CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển của kính hiển vi Kính hiển vi là một loại kính được thiết kế đặc biệt để phục vụ cho mục đích khoa học, vi sinh học. Tùy thuộc vào loại kính hiển vi, Dùng để tăng cường khả năng quan sát các đối tượng, vật thể có kích thước nhỏ bé mà so với mắt thường không thể quan sát được bằng cách tạo các hình ảnh phóng đại của vật thể đó độ phóng đại mẫu vật có thể gấp bình thường lên từ 40-3000 lần. Kỹ thuật quan sát và ghi nhận hình ảnh bằng các kính hiển vi được gọi là kỹ thuật hiển vi (microscopy). [1] Đầu thế kỷ 14, ở Italy đã có sự phát triển về nghề mài kính thuỷ tinh, kính mắt.
Kính hiển vi ban đầu được phát minh vào những năm 1950 ở Middelburg, Hà Lan. Zacharias Jansen (1580 – 1638), quốc tịch Hà Lan. Ông là một người thợ mài kính, kính lúp và kính đeo mắt đã rất phổ biến vào khoảng thời gian này. Sau này ông là một nhà hiển vi, nhà quang học tạo ra kính hiển vi quang học đầu tiên (1595) có thể phóng đại một vật lên gần 9 lần (Hình 1.
[2] Cuối thế kỷ XVI, Antony van Leeuwenhoek (1632 -1732) người Hà Lan đã phát hiện ra việc sử dụng thấu kính có thể làm tăng kích thước của hình ảnh và từ đó ông đã bắt đầu đánh bóng và mài thấu kính. Ông được coi là cha đẻ của ngành khoa học hiển vi. Thấu kính hiển vi mà ông nghĩ ra có thể phóng to hình ảnh vật thể lên rất nhiều lần (~300 lần). Kính hiển vi đầu tiên (1595) 14 Hình 1.
Kính hiển vi do Antony van Leeuwenhoek phát minh (1668) Chất lượng thấu kính này có thể nhìn được một số loài vi khuẩn siêu nhỏ, các loài động vật cực nhỏ và các chi tiết phúc tạp của các vật thể thông thường khác, Leeuwenhoek được cho là người đầu tiên đã phát hiện ra vi khuẩn và sinh vật nguyên sinh. Từ đó, Leeuwenhoek được coi là nhà vi sinh vật học đầu tiên và cũng được coi là người đã sáng lập và nghiên cứu ra kính hiển vi và đã góp phần vào việc phát triển lý thuyết về tế bào. [2] Sau đó ông đã gửi thư cho Viện Hoàng Gia Anh mô tả những gì đã nhìn thấy trong thế giới cực nhỏ nhờ quan sát qua kính hiển vi. Viện Hoàng Gia đã giao trách nhiệm kiểm chứng những khám phá của Antony van Leeuwenhoek cho Robert Hooke (1635 – 1703), ông là một nhà vật lý, toán học, và một nhà phát minh người Anh.
Năm 1665 ông đã chế tạo một loại kính rất hữu dụng là hiển vi kép và đã thực hiện hơn 60 công cuộc khảo sát bằng kính hiển vi này, gồm cả sự khám phá ra tế bào thực vật (Hình 1. Như vậy Robert Hooke là người đã phổ biến cách chế tạo và cách sử dụng kính hiển vi, ông là “Cha đẻ của khoa học hiển vi người Anh”. [3] Ban đầu, việc sử dụng kính hiển vi rất khó khăn. Ánh sáng bị khúc xạ đi qua thấu kính và làm thay đổi hình ảnh.
