Khảo Sát Hiệu Quả Kháng Oxy Hóa và Bảo Vệ Gan trên Mô Hình Chuột của Một Số Cây Thuộc Họ Cà Phê

Họ Cà phê (Rubiaceae) là một họ thực vật lớn, phân bố rộng rãi, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long. 200 trang · Trường Đại Học Cần Thơ · 2021.

• Tác giả: Phan Kim Định
• Người hướng dẫn: PGS. Đái Thị Xuân Trang
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Hiệu Quả Kháng Oxy Hóa và Bảo Vệ Gan từ Cây Thuộc Họ Cà Phê
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về các dạng oxy hoạt động và chất kháng oxy hóa
• 2.1.1. Các dạng oxy hoạt động
• 2.1.2. Chất kháng oxy hóa
• 2.1.3. Một số phương pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa
• 2.2. Tổng quan về gan
• 2.2.1. Sơ lược cấu trúc và chức năng gan
• 2.2.2. Các thông số chức năng gan
• 2.2.3. Đặc điểm mô học của gan
• 2.3. Nguyên nhân gây tổn thương gan
• 2.3.1. Các chất gây độc gan
• 2.3.2. Stress oxy hóa ảnh hưởng đến chức năng gan
• 2.4. Các dạng tổn thương gan
• 2.4.1. Bệnh gan nhiễm mỡ
• 2.4.2. Bệnh gan mạn tính
• 2.4.3. Xơ hóa gan và xơ gan
• 2.5. Một số loại thuốc bảo vệ gan
• 2.6. Sơ lược về một số loài thực vật thuộc họ Cà phê
• 2.6.1. Sơ lược về cây Mơ lông (Paederia lanuginose Wall.)
• 2.6.2. Sơ lược về cây Mơ leo (Paederia scandens L.)
• 2.6.3. Sơ lược về cây Trang to (Ixora duffii)
• 2.6.4. Sơ lược về cây Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa L.)
• 2.6.5. Sơ lược về cây Lưỡi rắn trắng (Hedyotis diffusa Willd.)
• 2.6.6. Sơ lược về cây Gáo trắng (Neolamarckia cadamba (Roxb.))
• 2.6.7. Sơ lược về cây Gáo vàng (Nauclea orientalis L.)
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phương tiện nghiên cứu
• 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.1.2. Nguyên vật liệu
• 3.1.3. Thiết bị và hóa chất
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Điều tra các loại cây dược liệu được dùng điều trị bệnh gan
• 3.2.2. Thu mẫu và chiết cao một số cây thuộc họ Cà phê
• 3.2.3. Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các cao chiết
• 3.2.4. Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết trên mô hình chuột
• 3.2.5. Thử nghiệm tính an toàn của cao chiết
• 3.2.6. Chiết cao phân đoạn và thử hoạt tính sinh học các cao phân đoạn
• 3.2.7. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ cao phân đoạn có hoạt tính bảo vệ gan hiệu quả nhất
• 3.2.8. Xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Điều tra cây dược liệu được sử dụng điều trị bệnh gan
• 4.2. Hiệu suất ly trích cao một số cây thuộc họ Cà phê
• 4.3. Hiệu quả kháng oxy hóa in vitro của các cao chiết
• 4.3.1. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết
• 4.3.2. Hiệu quả kháng oxy hóa in vitro của các cao chiết
• 4.3.3. Hiệu quả kháng viêm in vitro của các cao chiết
• 4.4. Khả năng bảo vệ gan của các cao chiết
• 4.4.1. Khả năng làm giảm enzyme gan của các cao chiết
• 4.4.2. Khả năng kháng oxy hóa in vivo của các cao chiết trên chuột tổn thương gan bằng CCl4
• 4.4.3. Khả năng bảo vệ mô gan của các cao chiết
• 4.5. Thử nghiệm tính an toàn của cao chiết
• 4.5.1. Thử nghiệm độc tính cấp
• 4.5.2. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn
• 4.6. Chiết cao phân đoạn và thử hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
• 4.6.1. Chiết cao phân đoạn từ cao tổng rễ Gáo vàng
• 4.6.2. Khả năng kháng oxy hóa của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
• 4.6.3. Khả năng bảo vệ gan của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
• 4.7. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất từ cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng
• 4.7.1. Phân lập và tinh chế một số hợp chất từ cao ethyl acetate
• 4.7.2. Biện luận xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
• PHỤ LỤC BẢNG
• PHỤ LỤC PHỔ
• PHỤ LỤC THỐNG KÊ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Về Kháng Oxy Hóa Cây Họ Cà Phê

Họ Cà phê (Rubiaceae) là một họ thực vật lớn, phân bố rộng rãi, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long. Các loài thực vật thuộc họ này được biết đến với hàm lượng lớn các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học, bao gồm iridoid, anthraquinone, triterpene, phenolic và alkaloid. Nhiều loại cây trong họ Cà phê đã được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều bệnh khác nhau. Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ gan của một số cây thuộc họ Cà phê, đánh giá tiềm năng dược lý của chúng. Mục tiêu là xác định các loài cây có triển vọng để phát triển thành các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược liệu hỗ trợ sức khỏe.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Họ Cà Phê Rubiaceae

Họ Cà phê (Rubiaceae) là một trong những họ thực vật lớn nhất, bao gồm nhiều loài cây có giá trị kinh tế và dược liệu. Các loài trong họ này thường chứa các hợp chất polyphenol, flavonoid, và alkaloid, được biết đến với khả năng kháng oxy hóa và các tác dụng sinh học khác. Nghiên cứu về các loài cây thuộc họ Cà phê có thể mở ra những hướng đi mới trong việc tìm kiếm các nguồn dược liệu tự nhiên và phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Kháng Oxy Hóa

Stress oxy hóa là một yếu tố quan trọng trong nhiều bệnh lý, bao gồm các bệnh về gan. Các chất kháng oxy hóa có thể giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do các gốc tự do gây ra. Nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của các loài cây thuộc họ Cà phê có thể cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng bảo vệ gan và các tác dụng có lợi khác cho sức khỏe. Việc xác định các hoạt chất sinh học có trong các loài cây này có thể dẫn đến việc phát triển các phương pháp điều trị mới.

II. Thách Thức Độc Tính Gan và Giải Pháp Từ Cây Họ Cà Phê

Độc tính gan là một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, có thể gây ra nhiều bệnh lý khác nhau, từ viêm gan đến xơ gan và ung thư gan. Các yếu tố gây độc tính gan bao gồm các chất độc từ môi trường, thuốc, rượu và các bệnh nhiễm trùng. Việc tìm kiếm các phương pháp bảo vệ gan hiệu quả là một nhu cầu cấp thiết. Các loài cây thuộc họ Cà phê, với các hoạt chất sinh học tiềm năng, có thể cung cấp một giải pháp tự nhiên để bảo vệ gan khỏi các tác nhân gây hại. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng bảo vệ gan của các loài cây này trên mô hình chuột.

