Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Vi Sinh Vật và Kháng Oxy Hóa của Dịch Chiết Hạt Bưởi (Citrus maxima)

• Tác giả: Nguyễn Quách Nhật Hoàng
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Ngọc Yên
• Trường học: Đại học Bách Khoa
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Vi Sinh Vật và Kháng Oxy Hóa của Dịch Chiết Hạt Bưởi (Citrus maxima)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

• LỜI CÁM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về hạt bưởi
• 1.2. Một số phương pháp tách chiết
• 1.2.1. Trích li bằng Soxhlet
• 1.2.2. Trích li bằng CO; siêu tới hạn
• 1.2.3. Trích li có sự hỗ trợ của vi sóng
• 1.2.4. Trích li có sự hỗ trợ của sóng siêu âm
• 1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
• 1.4. Một số chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh thường gặp
• 1.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
• 1.5.1. Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn
• 1.5.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
• 1.6. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
• 1.6.1. Phương pháp DPPH (Diphenylpicrylhydrazyl radical)
• 1.6.2. Phương pháp ABTS
• 1.6.3. Phương pháp ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
• 1.6.4. Phương pháp TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Potential)
• 1.6.5. Phương pháp FRAP (Ferric Reducing-Antioxidant Power)
• 1.6.6. Phương pháp Reducing Power
• 1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chung về vi sinh vật
• 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường thí nghiệm
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp CO; siêu tới hạn
• 2.3.2. Khảo sát quy trình tách chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate
• 2.3.3. Phân tích hàm lượng limonin bằng HPLC
• 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
• 2.3.4.1. Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn
• 2.3.4.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
• 2.3.5. Phương pháp DPPH xác định hoạt tính kháng oxy hóa
• 2.3.6. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Quy trình tách chiết dịch chiết hạt
• 3.1.1. Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp CO; siêu tới hạn
• 3.1.2. Khảo sát quy trình chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate
• 3.1.3. Chuẩn bị mẫu dịch chiết thử
• 3.2. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
• 3.2.1. Kết quả đo đường kính vòng kháng vi sinh vật
• 3.2.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
• 3.3. Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.1. Kết luận
• 4.2. Kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Dịch Chiết Hạt Bưởi Citrus maxima Tổng Quan Tiềm Năng

Quả bưởi (Citrus maxima) được ưa chuộng vì giàu vitamin và khoáng chất. Y học cổ truyền ghi nhận nhiều công dụng của các bộ phận quả bưởi, đặc biệt là hạt. Hạt bưởi có vị đắng, tính ấm, được sử dụng để chữa viêm loét dạ dày tá tràng. Tuy nhiên, trong sản xuất, hạt bưởi thường bị loại bỏ, gây lãng phí. Trong bối cảnh nhu cầu về các chất kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật tự nhiên ngày càng tăng, việc nghiên cứu dịch chiết hạt bưởi trở nên cấp thiết. Nghiên cứu này tập trung vào việc tận dụng nguồn phế liệu này, gia tăng giá trị sử dụng, giá trị kinh tế cho các sản phẩm từ bưởi, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, đồng thời đánh giá khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa, mở đường cho các nghiên cứu sâu hơn. Tài liệu gốc chỉ ra rằng hạt bưởi chứa nhiều limonoid, một hợp chất có nhiều tiềm năng sinh học.

1.1. Thành Phần Hóa Học Tiềm Năng của Hạt Bưởi Citrus maxima

Hạt bưởi chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm chất béo, protein, chất xơ, tro và đặc biệt là limonoids. Hàm lượng limonoid trong hạt bưởi cao hơn so với các loại hạt Citrus khác. Limonin, một loại limonoid aglycones, được tìm thấy nhiều trong hạt bưởi, có công thức phân tử C30H36O8 và có nhiều tiềm năng y học. Các limonoid aglycones khác bao gồm nomilin, obacunone và deacetylnomilin. Hàm lượng limonin trong 1 kg hạt bưởi khô có thể lên đến 19g, tùy thuộc vào giống bưởi và điều kiện địa lý. Nghiên cứu của Hasegawa và Hashinaga cũng cho thấy limonin là limonoid chiếm ưu thế trong các loài Citrus. Các nghiên cứu còn ghi nhận trong hạt bưởi có limonoids aglycones (773 – 9900 ppm) và limonoid glucosides (130 – 1912 ppm).