Năm 1729, thấu kính tiêu sắc được phát triển để sử dụng trong kính đeo mắt bởi Chester Moore Hall, chất lượng hình ảnh của kính hiển vi cũng được phát triển lên. [4] Đến năm 1774, Benjamin Martin ở London đã cho ra đời một bộ thấu kính có thể điều chỉnh màu sắc cho kính hiển vi. Các phiên bản kính hiển vi thời xưa Vào đầu thế kỷ 19, Joseph von Fraunhofer đã giảm thiểu được quang sai của ảnh nhờ những cải tiến chất lượng của các loại vật liệu thuỷ tinh dùng để chế tạo kính hiển vi quang học. Giữa thế kỷ 19, Giovanni Amici đã phát triển thêm các vật kính ngâm dầu và ngâm nước.
Đến năm 1873, Ernst Abbe đã đặt nền móng cho sự phát triển và sản xuất kính hiển vi về sau. Ông cũng là người đã phát minh ra một hệ thống thấu kính apochromatic, thấu kính này thậm chí còn có khả năng chỉnh màu tốt hơn thấu kính vô sắc. Được sản xuất vào cuối thế kỷ 19, kính hiển vi sử dụng ánh sáng đã đạt được hiệu quả cao của kính hiển vi quang học.[4] Năm 1903, Richard Zsigmondy (1865 -1929), Áo – Hung, đã chế tạo ra siêu kính hiển vi có thể quan sát được vật nhỏ hơn bước sóng ánh sáng (Hình 1. Ông đã đạt giải Nobel hoá học năm 1929.[4] Năm 1932, Frits Zernike (1888 – 1966), Hà Lan, đã phát minh ra kính phản pha.
Năm 1933, Ernst Ruska (1906 – 1988), ông là người đầu tiên phát minh ra kính hiển vi điện tử. Siêu kính hiển vi. Kính hiển vi điện tử do Ernst Ruska làm năm 1933 Marvin Minsky đã phát minh ra kính hiển vi đồng tụ vào năm 1957 – 1961 (Hình 1. Kính hiển vi đồng tụ Năm 1981, Gerd Binnig, Heinrich Rohrer đã đồng phát minh ra kính chui hầm.
Thế kỷ 20, đã khám phá và cho ra đời rất nhiều các loại kính hiển vi hiện đại. Kính hiển vi đã được phát triển mạnh mẽ với sự xuất hiện của kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quét đầu dò, kính hiển vi huỳnh quang. Các kỹ thuật và kính hiển vi này đã mở ra cánh cửa cho việc quan sát các cấu trúc vô cùng nhỏ và phức tạp, từ nguyên tử cho đến các tế bào và mô. Những bước phát triển từ kính hiển vi từ đơn giản cho đến sự phát triển của các loại kính hiển vi hiện đại, tiên tiến góp phần lớn cho những nhà nghiên cứu khoa học mang lại tính chính xác cao.2 Phân loại kính hiển vi Những thế kỷ gần đây, khoa học và công nghệ phát triển mạnh mẽ, nhiều loại kính hiển vi mới được ra đời với nhiều tính năng khác nhau.
Một số loại kính hiển vi có thể được nói đến như sau: Kính hiển vi quét đầu dò (kính hiển vi lực nguyên tử - AFM, kính hiển vi quét chui hầm – STM.), kính hiển vi quang học (kính hiển vi ánh sáng truyền qua, kính hiển vi phản pha, kính hiển vi phân cực, kính hiển vi soi ngược, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi đồng tụ,.), kính hiển vi điện tử ( kính hiển vi điện tử truyền qua – TEM, kính hiển vi điện tử quét - SEM). Kính hiển vi quét đầu dò (Scanning probe microscopy – SPM): Grend Binnig và Heinrich Rohrer đã phát minh ra nhóm kính hiển vi này vào năm 1981 (về kính hiển vi quét chui hầm) và đã dành giải thưởng Nobel Vật lý năm 1986 cho phát 18 minh này. Kính hiển vi quét đầu dò là một công nghệ quan trọng trong việc quan sát và nghiên cứu các mẫu ở mức độ nano (Hình 1. SPM hoạt động bằng cách sử dụng đầu dò cảm biến rất nhỏ quét trên bề mặt của mẫu.
