CHƯƠNG 1. TONG QUAN TAI LIEU 1. Tổng quan các nghiên cứu về sensor huỳnh quang 1. Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang Sử dụng sensor huỳnh quang đề phát hiện và định lượng các ion và phân tử đã được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh học, dược học, hóa học phân tích và khoa học môi trường [1].
Về cơ bản sensor huỳnh quang là một phân tử có thê tương tác chọn lọc với các chất phân tích, qua đó làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của phân tử. Các chất phân tích được phát hiện và định lượng dựa vào sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang này. Nếu tương tác giữa sensor với chất phân tích là thuận nghịch thì sensor được gọi là chemosensor và bất thuận nghịch thì được gọi là chemodosimeter [2]. Sensor huỳnh quang đầu tiên được công bố vào năm 1867 bởi Goppelsröder (Hình 1.
Sensor này hoạt động dựa vào sự hình thành phức chất phát huỳnh quang mạnh giữa ion AI?* và một hợp chat flavonoid gọi là morin [3]. Phát hiện này dẫn sự tìm kiếm các chất huỳnh quang khác để chế tạo các sensor huỳnh quang ứng dụng trong phát hiện và định lượng các chất phân tích. Morin: không phát huỳnh quang Morin-Al°*: Phát huỳnh quang Hình 1. Sensor huỳnh quang đấu tiên được công bố bởi Goppelsröder Đối tượng phân tích ban đầu của các sensor huỳnh quang chủ yếu là các cation kim loại.
Điều này là do các cation kim loại trong môi trường nước dễ tương tác chọn lọc với các phân tử huỳnh quang hơn so với các chất phân tích khác như anion hay các phân tử trung hòa. Ngày nay, lĩnh vực nghiên cứu sensor huỳnh quang đã và đang phát triển mạnh. Đối tượng phân tích cũng như phạm vi ứng dụng của các sensor huỳnh quang không ngừng được mở rộng, đặc biệt là các đối tượng phân tích trong các hệ sinh học. Cụ thể, các sensor huỳnh quang có thê phát hiện chọn lọc các cation, anion, các phân tử sinh học quan trọng như protein và DNA, trong môi trường cũng như trong cơ thê sống.
Cùng với sự phát triển của công nghệ kính hiển vi chụp ảnh huỳnh quang (Fluorescence imaging microscope), các sensor huỳnh quang là yếu tố cấu thành không thể thay thế trong công nghệ này, giúp cho việc theo dõi sự thay đổi nồng độ chất phân tích trong hệ sinh học phân giải theo cấu trúc không gian tế bào và theo thời gian thực [4]. So với các phương pháp phân tích truyền thống, việc sử dụng các sensor huỳnh quang có những lợi thế nhất định, như quá trình xử lý mẫu tương đối đơn giản, thời gian phân tích nhanh, thiết bị có giá thành không cao và kỹ thuật phân tích theo thời gian thực trong các hệ sinh học là gần như không thê thay thế bằng các phương pháp khác như theo dõi sự thay đổi nồng độ các đối tượng phân tích trong tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang. So với phương pháp phân tích UV-Vis, dựa vào sự chênh lệch cường độ chùm sáng đến và đi ra khỏi mẫu, phương pháp huỳnh quang đo trực tiếp cường độ ánh sáng phát xạ mà không tham chiếu với cường độ ánh sáng kích thích, tránh được nhiễu nền nên có độ nhạy cao hơn rất nhiều. Hiện nay các nghiên cứu về sensor huỳnh quang tập trung vào việc nâng cao độ nhạy, độ chọn lọc, mở rộng phạm vi các đối tượng phân tích và khả năng hoạt động của các sensor huỳnh quang trong các môi trường và điều kiện khác nhau.