1.2. Lợi Ích Sức Khỏe Tiềm Năng Từ Dịch Chiết Hạt Bưởi

Limonin, một thành phần quan trọng trong dịch chiết hạt bưởi, có nhiều lợi ích sức khỏe tiềm năng. Nghiên cứu cho thấy limonin có khả năng ức chế sự phiên mã của retrovirus như HIV-I và HTLV-I. Ngoài ra, limonin có tác dụng ổn định thần kinh, giảm sự phát triển của tế bào ung thư ruột kết, giảm cholesterol LDL và giảm nguy cơ xơ vữa động mạch. Các thí nghiệm trên chuột cho thấy limonoids từ quả bưởi có khả năng ức chế enzyme glutathione S-transferase và ức chế khối u ở dạ dày, miệng, phổi, da, đại tràng. Thí nghiệm trên tế bào ung thư vú ở người cũng cho thấy limonoids có tiềm năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

II. Thách Thức Bảo Quản Thực Phẩm Vai Trò của Kháng Vi Sinh Vật

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, bảo quản an toàn và kéo dài thời hạn sử dụng là một thách thức lớn. Vi khuẩn gây bệnh và nấm gây bệnh có thể gây hư hỏng thực phẩm, dẫn đến ngộ độc và lãng phí. Việc sử dụng các chất bảo quản tổng hợp đang gây ra nhiều lo ngại về an toàn thực phẩm và sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, việc tìm kiếm các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và hiệu quả là một ưu tiên hàng đầu. Nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết thực vật như dịch chiết hạt bưởi mang lại hy vọng về một giải pháp bảo quản thực phẩm an toàn và bền vững hơn. Hạt bưởi thường bị loại bỏ trong các quy trình chế biến, điều này dẫn đến việc không tận dụng được nguồn tài nguyên có giá trị.

2.1. Các Loại Vi Khuẩn Gây Bệnh Phổ Biến Trong Thực Phẩm

Nhiều loại vi khuẩn có thể gây bệnh khi xâm nhập vào thực phẩm, gây ra các triệu chứng từ khó chịu nhẹ đến nguy hiểm tính mạng. Các loại vi khuẩn gây bệnh phổ biến bao gồm Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi và Pseudomonas aeruginosa. Staphylococcus aureus có thể gây ngộ độc thực phẩm do sản xuất độc tố. Bacillus cereus thường liên quan đến các bệnh tiêu chảy. Salmonella typhi gây ra bệnh thương hàn. Pseudomonas aeruginosa có thể gây nhiễm trùng máu và viêm phổi. Việc kiểm soát sự phát triển của các vi khuẩn này trong thực phẩm là rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Do vậy, việc tìm kiếm các chất kháng khuẩn từ nguồn gốc tự nhiên là rất cần thiết.

2.2. Các Loại Nấm Gây Bệnh Thường Gặp Trong Thực Phẩm

Bên cạnh vi khuẩn, nấm cũng là một mối đe dọa lớn đối với an toàn thực phẩm. Một số loại nấm sản sinh ra độc tố, gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Các loại nấm gây bệnh phổ biến bao gồm Fusarium solani và Aspergillus flavus. Fusarium solani có thể sản xuất mycotoxin gây hại cho gan và thận. Aspergillus flavus sản xuất aflatoxin, một chất gây ung thư mạnh. Việc ngăn chặn sự phát triển của các nấm này trong thực phẩm là rất quan trọng. Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của dịch chiết hạt bưởi có thể giúp tìm ra giải pháp tự nhiên để bảo quản thực phẩm.

