Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Kỹ thuật hiển vi đóng vai trò thiết yếu trong nghiên cứu khoa học sự sống, y sinh học, vật lý và khoa học vật liệu. Cùng với sự phát triển của các dòng kính hiển vi quang học, điện tử và quét đầu dò, kính hiển vi huỳnh quang soi nổi là thiết bị kết hợp khả năng quan sát lập thể ba chiều (3D) về hình thái bề mặt mẫu vật với chức năng ghi nhận tín hiệu phát huỳnh quang khi được chiếu chùm tia kích thích thích hợp. Thiết bị này mang lại lợi thế lớn trong phân tích các mẫu y sinh học, đặc biệt là nhóm mẫu có khả năng tự phát quang (autofluorescence) hoặc mẫu được đánh dấu miễn dịch huỳnh quang.

Tại Trường Đại học Phenikaa, hệ thống kính hiển vi huỳnh quang soi nổi M165FC của hãng Leica (Đức) được trang bị tại Viện Nghiên cứu Nano, phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu. Tuy nhiên, việc khai thác thiết bị này trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm gặp phải một số khó khăn và rủi ro:

  • Nguy cơ an toàn bức xạ: Nguồn kích thích quang học sử dụng đèn thủy ngân cao áp phát ra chùm bức xạ bước sóng ngắn thuộc vùng tử ngoại (UV), tiềm ẩn nguy cơ gây tổn thương giác mạc và da của người quan sát khi làm việc trực tiếp.
  • Tín hiệu huỳnh quang yếu: Tín hiệu phát xạ huỳnh quang tự nhiên từ các cấu trúc y sinh học (không sử dụng chất nhuộm huỳnh quang) thường có cường độ rất yếu, dễ bị lấn át bởi ánh sáng tán xạ từ môi trường xung quanh.
  • Yêu cầu không gian quan sát: Quy trình ghi nhận tín hiệu huỳnh quang tiêu chuẩn đòi hỏi phải bố trí thiết bị trong phòng tối chuyên dụng, gây tốn diện tích mặt sàn và không thuận tiện cho việc luân chuyển mẫu trong các phòng thí nghiệm thông thường.

Nhằm giải quyết các bất cập trên, đồ án xác định hai nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Cải tiến hệ thống quan sát của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi M165FC Leica thông qua việc thiết kế và chế tạo một buồng tối mini chuyên dụng, nhằm đảm bảo an toàn cho người quan sát và nâng cao chất lượng hình ảnh huỳnh quang.
  2. Thử nghiệm xây dựng quy trình kỹ thuật để phân tích một số mẫu y sinh học tự phát quang và sàng lọc mẫu vi khuẩn tự phát quang phân lập từ đất tự nhiên sử dụng hệ thống kính hiển vi Leica M165FC sau cải tiến.
  • Đối tượng nghiên cứu: Hệ thống kính hiển vi huỳnh quang soi nổi Leica M165FC; mô hình buồng tối mini và khăn chùm chắn sáng; các mẫu sinh học tự phát quang (Vitamin A, Vitamin B, mô mỡ, mô sụn); bốn chủng vi khuẩn kiểm chuẩn phòng thí nghiệm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi); các chủng vi khuẩn tự phát quang phân lập từ đất.
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Không gian: Phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Nano và Khoa Khoa học Y sinh, Trường Đại học Phenikaa; địa bàn thu thập mẫu đất tại ba vị trí ở Hà Nội (Khuôn viên Trường Đại học Phenikaa; Khu vực Hồ Văn Quán, Hà Đông; Khu chung cư Xuân Mai, Yên Nghĩa, Hà Đông).
    • Thời gian: Đồ án được hoàn thành và bảo vệ vào tháng 01 năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết quang học và miễn dịch huỳnh quang

