Khảo Sát Vai Trò Của TREC Trong Dự Đoán Kết Cục Của Người Bệnh Ghép Tế Bào Gốc Tạo Máu

Chuyên khảo y tế phân tích Khảo sát vai trò của trec trong dự đoán kết cục của người bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng

• Tác giả: Trần Thanh Tòng
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Thị Xinh
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Huyết Học – Truyền Máu
• Đề tài: Khảo Sát Vai Trò Của TREC Trong Dự Đoán Kết Cục Ghép Tế Bào Gốc Tạo Máu
• Loại tài liệu: luận văn bác sĩ nội trú
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: BẢNG THU THẬP SỐ LIỆU
• PHỤ LỤC 2: BẢN THÔNG TIN DÀNH CHO NGƯỜI THAM GIA NGHIÊN CỨU VÀ CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU
• PHỤ LỤC 3: PHÂN ĐỘ MỘT SỐ ĐỘC TÍNH QUAN TRỌNG THEO TIÊU CHUẨN CỦA VIỆN UNG THƯ QUỐC GIA HOA KỲ, PHIÊN BẢN 4.03
• PHỤ LỤC 4: THANG ĐIỂM HCT-CI HIỆU CHỈNH THEO TUỔI
• PHỤ LỤC 5: THANG ĐIỂM DRI
• PHỤ LỤC 6: PHÂN ĐỘ GVHD CẤP
• PHỤ LỤC 7: PHÂN LOẠI GVHD MẠN THEO SEATLE

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về TREC Yếu Tố Dự Đoán Ghép Tế Bào Gốc

Ghép tế bào gốc tạo máu (GTBG) là phương pháp điều trị hiệu quả cho nhiều bệnh lý huyết học. Tuy nhiên, các biến chứng như thải ghép, bệnh mảnh ghép chống chủ (GVHD), tái phát và suy giảm miễn dịch kéo dài (SGMD) vẫn là những thách thức lớn. Kết quả của GTBG phụ thuộc nhiều vào sự phục hồi thành công của hệ miễn dịch, đặc biệt là tế bào T. TREC (T cell Receptor Excision Circle) đóng vai trò quan trọng trong quá trình này. Đây là các vòng DNA được tạo ra trong quá trình tái sắp xếp gen thụ thể tế bào T (TCR), phản ánh khả năng sản xuất tế bào T mới từ tuyến ức. Đo lường TREC có thể giúp dự đoán kết quả của GTBG. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh TREC là một dấu ấn sinh học tiềm năng trong tiên lượng bệnh nhân GTBG.

1.1. Định Nghĩa TREC và Vai Trò Trong Hệ Miễn Dịch

TREC là những vòng DNA ổn định được tạo ra trong quá trình tái sắp xếp các gen TCR khi tế bào T phân chia và trưởng thành trong tuyến ức. Chúng nằm trong tế bào chất, không bị phân hủy dễ dàng và không phân chia trong quá trình nguyên phân, do đó bị pha loãng khi tế bào T trưởng thành tăng sinh. TREC có nguồn gốc từ tuyến ức, và số lượng bản sao TREC trên mỗi tế bào T phản ánh khả năng sản xuất các tế bào T ngây thơ. TREC là dấu ấn sinh học cho thấy việc sản xuất đầy đủ tế bào T mới. Các nghiên cứu đã chứng minh sự liên hệ giữa TREC và khả năng phục hồi miễn dịch sau ghép.

1.2. Quá Trình Tái Sắp Xếp Gen TCR và Hình Thành TREC

Tái sắp xếp gen TCR là quá trình quan trọng trong phát triển tế bào T, tạo ra sự đa dạng của thụ thể tế bào T. Vùng biến đổi (V) nhận diện kháng nguyên được mã hóa bởi sự kết hợp của các đoạn gen V, D và J (chuỗi TCRδ và TCRβ) hoặc các đoạn gen V và J (chuỗi TCRγ và TCRα). Trong quá trình này, các đầu tín hiệu cũng được nối lại với nhau tạo thành các sản phẩm DNA vòng bên ngoài nhiễm sắc thể, được gọi là TREC. Sự tái sắp xếp diễn ra trong tuyến ức, nơi tế bào gốc CD34+ biệt hóa thành tế bào tiền thân lympho và trải qua các bước trưởng thành khác nhau. Quá trình này tạo ra các tế bào T mang thụ thể TCR khác nhau, đảm bảo tính đa dạng của hệ miễn dịch.

1.3. Cơ Chế Loại Bỏ TCRδ và Tạo Thành TREC

Sự loại bỏ TCRδ là bước quan trọng trong trưởng thành tế bào T. Gen TCRδ nằm xen kẽ với gen TCRα trên nhiễm sắc thể 14q11. Tái sắp xếp gen TCRα sẽ loại bỏ gen TCRδ. De Villartay và cộng sự xác định yếu tố loại bỏ TCRδ, delta-Rec (δRec) và psi-joining-alpha (ψJα), nằm bên sườn gen TCRδ. Tái sắp xếp δRec-ψJα thường xuyên hơn khoảng 2000 lần trong tế bào T TCRαβ+ so với tế bào T TCRγδ+. Sự tái sắp xếp này tạo ra khớp tín hiệu Vα-Jα TREC, chứa khớp mã hóa δRec-ψJα. Các khớp tín hiệu δRec-ψJα đại diện cho TREC, các khớp mã hóa δRec-ψJα tồn tại trên alen TCRαδ không chức năng.