III. Cách Chiết Xuất Dịch Chiết Hạt Bưởi Citrus maxima Hiệu Quả Nhất

Để khai thác tối đa tiềm năng của hạt bưởi, cần có các phương pháp chiết xuất hiệu quả để thu được dịch chiết giàu hoạt chất. Có nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau, mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Hai phương pháp được đề cập trong tài liệu gốc là chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn và chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate. Việc lựa chọn phương pháp chiết xuất phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loại dung môi, nhiệt độ, áp suất và thời gian chiết. Mục tiêu là tối ưu hóa hiệu quả chiết xuất, đồng thời đảm bảo an toàn và thân thiện với môi trường. Các phương pháp chiết xuất này cần được xem xét kỹ lưỡng, vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của dịch chiết.

3.1. Phương Pháp Chiết Soxhlet Sử Dụng Dung Môi Ethyl Acetate

Chiết Soxhlet là một phương pháp chiết xuất truyền thống, sử dụng nhiệt độ và dung môi để hòa tan các hợp chất mong muốn từ mẫu rắn. Dung môi ethyl acetate được sử dụng rộng rãi vì tính phân cực trung bình và khả năng hòa tan nhiều loại hợp chất. Ưu điểm của phương pháp Soxhlet là tiết kiệm dung môi và có thể chiết kiệt chất cần chiết từ mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này có thể làm giảm chất lượng dịch chiết do nhiệt độ cao có thể phá hủy các hợp chất kém bền nhiệt. Theo tài liệu gốc, phương pháp này đã được sử dụng để chiết limonoids từ hạt chanh. Phương pháp chiết Soxhlet là quá trình chiết hồi lưu dựa trên nguyên tắc hóa hơi. Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, khi gặp hệ thống làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thăng xuống pha rắn chứa chất cần hòa tan.

3.2. Phương Pháp Chiết CO2 Siêu Tới Hạn Ưu Điểm Vượt Trội

Chiết CO2 siêu tới hạn (SCO2) là một phương pháp chiết xuất tiên tiến, sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn để hòa tan các hợp chất. Ưu điểm của phương pháp SCO2 là sử dụng dung môi an toàn, thân thiện với môi trường, không độc hại và có thể dễ dàng loại bỏ sau khi chiết xuất. Ngoài ra, SCO2 có thể chiết xuất các hợp chất kém bền nhiệt mà không gây phá hủy. SCO2 cũng có tính chọn lọc cao, có thể điều chỉnh áp suất và nhiệt độ để chiết xuất các hợp chất mong muốn. Tuy nhiên, chiết SCO2 đòi hỏi thiết bị phức tạp và chi phí đầu tư ban đầu cao hơn so với chiết Soxhlet. CO2 siêu tới hạn có khả năng hòa tan tốt các chất ở cả ba dạng rắn, lỏng và khí. Dung môi siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất dễ bay hơi và cả các cấu tử không bay hơi của mẫu. CO2 là dung môi được ưu tiên lựa chọn do dễ kiếm, rẻ tiền và ít có phản ứng với các chất cần tách chiết.

IV. Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Vi Sinh Vật của Dịch Chiết

Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết hạt bưởi thu được bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn và ethyl acetate đối với sáu chủng vi sinh vật gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm. Các chủng vi sinh vật bao gồm Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani và Aspergillus flavus. Kết quả cho thấy dịch chiết hạt bưởi có khả năng ức chế sự phát triển của một số chủng vi sinh vật, đặc biệt là Staphylococcus aureus. Các kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, dịch chiết bằng CO2 siêu tới hạn có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với chiết bằng ethyl acetate.

4.1. Kết Quả Đo Đường Kính Vòng Kháng Khuẩn Của Dịch Chiết

Đường kính vòng kháng khuẩn là một chỉ số quan trọng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một chất. Vòng kháng khuẩn càng lớn, hoạt tính kháng khuẩn càng mạnh. Nghiên cứu đo đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết hạt bưởi đối với các chủng vi sinh vật khác nhau. Kết quả cho thấy dịch chiết hạt bưởi có khả năng tạo vòng kháng khuẩn đối với một số chủng vi sinh vật, nhưng không phải tất cả. Dịch chiết thu bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với dịch chiết thu bằng ethyl acetate đối với Staphylococcus aureus.