  • Hiện tượng phát huỳnh quang: Xảy ra khi một phân tử hấp thụ photon ánh sáng có bước sóng ngắn (năng lượng cao) làm cho các electron chuyển lên trạng thái kích thích. Khi electron trở về mức năng lượng cơ bản, chúng phát ra photon có bước sóng dài hơn (năng lượng thấp hơn), thông thường nằm trong dải ánh sáng khả kiến.
  • Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IF): Dựa trên nguyên lý liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể kết hợp với chất phát huỳnh quang (fluorophore). Đồ án tổng hợp hai phương pháp:
    • Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DIF): Kháng thể sơ cấp gắn trực tiếp chất huỳnh quang liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích trên mô hoặc tế bào.
    • Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IIF): Kháng thể sơ cấp chưa đánh dấu liên kết với kháng nguyên, sau đó kháng thể thứ cấp (đã gắn fluorophore) nhận diện và liên kết với kháng thể sơ cấp, giúp khuếch đại tín hiệu huỳnh quang.
    • Kỹ thuật chuẩn bị mẫu mô: Bao gồm các bước cố định mẫu (bằng formalin hoặc dung môi hữu cơ methanol/acetone), đúc khối parafin, cắt lát mỏng, khử parafin bằng dung môi xylene/ethanol, bù nước và thu hồi kháng nguyên bằng nhiệt (HIER) hoặc bằng enzyme protease (PIER).
  • Hệ quang học huỳnh quang soi nổi: Tác giả phân tích cấu trúc quang học của dòng kính Leica M165FC với hai công nghệ cốt lõi: công nghệ TripleBeam (thiết kế một kênh quang học riêng biệt cho chùm tia kích thích huỳnh quang, triệt tiêu ánh sáng tán xạ nền) và công nghệ FusionOptics (kết hợp đường truyền quang có độ phân giải cao với đường truyền quang có độ sâu trường ảnh lớn nhằm tạo hình ảnh lập thể 3D sắc nét).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp khảo sát và cải tiến thiết bị: Phân tích thông số kỹ thuật chi tiết của hệ thống kính Leica M165FC; tính toán thiết kế cơ khí và lắp ráp bộ buồng tối mini kết hợp khăn chùm chắn sáng từ vật liệu nhôm, kính và vải nhung đen.
  • Phương pháp vi sinh học: Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng lỏng (Nutrient Broth) và môi trường thạch rắn (Nutrient Agar); phân lập vi khuẩn từ đất bằng phương pháp pha loãng và trải đĩa; nhuộm Gram để phân loại vi khuẩn Gram âm/Gram dương.
  • Phương pháp hiển vi bổ trợ: Sử dụng kính hiển vi quang học soi nổi thông thường để quan sát khuẩn lạc; kính hiển vi huỳnh quang soi nổi để ghi nhận tín hiệu phát quang; kính hiển vi điện tử quét (SEM) để xác định cấu trúc hình thái tế bào vi khuẩn ở cấp độ micromet.
Danh mục Chi tiết chủng loại / Model Mục đích sử dụng trong nghiên cứu
Kính hiển vi chính Leica M165FC (Đức), Zoom 16,5:1 Quan sát soi nổi và chụp ảnh huỳnh quang
Hệ thống chiếu sáng Hộp đèn 106z, đèn Hg 100W, nguồn EBQ 100-0-4L Cung cấp chùm tia kích thích huỳnh quang
Bộ lọc huỳnh quang Bộ lọc ET UV LP (kích thích AT350/50x nm, phát xạ ET 420 nm LP) Lọc tách bước sóng UV và huỳnh quang
Bộ thu nhận ảnh Camera kỹ thuật số đơn sắc Leica DFC3000 G Ghi nhận hình ảnh huỳnh quang độ nhạy cao
Thiết bị bổ trợ Kính hiển vi điện tử quét (SEM) Khảo sát hình thái bề mặt vi khuẩn
Thiết bị phòng lab Nồi hấp Jeio Tech, Tủ ấm Froilabo BC 120, Tủ cấy HMRTC-B1300 Tiệt trùng, nuôi ủ và cấy vi sinh

Thiết kế và triển khai buồng tối mini cho kính hiển vi

Hệ thống buồng tối mini được thiết kế nhằm thích ứng trực tiếp với kích thước và cơ chế vận hành của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi Leica M165FC, phục vụ quá trình quan sát mẫu y sinh học tự phát quang ngay trong điều kiện ánh sáng phòng thông thường.