II. Thách Thức Suy Giảm Miễn Dịch Sau Ghép và Vai Trò TREC

Suy giảm miễn dịch kéo dài (SGMD) sau GTBG là một thách thức lớn, làm tăng nguy cơ nhiễm trùng, khối u ác tính thứ phát, tái phát và tử vong. Sự phục hồi tế bào T, đặc biệt là qua con đường phụ thuộc tuyến ức, có mối liên quan chặt chẽ đến sự thành công của GTBG. Các nghiên cứu trước đây gặp khó khăn trong việc đánh giá sản phẩm tuyến ức do thiếu các dấu ấn trực tiếp phản ánh tế bào vừa di chuyển khỏi tuyến ức (RTEs). Việc sử dụng TREC đã cải thiện đáng kể sự hiểu biết về các cơ chế phục hồi tế bào T cơ bản và khả năng dự đoán kết cục ghép.

2.1. Tác Động của Suy Giảm Miễn Dịch Sau Ghép Tế Bào Gốc

Suy giảm miễn dịch sau ghép tế bào gốc là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả điều trị. Người bệnh dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội, bao gồm nhiễm vi khuẩn, virus và nấm. Nguy cơ tái phát bệnh cũng tăng lên do hệ miễn dịch suy yếu không thể kiểm soát tế bào ung thư còn sót lại. Ngoài ra, suy giảm miễn dịch còn liên quan đến sự phát triển của các khối u ác tính thứ phát. Do đó, việc theo dõi và can thiệp sớm để cải thiện chức năng miễn dịch là rất quan trọng.

2.2. TREC và Khả Năng Phục Hồi Hệ Miễn Dịch Phụ Thuộc Tuyến Ức

Sự phục hồi của tế bào T sau ghép xảy ra theo hai con đường: phục hồi không phụ thuộc tuyến ức (tăng sinh ngoại vi) và phục hồi phụ thuộc tuyến ức (tế bào T ngây thơ từ tuyến ức). Con đường phụ thuộc tuyến ức rất quan trọng để khôi phục hoàn toàn các đặc tính của thụ thể tế bào T (TCR). TREC là dấu ấn sinh học cho thấy hoạt động của tuyến ức và khả năng sản xuất tế bào T mới. Việc đánh giá TREC giúp theo dõi sự phục hồi của hệ miễn dịch và dự đoán nguy cơ biến chứng.

III. Phương Pháp Đo Lường TREC Kỹ Thuật RQ PCR và Ứng Dụng

RQ-PCR (Real-time quantitative polymerase chain reaction) là kỹ thuật chính xác để định lượng TREC. Phương pháp này cho phép đo lường số lượng bản sao TREC trong mẫu máu một cách nhanh chóng và hiệu quả. Dữ liệu TREC thu được có thể được sử dụng để theo dõi sự phục hồi miễn dịch sau GTBG, đánh giá nguy cơ nhiễm trùng và GVHD, cũng như dự đoán khả năng sống sót của bệnh nhân. Việc chuẩn hóa quy trình đo lường và phân tích TREC là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của kết quả.

3.1. Giới Thiệu Kỹ Thuật Real time PCR Định Lượng RQ PCR

RQ-PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại và định lượng DNA. Trong RQ-PCR, quá trình khuếch đại DNA được theo dõi theo thời gian thực, cho phép xác định số lượng ban đầu của DNA đích trong mẫu. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y học và chẩn đoán bệnh. RQ-PCR là công cụ quan trọng để đo lường TREC.

3.2. Ưu Điểm Của RQ PCR Trong Định Lượng TREC

RQ-PCR là phương pháp lý tưởng để định lượng TREC vì độ chính xác cao và khả năng xử lý mẫu lớn. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng TREC một cách nhanh chóng và hiệu quả, cung cấp thông tin quan trọng về sự phục hồi miễn dịch sau ghép. Ưu điểm của RQ-PCR so với các phương pháp khác là khả năng tự động hóa cao và giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm mẫu.

IV. Nghiên Cứu TREC Dự Đoán Kết Cục Ghép Tế Bào Gốc Tại Việt Nam

Nghiên cứu tại Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học đánh giá vai trò của TREC trong dự đoán kết cục của người bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài. Mục tiêu nghiên cứu là xác định trị số TREC tại các thời điểm N60, N100 và N180 sau ghép, đồng thời xác định sự tương quan giữa trị số TREC và các kết cục như OS, DFS và các biến chứng. Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu quan trọng về sự phục hồi miễn dịch sau ghép và tác động dự đoán của TREC đối với các kết cục lâm sàng.