4.2. Xác Định Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu MIC Của Dịch Chiết

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ thấp nhất của một chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. MIC là một chỉ số quan trọng để đánh giá hiệu quả của một chất kháng khuẩn. Nghiên cứu xác định MIC của dịch chiết hạt bưởi đối với các chủng vi sinh vật khác nhau. Kết quả cho thấy MIC của dịch chiết hạt bưởi thay đổi tùy thuộc vào chủng vi sinh vật và phương pháp chiết xuất. Theo tài liệu gốc, dịch chiết bằng CO2 siêu tới hạn có MIC thấp hơn so với dịch chiết bằng ethyl acetate đối với Staphylococcus aureus, điều này khẳng định hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn của dịch chiết CO2 siêu tới hạn.

V. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa của Dịch Chiết Hạt Bưởi DPPH

Stress oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong nhiều bệnh tật. Các chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do các gốc tự do. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết hạt bưởi bằng phương pháp DPPH. Phương pháp DPPH là một phương pháp phổ biến để đo lường khả năng khử các gốc tự do của một chất. Kết quả cho thấy dịch chiết hạt bưởi có hoạt tính kháng oxy hóa đáng kể, cho thấy tiềm năng sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ sức khỏe.

5.1. Giá Trị IC50 Của Dịch Chiết Hạt Bưởi Theo Phương Pháp DPPH

Giá trị IC50 là nồng độ của một chất cần thiết để ức chế 50% hoạt động của các gốc tự do. Giá trị IC50 càng thấp, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh. Nghiên cứu xác định giá trị IC50 của dịch chiết hạt bưởi bằng phương pháp DPPH. Kết quả cho thấy dịch chiết hạt bưởi có giá trị IC50 đáng kể, cho thấy khả năng khử các gốc tự do hiệu quả. Theo tài liệu gốc, giá trị IC50 của dịch chiết hạt bưởi bằng CO2 siêu tới hạn là 45,34 mg/mL và ethyl acetate là 7,55 mg/mL.

VI. Kết Luận và Ứng Dụng Tiềm Năng của Dịch Chiết Hạt Bưởi

Nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết hạt bưởi (Citrus maxima) có hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa tiềm năng. Dịch chiết này có thể được sử dụng làm chất bảo quản tự nhiên trong thực phẩm, thay thế cho các chất bảo quản tổng hợp. Ngoài ra, dịch chiết hạt bưởi có thể được ứng dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, nhờ vào hoạt tính kháng oxy hóa. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá đầy đủ tính an toàn và hiệu quả của dịch chiết hạt bưởi trước khi đưa vào ứng dụng rộng rãi.

6.1. Ứng Dụng Dịch Chiết Hạt Bưởi Trong An Toàn Thực Phẩm

Với khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, dịch chiết hạt bưởi có thể được sử dụng làm chất bảo quản tự nhiên trong nhiều loại thực phẩm, giúp kéo dài thời hạn sử dụng và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Việc sử dụng dịch chiết hạt bưởi làm chất bảo quản có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng các chất bảo quản tổng hợp, vốn gây ra nhiều lo ngại về sức khỏe. Dịch chiết này có tiềm năng lớn để được ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm.

6.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Y Học và Chăm Sóc Sức Khỏe

Nhờ hoạt tính kháng oxy hóa và các đặc tính sinh học khác, dịch chiết hạt bưởi có thể được ứng dụng trong các sản phẩm y học và chăm sóc sức khỏe. Limonin và các limonoids khác có trong dịch chiết có thể có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do, giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính. Các nghiên cứu sâu hơn về độc tính và liều dùng an toàn là cần thiết để khai thác tối đa tiềm năng của dịch chiết hạt bưởi trong lĩnh vực này.