2.1. Các Nguyên Nhân Chính Gây Tổn Thương Gan

Nhiều yếu tố có thể gây tổn thương gan, bao gồm rượu, thuốc, virus (viêm gan B, C), các bệnh tự miễn và các chất độc từ môi trường. Stress oxy hóa cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tổn thương gan. Việc xác định và giảm thiểu các yếu tố nguy cơ này là rất quan trọng để bảo vệ gan và duy trì sức khỏe. Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng của các chất gây độc tính gan giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

2.2. Vai Trò Của Stress Oxy Hóa Trong Bệnh Gan

Stress oxy hóa xảy ra khi có sự mất cân bằng giữa các chất kháng oxy hóa và các gốc tự do trong cơ thể. Stress oxy hóa có thể gây tổn thương tế bào gan, dẫn đến viêm gan, xơ gan và các bệnh lý khác. Các chất kháng oxy hóa có thể giúp bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương do stress oxy hóa gây ra. Nghiên cứu về các chất kháng oxy hóa tự nhiên, như các hợp chất có trong cây họ Cà phê, có thể cung cấp các giải pháp bảo vệ gan hiệu quả.

2.3. Tiềm Năng Của Cây Họ Cà Phê Trong Bảo Vệ Gan

Các loài cây thuộc họ Cà phê chứa nhiều hoạt chất sinh học có khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ gan. Các hợp chất như polyphenol, flavonoid, và alkaloid có thể giúp giảm stress oxy hóa, giảm viêm và bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng bảo vệ gan của các loài cây này trên mô hình chuột, nhằm xác định các loài cây có tiềm năng để phát triển thành các sản phẩm dược liệu hoặc thực phẩm chức năng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đánh Giá Hiệu Quả Cây Họ Cà Phê

Nghiên cứu này sử dụng một loạt các phương pháp in vitro và in vivo để đánh giá khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ gan của các loài cây thuộc họ Cà phê. Các phương pháp in vitro bao gồm đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH, khả năng khử sắt và khả năng ức chế sự biến tính protein. Các phương pháp in vivo bao gồm gây độc tính gan trên chuột bằng carbon tetrachloride (CCl4) và đánh giá các chỉ số sinh hóa và mô học gan. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng dược lý của các loài cây này.

3.1. Phương Pháp In Vitro Đánh Giá Kháng Oxy Hóa

Các phương pháp in vitro được sử dụng để đánh giá khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết từ các loài cây thuộc họ Cà phê. Các phương pháp này bao gồm đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH, khả năng khử sắt và khả năng phosphomolybdenum. Các phương pháp này cho phép đánh giá nhanh chóng và hiệu quả khả năng kháng oxy hóa của các mẫu, cung cấp thông tin ban đầu về tiềm năng dược lý của chúng.

3.2. Mô Hình Chuột Gây Độc Tính Gan Bằng CCl4

Carbon tetrachloride (CCl4) được sử dụng để gây độc tính gan trên chuột. CCl4 là một chất độc gan mạnh, có thể gây ra viêm gan, xơ gan và các bệnh lý khác. Mô hình chuột gây độc tính gan bằng CCl4 được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về bảo vệ gan. Trong nghiên cứu này, mô hình này được sử dụng để đánh giá khả năng bảo vệ gan của các cao chiết từ các loài cây thuộc họ Cà phê.

3.3. Đánh Giá Các Chỉ Số Sinh Hóa và Mô Học Gan

Các chỉ số sinh hóa gan, như ALT, AST, MDA và GSH, được sử dụng để đánh giá mức độ tổn thương gan và hiệu quả bảo vệ gan của các cao chiết. Mô học gan được sử dụng để đánh giá cấu trúc tế bào gan và xác định các dấu hiệu của tổn thương gan, như viêm, xơ hóa và hoại tử. Kết hợp các chỉ số sinh hóa và mô học gan cung cấp một đánh giá toàn diện về hiệu quả bảo vệ gan của các cao chiết.

IV. Kết Quả Hiệu Quả Kháng Oxy Hóa và Bảo Vệ Gan Cây Gáo Vàng

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng (Nauclea orientalis L.) có hiệu quả bảo vệ gan tốt nhất. Cao chiết này có khả năng làm giảm enzyme ALT, AST, điều hòa hàm lượng MDA, GSH trong gan và bảo vệ được mô gan. Thử nghiệm độc tính cấp cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng có liều gây chết trên chuột lớn hơn 5000 mg/kg khối lượng chuột. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng ở liều 400 mg/kg khối lượng trong 90 ngày không thể hiện gây độc trên chuột.

4.1. Cao Chiết Rễ Gáo Vàng Giảm Enzyme Gan và Điều Hòa MDA GSH

Cao chiết rễ Gáo vàng (Nauclea orientalis L.) cho thấy khả năng làm giảm đáng kể nồng độ các enzyme gan ALT và AST, những chỉ số quan trọng cho thấy sự tổn thương gan. Đồng thời, cao chiết này cũng giúp điều hòa hàm lượng MDA (Malondialdehyde), một sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid, và GSH (Glutathione), một chất kháng oxy hóa quan trọng trong gan. Điều này cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng có khả năng bảo vệ gan khỏi stress oxy hóa.

4.2. Thử Nghiệm Độc Tính Cấp và Bán Trường Diễn Cao Gáo Vàng

Thử nghiệm độc tính cấp cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng có liều gây chết (LD50) trên chuột lớn hơn 5000 mg/kg, cho thấy mức độ an toàn tương đối cao. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn, trong đó chuột được cho uống cao chiết rễ Gáo vàng hàng ngày trong 90 ngày, không ghi nhận bất kỳ dấu hiệu độc tính nào, củng cố thêm tính an toàn của cao chiết này khi sử dụng trong thời gian dài.

4.3. Phân Lập và Xác Định Hợp Chất Từ Cao Ethyl Acetate Rễ Gáo Vàng

Phân đoạn ethyl acetate từ cao chiết rễ Gáo vàng được xác định có hoạt tính sinh học tốt nhất và được chọn để phân lập các hợp chất. Kết quả nghiên cứu đã phân lập và xác định được hai hợp chất từ phân đoạn ethyl acetate gồm naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid. Các hợp chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết rễ Gáo vàng.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Tiềm Năng Phát Triển Dược Liệu Từ Cây Cà Phê

Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học về tiềm năng dược lý của các loài cây thuộc họ Cà phê, đặc biệt là cây Gáo vàng, trong việc bảo vệ gan. Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược liệu hỗ trợ sức khỏe gan. Cần có thêm các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và tính an toàn của các sản phẩm này trên người.

5.1. Phát Triển Thực Phẩm Chức Năng Hỗ Trợ Chức Năng Gan

Cao chiết rễ Gáo vàng có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ chức năng gan. Các sản phẩm này có thể giúp bảo vệ gan khỏi các tác nhân gây hại, giảm stress oxy hóa và cải thiện chức năng gan. Cần có các nghiên cứu về công thức và quy trình sản xuất để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm.

5.2. Nghiên Cứu Phát Triển Dược Liệu Điều Trị Bệnh Gan

Các hợp chất phân lập từ cao chiết rễ Gáo vàng, như naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid, có thể là các ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển các dược liệu điều trị bệnh gan. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng và độc tính của các hợp chất này để đánh giá tiềm năng dược lý của chúng.

