 3n; hay tứ bội/tetraploid = 4n = 44 nhiễm sắc thể). Sán lá phổi trưởng thành (Hình 1.3) Sán lá phổi trưởng thành của giống Paragonimus có cấu tạo đặc trưng là có hình hạt cà phê (Hình 1. Cơ thể dài 7–15 mm, rộng 3–8 mm và dày 3–5 mm, màu đỏ hoặc trắng hồng, có 2 giác kích thước bằng nhau: trung bình 0,5–1,5 mm (giác miệng và giác bụng tùy thuộc vào từng loài).

Thực quản ngắn, ống tiêu hoá chạy theo vòng tròn, buồng trứng to, chia múi, tinh hoàn phân nhánh ít, ở phía cuối ống tiêu hoá. Lỗ sinh dục ở phía sau thân gần giác bụng. Buồng trứng và tinh hoàn được coi là đặc tính phân loại và được Miyazaki đề xuất năm 1974. Sán lá phổi giống Paragonimus thu thập tại Việt Nam.

9 Chúng tôi xin giới thiệu hạn chế ở một số loài SLP có liên quan trực tiếp đến các nghiên cứu SHPT trong đề tài này, trong đó có 3 loài chính, bao gồm Paragonimus heterotremus (Hình 1.4A); Paragonimus ohirai (Hình 1.4K) và Paragonimus westermani (Hình 1. Một số SLP khác phát hiện tại Việt Nam, gồm P. harinasutai (Hình 1.4D) [20] được giới thiệu nhưng không mô tả chi tiết. Một số đối tượng SLP khác mà đề tài chọn để so sánh và phân tích gen/hệ gen và các chỉ thị SHPT cũng sẽ được đề cập đến trong các chuyên mục tương ứng.

Sán lá phổi Paragonimus heterotremus (Hình 1.4A) Paragonimus heterotremus lần đầu tiên được phát hiện ở Trung Quốc và đến nay loài P. heterotremus được xác định phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Thái Lan và Ấn Độ [13, 26–29]. Ở sán trưởng thành, giác bụng nhỏ bằng khoảng một nửa đường kính của giác miệng, buồng trứng có nhiều nhánh và tinh hoàn phân thành nhiều nhánh [28, 29]. Sán lá phổi Paragonimus ohirai (Hình 1.