Tổng quan nghiên cứu

Quả bưởi (Citrus maxima) là loại trái cây nhiệt đới phổ biến, chứa nhiều vitamin và khoáng chất, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và công nghiệp thực phẩm. Trong đó, hạt bưởi thường bị loại bỏ trong quá trình chế biến, mặc dù chứa nhiều hợp chất sinh học quý giá như limonin – một limonoid có hoạt tính sinh học đa dạng. Nhu cầu sử dụng các chất có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật ngày càng tăng, đặc biệt trong bảo quản thực phẩm và phát triển dược phẩm tự nhiên. Tuy nhiên, nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi còn hạn chế.

Luận văn này nhằm khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi Thanh Trà (Thừa Thiên Huế) bằng hai phương pháp trích ly: CO₂ siêu tới hạn và Soxhlet với dung môi ethyl acetate. Nghiên cứu tập trung vào 6 chủng vi sinh vật gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm gồm Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani và Aspergillus flavus. Thời gian nghiên cứu từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2016 tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Kết quả nghiên cứu cung cấp số liệu cụ thể về nồng độ limonin trong dịch chiết, giá trị IC₅₀ của hoạt tính kháng oxy hóa và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với từng chủng vi sinh vật. Nghiên cứu góp phần nâng cao giá trị sử dụng phế liệu hạt bưởi, mở ra hướng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, công nghệ dược phẩm và mỹ phẩm, đồng thời giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Limonin và limonoids: Là nhóm hợp chất chính trong hạt bưởi, có cấu trúc aglycone, được biết đến với hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật và tiềm năng chống ung thư. Limonin có công thức phân tử C₃₀H₃₄O₈, được tìm thấy nhiều trong hạt Citrus maxima với hàm lượng khoảng 190 ppm trong dịch chiết CO₂ siêu tới hạn.

• Phương pháp trích ly CO₂ siêu tới hạn: Sử dụng CO₂ ở trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết xuất các hợp chất sinh học, ưu điểm là không gây ô nhiễm, giữ nguyên cấu trúc hoạt chất, có thể điều chỉnh áp suất và nhiệt độ để tối ưu hiệu suất chiết.

• Phương pháp Soxhlet với dung môi ethyl acetate: Phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, sử dụng ethyl acetate làm dung môi phân cực trung bình để chiết các hợp chất limonoids từ bột hạt bưởi.

• Hoạt tính kháng vi sinh vật: Được đánh giá qua phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên các chủng vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm mốc gây hại thực phẩm.

• Hoạt tính kháng oxy hóa: Đánh giá bằng phương pháp DPPH, đo khả năng loại bỏ gốc tự do, tính giá trị IC₅₀ – nồng độ dịch chiết cần thiết để ức chế 50% gốc tự do DPPH.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu là hạt bưởi Thanh Trà thu mua tại Thừa Thiên Huế, được sấy khô ở 50°C trong 72 giờ, nghiền mịn và bảo quản lạnh. Vi sinh vật thử nghiệm gồm 4 chủng vi khuẩn (Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa) và 2 chủng nấm mốc (Fusarium solani, Aspergillus flavus).

• Phương pháp trích ly:

  • CO₂ siêu tới hạn: Thực hiện ở 50°C, áp suất 25 MPa, thời gian 60 phút, đồng dung môi ethanol 30%, lưu lượng dòng 10 g/phút.
  • Soxhlet: Chiết với ethyl acetate ở 90°C trong 7 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:5 (g/mL).

• Phân tích hàm lượng limonin: Sử dụng HPLC với cột C18, pha động ACN:H₂O (40:60) có 0,1% acid formic, bước sóng phát hiện 210 nm.

• Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật:

  • Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn trên môi trường thạch Mueller-Hinton Agar (MHA) cho vi khuẩn và Potato Dextrose Agar (PDA) cho nấm mốc.
  • Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng, theo dãy nồng độ từ 80 đến 192 mg/mL.

• Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa: Phương pháp DPPH, đo hấp thu ở bước sóng 517 nm, tính IC₅₀ từ phần trăm ức chế gốc tự do.