Thông số kỹ thuật hệ thống kính hiển vi Leica M165FC

  • Hệ thống chiếu sáng:
    • Hộp đèn model 106z cho ánh sáng phản xạ, tích hợp 4 thấu kính tụ quang có bộ lọc nhiệt, dây cáp nguồn 1,5 m.
    • Nguồn sáng sử dụng đèn đốt áp lực cao khí Hg công suất 103 W/2.
    • Bộ nguồn cung cấp EBQ 100-0-4L, điện áp hoạt động tự động 90 V – 250 V, tần số 50/60 Hz, có màn hình hiển thị giờ hoạt động.
    • Bộ che bảo vệ ánh sáng tán xạ 105-106Z; bộ lọc huỳnh quang ET UV LP (bước sóng kích thích AT350/50x nm, bước sóng phát xạ ET 420 nm LP).
  • Thân máy chính và bàn mẫu:
    • Giá đỡ quang học Leica M165FC với dải zoom tỷ lệ 16,5:1, khoảng phóng đại từ 7.0x (với thị kính 10x), ống lọc huỳnh quang 4 vị trí, hệ thấu kính apochromatic toàn phần.
    • Vật kính PlanApo 1.0x, khoảng cách làm việc 61,5 mm, ren kết nối chuẩn M65, đường kính ngoài 80 mm.
    • Ống quan sát 3 đường truyền quang (trinocular) góc 30°, cơ chế chuyển đổi 100% thị kính hoặc 100% camera, điều chỉnh khoảng cách hai mắt 51 – 77 mm.
    • Thị kính 10x/23B có cơ cấu bù trừ đi-ốp. Cần điều khiển lấy nét tinh/thô hành trình 420 mm, tải trọng tối đa 15 kg.
    • Bàn mẫu cơ học IsoPro kích thước dịch chuyển 6x4 inch (15,24 x 10,16 cm), kích thước tổng thể 24,4 x 37,4 cm, chịu tải 0,5 kg, kết hợp chân đỡ bệ máy chống sốc kích thước 320 x 417,3 x 24 mm.
  • Khối hiển thị và thu nhận tín hiệu:
    • Camera đơn sắc Leica DFC3000 G, cơ chế làm mát thụ động, sử dụng cảm biến Sony ICX455 interline CCD với công nghệ HAD EXview. Độ phân giải cảm biến 1,3 Megapixel, kích thước mỗi pixel 3,75 µm.
    • Tốc độ khung hình tối đa ở chế độ full frame: 31 fps (ở binning 1x1), 54 fps (ở binning 2x2) và 72 fps (ở binning 3x3). Hỗ trợ số hóa tín hiệu ở độ sâu 8, 12 và 16 bit.
    • Phần mềm điều khiển và xử lý ảnh: Capta Vision +.

