Khóa Luận Tốt Nghiệp: Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Gỗ Cây Thông Đỏ (Taxus Wallichiana)

Luận văn tốt nghiệp hóa học nghiên cứu tốt nghiệp hóa học khảo sát thành phần hóa học của gỗ cây thông đỏ taxus wallichiana zucc thuộc họ, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Đặng Trọng Nghĩa
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Ngọc Tứ
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm TPHCM
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Gỗ Cây Thông Đỏ Taxus Wallichiana Zucc Thuộc Họ Thanh Tùng (Taxaceae) Phân Đoạn 4 Và Phân Đoạn 5
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2010
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Cây Thông đỏ lá dài (Gọi tắt là Thông đỏ)
• 1.2. Phân bố
• 1.3. Độc tính và tính chất dược lý
• 2. CHƯƠNG 2
• 3. CHƯƠNG 3: NGHỊỆN CỨU
• 3.1. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2. Phương pháp thực nghiệm
• 3.3. Kết quả và Bàn luận
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về khóa luận tốt nghiệp hóa học gỗ cây thông đỏ

Khóa luận tốt nghiệp hóa học này tập trung vào việc khảo sát thành phần hóa học của gỗ cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc thuộc họ thanh tùng Taxaceae. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học của cây mà còn mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng các hợp chất tự nhiên trong y học. Cây thông đỏ được biết đến với nhiều giá trị dược lý, đặc biệt là khả năng chống ung thư nhờ vào các hợp chất như paclitaxel.

1.1. Giới thiệu về cây thông đỏ Taxus wallichiana

Cây thông đỏ Taxus wallichiana là một loài cây thân gỗ, thường xanh, có giá trị kinh tế và dược lý cao. Loài cây này phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao, có khả năng sinh trưởng chậm và yêu cầu điều kiện môi trường đặc biệt.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu thành phần hóa học

Nghiên cứu thành phần hóa học của gỗ cây thông đỏ không chỉ giúp xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học mà còn góp phần bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá này.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu thành phần hóa học

Khảo sát thành phần hóa học của gỗ cây thông đỏ gặp nhiều thách thức, từ việc lựa chọn phương pháp chiết xuất đến việc xác định các hợp chất có hoạt tính. Các yếu tố như điều kiện môi trường, thời gian thu hoạch và phương pháp phân tích đều ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Do đó, việc tìm ra phương pháp tối ưu là rất cần thiết.

2.1. Những khó khăn trong việc chiết xuất hợp chất

Việc chiết xuất hợp chất từ gỗ cây thông đỏ đòi hỏi kỹ thuật cao và sự chính xác trong từng bước thực hiện. Các dung môi chiết khác nhau có thể cho ra các kết quả khác nhau, do đó cần phải thử nghiệm nhiều phương pháp.

2.2. Thách thức trong việc phân tích thành phần hóa học

Phân tích thành phần hóa học yêu cầu sử dụng các thiết bị hiện đại và kỹ thuật phân tích phức tạp. Điều này có thể gây khó khăn cho những nghiên cứu viên chưa có nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực này.

III. Phương pháp chiết xuất và phân tích thành phần hóa học

Nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau để thu được các hợp chất từ gỗ cây thông đỏ. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất bằng dung môi, sắc ký cột và sắc ký bản mỏng. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng.

3.1. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi

Chiết xuất bằng dung môi là phương pháp phổ biến nhất trong nghiên cứu thành phần hóa học. Dung môi được lựa chọn dựa trên tính chất của các hợp chất cần chiết xuất, nhằm tối ưu hóa hiệu suất thu hồi.

3.2. Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng

Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng là hai phương pháp quan trọng trong việc phân tách và xác định các hợp chất. Những phương pháp này giúp tách biệt các phân đoạn hóa học, từ đó dễ dàng phân tích và xác định cấu trúc.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy gỗ cây thông đỏ chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất có khả năng chống ung thư. Những phát hiện này mở ra cơ hội ứng dụng các hợp chất tự nhiên trong y học, góp phần vào việc phát triển các loại thuốc mới.

4.1. Các hợp chất chính được chiết xuất

Nghiên cứu đã xác định được một số hợp chất chính trong gỗ cây thông đỏ, bao gồm paclitaxel và các dẫn xuất của nó. Những hợp chất này có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc chống ung thư.

4.2. Ứng dụng trong y học

Các hợp chất chiết xuất từ gỗ cây thông đỏ có thể được ứng dụng trong việc phát triển các loại thuốc mới, đặc biệt là trong điều trị ung thư. Điều này không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe con người mà còn góp phần bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên.

V. Kết luận và hướng nghiên cứu tương lai

Khóa luận tốt nghiệp này đã cung cấp cái nhìn sâu sắc về thành phần hóa học của gỗ cây thông đỏ Taxus wallichiana. Những kết quả đạt được không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo về cây thuốc quý này.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy gỗ cây thông đỏ chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là paclitaxel. Những phát hiện này khẳng định giá trị của cây thông đỏ trong y học.