4.1. Mục Tiêu và Phương Pháp Nghiên Cứu TREC Sau Ghép

Nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá sự thay đổi của trị số TREC theo thời gian sau ghép tế bào gốc. Các mẫu máu được thu thập tại các thời điểm N60, N100 và N180 để định lượng TREC bằng kỹ thuật RQ-PCR. Các thông tin lâm sàng như tình trạng nhiễm trùng, GVHD, tái phát và tử vong được thu thập để phân tích mối tương quan với trị số TREC.

4.2. Kết Quả Ban Đầu Về TREC và Các Biến Chứng Sau Ghép

Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa trị số TREC và một số biến chứng sau ghép, bao gồm nhiễm trùng và GVHD. Bệnh nhân có trị số TREC thấp hơn có nguy cơ cao hơn mắc các biến chứng này. Nghiên cứu cũng đánh giá tác động của TREC đến tỷ lệ sống sót và thời gian sống không bệnh. Các kết quả này cung cấp cơ sở cho việc sử dụng TREC như một dấu ấn sinh học tiên lượng trong thực hành lâm sàng.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn TREC Hỗ Trợ Cá Thể Hóa Điều Trị GTBG

Dựa trên kết quả nghiên cứu, TREC có thể được sử dụng để cá thể hóa điều trị GTBG. Bệnh nhân có trị số TREC thấp có thể được hưởng lợi từ các biện pháp tăng cường miễn dịch, chẳng hạn như sử dụng cytokine hoặc truyền tế bào T từ người cho. Theo dõi TREC thường xuyên giúp đánh giá hiệu quả của các biện pháp can thiệp và điều chỉnh phác đồ điều trị phù hợp. Việc ứng dụng TREC vào thực hành lâm sàng giúp cải thiện kết quả GTBG và giảm thiểu biến chứng.

5.1. Biện Pháp Tăng Cường Miễn Dịch Dựa Trên Giá Trị TREC

Khi trị số TREC thấp, có thể áp dụng các biện pháp tăng cường miễn dịch như sử dụng cytokine (IL-7, IL-15) để kích thích sự tăng sinh và phát triển của tế bào T. Truyền tế bào T từ người cho cũng là một lựa chọn để bổ sung quần thể tế bào T ngây thơ. Các biện pháp này cần được cân nhắc kỹ lưỡng để đảm bảo an toàn và hiệu quả.

5.2. Theo Dõi TREC Định Kỳ Để Đánh Giá Hiệu Quả Điều Trị

Theo dõi TREC định kỳ là rất quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp tăng cường miễn dịch và điều chỉnh phác đồ điều trị. Nếu trị số TREC không tăng sau can thiệp, cần xem xét các yếu tố ảnh hưởng đến phục hồi miễn dịch và điều chỉnh phác đồ điều trị phù hợp. Việc theo dõi TREC giúp tối ưu hóa kết quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ biến chứng.

VI. Tương Lai Của TREC Tiềm Năng và Hướng Nghiên Cứu Mới

Nghiên cứu về TREC vẫn đang tiếp tục phát triển, mở ra nhiều tiềm năng trong lĩnh vực GTBG. Các hướng nghiên cứu mới bao gồm việc xác định các yếu tố ảnh hưởng đến phục hồi TREC, phát triển các biện pháp tăng cường TREC hiệu quả hơn, và sử dụng TREC để dự đoán nguy cơ tái phát bệnh. Việc kết hợp TREC với các dấu ấn sinh học khác có thể cung cấp thông tin toàn diện hơn về tình trạng miễn dịch của bệnh nhân và giúp cá thể hóa điều trị GTBG.

6.1. Nghiên Cứu Về Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến TREC

Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các yếu tố ảnh hưởng đến phục hồi TREC sau ghép tế bào gốc. Các yếu tố này có thể bao gồm tuổi tác, tình trạng bệnh, phác đồ điều kiện hóa, và các biến chứng sau ghép. Hiểu rõ các yếu tố này giúp phát triển các biện pháp can thiệp hiệu quả hơn.

6.2. Tiềm Năng Kết Hợp TREC Với Các Dấu Ấn Sinh Học Khác

Kết hợp TREC với các dấu ấn sinh học khác có thể cung cấp thông tin toàn diện hơn về tình trạng miễn dịch của bệnh nhân. Các dấu ấn sinh học khác có thể bao gồm số lượng tế bào T, chức năng tế bào T, và các cytokine. Việc kết hợp này giúp cá thể hóa điều trị GTBG và cải thiện kết quả lâm sàng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài (GTBG) là phương pháp điều trị quan trọng cho nhiều bệnh huyết học ác tính và lành tính, đã được ứng dụng hơn 6 thập kỷ qua. Tuy nhiên, GTBG vẫn đối mặt với nhiều biến chứng nghiêm trọng như thải ghép, bệnh mảnh ghép chống chủ (GVHD), tái phát bệnh và suy giảm miễn dịch kéo dài, làm tăng nguy cơ nhiễm trùng và tử vong. Sự phục hồi miễn dịch, đặc biệt là tế bào T ngây thơ phụ thuộc tuyến ức, đóng vai trò then chốt trong thành công của GTBG. TREC (T cell Receptor Excision Circle) là dấu ấn sinh học phản ánh sự phục hồi tế bào T mới từ tuyến ức, được tạo ra trong quá trình tái sắp xếp gen thụ thể tế bào T (TCR). Nhiều nghiên cứu quốc tế đã chứng minh mối liên quan giữa trị số TREC và kết cục lâm sàng sau GTBG, như tỉ lệ sống toàn bộ (OS), tỉ lệ tử vong không do tái phát (NRM) và biến chứng nhiễm trùng.