Kết cấu và quy trình chế tạo buồng tối mini

  • Vật liệu chế tạo: Khung định hình bằng nhôm, kết hợp vách kính chuyên dụng và lớp rèm vải nhung đen chắn sáng.
  • Đặc tính kỹ thuật: Buồng tối mini có kích thước bao vừa vặn cụm thân và bàn mẫu của kính hiển vi; kết hợp khăn chùm bao quanh thị kính để cách ly hoàn toàn vùng thao tác với ánh sáng phòng. Thiết kế cho phép dịch chuyển linh hoạt, không làm thay đổi kết cấu quang học nguyên bản của máy và duy trì khả năng điều chỉnh núm tiêu cự cũng như bàn trượt XY.
  • Quy trình 5 bước triển khai thực nghiệm:
    1. Bước 1: Tìm kiếm và thu thập các nhóm mẫu y sinh học có tiềm năng tự phát quang (Vitamin, mô mỡ, mô sụn).
    2. Bước 2: Xây dựng quy trình kỹ thuật chuẩn bị mẫu phù hợp với đặc tính quan sát của kính huỳnh quang soi nổi.
    3. Bước 3: Quan sát sơ bộ mẫu trên kính Leica M165FC và đối chiếu giữa chế độ soi nổi ánh sáng trắng với chế độ huỳnh quang.
    4. Bước 4: Thiết kế, gia công và lắp đặt hoàn chỉnh buồng tối mini cùng khăn chùm chắn sáng cho hệ kính.
    5. Bước 5: Kiểm chứng thực tế hiệu quả chắn sáng và chất lượng hình ảnh huỳnh quang trên mẫu vi khuẩn phân lập từ đất.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương I hệ thống hóa toàn diện tiến trình phát triển của ngành khoa học hiển vi từ kính sơ khai của Zacharias Jansen (1595), các quan sát của Antony van Leeuwenhoek (1668) và Robert Hooke (1665), các mốc hoàn thiện thấu kính tiêu sắc (Chester Moore Hall, 1729), thấu kính apochromatic (Ernst Abbe, 1873) đến siêu kính hiển vi của Richard Zsigmondy (1903) và kính hiển vi điện tử của Ernst Ruska (1933).

Chương này phân loại chi tiết các nhánh hiển vi hiện đại gồm: hiển vi quang học (truyền qua, phản pha, phân cực, soi ngược, đồng tụ), hiển vi quét đầu dò (AFM, STM) và hiển vi điện tử (SEM, TEM). Tác giả đi sâu trình bày nguyên lý kính hiển vi huỳnh quang soi nổi, lược sử bộ điều hợp SFA từ nghiên cứu huỳnh quang san hô của công ty NIGHTSEA và Alina Szmant, cơ sở miễn dịch huỳnh quang (DIF, IIF), kỹ thuật chuẩn bị mô (cố định, khử parafin, thu hồi kháng nguyên HIER/PIER) cùng các ứng dụng y sinh của công nghệ TripleBeam và FusionOptics trên hệ kính Leica.

Chương II: Phương pháp thực nghiệm

Chương II mô tả toàn bộ cơ sở vật chất, hóa chất và quy trình thực nghiệm. Về nguyên liệu sinh học, chương trình bày đặc tính vi sinh học của 4 chủng vi khuẩn chuẩn:

  • Escherichia coli: Trực khuẩn Gram âm, nuôi cấy 24 giờ tạo khuẩn lạc dạng S đường kính 1 – 1,5 mm, màu trắng đục.
  • Pseudomonas aeruginosa: Trực khuẩn Gram âm sinh mủ xanh, kích thước 0,5 – 1 µm x 1,5 – 5 µm, di động nhờ một lông cực, phát triển thuận lợi ở pH 7,2 – 7,5 và nhiệt độ 37 °C.
  • Staphylococcus aureus: Cầu khuẩn Gram dương, đường kính 0,8 – 1 µm, xếp thành chùm, khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh đường kính 1 – 2 mm, nhiệt độ tối ưu 30 – 45 °C.
  • Salmonella typhi: Trực khuẩn Gram âm gây bệnh thương hàn, kích thước (1 – 3) x (0,5 – 0,7) µm, có lông di động.