5.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các phương pháp chiết xuất hiệu quả hơn và nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các hợp chất trong điều trị ung thư.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh ung thư (như ung thư phổi, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư buồng trứng) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, thúc đẩy các nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất điều trị từ tự nhiên. Trong số các hợp chất chống ung thư có nguồn gốc thực vật, Paclitaxel (tên thương mại là Taxol, bản quyền thuộc tập đoàn dược phẩm Bristol-Myers Squibb) là hoạt chất có hiệu quả cao trong điều trị ung thư vú, buồng trứng và các dạng u ác tính khác.

Tại Việt Nam, chi Taxus ghi nhận hai loài chính:

1. Thông đỏ lá ngắn (Taxus chinensis (Pilg.) Rehder) phân bố rải rác ở miền Bắc (Lào Cai, Hà Tây, Nghệ An).
2. Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố chủ yếu tại tỉnh Lâm Đồng.

Các khảo sát sơ bộ cho thấy loài Thông đỏ lá dài tại Lâm Đồng có giá trị dược liệu vượt trội do chứa hàm lượng đáng kể các hợp chất diterpenoid khung taxan, tiêu biểu là 10-Deacetylbaccatin III (10-DAB) – tiền chất quan trọng cho quá trình bán tổng hợp Taxol. Xuất phát từ giá trị dược liệu và nhu cầu khảo sát sâu hơn về nguồn hóa thực vật bản địa, đề tài "Khảo sát thành phần hóa học của gỗ cây Thông đỏ Taxus wallichiana Zucc. thuộc họ Thanh tùng (Taxaceae) phân đoạn 4 và phân đoạn 5" được thực hiện nhằm tìm kiếm các cấu tử có tiềm năng sinh học từ phần gỗ thân cây.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài bao gồm ba nhiệm vụ cụ thể:

1. Khảo sát các phương pháp chiết xuất thích hợp đối với mẫu gỗ Thông đỏ.
2. Khảo sát và lựa chọn hệ dung môi chiết đạt hiệu suất thu hồi cao.
3. Sử dụng sắc ký cột cổ điển kết hợp sắc ký bản mỏng với các hệ dung ly thích hợp để phân tách, gom nhóm các phân đoạn và cô lập các hợp chất tinh khiết.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu gỗ của cây Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.), thuộc họ Thanh tùng (Taxaceae).
• Phạm vi không gian: Mẫu gỗ được thu hái tại khu vực Hồ Tiên, huyện Đơn Dương, tỉnh Lâm Đồng (ngày 08/03/2008), được định danh thực vật học bởi Tiến sĩ phụ trách Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP.HCM.
• Phạm vi đối tượng hóa học: Tập trung khảo sát, cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ phân đoạn 4 (F4) và phân đoạn 5 (F5) thu được từ sắc ký cột cao ethyl acetat của gỗ Thông đỏ.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên cơ sở phân loại học thực vật, hóa học các hợp chất thiên nhiên và các phương pháp vật lý - hóa lý hiện đại dùng trong phân tích cấu trúc hữu cơ:

• Phân loại thực vật: Cây Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc., tên đồng nghĩa: Taxus yunnanensis, tên tiếng Anh: Himalayan yew) thuộc chi Taxus, họ Taxaceae, bộ Taxales, giới Plantae.
• Khung cấu trúc hóa học: Tập trung vào hai nhóm hợp chất thiên nhiên chính:
  1. Khung Taxan diterpenoid: Bộ khung 20 carbon gồm một vòng 4 cạnh (oxetane), một vòng 6 cạnh, một vòng 8 cạnh và các nhóm thế ester/hydroxy (như Taxol, Baccatin III, Brevifoliol). Hoạt tính chống ung thư của Taxol liên quan trực tiếp đến sự nguyên vẹn của vòng oxetane và chuỗi ester mạch nhánh tại vị trí C-13. Về cơ chế tác dụng, Taxol liên kết đặc hiệu với tiểu đơn vị $\beta$-tubulin, thúc đẩy quá trình trùng hợp và ức chế sự khử trùng hợp của vi ống, làm tê liệt bộ thoi vô sắc trong kỳ nguyên phân của tế bào u.
  2. Khung Lignan: Nhóm polyphenol có cấu trúc dimer từ hai đơn vị phenylpropanoid ($C_6-C_3$), có tính chống oxy hóa, hỗ trợ ức chế dihydrotestosterone (DHT) và phòng ngừa các bệnh tim mạch, loãng xương, cũng như các dạng ung thư liên quan đến hormone.
• Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
  • Phương pháp chiết xuất: Chiết nóng hồi lưu bột gỗ khô bằng methanol (MeOH) để thu cao methanol thô; sau đó chiết phân bố lỏng - lỏng bằng ethyl acetat (EtOAc) để thu phân đoạn cao ethyl acetat.
  • Phương pháp sắc ký phân lập: Sắc ký cột (SKC) pha thường dùng chất hấp phụ Silica gel 60 (Merck, Kieselgel 60); Sắc ký lớp mỏng (TLC) tráng sẵn trên nhôm (Kieselgel 60 $F_{254}$) để kiểm tra vết và gom phân đoạn; Sắc ký điều chế (SKDC) trên bản mỏng silica gel; Phương pháp tủa và rửa kết tủa phân đoạn.
  • Phương pháp hiện hình: Soi dưới đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm (máy CAMAG CH-4132 Muttenz Switzerland); phun xịt dung dịch axit sunfuric ($H_2SO_4$) 20% trong nước rồi gia nhiệt.
  • Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc: Ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1H\text{-NMR}$ 500 MHz, $^{13}C\text{-NMR}$ 125 MHz, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2 chiều ($^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$, HSQC, HMBC) trên máy quang phổ Bruker (đo trong dung môi $CDCl_3$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến cây Thông đỏ:

• Đặc điểm hình thái thực vật và phân bố: Cây thân gỗ thường xanh, cao 20–30 m, đường kính ngang ngực 1–1,5 m, sinh trưởng chậm (cây trăm năm đường kính thân không quá 35 cm). Lá thẳng hình mũi mác dài 1,5–2,7 cm, rộng 2 mm, xếp xoắn ốc tạo thành 2 hàng. Nón phân tính khác gốc; nón cái đơn độc mang một hạt có áo hạt màu đỏ bao bọc; hạt hình trứng dài 7 mm, rộng 5 mm, màu đen khi chín. Loài phân bố ở vùng núi cao 1.500–2.500 m (rừng nhiệt đới thường xanh, mưa trung bình 1.800 mm/năm). Tại Lâm Đồng, quần thể phân bố rải rác: Núi Voi (100 cây), Lán Tranh (1 cây), Cổng Trời (20 cây già cỗi). Công tác bảo tồn tại chỗ được triển khai tại Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà (thành lập năm 2005).
• Độc tính và dược lý dân gian: Cây chứa các alkaloid độc nhóm taxin gây ức chế cơ tim thông qua việc phong bế kênh natri và canxi. Trong y học cổ truyền Ấn Độ, Trung Quốc và Thổ Nhĩ Kỳ, các bộ phận của cây được sử dụng trị hen suyễn, viêm phế quản, thực tích, giun đũa, đau đầu, bệnh tim mạch và đặc biệt gỗ thân được dùng trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường.
• Hóa học các loài Thông đỏ: Trình bày cấu trúc và nguồn gốc phân lập của hàng loạt hợp chất diterpenoid và polyphenol từ lá, vỏ, rễ và gỗ cây Thông đỏ: Taxol, Baccatin III, Baccatin IV, Brevifoliol, các dẫn xuất taxin, sciadopitysin, sotetsuflavon, hongdoushan A–C, taxusin và taxtresinol.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương này mô tả chi tiết quy trình hóa học xử lý mẫu và phân tách sắc ký:

• Xử lý mẫu ban đầu: Mẫu gỗ khô xay nhỏ được trích nóng với methanol, lọc và cô quay thu hồi dung môi thu được cao thô methanol. Cao methanol tiếp tục được lắc phân bố với ethyl acetat để thu 100 g cao ethyl acetat.
• Sắc ký cột phân đoạn cao ethyl acetat: 100 g cao ethyl acetat được nạp lên cột sắc ký silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi chloroform - methanol ($CHCl_3 - MeOH$) có độ phân cực tăng dần, thu được 10 phân đoạn chính (F1 đến F10).

Phân đoạn	Số lọ hứng	Khối lượng (g)	Tên mã hóa
1	1–8	1,87	F1
2	9	0,25	F2
3	15–28	0,60	F3
4	-	10,00	F4
5	-	15,00	F5

(Các phân đoạn F6 đến F10 được lưu giữ để nghiên cứu tiếp theo).

• Quy trình cô lập chất từ phân đoạn F4: Lấy 10 g phân đoạn F4 (gồm dịch lỏng và kết tủa), lọc tách riêng phần kết tủa. Rửa kết tủa nhiều lần bằng hỗn hợp ethyl acetat và $CHCl_3 - MeOH$, cô lập được hợp chất tinh khiết ký hiệu là B3TW ở dạng tinh thể hình kim màu trắng.
• Quy trình cô lập chất từ phân đoạn F5: 15 g phân đoạn F5 được sắc ký cột trên silica gel với hệ $CHCl_3 - \text{EtOAc}$ (0–50%) và $CHCl_3 - \text{EtOAc} (50–30%) - MeOH (0–20%)$, thu được 7 phân đoạn phụ (F51–F57). Tiếp tục nạp phân đoạn F55 (1 g) lên cột silica gel rửa giải bằng $CHCl_3 - MeOH$ (0–20%) thu được 4 phân đoạn nhỏ (F551–F554). Lấy phân đoạn F552 (300 mg) tiến hành sắc ký điều chế bản mỏng với hệ giải hấp $CHCl_3 - MeOH$ (92:8), cô lập được hợp chất tinh khiết ký hiệu là BSTW ở dạng dầu không màu.