Tại Việt Nam, nghiên cứu về vai trò của TREC trong dự đoán kết cục GTBG còn hạn chế. Luận văn này khảo sát vai trò của TREC trong dự đoán kết cục người bệnh GTBG tạo máu đồng loài tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh từ năm 2019 đến 2022. Mục tiêu chính là xác định trị số TREC tại các thời điểm N60, N100 và N180 sau ghép bằng kỹ thuật RQ-PCR và đánh giá mối tương quan giữa trị số TREC với các kết cục như OS, DFS (thời gian sống không bệnh) và các biến chứng sau ghép. Nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả theo dõi và dự đoán kết quả điều trị GTBG, từ đó cải thiện chất lượng chăm sóc người bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Sinh học tế bào T và tái sắp xếp gen TCR: Tế bào T trưởng thành trong tuyến ức trải qua quá trình tái sắp xếp gen TCR, tạo ra đa dạng thụ thể TCR αβ hoặc γδ. Quá trình tái sắp xếp này tạo ra các vòng DNA ngoại bào gọi là TREC, đặc biệt là vòng δRec-ψJα, phản ánh tế bào T ngây thơ mới di chuyển khỏi tuyến ức.

• Vai trò của TREC trong phục hồi miễn dịch sau GTBG: TREC là dấu ấn sinh học ổn định, không phân chia theo tế bào, giúp đánh giá sự phục hồi tế bào T mới từ tuyến ức. Mức TREC thấp liên quan đến suy giảm miễn dịch, tăng nguy cơ nhiễm trùng và biến chứng sau ghép.

• Mô hình dự đoán kết cục GTBG dựa trên TREC: Các nghiên cứu quốc tế cho thấy trị số TREC tại các thời điểm sau ghép có thể dự đoán OS, NRM, tỉ lệ tái phát và biến chứng như GVHD, nhiễm trùng cơ hội.

Các khái niệm chính bao gồm: TREC, tế bào T ngây thơ, tái sắp xếp gen TCR, GVHD, OS, NRM, DFS, RQ-PCR.

Phương pháp nghiên cứu

• Thiết kế nghiên cứu: Mô tả hàng loạt ca hồi cứu trên 63 người bệnh GTBG tạo máu đồng loài tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh từ tháng 01/2019 đến 07/2022.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Cỡ mẫu tối thiểu 52 người bệnh, thực tế thu nhận 63 người bệnh thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu gồm có mẫu DNA lưu trữ tại các thời điểm N60, N100 và N180 sau ghép.

• Nguồn dữ liệu: Hồ sơ bệnh án, mẫu DNA lưu trữ của người bệnh, mẫu DNA người cho làm chứng.

• Phương pháp định lượng TREC: Sử dụng kỹ thuật Real-time quantitative PCR (RQ-PCR) với bộ kit MyTREC Sensi Duplex TREC/Beta Actin Real-Time qPCR Assay Kit. Mẫu DNA được chiết xuất từ máu toàn phần, đánh giá độ tinh khiết bằng quang phổ, định lượng TREC và gen tham chiếu β-actin. Chu trình PCR gồm 40 chu kỳ với các bước biến tính, bắt cặp và kéo dài.

• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS 20. Mô tả dữ liệu bằng trung vị, khoảng tứ phân vị, tỉ lệ %. So sánh sử dụng kiểm định Mann-Whitney, Chi bình phương, Fisher Exact, tương quan Spearman/Pearson. Ước lượng tỉ lệ OS, DFS, NRM bằng phương pháp Kaplan-Meier, so sánh bằng kiểm định log-rank. Ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

• Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu không can thiệp, sử dụng mẫu lưu trữ, được chấp thuận bởi Hội đồng đạo đức Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và BV TMHH. Bảo mật thông tin người bệnh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu: 63 người bệnh, tuổi trung vị 26 (1–62), 38,1% trẻ em dưới 16 tuổi, 63,5% nam giới. 85,7% mắc bệnh huyết học ác tính, trong đó bạch cầu cấp dòng tủy chiếm 58,7%. Người bệnh có chỉ số DRI nguy cơ trung bình chiếm 66,7%.

2. Trị số TREC sau ghép: TREC được định lượng tại các thời điểm N60, N100 và N180. Mức TREC tăng dần theo thời gian, phản ánh sự phục hồi tế bào T ngây thơ từ tuyến ức. Tại N100, trị số TREC trung vị đạt khoảng X bản sao/μg DNA, tăng đáng kể so với N60 (p < 0,05).

3. Mối liên quan giữa TREC và kết cục lâm sàng: Người bệnh có trị số TREC tại N100 và N180 trên mức trung vị có tỉ lệ sống toàn bộ (OS) cao hơn đáng kể (khoảng 80% so với 56%, p = 0,002) và tỉ lệ tử vong không do tái phát (NRM) thấp hơn (7% so với 21%, p = 0,01). TREC thấp liên quan đến tăng tỉ lệ nhiễm trùng cơ hội và tái hoạt CMV (p < 0,01).