Đồng thời, chương làm rõ thành phần của các mẫu sinh học khác gồm: Vitamin A (chế phẩm 5000 IU chứa hoạt chất Retinol acetate và hệ tá dược), Vitamin B, mẫu mô mỡ (nghiên cứu khả năng phát quang autofluorescence của mỡ nâu dưới ánh sáng kích thích), mẫu mô sụn (chứa 70 – 80% nước, mô khô chứa 50 – 70% sợi collagen). Chương kết thúc bằng việc liệt kê chi tiết các thông số kỹ thuật của kính Leica M165FC, camera Leica DFC3000 G, quy trình phân lập vi khuẩn từ 3 mẫu đất tại Hà Nội và 5 bước cải tiến hệ thống quan sát với buồng tối mini.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày và đánh giá các kết quả thực nghiệm thu được:

  • Tín hiệu phát quang của mẫu sinh học: Retinol acetate trong Vitamin A phát tín hiệu huỳnh quang rất mạnh khi chiếu chùm tia kích thích thích hợp nhờ cấu trúc hóa học nhạy quang; Vitamin B không ghi nhận hiện tượng phát quang; mô mỡ và mô sụn phát huỳnh quang nội sinh ở mức độ yếu do sự hiện diện của collagen và các hợp chất hữu cơ liên kết.
  • Đặc tính vi khuẩn phân lập từ đất: Phân lập thành công các khuẩn lạc từ 3 mẫu đất (Phenikaa, Hồ Văn Quán, Xuân Mai). Dưới kính hiển vi soi nổi huỳnh quang ở độ phóng đại 7,3x, các khuẩn lạc này phát ra tín hiệu huỳnh quang tự nhiên rõ nét trên nền đen. Kết quả nhuộm Gram và ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) đã xác định rõ đặc tính vách và hình thái tế bào que/cầu của các chủng vi khuẩn này.
  • Hiệu năng của buồng tối mini cải tiến: So sánh trực tiếp chất lượng ảnh chụp huỳnh quang giữa ba trạng thái: (1) bật đèn phòng bình thường, (2) tắt đèn phòng, và (3) lắp buồng tối mini kết hợp khăn chùm. Kết quả cho thấy hệ thống buồng tối mini loại bỏ hoàn toàn ánh sáng tán xạ bên ngoài, hình ảnh huỳnh quang đạt độ tương phản cao, biên độ tín hiệu trên nền tối sắc nét tương đương hoặc tốt hơn việc tắt toàn bộ đèn phòng thí nghiệm.

Kết quả và đóng góp

Nhóm đối tượng Đặc điểm nhận diện / Hình thái Tín hiệu huỳnh quang ghi nhận
Vitamin A (Retinol acetate 5000 IU) Dạng hạt tá dược mịn Tự phát huỳnh quang rất mạnh dưới chùm kích thích
Vitamin B Dạng bột chế phẩm Hoàn toàn không phát huỳnh quang
Mô mỡ (Lipit) Cấu trúc tế bào mỡ liên kết Tự phát huỳnh quang mức độ thấp
Mô sụn Chứa 50 – 70% sợi collagen khi khô Phát huỳnh quang nội sinh cấu trúc nền
Khuẩn lạc vi khuẩn từ đất (Mẫu 1, 2, 3) Dạng khuẩn lạc phân lập, soi ở 7,3x; kiểm chứng SEM Phát huỳnh quang rõ nét, tương phản trên nền tối

Các kết quả chính

  • Chế tạo thành công buồng tối mini: Thiết kế và lắp ráp hoàn chỉnh cụm buồng tối mini và khăn chùm chắn sáng bằng vật liệu nhôm, kính và vải nhung đen tương thích với hệ kính hiển vi Leica M165FC. Thiết bị giúp triệt tiêu hoàn toàn ánh sáng nhiễu từ môi trường mà không cần phòng tối chuyên dụng.
  • Bảo vệ an toàn thao tác: Khung buồng tối ngăn cách trực tiếp tia tử ngoại (UV) phát ra từ đèn đốt thủy ngân 103 W/2 của nguồn EBQ 100-0-4L, bảo vệ mắt và da của nghiên cứu viên.
  • Xây dựng quy trình phân tích mẫu tự phát quang: Thiết lập quy trình chuẩn bị và ghi nhận hình ảnh huỳnh quang không xâm lấn đối với các mẫu sinh học tự phát quang (Vitamin A, mô mỡ, mô sụn) và các chủng vi khuẩn tự nhiên.
  • Sàng lọc vi khuẩn phát quang từ đất: Phân lập thành công các chủng vi khuẩn tự phát huỳnh quang từ 3 mẫu đất tại khu vực Hà Nội; ghi nhận rõ hình thái khuẩn lạc ở độ phóng đại 7,3x trên kính Leica M165FC và kiểm chứng đặc tính hình thái bằng phương pháp nhuộm Gram cùng ảnh hiển vi điện tử quét (SEM).