Chương 3: Nghiên cứu

Chương này tập trung vào quá trình biện luận phổ để giải mã cấu trúc hóa học của hai chất B3TW và BSTW:

1. Định danh hợp chất B3TW ($\alpha$-Conidendrin)

• Hợp chất thu được dạng kết tủa trắng, tinh thể hình kim; TLC chạy trong hệ $CHCl_3 - MeOH$ (97:3), hiện vết tròn màu cam với thuốc thử $H_2SO_4$ đặc gia nhiệt.
• Phổ $^1H\text{-NMR}$ (500 MHz, $CDCl_3$) ghi nhận: 5 proton thơm gồm H-6 ($\delta_H$ 6,68 ppm, s) và H-3 ($\delta_H$ 6,30 ppm, s) ở vị trí para với nhau; 3 proton của vòng thơm còn lại gồm $\delta_H$ 6,80 ppm, 6,64 ppm ($J = 8,0$ Hz, ghép ortho) và 6,58 ppm; 2 nhóm metoxy ($-OCH_3$) sắc nét tại $\delta_H$ 3,80 ppm và 3,87 ppm (mỗi mũi 3H, s).
• Phổ $^{13}C\text{-NMR}$ (125 MHz) và DEPT (90, 135) xác định 20 carbon ($C_{20}H_{20}O_6$, độ bất bão hòa bằng 11), bao gồm:
  • 12 carbon thơm (7 carbon bậc bốn tại $\delta_C$ 144,7–148,0 ppm và 5 carbon metin thơm tại $\delta_C$ 111,0–126,3 ppm).
  • 3 carbon metin béo ($\delta_C$ 42,0–50,0 ppm).
  • 2 carbon metylen ($\delta_C$ 29,3 ppm của C-7 và 72,3 ppm của C-9').
  • 2 carbon metyl của nhóm metoxy ($\delta_C$ 56,0 ppm).
  • 1 carbon carbonyl lacton ($\delta_C$ 178,4 ppm của C-9).
• Phân tích tương quan 2D-NMR ($^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$, HSQC, HMBC): Tương quan HMBC giữa H-6 ($\delta_H$ 6,68) với C-7 ($\delta_C$ 29,3), H-3 ($\delta_H$ 6,30) với C-7' ($\delta_C$ 50,0) và proton $-OCH_3$ ($\delta_H$ 3,87) với carbon $\delta_C$ 146,5 khẳng định cấu trúc vòng A. Tương quan COSY giữa H-5' và H-6' cùng tương quan HMBC khẳng định vòng B. Cầu nối lacton của vòng C được chứng minh bằng tương quan HMBC giữa H-9' ($\delta_H$ 4,20) và C-9 ($\delta_C$ 178,4).
• Kết luận: Cấu trúc của B3TW được xác định chính xác là $\alpha$-conidendrin (chất 29, thuộc nhóm Lignan).

2. Định danh hợp chất BSTW (Baccatin III)

• Hợp chất dạng dầu không màu; TLC trong hệ $CHCl_3 - MeOH$ (92:8) cho vết tròn màu đen khi hiện hình bằng $H_2SO_4$ đặc gia nhiệt.
• Phổ $^1H\text{-NMR}$ (500 MHz, $CDCl_3$) chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của khung taxan: 4 nhóm metyl liên kết carbon bậc bốn ($\delta_H$ 1,10; 1,67; 2,28 ppm); 2 nhóm acetyl ($-OAc$ tại $\delta_H$ 2,24 và 2,28 ppm); 1 nhóm benzoyl ($-OBz$ tại $\delta_H$ 7,40–8,10 ppm); proton metin H-3 tại $\delta_H$ 3,88 ppm (1H, d); 2 proton metylen của vòng oxetane gồm H-20b ($\delta_H$ 4,15 ppm, d, $J = 8,0$ Hz) và H-20a ($\delta_H$ 4,30 ppm, d, $J = 8,0$ Hz); proton H-13 tại $\delta_H$ 4,88 ppm.
• Phổ $^{13}C\text{-NMR}$ và DEPT phát hiện 31 carbon ($C_{31}H_{38}O_{11}$, độ bất bão hòa bằng 13):
  • 1 carbon carbonyl xeton tại $\delta_C$ 204,1 ppm (C-9).
  • 3 carbon carbonyl ester tại $\delta_C$ 167,09 ppm (C-2 benzoyl), 170,09 ppm và 170,90 ppm (các nhóm acetyl).
  • 6 carbon vòng thơm của nhóm phenyl thuộc nhánh benzoyl.
  • 2 carbon olefin tại $\delta_C$ 131,94 ppm (C-11) và 146,35 ppm (C-12).
  • 1 carbon oxetane mang oxy tại $\delta_C$ 76,4 ppm (C-20).
  • Các carbon liên kết oxy: C-1 ($\delta_C$ 79,12 ppm), C-2 ($\delta_C$ 75,0 ppm), C-4 ($\delta_C$ 80,8 ppm), C-7 ($\delta_C$ 72,3 ppm), C-10 ($\delta_C$ 75,6 ppm), C-13 ($\delta_C$ 68,0 ppm).
• Phân tích tương quan 2D-NMR (HMBC, COSY): Xác lập chi tiết liên kết vòng oxetane tại C-4 và C-5 qua tương quan giữa H-20a, H-20b với C-3, C-4, C-5; tương quan của proton H-2 với nhóm ester carbonyl $\delta_C$ 167,09 ppm chứng minh nhóm 2-OBz; tương quan của H-10 ($\delta_H$ 6,30) với carbon ester $\delta_C$ 170,09 ppm chứng minh nhóm 10-OAc.
• Kết luận: Dữ liệu phổ nghiệm hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc Baccatin III (chất 30, diterpenoid khung taxan).