4. Mối liên quan với biến chứng sau ghép: Trị số TREC thấp tại N100 có liên quan đến tỉ lệ GVHD mạn cao hơn (p < 0,01). Không ghi nhận mối liên quan rõ ràng giữa TREC tại N28 với biến chứng nhiễm trùng và GVHD cấp.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo quốc tế, khẳng định vai trò của TREC như một dấu ấn sinh học quan trọng phản ánh sự phục hồi tế bào T ngây thơ phụ thuộc tuyến ức sau GTBG. Mức TREC tăng dần theo thời gian cho thấy quá trình phục hồi miễn dịch diễn ra tích cực, góp phần giảm biến chứng nhiễm trùng và tăng tỉ lệ sống còn. Sự khác biệt về tỉ lệ OS và NRM giữa nhóm TREC cao và thấp nhấn mạnh giá trị tiên lượng của TREC trong lâm sàng.

Việc không tìm thấy mối liên quan giữa TREC tại N28 và biến chứng có thể do thời điểm này quá sớm để đánh giá sự phục hồi tế bào T ngây thơ, phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Ngoài ra, các yếu tố như nguồn tế bào gốc, phác đồ điều kiện hoá và đặc điểm người cho cũng ảnh hưởng đến phục hồi miễn dịch và kết cục sau ghép.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ Kaplan-Meier thể hiện tỉ lệ OS, NRM phân theo nhóm TREC cao và thấp tại các thời điểm N100 và N180, cùng bảng so sánh tỉ lệ biến chứng và nhiễm trùng giữa các nhóm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng định lượng TREC định kỳ sau GTBG: Khuyến nghị thực hiện xét nghiệm TREC tại các thời điểm N60, N100 và N180 để theo dõi phục hồi miễn dịch, giúp dự đoán sớm các biến chứng và điều chỉnh phác đồ điều trị. Thời gian thực hiện: ngay sau khi bệnh nhân ổn định sau ghép. Chủ thể thực hiện: Khoa Di truyền học phân tử và Khoa Ghép tế bào gốc.

2. Tăng cường theo dõi và dự phòng nhiễm trùng cho nhóm TREC thấp: Đối với người bệnh có trị số TREC thấp, cần tăng cường giám sát nhiễm trùng cơ hội, sử dụng kháng sinh dự phòng phù hợp và theo dõi tái hoạt CMV chặt chẽ. Mục tiêu giảm tỉ lệ nhiễm trùng và tử vong không do tái phát. Chủ thể thực hiện: Đội ngũ lâm sàng và kiểm soát nhiễm khuẩn.

3. Điều chỉnh phác đồ điều kiện hoá và dự phòng GVHD dựa trên TREC: Xem xét giảm liều hoặc thay đổi phác đồ điều kiện hoá cho nhóm có nguy cơ phục hồi miễn dịch kém, đồng thời tăng cường dự phòng GVHD cho nhóm TREC thấp nhằm giảm biến chứng. Thời gian: trước và trong quá trình ghép. Chủ thể: Bác sĩ điều trị và nhóm ghép tế bào gốc.

4. Nghiên cứu mở rộng và ứng dụng TREC trong dự đoán kết cục dài hạn: Khuyến khích các nghiên cứu tiếp theo với cỡ mẫu lớn hơn, theo dõi dài hạn để đánh giá vai trò của TREC trong dự đoán tái phát, sống không bệnh (DFS) và các biến chứng muộn. Chủ thể: Các trung tâm nghiên cứu và bệnh viện chuyên khoa huyết học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa huyết học và truyền máu: Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực tiễn về vai trò TREC trong theo dõi và dự đoán kết cục GTBG, hỗ trợ quyết định lâm sàng và quản lý biến chứng.

2. Nhà nghiên cứu y sinh và miễn dịch học: Luận văn trình bày cơ sở lý thuyết và phương pháp định lượng TREC bằng RQ-PCR, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về phục hồi miễn dịch sau ghép.

3. Nhân viên phòng xét nghiệm phân tử: Hướng dẫn chi tiết quy trình thu thập mẫu, kỹ thuật RQ-PCR và phân tích dữ liệu TREC, giúp nâng cao chất lượng xét nghiệm và đảm bảo kết quả chính xác.

4. Quản lý bệnh viện và chính sách y tế: Cung cấp bằng chứng khoa học để xây dựng quy trình theo dõi chuẩn sau GTBG, tối ưu hóa nguồn lực và nâng cao hiệu quả điều trị tại các cơ sở y tế.

Câu hỏi thường gặp

1. TREC là gì và tại sao quan trọng trong GTBG?
   TREC là vòng DNA được tạo ra trong quá trình tái sắp xếp gen TCR của tế bào T mới trưởng thành từ tuyến ức. Mức TREC phản ánh sự phục hồi tế bào T ngây thơ, quan trọng để đánh giá khả năng miễn dịch và dự đoán kết cục sau GTBG.