Gần đây nhiều sensor huỳnh quang được công bố có thê phát hiện chọn lọc các cation kim loại như Hg?* [5-8], Cu?: [9-12], Fe?! [13], Fe!" [14-16], Zn”t [14],[17], C* [18],[19], Ag* [20],[21], Pb?* [12],[21]1, Mg"*, Ba** [22], Cd?* [23]. Sensor phát hiện các cation kim loại trong môi trường tế bào như Hg?' trong tế bảo ung thư vú [24], Cu?” trong Iysosome của tế bào 293T [25], Cd?* [26], va Pb?* [27] trong tế bào Hela. Sensor huỳnh quang phát hiện các anion như FF [28], CN [29], Br [30], S” [31], HSOx /SOs” [32]; phát hiện các phân tử trung hòa như HaS [33], SOa [34], các biothiol (GSH, Hcy va Cys) [35-37]. Ở Việt Nam, có rất ít nhóm nghiên cứu về sensor huỳnh quang.
Các công bố về lĩnh vực này chủ yếu đến từ nhóm của GS. Dương Tuấn Quang. Ông và cộng sự đã công bố các sensor huỳnh quang phát hiện Hg”' [38-45], Cu”: [39],[46], Ag* [39], Al?* [47],[48], Cs* [49], F [49] va cdc biothiol [50],[51]. Mặc dù cdc sensor huỳnh quang mới liên tục được công bố, nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần được giải quyết trong lĩnh vực này bao gồm nâng cao độ nhạy, độ chọn lọc, mở rộng phạm vi các đối tượng phân tích và khả năng hoạt động của các sensor huỳnh quang trong các môi trường và điều kiện khác nhau.
Nguyên tắc hoạt động của sensor huỳnh quang Các sensor huỳnh quang có thể hoạt động theo nhiều nguyên tắc khác nhau.2 minh họa nguyên tắc hoạt động cơ bản của một sensor huỳnh quang. Khi chưa có mặt chất phân tích, phân tử sensor có thê ở trạng thái phát (ON) hoặc không phát (OFF) huỳnh quang. Quá trình liên kết hóa học của phân tử sensor với chất phân tích làm thay đổi cấu trúc electron của sensor, dẫn đến phân tử chuyên từ trạng thái phát sang không phát huỳnh quang (ON-OEFE) hoặc không phát sang phát huỳnh quang (OFF-ON). Ngoài hai nguyên tắc hoạt động thường gặp trên, có thể chất phân tích không dập tắt huỳnh quang mà làm thay đổi bước sóng phát xạ huỳnh quang của oe oe sensor [52].
Bật huỳnh quang (ON)_ Chát phân tích Tắt huỳnh quang (OFF) Tắt huỳnh quang (OFF) Bật huỳnh quang (ON) Hình 1. Hai nguyên tắc hoạt động thường gặp của sensor huỳnh quang 1. Cấu tạo của sensor huỳnh quang Một sensor huỳnh quang về cơ bản gồm ba bộ phận: 1) Fluorophore là bộ phận chịu trách nhiệm cho quá trình hấp thụ photon và phát xạ huỳnh quang; 2) Receptor đóng vai trò tương tác chọn lọc với đối tượng phân tích và 3) Spacer có vai trò liên kết và truyền tín hiệu giữa fluorophore va receptor (Hinh 1. » - Fluorophore Spacer Receptor Analyte = 'VV OFF Hình 1.
Cấu tạo thường gặp của sensor huỳnh quang ON Hình 1. Cấu tạo của hai sensor huỳnh quang BCIO và CCF1 Hình 1.4 trình bày cấu tạo của sensor BCIO được công bố bởi Hao Zhu và cộng sự [53] phát hiện HCIO trong tế bào ung thư và sensor CCF1 được phát triển bởi Jia và cộng sự [54] phát hiện Cu”' trong môi trường nội bào. Sensor BCIO sử dụng fluorophore dua trén BODIPY, nhém ethane-1,2-diyl 14 spacer va receptor 1a dẫn xuất của pyrrole. Quá trình oxy hóa nhân pyrrole bởi HCIO dẫn đến sự phát huỳnh quang của BCIO.
Sensor ngoài cấu trúc theo kiểu “fluorophore — spacer — recepfor”, receptor có thê gắn trực tiếp lên fluorophore mà không cần spacer hoặc bản thân fluorophore có chứa sẵn các nhóm chức đóng vai trò làm receptor [1]. Cơ sở vật lý của quá trình hấp thụ và phát xạ của phân tử 1. Quá trình hấp thụ Ở trạng thái cơ bản, phân tử có thê hấp thụ photon đề chuyên lên các trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn. Theo quan điểm của cơ học lượng tử, quá trình này làm thay đổi hàm sóng của electron từ trạng thái có năng lượng thấp sang trạng thái có năng lượng cao hơn.