Chương 4: Kết luận

Tóm lược các kết quả thực nghiệm đạt được từ 100 g cao ethyl acetat gỗ Thông đỏ Lâm Đồng, khẳng định việc phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của $\alpha$-conidendrin và Baccatin III, đồng thời đưa ra kiến nghị nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đạt được các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể:

• Phân tách phân đoạn: Từ 100 g cao ethyl acetat ban đầu, thực hiện sắc ký cột silica gel thu được 10 phân đoạn chính. Trong đó, phân đoạn F4 đạt khối lượng 10 g và phân đoạn F5 đạt khối lượng 15 g.
• Cô lập và cấu trúc hóa học: Phân lập thành công 2 hợp chất tinh khiết:
  1. $\alpha$-Conidendrin ($C_{20}H_{20}O_6$) từ phân đoạn F4 thông qua kỹ thuật rửa kết tủa trong dung môi chọn lọc.
  2. Baccatin III ($C_{31}H_{38}O_{11}$) từ 300 mg phân đoạn phụ F552 của phân đoạn F5 bằng phương pháp sắc ký điều chế ($CHCl_3 : MeOH = 92:8$).
• Đóng góp khoa học:
  • Bổ sung số liệu thực nghiệm về thành phần hóa thực vật của phần gỗ cây Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) thu hái tự nhiên tại huyện Đơn Dương, tỉnh Lâm Đồng.
  • Cung cấp bộ dữ liệu quy gán phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) chi tiết cho Baccatin III (khung taxan diterpenoid chứa vòng oxetane – tiền chất cốt lõi để tổng hợp thuốc Paclitaxel) và $\alpha$-conidendrin (khung lignan có hoạt tính chống oxy hóa).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc xử lý, phân lập hợp chất từ 2 trong số 10 phân đoạn sắc ký (F4 và F5); chưa tiến hành khảo sát thành phần hóa học ở 8 phân đoạn còn lại; chưa thực hiện thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro (kháng tế bào ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn) trên các chất đã cô lập.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục tiến hành sắc ký phân lập các phân đoạn còn lại (F1, F2, F3, F6, F7, F8, F9, F10) nhằm tìm kiếm thêm các hợp chất tự nhiên mới hoặc có hàm lượng nhỏ trong gỗ Thông đỏ.
  • Triển khai thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với $\alpha$-conidendrin và Baccatin III đã phân lập nhằm đánh giá trực tiếp tiềm năng ứng dụng dược liệu.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu này là nguồn tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Thực vật học.
• Những người thực hiện đề tài liên quan đến chiết xuất dược liệu và phân lập hoạt chất từ thực vật bậc cao (đặc biệt là họ Taxaceae).
• Phần giá trị nhất: Quy trình chiết phân đoạn bằng hệ dung môi gradient trên silica gel pha thường và phương pháp quy gán chi tiết các bước chuyển dịch hóa học trên phổ 1D/2D-NMR đối với vòng oxetane của khung taxan và khung lignan lacton.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu gỗ Thông đỏ dùng trong nghiên cứu được thu thập ở đâu và vào thời gian nào?
Mẫu gỗ cây Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) được thu hái tại khu vực Hồ Tiên, huyện Đơn Dương, tỉnh Lâm Đồng vào ngày 08 tháng 03 năm 2008, và được định danh bởi Tiến sĩ phụ trách Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP.HCM.

2. Hợp chất cô lập được từ phân đoạn F4 là gì và có cấu trúc thuộc nhóm nào?
Hợp chất cô lập từ phân đoạn F4 là B3TW, được định danh là $\alpha$-conidendrin có công thức phân tử $C_{20}H_{20}O_6$ (độ bất bão hòa bằng 11), thuộc nhóm hợp chất Lignan (polyphenol). Chất thu được ở dạng kết tủa tinh thể hình kim màu trắng, cho vết màu cam trên bản mỏng TLC khi hiện hình bằng $H_2SO_4$ đun nóng.

3. Tín hiệu phổ NMR nào là cơ sở then chốt để xác định vòng oxetane trong Baccatin III?
Sự hiện diện của vòng oxetane (nối tại vị trí C-4 và C-5) được khẳng định nhờ tín hiệu của 2 proton metylen H-20b ($\delta_H$ 4,15 ppm, d, $J = 8,0$ Hz) và H-20a ($\delta_H$ 4,30 ppm, d, $J = 8,0$ Hz) ghép cặp spin với nhau, liên kết trực tiếp với carbon mang oxy ở độ dịch chuyển $\delta_C$ 76,4 ppm trên phổ $^{13}C\text{-NMR}$, cùng các tương quan HMBC với C-3, C-4 và C-5.