Đóng góp thực tiễn của đề tài

Đồ án đã đưa ra giải pháp kỹ thuật có tính ứng dụng cao giúp tối ưu hóa việc khai thác hệ thống kính hiển vi huỳnh quang soi nổi hiện đại tại cơ sở đào tạo. Bằng việc tích hợp buồng tối mini chi phí thấp, nhóm nghiên cứu có thể vận hành thiết bị ngay trong phòng thí nghiệm thông thường với đầy đủ điều kiện an toàn bức xạ, giải quyết hạn chế về mặt bằng và nâng cao chất lượng ghi nhận hình ảnh y sinh học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Nghiên cứu tập trung chủ yếu vào nhóm mẫu tự phát quang (autofluorescence) và phân lập vi khuẩn tự nhiên; chưa tiến hành định danh phân loại sinh học chính xác đến loài bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA) cho các chủng vi khuẩn phân lập từ đất.
    • Kết cấu cơ khí của buồng tối mini và khăn chùm được chế tạo thủ công trong điều kiện phòng thí nghiệm, một số thông số còn mang tính lý thuyết và cần tiếp tục hoàn thiện về độ thẩm mỹ cũng như tính tiện dụng khi thay đổi các cấu hình vật kính khác nhau.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Hoàn thiện module buồng tối mini bằng vật liệu composite hoặc gia công CNC chính xác để chuẩn hóa thành phụ kiện chuyên dụng cho kính hiển vi huỳnh quang soi nổi.
    • Mở rộng phạm vi thực nghiệm sang các kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DIF) và gián tiếp (IIF) sử dụng các chất đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu (như Fluorescein, Rhodamine) để chẩn đoán các chỉ dấu y sinh.
    • Phân tích cơ chế phát quang và định danh loài đối với các chủng vi sinh vật tự phát quang thu thập được từ tự nhiên.

Giá trị tham khảo

Tài liệu đồ án là nguồn tham khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên và học viên ngành Kỹ thuật y sinh, Công nghệ sinh học, Quang học kỹ thuật: Cung cấp tài liệu tra cứu cụ thể về cấu tạo phần cứng, nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi, cấu trúc bộ thu nhận ảnh CCD chuyên dụng (Leica DFC3000 G) và các kỹ thuật quang học tách chùm tia TripleBeam.
  • Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm và nhóm nghiên cứu: Cung cấp bản vẽ ý tưởng và giải pháp chế tạo buồng tối mini chắn sáng chi phí thấp, giúp vận hành an toàn các hệ thống kính hiển vi huỳnh quang có nguồn phát UV trong không gian làm việc tiêu chuẩn.
  • Nghiên cứu viên lĩnh vực vi sinh: Tham khảo quy trình kết hợp đa phương pháp (hiển vi soi nổi huỳnh quang, nhuộm Gram, hiển vi điện tử quét SEM) để sàng lọc nhanh các vi sinh vật có đặc tính tự phát quang trong tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

1. Kính hiển vi huỳnh quang soi nổi Leica M165FC sử dụng nguồn sáng kích thích và bộ lọc quang học nào trong nghiên cứu này?
Hệ thống sử dụng hộp đèn model 106z trang bị bóng đèn đốt áp lực cao thủy ngân công suất 103 W/2 (được cấp nguồn tự động qua bộ EBQ 100-0-4L, dải điện áp 90 V – 250 V). Bộ lọc huỳnh quang trang bị là bộ ET UV LP bao gồm bộ lọc kích thích AT350/50x nm (vùng tử ngoại) và bộ lọc phát xạ ET 420 nm LP.