• Timeline nghiên cứu: Từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2016, bao gồm thu thập nguyên liệu, trích ly, phân tích hóa học, thử nghiệm vi sinh và xử lý số liệu bằng SPSS 16.0 và Excel 2007.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng điều kiện trích ly đến hàm lượng limonin:

   • Phương pháp CO₂ siêu tới hạn: Nồng độ limonin cao nhất đạt 185,83 ppm ở 50°C, 25 MPa, 60 phút, đồng dung môi ethanol 30%. Nồng độ limonin tăng theo áp suất và thời gian trích ly đến điểm tối ưu.
   • Phương pháp Soxhlet: Nồng độ limonin cao nhất 180,35 ppm ở 90°C, 7 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:5.

2. Hoạt tính kháng vi sinh vật:

   • Dịch chiết CO₂ siêu tới hạn (DC1) có khả năng kháng tất cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính vòng kháng khuẩn từ 9,33 đến 13,33 mm, MIC dao động từ 96 đến 160 mg/mL.
   • Dịch chiết Soxhlet (DC2) kháng kém hơn, MIC đối với Staphylococcus aureus là 128 mg/mL, còn lại >192 mg/mL.
   • Đối với nấm mốc, chỉ DC1 có khả năng kháng Fusarium solani với MIC >192 mg/mL, cả hai dịch chiết không kháng Aspergillus flavus.

3. Hoạt tính kháng oxy hóa:

   • Giá trị IC₅₀ của DC1 là 45,34 mg/mL, của DC2 là 7,55 mg/mL, cho thấy dịch chiết Soxhlet có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn.
   • Sự khác biệt này có thể do Soxhlet chiết được nhiều flavonoids hơn, trong khi CO₂ siêu tới hạn chủ yếu chiết limonoids.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp trích ly CO₂ siêu tới hạn ưu việt trong việc giữ nguyên hoạt tính kháng vi sinh vật, đặc biệt với vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus và Bacillus cereus. Điều này có thể giải thích bởi CO₂ siêu tới hạn không làm biến đổi các hợp chất hoạt tính nhạy nhiệt, trong khi Soxhlet có thể làm mất một số thành phần do nhiệt độ cao và thời gian chiết kéo dài.

Hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn trên vi khuẩn Gram dương so với Gram âm là do cấu trúc màng tế bào Gram âm phức tạp hơn, có lớp lipopolysaccharide hạn chế sự thâm nhập của các hợp chất kháng khuẩn. Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất thuộc về Bacillus cereus (13,33 mm với DC1), phù hợp với đặc tính sinh học của vi khuẩn này.

Hoạt tính kháng oxy hóa cao của dịch chiết Soxhlet phản ánh khả năng chiết xuất flavonoids – các hợp chất có vòng chromanol với nhóm hydroxyl, có khả năng cho electron để trung hòa gốc tự do DPPH. Trong khi đó, limonoids chiếm ưu thế trong dịch chiết CO₂ siêu tới hạn có hoạt tính kháng oxy hóa thấp hơn.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh nồng độ limonin theo điều kiện trích ly, biểu đồ đường kính vòng kháng khuẩn và biểu đồ IC₅₀ của hai dịch chiết, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của từng phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình trích ly CO₂ siêu tới hạn nhằm nâng cao hàm lượng limonin và hoạt tính kháng vi sinh vật, tập trung điều chỉnh áp suất và đồng dung môi ethanol trong vòng 6 tháng, do phòng thí nghiệm thực hiện.

2. Mở rộng khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật trên nhiều chủng vi khuẩn và nấm mốc khác để đánh giá phổ tác dụng, đặc biệt các chủng gây bệnh thực phẩm phổ biến, trong 1 năm, phối hợp với viện nghiên cứu vi sinh.

3. Nghiên cứu phối hợp dịch chiết hạt bưởi với các chất bảo quản tự nhiên khác nhằm tăng cường hiệu quả bảo quản thực phẩm, giảm liều lượng sử dụng, trong 12 tháng, do các công ty thực phẩm thực hiện.