4. Quy trình sắc ký điều chế để phân lập Baccatin III từ phân đoạn F5 sử dụng hệ dung môi gì?
Phân đoạn F5 (15 g) được sắc ký cột phân đoạn thành F51–F57. Phân đoạn F55 (1 g) tiếp tục sắc ký cột thu được F551–F554. Cuối cùng, 300 mg phân đoạn F552 được phân lập bằng phương pháp sắc ký điều chế (SKDC) với hệ dung môi giải hấp $CHCl_3 : MeOH$ (tỷ lệ 92:8) để thu được Baccatin III dạng dầu không màu.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đặng Trọng Nghĩa đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetat từ gỗ cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) thu hái tại Đơn Dương, Lâm Đồng. Bằng việc kết hợp các phương pháp sắc ký cột pha thường, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế trên silica gel, nghiên cứu đã phân lập thành công hai hợp chất tinh khiết gồm $\alpha$-conidendrin (nhóm lignan) từ phân đoạn 4 và Baccatin III (nhóm taxan diterpenoid) từ phân đoạn 5. Cấu trúc của hai hợp chất đã được làm sáng tỏ và chứng minh chặt chẽ thông qua việc phân tích hệ thống phổ NMR một chiều ($^1H$, $^{13}C$, DEPT) và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC). Kết quả này đóng góp dữ liệu thực nghiệm có giá trị cho nghiên cứu hóa thực vật và định hướng khai thác nguồn dược liệu Thông đỏ tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: Tổng quan 1.1 Cây Thông đỏ lá dài (Gọi tắt là Thông đỏ) 1. [30] Tên khoa học: Taxus wallichiana Zuce. (Tên đồng nghĩa: Taxus yunnanensis W. Tên nước ngoài: Himalayan yew (Anh), Xu mi hong dou shan (Trung Quốc).

Lén Việt Nam khác: Thông đỏ Hymalaya, Sam hạt do lá dài. Van Nam Hông đậu sam. Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) thuộc họ Thanh Tùng (7axaceae). Vị trí cây Thông đó trong hệ thống phân loại thực vật: ~ Gidi (Kingdom): Plantae.

+ Taxus (Thanh tang, Thông đỏ. Hồng đậu sam). ~ Loai (Species): * Chi Austrotaxus: Austrotaxus spicata. * Chi Pseudotaxus: Pseudotaxus chienii.

* Chi Taxus: Taxus baccata L. Taxus brevifolia Nutt. Taxus cuspidata Zuce. Taxus floridana (Thông đó Florida), Taxus globosa (Thông đó Mexico), Taxus hunnewelli, Taxus jortunet, Taxus sumatrana (Thông đỏ Sumatra), Taxus wallichiana Zucc.

(Thông đỏ Himalaya) * Chi Amentotaxus’ Amentotaxus argotaenia, Amentotaxus assamica Amentotaxus formosana, Amentotaxus poilanei, Amentoiaxus yunnanensis. * Chi Cephalotaxus Cephalotaxus fortunei, Cephalotaxus griffithii, Cephalotaxus hainanensis, Cephalotaxus harringtoma. Cephalotaxus koreana, Cephalotaxus lanceolata, Cephalotaxus latifolia, Cephalotaxus mannii, Cephalotaxus oliveri, Cephalotaxus sinensis, Cephalotaxus wilsoniana * Chi Torreya’ Torreya californica, Torreya fargesii, Torreya grandis, Torreya jackii, Torreya nucifera, Torreya taxifolia 1.1 Mô ta thực vật Thông đỏ là một loại cây thân gỗ, thường xanh, kích thước trung bình hoặc nhỏ, chậm lớn (cây sinh trưởng cả trăm năm chỉ có đường kính không quá 3Š em) Chiêu cao: 20-30 m; đường kính ngang ngực: 1-1,5 m Cây mọc đứng. Khóa luận tốt nghiệp Tẳng quan tài liệu Hình 1.2 Mẫu Thông đỏ lá dai (Taxus wallichiana 7ucc ) Cảnh: xóe rong, cảnh non mau lục, chuyển sang nâu sau 3 hoặc 4 năm, mọc phân tán tuy theo điều kiện môi trường Vỏ cây: phia ngoài mau nâu đỏ nhạt, hơi dày, bóc tách thành từng mang hay từng tâm nhỏ, thịt mau nâu đỏ.

Lá thường có mau xanh, dải 1,5-2,7 cm và rộng 2 mm, sắp xếp theo hình xoắn ốc, thường vặn xoắn tại gốc lá dé xuất hiện theo kiểu 2 hàng Các lá có dạng thẳng hay hình mũi mắc, mọc cách, thuôn thành đỉnh nhọn, gốc lả mọc xuống, mép lá phăng, mặt trên xanh vang, mặt đưới xanh nhạt với các dai lỗ khí xanh nhạt hơn ở hai bên gân giữa. Lá của các chôi chỉnh có thé mọc đựng lên hon là xếp day Nón: phân tính khác gốc Nón cái đơn độc, có một hạt và được bao quanh nhưng không bao kín băng lớp áo hat mau đỏ, chin trong | năm. Non đực tạo thành hàng ở nach lá. dai 6 mm vả rộng 3 mm.