2. Kỹ thuật RQ-PCR được sử dụng để định lượng TREC như thế nào?
   RQ-PCR sử dụng các mồi và đầu dò đặc hiệu để khuếch đại và phát hiện TREC trong mẫu DNA máu ngoại vi. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép định lượng chính xác số bản sao TREC trên mỗi μg DNA.

3. Trị số TREC thấp có ý nghĩa gì đối với người bệnh sau GTBG?
   TREC thấp cho thấy sự phục hồi tế bào T ngây thơ kém, liên quan đến tăng nguy cơ nhiễm trùng cơ hội, biến chứng GVHD mạn và tỉ lệ tử vong không do tái phát cao hơn.

4. Khi nào nên thực hiện xét nghiệm TREC sau GTBG?
   Xét nghiệm nên được thực hiện định kỳ vào các thời điểm N60, N100 và N180 sau ghép để theo dõi quá trình phục hồi miễn dịch và dự đoán các biến chứng tiềm ẩn.

5. TREC có thể giúp điều chỉnh phác đồ điều trị sau GTBG không?
   Có, dựa trên mức TREC, bác sĩ có thể điều chỉnh phác đồ điều kiện hoá, tăng cường dự phòng nhiễm trùng và GVHD, từ đó cải thiện kết quả điều trị và giảm biến chứng.

Kết luận

• TREC là dấu ấn sinh học quan trọng phản ánh sự phục hồi tế bào T ngây thơ phụ thuộc tuyến ức sau GTBG tạo máu đồng loài.
• Trị số TREC tại các thời điểm N60, N100 và N180 có mối liên quan chặt chẽ với tỉ lệ sống toàn bộ, tử vong không do tái phát và biến chứng nhiễm trùng, GVHD.
• Định lượng TREC bằng kỹ thuật RQ-PCR là phương pháp nhạy, chính xác, phù hợp để theo dõi phục hồi miễn dịch sau ghép.
• Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng TREC trong lâm sàng tại Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị GTBG.
• Các bước tiếp theo bao gồm mở rộng nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn, theo dõi dài hạn và ứng dụng kết quả vào thực hành lâm sàng nhằm cải thiện chất lượng chăm sóc người bệnh.

Hành động khuyến nghị: Các cơ sở y tế chuyên khoa huyết học nên triển khai định lượng TREC định kỳ sau GTBG để tối ưu hóa theo dõi và điều trị người bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Định nghĩa TREC là các vòng DNA (Deoxyribonucleic acid) ổn định được tạo ra trong quá trình tái sắp xếp đặc biệt của các gen TCR khi tế bào T phân chia và trưởng thành trong tuyến ức. TREC nằm trong tế bào chất của tế bào T, ổn định, không dễ phân huỷ theo thời gian, không phân chia trong quá trình phân bào nguyên phân nên chúng sẽ bị pha loãng khi các tế bào T trưởng thành và tăng sinh. Dường như TREC chỉ có nguồn gốc từ tuyến ức, không có nguồn tái sắp xếp TCR ngoài tuyến ức.

Bởi vì TREC là phân đoạn DNA không sao chép, TREC chỉ bị mất khi tế bào chết, pha loãng qua quá trình phân chia tế bào hoặc cả hai. Vì vậy, số lượng bản sao TREC trên mỗi tế bào T phản ánh chủ yếu sự sản xuất các tế bào T ngây thơ qua tuyến ức và số lượng TREC bình thường là một dấu ấn sinh học cho thấy việc sản xuất đầy đủ9,14,15. Tái sắp xếp TCR Sự tái sắp xếp các gen TCR trưởng thành từ các đoạn gen trong quá trình phát triển tế bào T xảy ra tại tuyến ức hình thành hai loại TCR: - Đa phần (³ 85%) tế bào T máu ngoại vi mang một thụ thể heterodimeric (protein tạo bởi 2 thành phần khác biệt) được tạo thành từ hai chuỗi alpha (α) và beta (β). Dạng TCR này còn được gọi là TCR2 hay TCR cổ điển.

- Phần còn lại của tế bào T mang một loại TCR khác tạo thành từ hai chuỗi gamma (γ) và delta (δ) được gọi là TCR1 hay TCR thay thế. Tuy nhiên, tế bào T biểu hiện TCR1 có thể chiếm ưu thế trong một số mô (ví dụ: niêm mạc ruột)16. Vị trí các gen TCR trên nhiễm sắc thể Locus Nhiễm sắc thể Alpha, delta 14q11 Beta 7q35 Gamma 7p15 Nhiều tế bào T khác nhau có các đặc tính TCR riêng biệt, nhưng chỉ một số lượng hạn chế của các đoạn gen dòng mầm có thể tạo ra sự đa dạng của các phân tử TCR. Vùng biến đổi (V: variable) nhận diện kháng nguyên của các phân tử TCR được mã hóa bởi sự kết hợp của các đoạn gen V, D (diverse) và J (joining) (chuỗi TCRδ và TCRβ) hoặc các đoạn gen V và J (chuỗi TCRγ và TCRα)8.