5.3. Khuyến Nghị Nghiên Cứu Lâm Sàng Đánh Giá Hiệu Quả Trên Người

Để xác nhận hiệu quả và tính an toàn của các sản phẩm từ cây Gáo vàng trên người, cần có các nghiên cứu lâm sàng. Các nghiên cứu này nên được thiết kế cẩn thận để đánh giá các chỉ số sinh hóa gan, mô học gan và các tác dụng phụ có thể xảy ra. Kết quả của các nghiên cứu lâm sàng sẽ cung cấp bằng chứng khoa học vững chắc để hỗ trợ việc sử dụng các sản phẩm này trong thực tế.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Bảo Vệ Gan Từ Thiên Nhiên

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng kháng oxy hóa và bảo vệ gan của một số loài cây thuộc họ Cà phê, đặc biệt là cây Gáo vàng. Kết quả nghiên cứu mở ra những hướng đi mới trong việc tìm kiếm các giải pháp tự nhiên để bảo vệ gan và cải thiện sức khỏe. Cần có thêm các nghiên cứu về cơ chế tác dụng, độc tính và hiệu quả lâm sàng của các loài cây này để khai thác tối đa tiềm năng dược lý của chúng.

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Chính Về Hiệu Quả Bảo Vệ Gan

Nghiên cứu đã xác định được cao chiết rễ Gáo vàng có hiệu quả bảo vệ gan tốt nhất, thể hiện qua khả năng giảm enzyme gan, điều hòa các chất kháng oxy hóa và bảo vệ mô gan. Các thử nghiệm độc tính cho thấy cao chiết này có mức độ an toàn cao. Các hợp chất naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid đã được phân lập từ cao chiết rễ Gáo vàng và có thể đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả bảo vệ gan.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Cơ Chế Tác Dụng

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của các hợp chất có trong cao chiết rễ Gáo vàng. Điều này có thể bao gồm các nghiên cứu về tác động của các hợp chất này lên các con đường tín hiệu tế bào, các enzyme liên quan đến stress oxy hóa và các quá trình viêm. Hiểu rõ cơ chế tác dụng sẽ giúp tối ưu hóa việc sử dụng các hợp chất này trong việc bảo vệ gan.

6.3. Đánh Giá Tiềm Năng Kết Hợp Với Các Phương Pháp Điều Trị Khác

Cần có các nghiên cứu đánh giá tiềm năng kết hợp cao chiết rễ Gáo vàng với các phương pháp điều trị bệnh gan khác. Việc kết hợp các phương pháp điều trị có thể mang lại hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng một phương pháp duy nhất. Các nghiên cứu này nên được thực hiện trên mô hình in vitro, in vivo và lâm sàng để đánh giá hiệu quả và tính an toàn của việc kết hợp.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tổn thương gan và suy giảm chức năng gan là các vấn đề bệnh lý phổ biến, khởi phát từ tình trạng stress oxy hóa khi các gốc tự do (ROS) tấn công và làm biến đổi các đại phân tử sinh học màng tế bào. Quá trình peroxide hóa lipid làm phá hủy cấu trúc màng tế bào gan, dẫn đến sự suy giảm hệ thống kháng oxy hóa nội sinh và gây hoại tử mô gan. Diễn tiến bệnh lý gan thường kéo dài từ gan nhiễm mỡ, viêm gan, xơ hóa và tiến triển thành xơ gan. Mặc dù y học hiện đại đã đạt được nhiều thành tựu, các loại thuốc điều trị và bảo vệ tế bào gan có nguồn gốc từ thiên nhiên vẫn còn hạn chế về số lượng và chủng loại. Thực vật thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) phân bố phong phú tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, chứa nhiều nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học như iridoid, anthraquinone, triterpene, phenolic và alkaloid, từ lâu đã được nhân dân sử dụng trong các bài thuốc dân gian. Tuy nhiên, việc đánh giá khoa học một cách toàn diện và có hệ thống về hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ gan của các loài thực vật này từ mức độ in vitro đến in vivo vẫn còn là một khoảng trống nghiên cứu cần được giải quyết.

Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sinh học của nghiên cứu sinh Phan Kim Định (Trường Đại học Cần Thơ, 2021), dưới sự hướng dẫn của PGS. Đái Thị Xuân Trang và PGS. Nguyễn Trọng Tuân, được thực hiện nhằm khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan của một số loài thực vật thuộc họ Cà phê trên mô hình chuột. Mục tiêu trọng tâm là sàng lọc, tuyển chọn loài, bộ phận cây và phân đoạn dịch chiết có hoạt tính sinh học tốt nhất, từ đó phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tiềm năng, cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển nguồn dược liệu mới phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh gan.

Luận án xác định 7 nội dung nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản:

1. Điều tra cây dược liệu được sử dụng điều trị bệnh gan;
2. Thu mẫu và chiết cao một số cây thuộc họ Cà phê;
3. Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết;
4. Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của các cao chiết;
5. Thử nghiệm tính an toàn của các cao chiết;
6. Chiết cao phân đoạn và thử hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn;
7. Phân lập chất từ phân đoạn có hoạt tính sinh học.

• Đối tượng nghiên cứu: 7 loài thực vật thuộc họ Cà phê gồm Trang to (Ixora duffii), Mơ lông (Paederia lanuginosa Wall.), Mơ leo (Paederia scandens L.), Gáo trắng (Neolamarckia cadamba (Roxb.) Bosser), Gáo vàng (Nauclea orientalis L.), Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa L.) và Lưỡi rắn trắng (Hedyotis diffusa Willd.); đối tượng động vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng Mus musculus giống đực, khỏe mạnh, khối lượng 20-30 g.
• Phạm vi không gian: Khảo sát tri thức y học dân gian tại các cơ sở y học cổ truyền thuộc 3 tỉnh Kiên Giang, An Giang và Vĩnh Long; thu thập mẫu thực vật tại tỉnh Vĩnh Long và Hậu Giang; thực hiện các thử nghiệm in vitro, in vivo, độc tính và hóa thực vật tại Trường Đại học Cần Thơ và Phòng xét nghiệm 144 (Cần Thơ).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai thực hiện trong giai đoạn từ tháng 06/2015 đến tháng 12/2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu về các nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học và các loài thảo dược có tác dụng bảo vệ gan trên thế giới và tại Việt Nam:

• Các nghiên cứu về thảo dược bảo vệ gan điển hình gồm: Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri) chứa phyllanthin có tác dụng dọn gốc tự do, bảo vệ tế bào gan chống lại tác hại của $CCl_4$ và galactosamine (De Araújo Júnior et al.; Chatterjee and Sil, 2007; Meselhy et al.); Dành dành (Gardenia jasminoides) với hai hoạt chất chính là genipin và crocin có khả năng kháng viêm, kháng oxy hóa (Chen et al.; Xiao et al.); Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum Jack.) chứa (+)-catechin và acid protocatechuic có khả năng kích hoạt yếu tố phiên mã Nrf2 giúp bảo vệ mô gan và thận chuột (Mai Nguyễn Ngọc Trác, 2020); Đan sâm (Salvia miltiorrhiza) chứa acid salvianolic B giúp giảm men gan aminotransferase và ức chế quá trình apoptosis tế bào gan (Chen et al.; Hong et al.); Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis) với baicalein, baicalin và wogonin (Talbi et al.; Wan et al., 2008; Lee and Park, 2015); Cam thảo (Glycyrrhiza glabra) chứa glycyrrhizin chống sinh sợi mô gan (Al-Razzuqi et al.; Shirani et al.); Chùm ngây (Moringa oleifera) chứa $\beta$-sitosterol, quercetin, kaempferol (Singh et al.); Cà gai leo (Solanum procumbens Lour) chứa solaprocumosides và solacanin A (Truong et al.; Nguyen et al.); và cây Kế sữa (Silybum marianum L.) với phức hợp flavonolignan silymarin (silybin, silydianin, silychristin) được sử dụng phổ biến làm chất đối chứng bảo vệ gan (Shaarawy et al.; Rasool et al.; Pradhan and Girish, 2006).
• Các nghiên cứu về các loài thuộc họ Cà phê (Rubiaceae):
  • Cây Mơ lông (Paederia lanuginosa Wall.) và Mơ leo (Paederia scandens L.): Ghi nhận các hợp chất iridoid glucoside, paederoside, phenylpropanoid và flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, bảo vệ gan và thận (Huỳnh Kim Diệu, 2010; Miyanaga et al., 2011; Nguyễn Thị Ngọc Ánh, 2015; Đặng Ngọc Quang và Nguyễn Xuân Dũng, 2006; Đặng Ngọc Quang và Lê Huy Nguyên, 2009; Hideaki, 2002; Kim et al., 2004; Zou et al., 2006; He et al., 2010; Wu et al., 2013; Peng et al., 2015; Xiao et al., 2018).
  • Chi Ixora (Trang to và Trang son): Được chứng minh có khả năng trung hòa gốc tự do, kháng viêm và bảo vệ gan trên mô hình động vật (Baliga and Kurian, 2012; Latha and Panikkar, 2001; Ratnasooriya et al., 2005; Saha et al., 2008; Shyamal et al.).
  • Cây Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa L.) và Lưỡi rắn trắng (Hedyotis diffusa Willd.): Chứa nhiều alkaloid, flavonoid, polysaccharide và triterpene có hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế phản ứng viêm và kháng tế bào ung thư (Sasikumar et al., 2010; Lin et al., 2002, 2018; Chimkode et al., 2009; Rajagopal et al., 2018; Chen et al., 2016; Li et al., 2019; Du et al.).
  • Cây Gáo trắng (Neolamarckia cadamba) và Gáo vàng (Nauclea orientalis L.): Các nghiên cứu trên thế giới đã phân lập được các alkaloid indole (naucleficine, cadambine, strictosamide), saponin triterpene (dẫn xuất acid quinovic) và phenolic có hoạt tính kháng viêm, ức chế enzyme COX-2 và độc tế bào (Ganjewala et al.; Dwevedi et al., 2015; Chandel et al., 2016; Yuan et al., 2020; Erdelmeier et al., 1992; Sichaem et al., 2010; Tao et al., 2012; Phan et al., 2015; Liu et al., 2018). Tại Việt Nam, nghiên cứu về Gáo vàng chủ yếu mới khảo sát sơ bộ khả năng kháng oxy hóa hoặc thành phần gỗ (Phan Thị Anh Đào và Võ Thị Ngà, 2015; Võ Văn Lẹo, 2016).

Vị trí của luận án: Luận án giải quyết khoảng trống về sự thiếu hụt các dữ liệu thực nghiệm so sánh đồng thời hoạt tính sinh học giữa các loài và các bộ phận khác nhau trong cùng họ Cà phê phân bố tại Việt Nam. Công trình xây dựng một quy trình sàng lọc khép kín từ điều tra tri thức bản địa, định lượng hoạt chất tổng, đánh giá đa cơ chế kháng oxy hóa và kháng viêm in vitro, kiểm chứng hiệu quả phục hồi tổn thương gan in vivo trên mô hình chuột nhiễm độc $CCl_4$, thử nghiệm độc tính an toàn (cấp tính và bán trường diễn), cho đến phân đoạn dịch chiết và phân lập hoạt chất tinh khiết bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hiện đại.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Khung phân tích bệnh sinh tổn thương gan: Dựa trên cơ chế stress oxy hóa và phản ứng viêm. Carbon tetrachloride ($CCl_4$) khi vào cơ thể được chuyển hóa bởi hệ enzyme cytochrome P450 (chủ yếu là CYP2E1) tại lưới nội chất tế bào gan thành các gốc tự do trichloromethyl ($CCl_3^\bullet$) và trichloromethyl peroxyl ($Cl_3COO^\bullet$). Các gốc này tấn công acid béo chưa no của màng tế bào, kích hoạt phản ứng dây chuyền peroxide hóa lipid, tạo ra malonyl dialdehyde (MDA) làm rò rỉ màng tế bào, giải phóng các enzyme nội bào alanine transaminase (ALT) và aspartate transaminase (AST) vào huyết thanh, đồng thời làm cạn kiệt nguồn glutathione (GSH) nội sinh và phá hủy cấu trúc tiểu thùy gan.
• Khung đánh giá chất kháng oxy hóa và bảo vệ gan: Chất kháng oxy hóa ngoại sinh từ thực vật cung cấp nguyên tử hydro ($H^+$) hoặc electron ($e^-$) để trung hòa gốc tự do, bẻ gãy chuỗi peroxide hóa lipid, phục hồi hàm lượng GSH, hạ thấp mức MDA mô gan, giảm nồng độ men gan ALT/AST và bảo vệ toàn vẹn cấu trúc vi thể mô gan.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp điều tra: Phỏng vấn người dân và lương y tại 3 cơ sở y học cổ truyền: Hội Đông y Thị xã Bình Minh (Vĩnh Long), Đền thờ Nguyễn Trung Trực (Rạch Giá, Kiên Giang) và Chùa Tịnh Độ (Tri Tôn, An Giang) để thu thập danh mục các cây thuốc điều trị bệnh gan.
• Phương pháp thu mẫu và chiết xuất: Mẫu thực vật được thu hái tại Vĩnh Long và Hậu Giang, định danh thực vật học bởi chuyên gia Trường Đại học Cần Thơ dựa theo tài liệu của Phạm Hoàng Hộ (2003) và lưu trữ mã số tiêu bản (Trang to: VL_Idu201506010003; Mơ lông: VL_Pla201506010001; Mơ leo: VL_Psc201506010002; Gáo trắng: VL_Nca201507010007; Gáo vàng: HG_Nor201507010007; Lưỡi rắn: VL_Hco201506010004; Lưỡi rắn trắng: VL_Hdi201506010005). Các bộ phận thực vật được sấy khô, xay nhỏ, chiết ngâm dầm với methanol và cô quay đuổi dung môi thu 12 cao methanol tổng.
• Phương pháp định lượng sơ bộ và thử nghiệm in vitro:
  • Định lượng polyphenol tổng (thuốc thử Folin-Ciocalteu, chuẩn gallic acid), flavonoid tổng ($AlCl_3$, chuẩn quercetin), alkaloid tổng (phản ứng với bromocresol green, chuẩn atropine sulfate).
  • Đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH (đo quang 517 nm, xác định giá trị $EC_{50}$).
  • Đánh giá khả năng khử sắt (Reducing power - RP, đo quang 700 nm, chuẩn BHA).
  • Đánh giá khả năng kháng oxy hóa tổng số bằng phương pháp phosphomolybdenum (chuẩn Trolox).
  • Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro qua thử nghiệm ức chế sự biến tính protein huyết thanh bò (BSA, chuẩn diclofenac natri).
• Phương pháp khảo sát in vivo trên mô hình chuột:
  • Chuột Mus musculus (20-30 g) được chia lô thí nghiệm, gây nhiễm độc gan bằng $CCl_4$ (pha trong dầu olive), cho uống cao chiết thử nghiệm liên tục trong 7 ngày; sử dụng silymarin làm thuốc đối chứng dương.
  • Xét nghiệm sinh hóa huyết thanh: Đo hoạt độ enzyme ALT và AST bằng máy đo chuyên dụng tại Phòng xét nghiệm 144 Cần Thơ.
  • Xét nghiệm sinh hóa mô gan: Định lượng hàm lượng MDA qua phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) đo quang ở bước sóng 532 nm (chuẩn 1,1,3,3-tetramethoxypropane); định lượng hàm lượng GSH bằng phương pháp Ellman đo quang ở bước sóng 412 nm (chuẩn glutathione khử).
  • Đánh giá mô bệnh học: Gan chuột được cố định bằng formol 10%, đúc khối parafin, cắt lát mỏng vi phẫu, nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E), quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học để đánh giá mức độ thoái hóa mỡ, hoại tử tế bào gan và tổn thương xoang gan.
• Phương pháp thử nghiệm tính an toàn sinh học:
  • Độc tính cấp: Thực hiện theo hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD 423), xác định giá trị $LD_{50}$ ở các mức liều giới hạn 2000 mg/kg và 5000 mg/kg khối lượng chuột.
  • Độc tính bán trường diễn: Cho chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng ở liều 400 mg/kg khối lượng cơ thể mỗi ngày liên tục trong 90 ngày; theo dõi khối lượng cơ thể, các chỉ số huyết học, các chỉ số sinh hóa chức năng gan, thận và vi phẫu mô học các cơ quan nội tạng.
• Phương pháp chiết phân đoạn và phân lập hợp chất:
  • Chiết phân đoạn cao methanol tổng rễ Gáo vàng bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexane và ethyl acetate.
  • Sắc ký cột nhanh pha thường (Dry column flash chromatography) và sắc ký cột cổ điển pha thường với chất hấp phụ silica gel 60.
  • Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM).
  • Xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT), 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC) và phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS), đối chiếu dữ liệu phổ với các tài liệu chuẩn.
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được tính toán giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn, phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phép kiểm định Duncan hoặc Tukey ở mức ý nghĩa thống kê $p < 0,05$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này phân tích tổng quan vai trò sinh học của gan và các tác nhân gây tổn hại chức năng gan từ môi trường, thuốc, hóa chất và rượu bia thông qua cơ chế stress oxy hóa. Đặt ra tính cấp thiết của việc khai thác nguồn tài nguyên thực vật họ Cà phê (Rubiaceae) tại Đồng bằng sông Cửu Long nhằm tìm kiếm các hoạt chất kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào gan. Xác định rõ mục tiêu, 7 nội dung nghiên cứu cụ thể, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Nội dung chương 2 bao gồm 6 phần chính:

1. Tổng quan về các dạng oxy hoạt động và chất kháng oxy hóa: Trình bày chi tiết cơ chế phát sinh gốc tự do (ROS) nội sinh từ ty thể, lưới nội chất; tác hại của ROS đối với màng lipid, protein, DNA; phân loại chất kháng oxy hóa nội sinh (SOD, CAT, GPx, GSH) và ngoại sinh (tự nhiên: flavonoid, polyphenol, vitamin; tổng hợp: BHA, BHT); các phương pháp hóa học đánh giá khả năng kháng oxy hóa in vitro (DPPH, khử sắt, phosphomolybdenum, dọn gốc superoxide, phản ứng $H_2O_2$).
2. Tổng quan về gan: Trình bày giải phẫu và cấu trúc mô học tiểu thùy gan, bộ ba khoảng cửa, tế bào nhu mô gan, tế bào Kupffer, tế bào sao, khoảng Disse; các chỉ số sinh hóa chức năng gan (ALT, AST, ALP, Bilirubin, GGT, Protein tổng số, Albumin) và các chỉ số oxy hóa mô gan (GSH, SOD, CAT, MDA).
3. Nguyên nhân gây tổn thương gan: Phân tích cơ chế bệnh sinh của các chất gây độc gan thực nghiệm ($CCl_4$, paracetamol); stress oxy hóa do rượu qua hệ thống ADH và MEOS (CYP2E1); stress oxy hóa do thuốc và độc chất môi trường (kim loại nặng chì, thủy ngân, độc tố microcystin).
4. Các dạng tổn thương gan: Tiến trình bệnh học từ gan nhiễm mỡ, bệnh gan mạn tính, phản ứng của tế bào sao tăng sinh lắng đọng chất nền ngoại bào (ECM, collagen type I, III) dẫn đến xơ hóa gan và xơ gan.
5. Một số loại thuốc bảo vệ gan: Tổng quan các chế phẩm bảo vệ gan có nguồn gốc thảo dược (silymarin/Legalon, Dihacharin, Hana, Boganic, Liv 52).
6. Sơ lược về một số loài thực vật thuộc họ Cà phê: Tổng hợp đặc điểm thực vật học, công dụng dân gian, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đã công bố của 7 loài nghiên cứu: Mơ lông, Mơ leo, Trang to, Lưỡi rắn, Lưỡi rắn trắng, Gáo trắng và Gáo vàng.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết phương tiện nghiên cứu, thời gian (06/2015 - 12/2020), địa điểm (Trường Đại học Cần Thơ, Phòng xét nghiệm 144, các cơ sở y học cổ truyền tại Vĩnh Long, Kiên Giang, An Giang); nguyên vật liệu (mã số mẫu thực vật lưu trữ, nguồn chuột thí nghiệm từ Viện Pasteur TP.HCM); hóa chất và trang thiết bị. Thiết lập đầy đủ quy trình thực nghiệm cho 7 nội dung nghiên cứu: điều tra thực vật học dân tộc; chiết cao tổng; định lượng polyphenol, flavonoid, alkaloid tổng; các thử nghiệm in vitro (DPPH, RP, TAC, BSA); mô hình tổn thương gan cấp bằng $CCl_4$ trên chuột; phương pháp xét nghiệm men gan ALT/AST, hàm lượng MDA và GSH mô gan; kỹ thuật làm tiêu bản mô học nhuộm H&E; quy trình thử độc tính cấp ($LD_{50}$) và độc tính bán trường diễn (90 ngày); quy trình chiết phân đoạn, sắc ký cột tinh chế và các kỹ thuật đo phổ 1D/2D-NMR, ESI-MS để xác định cấu trúc hóa học.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo tiến trình nghiên cứu:

[Khảo sát thực vật học dân gian: 50 loài/22 họ]
[Thu mẫu & chiết 12 cao methanol từ 7 loài họ Cà phê]
[Sàng lọc in vitro: polyphenol, flavonoid, alkaloid, DPPH, RP, TAC, BSA]
[Thử nghiệm in vivo trên chuột nhiễm độc CCl4: ALT, AST, MDA, GSH, mô học]
[Đánh giá an toàn sinh học: Độc cấp (LD50 > 5000 mg/kg) & Bán trường diễn (90 ngày, 400 mg/kg)]
[Chiết phân đoạn rễ Gáo vàng (n-hexan, ethyl acetate, nước) & Thử hoạt tính]
[Sắc ký cột phân lập & Biện luận cấu trúc: Naucleficine (NO01) và 3-O-rhamnoside quinovic acid (NO02)]

Tổng hợp kết quả chi tiết từng nội dung:

• Kết quả điều tra và ly trích: Thu thập thông tin 50 loài cây thuốc điều trị bệnh gan thuộc 22 họ thực vật tại 3 tỉnh ĐBSCL; họ Cà phê có số lượng loài được sử dụng nhiều nhất. Thực hiện chiết xuất thu được 12 loại cao methanol tổng từ 7 loài đã chọn.
• Kết quả sàng lọc in vitro: Đánh giá hàm lượng polyphenol, flavonoid, alkaloid tổng cùng các chỉ số kháng oxy hóa ($EC_{50}$ DPPH, khử sắt, phosphomolybdenum) và kháng viêm (ức chế biến tính protein BSA). Tuyển chọn được 9 cao chiết có hàm lượng hoạt chất và hoạt tính sinh học cao: lá Trang to, lá Mơ lông, lá Mơ leo, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng, rễ Gáo trắng, lá Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng và rễ Gáo vàng.
• Kết quả bảo vệ gan in vivo trên mô hình chuột nhiễm độc $CCl_4$: Trong 9 cao chiết thử nghiệm, có 6 cao chiết (gồm toàn bộ các bộ phận lá, vỏ thân, rễ của cây Gáo trắng và cây Gáo vàng) thể hiện khả năng làm giảm hoạt độ enzyme ALT và AST huyết thanh rõ rệt, ức chế tạo thành MDA và phục hồi lượng GSH nội sinh trong gan chuột. Kết hợp với hình ảnh vi phẫu mô bệnh học gan nhuộm H&E, rễ Gáo vàng được xác định là mẫu có hiệu quả bảo vệ gan và phục hồi cấu trúc mô học tế bào gan tốt nhất.

TT	Loài thực vật	Bộ phận thu mẫu	Kháng oxy hóa, kháng viêm in vitro	Khả năng bảo vệ gan in vivo ($CCl_4$)
1	Trang to (Ixora duffii)	Lá, Hoa	Lá đạt hoạt tính tốt	Hoạt tính trung bình
2	Mơ lông (Paederia lanuginosa)	Lá	Đạt hoạt tính tốt	Hoạt tính trung bình
3	Mơ leo (Paederia scandens)	Lá	Đạt hoạt tính tốt	Hoạt tính trung bình
4	Gáo trắng (Neolamarckia cadamba)	Lá, Vỏ thân, Rễ	Cả 3 bộ phận đều đạt cao	Giảm ALT/AST, MDA; tăng GSH
5	Gáo vàng (Nauclea orientalis)	Lá, Vỏ thân, Rễ	Cả 3 bộ phận đều đạt cao	Giảm ALT/AST, MDA; tăng GSH (Rễ tốt nhất)
6	Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa)	Cả cây	Hoạt tính thấp hơn	Không chọn thử in vivo
7	Lưỡi rắn trắng (Hedyotis diffusa)	Cả cây	Hoạt tính thấp hơn	Không chọn thử in vivo

• Kết quả thử nghiệm tính an toàn: Các cao chiết từ lá, vỏ thân và rễ cây Gáo vàng có giá trị $LD_{50}$ đường uống trên chuột lớn hơn 5000 mg/kg khối lượng cơ thể (không ghi nhận chuột chết ở liều thử nghiệm cao nhất). Thử nghiệm độc tính bán trường diễn khi cho chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng ở liều 400 mg/kg/ngày liên tục suốt 90 ngày cho thấy các chỉ số huyết học, sinh hóa chức năng gan, thận và hình ảnh vi phẫu cấu trúc các cơ quan nội tạng không có sự sai khác mang ý nghĩa bệnh lý so với lô đối chứng sinh lý.
• Kết quả chiết phân đoạn và thử hoạt tính sinh học: Phân đoạn ethyl acetate từ cao rễ Gáo vàng thể hiện hàm lượng polyphenol, flavonoid cao nhất, hoạt tính dọn gốc tự do DPPH, khử sắt, phosphomolybdenum và ức chế biến tính protein BSA tốt nhất, đồng thời có hiệu quả phục hồi tổn thương gan trên chuột vượt trội so với phân đoạn $n$-hexane và phân đoạn nước.
• Kết quả phân lập và biện luận cấu trúc hóa học: Từ phân đoạn ethyl acetate của rễ Gáo vàng, bằng các kỹ thuật sắc ký cột silica gel kết hợp phân tích dữ liệu phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC và ESI-MS, đã phân lập và xác định cấu trúc 2 hợp chất tinh khiết:
  • Hợp chất NO01: Xác định là naucleficine (khung indole alkaloid).
  • Hợp chất NO02: Xác định là 3-O-rhamnoside quinovic acid (khung triterpenoid saponin).

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các kết luận khoa học cốt lõi của toàn bộ luận án, khẳng định giá trị dược liệu của rễ Gáo vàng và 2 hợp chất phân lập được. Đồng thời, nêu các kiến nghị định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế tác động chuyên sâu và ứng dụng thực tiễn.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm toàn diện, có hệ thống về thành phần hóa thực vật sơ bộ (polyphenol, flavonoid, alkaloid) và hoạt tính sinh học in vitro (kháng oxy hóa theo nhiều cơ chế, ức chế biến tính protein kháng viêm) của 12 dịch chiết từ 7 loài thực vật thuộc họ Cà phê phân bố tại Đồng bằng sông Cửu Long.
2. Chứng minh trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) rằng các cao chiết từ cây Gáo trắng và Gáo vàng, đặc biệt là cao chiết rễ Gáo vàng (Nauclea orientalis L.), có hiệu quả bảo vệ tế bào gan chống lại tổn thương do $CCl_4$ thông qua cơ chế hạ men gan ALT, AST, ức chế sự peroxide hóa lipid (giảm MDA) và bảo tồn/gia tăng hàm lượng chất kháng oxy hóa nội sinh (GSH) trong mô gan, đồng thời bảo vệ toàn vẹn cấu trúc vi thể mô học gan.
3. Xác định phân đoạn ethyl acetate từ rễ Gáo vàng là phân đoạn tập trung hoạt tính sinh học cao nhất và lần đầu tiên phân lập, biện luận cấu trúc thành công 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn này gồm naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

1. Khoa học hóa và xác thực kinh nghiệm sử dụng các bài thuốc dân gian điều trị bệnh gan tại các cơ sở y học cổ truyền thuộc các tỉnh Kiên Giang, An Giang và Vĩnh Long.
2. Xác định tính an toàn sinh học của cao chiết rễ Gáo vàng qua các thử nghiệm độc tính cấp ($LD_{50} > 5000\text{ mg/kg}$) và độc tính bán trường diễn (liều 400 mg/kg trong 90 ngày không gây biến đổi bệnh lý), tạo tiền đề an toàn cho việc ứng dụng trên cơ thể sống.
3. Đề xuất quy trình chiết xuất, phân đoạn làm giàu hoạt chất và mở ra hướng phát triển các chế phẩm hỗ trợ bảo vệ gan, phòng ngừa các bệnh lý tổn thương gan do stress oxy hóa từ nguồn nguyên liệu rễ cây Gáo vàng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:

  • Mô hình gây tổn thương gan trên động vật trong luận án mới tập trung vào mô hình tổn thương gan cấp tính bằng hóa chất $CCl_4$; chưa khảo sát trên các mô hình bệnh lý mạn tính khác như viêm gan do rượu kéo dài, gan nhiễm mỡ không do rượu hoặc xơ gan tiến triển dài ngày.
  • Số lượng hợp chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng mới dừng lại ở 2 hợp chất chính (naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid); chưa tiến hành phân lập vét cạn toàn bộ các phân đoạn còn lại.
  • Hoạt tính bảo vệ gan và kháng oxy hóa trực tiếp của từng hợp chất đơn lẻ tinh khiết sau phân lập chưa được thử nghiệm độc lập trên mô hình tế bào và mô hình động vật.

• Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

  • Tiếp tục chiết tách, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc các hợp chất thứ cấp khác hiện diện trong phân đoạn ethyl acetate và các phân đoạn dung môi khác của rễ cây Gáo vàng.
  • Khảo sát hoạt tính sinh học và cơ chế phân tử trực tiếp của hai hợp chất tinh khiết naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid trên các dòng tế bào gan người (như HepG2) và trên mô hình động vật.
  • Nghiên cứu sâu hơn về các con đường truyền tín hiệu nội bào liên quan đến khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm (như con đường Nrf2/ARE, NF-$\kappa\text{B}$, COX-2).
  • Nghiên cứu công nghệ bào chế, tiêu chuẩn hóa cao định chuẩn và xây dựng quy trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe hoặc dược phẩm từ rễ cây Gáo vàng.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo đối với nhiều đối tượng chuyên môn:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Công nghệ sinh học, Dược học, Hóa hợp chất thiên nhiên và Y học cổ truyền: Luận án cung cấp một khung phương pháp luận nghiên cứu mẫu mực, kết hợp chặt chẽ giữa điều tra dân tộc thực vật học (ethnopharmacology), sàng lọc hóa thực vật, thử nghiệm sinh học đa tầng (in vitro - in vivo), đánh giá độc tính an toàn theo chuẩn quốc tế (OECD) và kỹ thuật phân lập, xác định cấu trúc hợp chất bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR hiện đại.
• Giảng viên và các nhà nghiên cứu: Có thể sử dụng các số liệu thực nghiệm trong luận án làm tài liệu giảng dạy chuyên đề về độc chất học thực nghiệm, mô hình bệnh lý động vật, hóa học các hợp chất thiên nhiên từ thực vật họ Cà phê và cơ chế chống stress oxy hóa.
• Các nhà sản xuất dược phẩm và cơ sở khám chữa bệnh y học cổ truyền: Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy về 50 loài cây thuốc trị bệnh gan tại Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là nguồn nguyên liệu tiềm năng từ cây Gáo vàng (Nauclea orientalis L.), hỗ trợ công tác phát triển sản phẩm thuốc dược liệu và thực phẩm chức năng bảo vệ tế bào gan.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã khảo sát bao nhiêu loài cây thuộc họ Cà phê và những bộ phận nào được thu mẫu nghiên cứu?
Luận án đã thu mẫu và nghiên cứu 7 loài thực vật thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) với 12 mẫu bộ phận khác nhau gồm: Trang to (lá, hoa), Mơ lông (lá), Mơ leo (lá), Gáo trắng (lá, vỏ thân, rễ), Gáo vàng (lá, vỏ thân, rễ), Lưỡi rắn (toàn cây) và Lưỡi rắn trắng (toàn cây).

2. Trong số các mẫu thực vật được khảo sát, loại cao chiết nào thể hiện hiệu quả bảo vệ gan và kháng oxy hóa tốt nhất?
Cao chiết methanol rễ cây Gáo vàng (Nauclea orientalis L.) và phân đoạn ethyl acetate từ rễ Gáo vàng thể hiện hiệu quả tốt nhất. Mẫu này làm giảm hoạt độ men gan ALT, AST huyết thanh rõ rệt, hạ thấp mức MDA, khôi phục hàm lượng GSH nội sinh trong gan chuột nhiễm độc $CCl_4$ và bảo vệ nguyên vẹn cấu trúc vi thể mô gan.

3. Các chỉ số sinh hóa và tiêu chí mô bệnh học nào được sử dụng để đánh giá hiệu quả bảo vệ gan trên chuột?
Nghiên cứu sử dụng các chỉ số: hoạt độ enzyme transaminase trong huyết thanh (ALT, AST); nồng độ sản phẩm peroxide hóa lipid malonyl dialdehyde (MDA) và hàm lượng chất kháng oxy hóa khử glutathione (GSH) trong mô gan; kết hợp quan sát lát cắt mô học nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) để đánh giá mức độ thoái hóa mỡ, hoại tử tế bào và giãn xoang gan.

4. Tính an toàn của cao chiết rễ Gáo vàng được xác định qua các thử nghiệm nào và cho kết quả ra sao?
Cao chiết rễ Gáo vàng đã qua thử nghiệm độc tính cấp trên chuột với giá trị $LD_{50} > 5000\text{ mg/kg}$ khối lượng cơ thể (không gây chết chuột ở liều tối đa). Trong thử nghiệm độc tính bán trường diễn với liều 400 mg/kg khối lượng cơ thể cho uống liên tục suốt 90 ngày, chuột hoàn toàn bình thường về thể trạng, không có sự sai khác bệnh lý về các chỉ số huyết học, sinh hóa chức năng gan, thận và vi phẫu mô học nội tạng.

5. Những hợp chất nào đã được phân lập và xác định cấu trúc từ phân đoạn có hoạt tính cao nhất của rễ Gáo vàng?
Từ phân đoạn ethyl acetate của rễ Gáo vàng, luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất tinh khiết gồm hợp chất NO01 là naucleficine (alkaloid phân nhóm indole) và hợp chất NO02 là 3-O-rhamnoside quinovic acid (saponin phân nhóm triterpenoid).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Phan Kim Định đã thực hiện một nghiên cứu thực nghiệm toàn diện, có hệ thống về thành phần hóa thực vật, khả năng kháng oxy hóa và hiệu quả bảo vệ gan của các loài thực vật thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) tại Đồng bằng sông Cửu Long. Công trình đã khẳng định giá trị dược lý vượt trội của cao chiết rễ cây Gáo vàng (Nauclea orientalis L.) và phân đoạn ethyl acetate trong việc hạ men gan ALT, AST, giảm stress oxy hóa màng lipid và phục hồi tổn thương mô gan chuột do $CCl_4$, đồng thời xác nhận tính an toàn sinh học qua các thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn. Việc phân lập và xác định thành công cấu trúc của naucleficine và 3-O-rhamnoside quinovic acid đã đóng góp những dữ liệu khoa học quan trọng, mở ra tiềm năng ứng dụng rễ Gáo vàng trong nghiên cứu và phát triển các sản phẩm dược liệu hỗ trợ điều trị bệnh gan.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: GIỚI THIỆU Gan là một trong những cơ quan lớn nhất trong cơ thể con người, giữ vai trò quan trọng trong sự trao đổi chất và bài tiết (Ahsan et al. Trong quá trình thực hiện chức năng giải độc cơ thể và bài tiết các chất nội sinh và ngoại sinh, gan là cơ quan bị tấn công đầu tiên và liên tục bởi các chất độc hại, kết quả gan bị tổn thương và rối loạn chức năng (Bodakhe and Ram, 2007). Tổn thương gan hoặc suy giảm chức năng của gan dẫn đến nhiều ảnh hưởng xấu đối với sức khoẻ của cơ thể (Subramaniam et al. Các nguyên nhân chủ yếu gây tổn thương gan có thể là do các hóa chất độc trong môi trường, các loại thuốc sử dụng liều cao kéo dài, uống rượu quá mức, các bệnh nhiễm trùng và rối loạn tự miễn.