Đầu dò này thường được làm từ vật liệu như silic, có đầu nhọn và có thể tạo ra hình ảnh với độ chính xác cực cao. Kỹ thuật khắc nano – nanolithography, tương tác giữa mẫu và mũi dò được sử dụng để làm công cụ thao tác trên bề mặt, nhằm tạo ra các chi tiết nhỏ trong công nghệ nano. [6] Nhược điểm: Quá trình quét đòi hỏi thời gian lớn nên quá trình ghi ảnh thường rất chậm. Kích thước ảnh không lớn và chỉ cho ảnh vi cấu trúc bề mặt.
Kính hiển vi quét đầu dò 19 Hình 1. Kính hiển vi quang học Kính hiển vi quang học (Optical Microscope): là một loại kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến để quan sát hình ảnh các vật thể nhỏ được phóng đại nhờ một hệ thống các thấu kính thuỷ tinh (Hình 1. Đây là loại kính hiển vi đơn giản, lâu đời, và phổ biến nhất. Kính hiển vi quang học hoạt động hoàn toàn dựa trên nguyên tắc khúc xạ ánh sáng qua hệ các thấu kính thuỷ tinh.
[6] Kính hiển vi điện tử (Electron Microscope): kính hiển vi điện tử có độ phóng đại và độ phân giải cao hơn nhiều so với kính hiển vi quang học. Kính hiển vi điện tử hoạt động dựa trên việc sử dụng chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Có hai loại chính của kính hiển vi điện tử là: Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM): Sử dụng electron để tạo ra hình ảnh của bề mặt mẫu. Khi electron chạm vào bề mặt mẫu, các tia phản xạ được thu thập và biểu diễn dưới dạng hình ảnh, tạo ra hình ảnh có độ phân giải cao về bề mặt của mẫu.
Kính hiển vi điện tử quét có thao tác đơn giản, không cần phá huỷ mẫu, dễ sử dụng và có giá thành thấp hơn so với kính hiển vi điện tử truyền qua.[6] Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microcopy- TEM): Sử dụng electron để tạo ra hình ảnh có cấu trúc nội bộ của mẫu. Electron được điều chỉnh và chiếu qua mẫu, các electron này sau đó được thu thập thông qua mẫu để 20 tạo ra hình ảnh về cấu trúc nội bộ với độ phân giải cực cao. TEM được sử dụng rộng rãi trong vật lý chất rắn, công nghệ nano, sinh học, y học, khoa học vật liệu,… TEM có nhiều điểm mạnh: có thể tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ phân giải và độ tương phản cao, cho hình ảnh thật của các cấu trúc bên trong vật rắn do đó đem lại nhiều thông tin hơn, dễ dàng tạo ra hình ảnh ở cấp độ nguyên tử.[6] Tuy nhiên, TEM có giá thành cao, sự ổn định về điện, điều kiện làm việc cao, nhiều phép xử lý mẫu phức tạp cần phải phá huỷ mẫu. Việc điều khiển TEM phức tạp và cần thực hiện các bước với độ chính xác cao.
Kính hiển vi điện tử quét - Hình 1. Kính hiển vi điện tử truyền SEM qua -TEM 21 1.3 Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi 1.1 Kính hiển vi soi nổi Kính hiển vi soi nổi là một loại kính hiển vi quang học. Là loại kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng huỳnh quang và lân quang để tạo ra hình ảnh của các vật thể nhỏ. Nguyên lý hoạt động của nó dựa trên việc sử dụng ánh sáng khả kiến để chiếu qua mẫu vật và sau đó tiếp tục qua một hệ thống quang học (ống kính) để tạo ra hình ảnh được phóng đại trên một trục quang học.2 Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi là một thiết bị hiển vi dùng tín hiệu huỳnh quang phản xạ và hấp thụ để thực hiện nghiên cứu các phân tử cụ thể trong mẫu y sinh học.