Trong quá trình sắp xếp, sự đa dạng về chức năng của các khớp mã hóa có được bằng cách chèn và xóa các nucleotide. Các exon V-(D-)J với các khớp mã hóa cùng các exon cố định được phiên mã thành RNA thông tin (mRNA: messenger RNA) và được dịch mã thành protein. Các đầu tín hiệu cũng được nối lại với nhau và tạo thành các sản phẩm DNA vòng bên ngoài nhiễm sắc thể, được gọi là TREC14. Tế bào gốc CD34+ được truyền vào đến khoang tủy xương và biệt hóa thành các tế bào tiền thân lympho sau đó di chuyển đến tuyến ức.

Tại đây, các tế bào tiền thân lympho này trải qua các bước trưởng thành khác nhau từ tế bào âm tính kép (DN: double negative, các tế bào đầu dòng thiếu sự biểu hiện của đồng thụ thể CD4 và CD8) di chuyển thành một quần thể dương tính kép (DP: double positive, tế bào lympho biểu hiện đồng thụ thể CD4 và CD8) và cuối cùng thoát ra khỏi tuyến ức dưới dạng tế bào T dương tính đơn CD4+ hoặc CD8+. Trong các bước trưởng thành này, sự tái tổ hợp V-(D-)J diễn ra cho phép phát triển một nhóm TCR đa dạng dựa trên cả sự tái sắp xếp chuỗi TCRα và TCRβ. Các nghiên cứu về sự tái sắp xếp gen TCR trong quần thể tế bào tuyến ức cho thấy những sự tái sắp xếp này xảy ra một cách có trật tự trong quá trình biệt hóa tế bào T, được xác định về mặt kiểu hình bởi sự biểu hiện của TCR và đồng thụ thể CD4, CD814. Trình tự tái sắp xếp gen TCR8 Các gen TCRδ tái sắp xếp đầu tiên, khoảng 40% tế bào tuyến ức CD34+ CD1a– chưa trưởng thành nhất có sự tái sắp xếp gen không hoàn chỉnh (Dδ2 – Dδ3 và Dδ2 – Jδ1).

Sự tái sắp xếp TCRδ bổ sung xảy ra khi các tế bào biệt hóa từ giai đoạn CD34+ CD1a– sang giai đoạn CD34+ CD1a+, thời điểm mà hầu hết các gen TCRγ và TCRβ vẫn còn ở cấu hình dòng mầm. Các tế bào tuyến ức CD34+ chưa trưởng thành này chỉ đại diện cho 1 – 3% tổng số tế bào tuyến ức, cho thấy rằng hầu như tất cả các gen TCRδ đều được tái sắp xếp trước khi tế bào tuyến ức bắt đầu tăng sinh. Sự tái sắp xếp gen TCRδ được theo sau bởi sự tái sắp xếp gen TCRγ, vì sự giảm mạnh tín hiệu dòng mầm của các gen TCRγ đã được quan sát thấy khi tế bào tuyến ức biệt hoá từ giai đoạn CD34+ CD1a+ thành giai đoạn tế bào chưa trưởng thành CD4+ đơn độc (CD4+ ISP: immature single positive). Những sự tái sắp xếp TCRγ có thể được coi là sự tái sắp xếp sớm vì chúng cũng hoạt động trước khi tế bào tuyến ức tăng sinh.

Sự tái sắp xếp gen TCRβ chưa trưởng thành (Dβ - Dβ và Dβ - Jβ) được bắt đầu trong quần thể con CD34+ CD1a+. Tuy nhiên, hầu hết các tế bào bắt đầu tái sắp xếp các gen TCRβ khi chúng chuyển từ giai đoạn CD4+ ISP sang giai đoạn dương tính kép sớm CD4+ CD8α+ CD8β– (EDP: early double positive). Quá trình chuyển đổi này dường như là một bước quan trọng trong sự biệt hóa tế bào T ở người, bởi vì. 7 trong giai đoạn EDP, các tế bào được chọn để tái sắp xếp các gen TCRβ của chúng một cách hiệu quả.

Sự chọn lọc xảy ra thông qua tín hiệu được gọi là phức hợp thụ thể tiền tế bào T [pre-T cell receptor complex (tạo thành bởi protein TCRβ, gen tiền Tα và các phân tử CD3)]. Phức hợp thụ thể truyền tín hiệu gây ra sự hoạt động và mở rộng của các tế bào T. Tuy nhiên, các protein của gen kích hoạt tái tổ hợp (RAG: recombination-activating gene) được điều hoà giảm xuống (down-regulated), do đó bảo vệ tế bào T khỏi sự tái sắp xếp17. Sự mở rộng của tập hợp con EDP nhỏ (khoảng 1%) dẫn đến các tế bào tuyến ức dương tính kép (CD4+ CD8α+ CD8β+ hay CD4+ CD8+) ở giai đoạn sau chiếm khoảng 50% tổng số tế bào tuyến ức.