Năng lượng photon hấp thụ bằng chênh lệch năng lượng giữa hai trạng thái chuyển đổi (4E): C Ephoton = hà = AE (1.1) Phần lớn các phân tử hữu cơ hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại xa. Tuy nhiên, các ứng dụng thực tế quá trình hấp thụ ánh sáng của phân tử chủ yếu gặp ở vùng ánh sáng khả kiến và tử ngoại gần như phân tích trắc quang và công nghiệp phẩm màu. Đề có thê hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến và tử ngoại gần, các phân tử hữu cơ phải chứa nhóm nhận tín hiệu ánh sáng gọi là chromophore (hoặc fluorophore trong hợp chất huỳnh quang) chịu trách nhiệm chính cho quá trình kích thích electron trong phân tử. Các trung tâm chromophore, trong hầu hết các trường hợp, liên quan đến sự có mặt hệ liên hợp electron 7r của vòng thơm, dị vòng và hệ liên kết đôi liên hợp dài.
So Sy v=3-—4 = = v=2 ® v=0 — v=0 Sy "¬ Ẹ v=0 > s a tr xo x9 wn ‹q)- = v=3 v= So v=1 v=0 Bước sóng (2) Hình 1. Các chuyển đổi trạng thái electron trong phổ hấp thụ của anthracene Hình 1.5 minh họa phổ hấp thụ của anthracene. Bình thường phân tử anthracene ở trạng thái cơ bản singlet (So) và phân bố chủ yếu ở mức dao động thấp nhất, ạ (ký hiệu là So„„). Khi phân tử anthracene hấp thụ photon ánh sáng có bước sóng thích hợp, nó sẽ chuyển lên trạng thái kích thích S¡ (có cùng độ bội spin theo quy tắc chọn lọc spin) ứng với các mức dao động khác nhau có thể có.
Xác suất của các chuyển đổi kết thúc ở các mức dao động khác nhau của trạng thái kích thích phụ thuộc hình học ở trạng thái cơ bản. Vì quá trình chuyên trạng thái electron về cơ bản là tức thì so với thang thời gian của chuyển động hạt nhân, nên hình học của phân tử không thay đổi trong suốt quá trình chuyển đổi. Theo nguyên lý Franck — Condon, chuyên đổi có xác suất lớn nhất ứng với mức dao động của trạng thái kích thích phù hợp nhất với hình học ở trạng thái cơ bản. Giá trị xác suất của chuyên đổi được xác định bằng cường độ dao động ƒ (oscillator strength).
Giá trị „„„ trong phổ hấp thụ của phân tử ứng với chuyên đổi có cường độ dao động lớn nhất. Trong trường hợp phan tw anthracene, Ama, tng voi chuyén đổi So,v9 S1ạ [55]. Quá trình phát xạ huỳnh quang Hiện tượng phát huỳnh quang được mô tả lần đầu tiên bởi Sahagun (1560) khi ông quan sát thấy sự phát huỳnh quang của dich chiết từ cây Eysenhardtia polystachya. Trong bài báo năm 1852 về khả năng thay đổi bước sóng của ánh sáng, Stokes đã mô tả khả năng của khoáng chất.
Khoáng chất phát huỳnh fluorite va thuy tinh uranium c6 thé thay quang dưới ánh sáng tử ngoại đổi ánh sáng cực tím không nhìn thấy thành ánh sáng màu xanh. Ông đặt tên cho hiện tượng này là huỳnh quang. Thuật ngữ huỳnh quang (fluorescence) bắt nguồn từ tên gọi khác của khoáng fluorite 1a fluororspar [56].6 cho thấy các màu ánh sáng huỳnh quang khác nhau của một số khoáng chất khi được chiếu bởi ánh sáng tử ngoại.7 trình bày cơ chế quá trình hấp thụ ánh sáng và phát xạ huỳnh quang của một phân tử điển hình. Sau khi bị kích thích, phân tử chuyên lên trạng thái kích thích S2.