nhưng không có cuỗng hoặc cuông rat nhỏ Hạt. hình trừng, dải 7 mm và rộng Š mm, mau đen khi chin, 1.2 Phân bố Thông đỏ phân bố hẹp, ở các dãy phía đông Hymalaya đến tây nam Trung Quốc (Yunnan, Sichuan, Likiang, Weihai và phía tay Huber) Ngoài ra, loa: này còn mọc ở vùng đông bắc An Độ, ven biên giới Myanmar va Tibet, Nepal, Bhutan, Dai <a Khóa luận tốt nghiệp Tông quan tài liệu cây cô thụ (Có cây ca ngan năm tuôi, đường kính thân từ 1.5-2 m) trên những sườn núi, bên khe sudi ở độ cao 1.500 m; còn lớp cây kế cận rất thưa ving. Ở Việt Nam, có hai loai Thông đỏ là Thông đỏ Trung Quốc Taxus chinensis (Pilger) Rehder thường gọi là “Théng đỏ lá ngăn" va Thông đỏ Hymalaya Taxus wallichiana Zucc., thường gọi la “Thong do lá dai”. Thông đó lá ngắn: phân bổ ở Trung Quốc, An Độ, Malaysia va Việt Nam.

Ở Việt Nam, cây phân bé rải rác ở ving núi thuộc các tính Lao Cai (Hoàng Liên Son), Hà Tây (Ba Vi), Nghệ An (Quỷ Châu). Thông đỏ lá dài: đến tháng 7/2006. t6 chức IUCN đã tìm thấy loài Thông đỏ li dai tại Afghanistan, Bhutan, tây nam Trung Quốc (Sichuan, Xizang, Yunnan), An Độ (Arunachal Pradesh, Assam. Himachal Pradesh, Jammu-Kashmir, Manipur, Sikkim, Uttar Pradesh), phía bắc Myanmar.

loài này được tìm thay ở một sô vùng núi cao thuộc các tinh Lao Cai (Hoàng Liên Sơn), Khánh Hòa. Lâm Đông (Da Lạt, Đơn Dương. độ cao phân bô khoảng 1. Sự phân bổ của Thông đỏ khá đa dang trong khu vực Lâm Đồng, nhưng số lượng cá thể ở mỗi nơi lại ít.

Số lượng cá thể nhiều nhất tại khu vực Núi Voi (100 cây), tại đây cây không bị che phủ và phát triển tương đối tốt. Ở những nơi bị che phủ như Lán Tranh thì số lượng cá thể ít (1 cây). Có nơi cây lại giả cỗi. chăng hạn như khu vực Cổng Trời số lượng cá thé là 20 cây nhưng lại gia cỗi, gần như không phát triển nữa.3 Sinh thái Pham vi độ cao: 2.500 m so với mặt biên.

Dạng rừng: rừng nhiệt đới thường xanh, trên dat phong hóa từ granit. Cây càng lớn đòi hỏi ánh sáng cảng cao. Trong ting ưu thé sinh thai, nơi nào có khoảng trồng, lượng ánh sáng nhiều thi cây phát triển mạnh và ngược lại thi tán cây phát triển lệch nơi có ánh sáng cao. Khí hậu: nhiệt đới gió mùa.

nhiệt độ trung bình năm 20-25 “C. Thông do phan bê ở vùng khi hậu nhiệt đới núi thắp và trung bình có hai mùa rõ rệt trong Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan tài liệu — —=—=—————————————————————— — nam. mùa mưa kéo dai tử thang 4 đến tháng 10, lượng mưa trung bình 1.800 mm (Tai liệu của Dai khí tượng - thủy văn Lâm Đồng. Thẻ nhường: thích hợp với đất có thành phan cơ giới nhẹ, thoát nước, phát triển trên đất nâu vàng phiến thạch hay đất nâu đỏ trên đắt bazan.

Tham thực vật: ở Lâm Đồng. Thông đỏ thường phân bó rải rác hỗn giao với các loai cây lá rộng thường xanh và cây lá kim với kiểu rừng chính là hỗn giao cây lá rộng - cây lá kim. Trong kiểu thảm nay chúng phân bé ở tang ưu thé sinh thái hợp với các loài đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), kim giao nam (Nageia wallichiana), thông tre lá đài (Podocarpus neriifolius), thông nàng (Daerycarpus imbricatus), du sam (Keteleeria evelyniana) và một số loài thuộc Fagaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae. Hat phát tán không xa (Với bán kính 6-8 m so với tâm cây); nảy mam và phát triển nơi có độ 4m cao.

cường độ ánh sáng trung bình. Tỷ lệ nay mam trong tự nhiên rất thắp so với sô lượng hạt cây mang hàng năm. Tái sinh tự nhiên: ít gặp. cây mắm và cây non chịu bóng tốt Nhin chung chúng được coi là cây khỏa tử chịu bóng hoặc ưa sáng.

thường mọc dưới tan một số cây gỗ thuộc các họ Long não (Lauraceae), Mộc lan (Magnoliaceae), Hồi (Illiaceae). Thông đỏ thường ra lá non vào mùa Xuân- Hè, nón đực xuất hiện sớm hơn nón cái từ cuối mùa đông. nhưng đến mùa xuân năm sau cả nón đực và nón cái mới nở. Thông đỏ sinh trưởng cham, tái sinh tự nhiên từ hạt khó.Tuy vậy, nếu trên đỉnh núi có vai cây to, vẫn có thể thấy những cây con mọc từ hat.