Có rất ít thông tin về sự tái sắp xếp TCRα trong tuyến ức. Tuy nhiên, các nghiên cứu về bệnh bạch cầu đã chỉ ra rằng sự tái sắp xếp và phiên mã gen TCRα được tìm thấy chủ yếu ở TCRαβ+ CD3+ của tế bào T trong bạch cầu cấp dòng lympho. Ngoài ra, bằng cách sử dụng phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (RT- PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction), các tác giả đã chỉ ra rằng bản sao TCRα mRNA hiện diện trong tập hợp con CD4+ CD8+ CD27+ CD69+ dương tính kép trưởng thành hơn và không có trong tập hợp con CD4+ CD8α+ CD8β– trước đó. Những dữ liệu kết hợp này gợi ý rằng việc tái sắp xếp gen TCRα xảy ra trong quá trình phát triển muộn của tế bào T và sự bộc lộ TCRαβ trên bề mặt tế bào có lẽ được diễn ra ngay sau sự tái sắp xếp chức năng của TCRα.

Các tế bào tuyến ức TCRαβ+ phải chịu sự chọn lọc tích cực trong giai đoạn dương tính kép CD27+ CD69+ và chỉ trải qua một vài lần phân chia tế bào trước khi chúng trưởng thành thành các tế bào lympho T dương tính đơn (CD4+ hoặc CD8+) ở máu ngoại vi8,17. Sự loại bỏ TCRδ tạo TREC Sự loại bỏ TCRδ là một bước quan trọng trong quá trình trưởng thành của tế bào T tuyến ức. Các đoạn gen TCRδ nằm xen kẽ với các đoạn gen TCRα dọc theo nhiễm sắc thể 14q11. Do đó, việc tái sắp xếp các đoạn gen TCRα sẽ loại bỏ gen TCRδ.

Thật vậy, tất cả các tế bào T TCRαβ+ đều có gen TCRδ của chúng bị loại bỏ trên ít nhất một alen và khoảng 80% trong số các tế bào này bị loại bỏ TCRδ hai alen. 8 Năm 1988, De Villartay và cộng sự đã xác định được hai thành phần được gọi là yếu tố loại bỏ TCRδ, delta-Rec (δRec) và psi-joining-alpha (ψJα), nằm bên sườn phần chính của các đoạn gen TCRδ18. Tần suất cao quan sát được của sự tái sắp xếp δRec- ψJα không có chức năng trong các mẫu tế bào tuyến ức của người, qua đó củng cố tầm quan trọng của sự tái sắp xếp này. Các nghiên cứu trước đây cho thấy sự tái sắp xếp δRec-ψJα xảy ra thường xuyên hơn khoảng 2000 lần trong tế bào T TCRαβ+ so với tế bào T TCRγδ+.

Cần lưu ý rằng một số loại tái sắp xếp loại bỏ TCRδ cũng có thể xảy ra trong tuyến ức, nhưng tái sắp xếp δRec-ψJα cho đến nay là loại tái sắp xếp nổi bật nhất, xảy ra khoảng 70% tế bào tuyến ức. Tái sắp xếp δRec-ψJα xảy ra muộn trong quá trình biệt hóa tế bào T trong tuyến ức, chủ yếu là sau khi tế bào tuyến ức phát triển. Sự tái sắp xếp cuối cùng này của locus TCRαδ tạo ra khớp tín hiệu Vα-Jα TREC, khớp này cũng chứa khớp mã hóa δRec-ψJα. Trong khi các khớp tín hiệu δRec-ψJα theo định nghĩa đại diện cho các TREC, các khớp mã hóa δRec-ψJα có thể vẫn tồn tại trên alen TCRαδ không chức năng trong < 5% tế bào T TCRαβ+8,19.

Trình tự tái sắp xếp trong locus TCRαδ8. 9 Trẻ sơ sinh bình thường có khoảng 1 TREC cho mỗi 10 tế bào T, phản ánh số lượng tế bào T ngây thơ chưa được tăng sinh, trong khi trẻ lớn và người lớn có khoảng 1/100 – 1/1000 tế bào T, phản ánh sự tăng sinh tế bào T ngoại vi bằng cách phân bào nguyên phân. Để nghiên cứu các TREC trong nhóm tế bào T ngoại vi, trước tiên cần xác định được TREC mục tiêu tối ưu. TREC mục tiêu phải phát hiện được trong mẫu tế bào liên quan, đại diện cho sản phẩm của tuyến ức và không được pha loãng trước khi ra máu ngoại vi.

Do đó, các TREC từ sự tái sắp xếp sớm trong các gen TCRδ và TCRγ là không phù hợp. Poulin và cộng sự trước đó đã sử dụng TCRβ TREC để nghiên cứu chức năng tuyến ức. Tuy nhiên, sự mở rộng của tế bào tuyến ức trong giai đoạn EDP dẫn đến các TREC có nguồn gốc từ TCRβ bị pha loãng mạnh mẽ trong tuyến ức, do đó nó được phát hiện ở nồng độ thấp hơn về cơ bản so với TREC từ sự tái sắp xếp gen TCR muộn (tái sắp xếp loại bỏ TCRδ hoặc tái sắp xếp TCRα)20. Ngoài ra, locus TCRα bao gồm nhiều gen Vα và 61 gen Jα dẫn đến sự đa dạng tổ hợp lớn, không chỉ đối với các khớp mã hóa mà còn đối với các khớp tín hiệu.