4. Phát triển sản phẩm ứng dụng trong công nghệ dược phẩm và mỹ phẩm dựa trên hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của dịch chiết, tập trung vào các sản phẩm chống lão hóa và kháng khuẩn da, trong 18 tháng, do doanh nghiệp và viện nghiên cứu phối hợp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sâu về chiết xuất hoạt chất từ nguyên liệu tự nhiên, ứng dụng trong bảo quản và phát triển sản phẩm mới.

2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm: Tìm hiểu tiềm năng ứng dụng dịch chiết hạt bưởi làm nguyên liệu kháng oxy hóa và kháng khuẩn tự nhiên, nâng cao giá trị sản phẩm.

3. Chuyên gia trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển các giải pháp bảo quản an toàn, giảm sử dụng hóa chất tổng hợp.

4. Cơ quan quản lý và phát triển nông nghiệp: Khai thác nguồn phế liệu hạt bưởi, thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững và giảm ô nhiễm môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Dịch chiết hạt bưởi có thể kháng được những loại vi sinh vật nào?
   Dịch chiết CO₂ siêu tới hạn kháng được Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa và Fusarium solani, trong khi dịch chiết Soxhlet chủ yếu kháng Staphylococcus aureus. Điều này được xác định qua đường kính vòng kháng khuẩn và MIC.

2. Phương pháp trích ly nào hiệu quả hơn trong việc giữ hoạt tính kháng khuẩn?
   Phương pháp CO₂ siêu tới hạn cho hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, với MIC thấp hơn từ 1,3 lần so với Soxhlet, do không làm biến đổi các hợp chất hoạt tính nhạy nhiệt.

3. Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết được đánh giá như thế nào?
   Bằng phương pháp DPPH, dịch chiết Soxhlet có IC₅₀ là 7,55 mg/mL, mạnh hơn dịch chiết CO₂ siêu tới hạn với IC₅₀ là 45,34 mg/mL, phản ánh sự khác biệt về thành phần flavonoids và limonoids.

4. Có thể ứng dụng dịch chiết hạt bưởi trong bảo quản thực phẩm không?
   Có, dịch chiết có khả năng kháng vi sinh vật gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm, có thể dùng làm chất bảo quản tự nhiên, giúp kéo dài thời gian sử dụng và an toàn cho người tiêu dùng.

5. Nghiên cứu này có thể mở rộng ứng dụng ra lĩnh vực nào khác?
   Ngoài thực phẩm, dịch chiết có thể ứng dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm với chức năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, hỗ trợ điều trị viêm nhiễm và làm đẹp da.

Kết luận

• Đã xác định được điều kiện tối ưu trích ly limonin từ hạt bưởi bằng CO₂ siêu tới hạn (50°C, 25 MPa, 60 phút, ethanol 30%) và Soxhlet (90°C, 7 giờ, tỷ lệ 1:5).
• Dịch chiết CO₂ siêu tới hạn có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh hơn, đặc biệt với vi khuẩn Gram dương, MIC thấp nhất là 96 mg/mL với Staphylococcus aureus.
• Dịch chiết Soxhlet có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn với IC₅₀ là 7,55 mg/mL, do chiết được nhiều flavonoids hơn.
• Cả hai dịch chiết không có hoạt tính kháng Aspergillus flavus, chỉ dịch chiết CO₂ siêu tới hạn kháng được Fusarium solani.
• Nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng dịch chiết hạt bưởi trong bảo quản thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và giảm ô nhiễm môi trường.

Next steps: Tiếp tục khảo sát hoạt tính trên nhiều chủng vi sinh vật hơn, tối ưu quy trình trích ly và phát triển sản phẩm ứng dụng thực tiễn.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm và dược phẩm nên hợp tác để khai thác tiềm năng của dịch chiết hạt bưởi, thúc đẩy phát triển sản phẩm tự nhiên an toàn và hiệu quả.