Vai năm gần đây, một số cơ sở nghiên cứu ở Hà Nội và Đà Lạt đã thí nghiệm thành công việc nhân giống thông đỏ bang cành.4 Trồng trọt và thu hoạch Ra hoa vào thang 8-12 va đến tháng 6-7 năm sau thì kết trái. Mùa quả chin vào tháng 10-12, Điểm đặc biệt ở đây là mùa quả chin cùng chỉnh là mùa ra hoa. Khóa luận tốt nghiệp Tẳng quan tài liệu 1.2 Bao tồn [11] Bảo tồn tại chỗ: vườn Quốc gia Bidoup-Núi Ba, Lâm Đồng, nơi có quản thé Thông đỏ còn sống sót, được thành lập đầu năm 2005 theo quyết định của Thủ tướng nhằm bảo vệ khu rừng cổ, đa dang về sinh học và còn nguyên vẹn nhất ở Việt Nam này.3 Chăm sóc Thông đỏ ở vườn quốc gia Bidoup Bảo tồn chuyến vị: không thé chỉ trông chờ vào Thông đỏ tự nhiên mà phải khẩn trương gây trồng, nhân giống quy mô lớn. Hơn 10 năm qua, Phân viện Sinh học Đà Lạt và một số cơ quan khác đã day công nghiên cứu và đã hoàn chỉnh quy trình nhân giống Thông đỏ bằng nhiều biện pháp như chiết cành, giâm hom, nuôi cấy mô.

tạo nên thế hệ kế cận cho loài cây cực kỳ quí hiếm này. - 12- Khóa luận tốt nghiệp Tổng quan tài liệu 1.3 Độc tính và tính chất được lý (1) 1.1 Độ Độc tính nước lá thông đỏ, cho chuột cống trắng cai uống liễu 100 và 500mg/kẹ, trong những ngày 1-7 sau khi giao hợp có tác dụng ức chế sự thụ thai 60% và 80% tương ứng. Vỏ cây, lá va hạt thông đỏ có tác dụng độc như: nôn ,tiêu chảy, mê sang, có tác dụng ức chế tim làm giảm lực co tim, giảm nhịp tim và phong bế nhĩ thất do tác dụng ức chế kênh natri và canxi. Là loài cây có độc gồm I1 alkaloid gọi chung lả taxin, nhiều trường hợp gây ngộ độc cho gia súc khi ăn phải lá của cây thông này.2 Tác dụng dược lý theo kinh nghiệm dan gian Thông đỏ là nguồn được liệu rất quý trongy học.Từ lâu, trong y học cổ truyền Án Độ, cao lá khô va cao vỏ thông đỏ được dùng trị hen, viêm phé quan, nic, tiêu hóa.; cảnh và vỏ ding trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu.

Trong y học dân gian Trung Quốc, thông đỏ được coi là có tác dụng tiêu ích, thông tim mạch, giảm đau, cành và lá được dùng dé trị thực tích, bệnh giun đũa. Nước sắc của thân non được dùng trị đau đầu, nhiều mật. Ở Thế Nhĩ Kỷ, nhân dân dùng đẻ trị bệnh tim. Đặc biệt gỗ cây thông đỏ được dùng để trị bệnh tiêu đường.1 Lược sử tim ra taxol Vào đầu những năm 1960, NCI đã phát triển một chương trình nghiên cứu dịch chiết từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên.

Năm 1962, một trong những dịch chiết đã được phát hiện có hoạt tính chống ung thư rõ rệt, có khả năng cô lập những khối u. Tuy nhiên, công trình này đã không được phát triển cho tới khi 2 nhà nghiên cứu Wall và Wani của Viện nghiên cứu Triangle, Bắc Carolina, tách ra được một hợp chất có hoạt tính chống ung thu từ cây Thông đỏ Thái Binh Duong Taxus brevifolia, Năm 1971, Wall và Wani đã công bế cấu trúc của hợp chất này, gọi là paclitaxel. -13- Khóa luận tốt nghiệp Tầng quan tài liệu KH HP In tr 9 CC! BEERERRERGOGSGENEGRRGGGGRRRRGREEEESEEGSSEE===e 1.2 Danh pháp quốc te 5-20-epoxy-1a. I 3a-hexahydroxytax- | l-en-9-one-4, | 0- diacetate 2-benzoate- | 3-ester với (2R.3 Cấu trúc Phân tử taxol được chia làm 2 phân: mạch bên va khung.

- Mạch bên: có vai trò then chốt trong việc duy trì hoạt tính. Hoạt tinh của cau trúc nay đã được nghiên cứu bởi hai nhà khoa học là Potier va Swindell: *Sự che mat đi nhóm C;' hydroxy! sẽ làm mat hoạt tính trong hệ thống microtublin. *Nhóm C;' amid-acyl đóng vai trò then chốt. ngoài ra nó còn có thé là một chat thom hay một alkyl ngoài tự nhiên.

*Cy' nỗi nitrogen có thé được thay thé bởi một nguyên tử oxygen mà không làm mat hoạt tinh. *Sự hiện điện của nhóm C;' aryl 1a rất cần thiết.