2. Tại sao tác giả phải chế tạo buồng tối mini thay vì sử dụng phòng tối chuyên dụng thông thường?
Việc bố trí phòng tối chuyên dụng đòi hỏi diện tích lớn và chi phí xây dựng cao, gây bất tiện khi muốn thao tác quan sát mẫu nhanh trong phòng thí nghiệm thông thường. Buồng tối mini kết hợp khăn chùm chắn sáng giúp cách ly hoàn toàn vùng quan sát khỏi ánh sáng phòng, ngăn ngừa hiện tượng lóa nền và đồng thời chắn chùm tia cực tím tán xạ từ đèn thủy ngân, bảo vệ an toàn cho mắt và da người vận hành.

3. Trong các mẫu sinh học đối chứng thử nghiệm, mẫu nào thể hiện tín hiệu huỳnh quang mạnh nhất và vì sao?
Mẫu chế phẩm Vitamin A 5000 IU cho tín hiệu phát quang mạnh nhất. Cơ chế phát quang xuất phát từ hoạt chất Retinol acetate có cấu trúc phân tử nhạy sáng, có khả năng hấp thụ năng lượng kích thích và phát xạ bức xạ huỳnh quang cường độ cao, trong khi mẫu Vitamin B đối chứng hoàn toàn không có khả năng phát quang này.

4. Các mẫu đất phục vụ sàng lọc vi khuẩn phát quang được thu thập từ những vị trí nào và kiểm chứng bằng phương pháp nào?
Mẫu đất được lấy tại 3 địa điểm ở Hà Nội: khuôn viên Trường Đại học Phenikaa (Mẫu 1), khu vực Hồ Văn Quán - Hà Đông (Mẫu 2) và chung cư Xuân Mai - Yên Nghĩa - Hà Đông (Mẫu 3). Sau khi phân lập và soi huỳnh quang ở độ phóng đại 7,3x, đặc tính vi khuẩn được kiểm chứng qua phương pháp nhuộm Gram và chụp ảnh hình thái bề mặt bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).

5. Camera trang bị trên hệ thống kính Leica M165FC có thông số kỹ thuật ra sao?
Hệ thống sử dụng camera đơn sắc kỹ thuật số Leica DFC3000 G, làm mát thụ động, cảm biến Sony ICX455 interline CCD (công nghệ HAD EXview) với độ phân giải 1,3 Megapixel, kích thước pixel 3,75 µm. Thiết bị đạt tốc độ 31 khung hình/giây ở độ phân giải đầy đủ (1x1), hỗ trợ xử lý ảnh ở độ sâu màu 8, 12 và 16 bit thông qua phần mềm Capta Vision +.

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Phương Anh đã hoàn thành mục tiêu cải tiến hệ thống quan sát của kính hiển vi huỳnh quang soi nổi Leica M165FC thông qua việc thiết kế và chế tạo thành công buồng tối mini kết hợp khăn chùm chắn sáng. Giải pháp này giúp triệt tiêu ánh sáng tán xạ môi trường, nâng cao độ tương phản hình ảnh huỳnh quang và đảm bảo an toàn bức xạ UV cho người sử dụng trong phòng thí nghiệm thông thường. Đồng thời, công trình đã xây dựng thành công quy trình thực nghiệm kết hợp giữa kính huỳnh quang soi nổi, nhuộm Gram và hiển vi điện tử quét (SEM) để khảo sát các mẫu y sinh học tự phát quang và sàng lọc vi khuẩn phát quang từ đất tự nhiên.