Hầu hết các tác nhân này gây ra stress oxy hóa, sinh ra nhiều gốc tự do trong gan tấn công vào các đại phân tử sinh học gây tổn hại tế bào gan. Các hóa chất gây độc cho gan chủ yếu bằng cách gây ra sự peroxide hóa lipid trong tế bào gan và các tổn thương oxy hóa khác (Abou Sief, 2016). Sự tiến triển phổ biến của bệnh gan thường khởi phát từ gan nhiễm mỡ đến viêm gan và cuối cùng là sự xơ hóa và xơ gan. Nếu không được điều trị, xơ hóa có thể tiến triển thành xơ gan, cuối cùng dẫn đến suy gan và tử vong.

Các bệnh về gan là một trong những vấn đề sức khỏe nghiêm trọng nhất trên thế giới ngày nay. Mặc dù có những tiến bộ lớn trong y học hiện đại, nhưng việc phòng ngừa và điều trị vẫn còn hạn chế. Phần lớn các độc tố gây tổn hại tế bào gan do sự peroxide hóa lipid và các tổn hại oxy hóa sinh ra gây suy giảm hệ thống chống oxy hóa nội sinh và chết tế bào gan. Dùng chất kháng oxy hóa để bổ sung làm giảm sự peroxide hóa và stress oxy hóa là một trong những liệu pháp hiệu quả để phòng và điều trị các tổn thương gan.

Chất kháng oxy hóa tự nhiên như flavonoid, phenolic, tanin, terpenoid tìm thấy ở nhiều loại thực vật khác nhau (Prakash et al. Cây dược liệu có những ảnh hưởng khác nhau đến các hệ thống sống, một số là thuốc an thần, thuốc giảm đau, thuốc hạ sốt, bảo vệ tim mạch, kháng khuẩn, kháng virus và thuốc chống kí sinh trùng (Olaleye et al. Các dược phẩm có nguồn gốc thực vật được ghi nhận có hiệu quả và an toàn cho gan (Ranawat et al. Việc sử dụng các phương thuốc tự nhiên để điều trị bệnh gan có lịch sử lâu dài, cây thuốc và dẫn xuất của chúng vẫn được sử dụng ở nhiều nơi thế giới theo nhiều cách thức khác nhau.

Các nghiên cứu phát triển các dược phẩm mới từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên đóng góp mạnh mẽ vào các lĩnh vực điều trị bao gồm bảo vệ gan. Hiện nay, thuốc điều trị các bệnh rối loạn về gan chủ yếu bào chế từ thực vật nhưng không nhiều. Mục tiêu của nghiên cứu là khảo sát hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan của một số cây thuộc họ Cà phê, nhằm sàng lọc tuyển chọn loại cây hoặc bộ phận của cây có hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan tốt nhất, góp phần cung cấp thông tin về nguồn dược liệu mới cho phòng ngừa và điều trị bệnh gan. Nghiên cứu được thực hiện với các nội dung cụ thể sau: 2 (1) Điều tra cây dược liệu được sử dụng điều trị bệnh gan; (2) Thu mẫu và chiết cao một số cây thuộc họ Cà phê; (3) Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết; (4) Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của các cao chiết; (5) Thử nghiệm tính an toàn của các cao chiết; (6) Chiết cao phân đoạn và thử hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn; (7) Phân lập chất từ phân đoạn có hoạt tính sinh học.

Ý nghĩa của luận án Kết quả của luận án là cơ sở khoa học về khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ gan của các cao chiết methanol của 7 loại thực vật trong họ Cà phê bao gồm: Trang to (lá, hoa), Mơ lông (lá), Mơ leo (lá), Gáo trắng (lá, vỏ thân, rễ), Gáo vàng (lá, vỏ thân, rễ), Lưỡi rắn (cả cây) và Lưỡi rắn trắng (cả cây). Luận án đã xác định được rễ Gáo vàng có hiệu quả kháng oxy hóa và bảo vệ gan tốt nhất, đặc biệt là chứng minh được cao chiết phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng có hoạt tính bảo vệ gan, kháng peroxide hóa lipid và làm tăng hàm lượng chất kháng oxy hóa trong gan. Từ đó, góp phần tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất ra loại sản phẩm mới phòng ngừa và điều trị bệnh gan. Điểm mới của luận án Nghiên cứu được thực hiện có hệ thống để khảo sát hoạt tính sinh học của các loại thực vật trong cùng họ Cà phê (Rubiaceae) bao gồm sàng lọc in vitro khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm cho đến thí nghiệm in vivo trên động vật.

Các cao methanol được chiết từ các loại thực vật nghiên cứu được xác định khả năng bảo vệ gan dựa trên cơ sở kết hợp các xét nghiệm sinh hóa khảo sát khả năng giảm stress oxy hóa in vivo và quan sát mô bệnh học. Loại cao chiết thực vật có hoạt tính kháng oxy hóa và bảo vệ gan tốt được được tuyển chọn chiết phân đoạn, thử lại hoạt tính, chọn phân đoạn hiệu quả để phân lập chất và xác định cấu trúc hóa học chất phân lập được. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng các loại thực vật trong họ Cà phê làm thuốc điều trị bệnh gan. 3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về các dạng oxy hoạt động và chất kháng oxy hóa 2.1 Các dạng oxy hoạt động 2.1 Sự tạo thành các dạng oxy hoạt động trong cơ thể Trong cơ thể sinh vật, hầu hết các dạng oxy hoạt động (Reactive oxygen species- ROS) có nguồn gốc nội sinh, được tạo ra từ các phản ứng oxy hóa khử trong quá trình chuyển hóa.

Oxy trong chuỗi hô hấp tế bào sẽ nhận điện tử chủ yếu ở ty thể và tạo ra gốc superoxide (O2🞄-). Gốc này được chuyển thành H2O2 bởi sự xúc tác của superoxide dismutase (SOD). Ở điều kiện sinh lý, các gốc O2🞄- và H2O2 chỉ tồn tại ở nồng độ thấp và vô hại với cơ thể. Khi có sự xúc tác của các enzyme hoặc kim loại như Fe2+, Cu2+ thúc đẩy sự tương tác giữa các gốc O2🞄- và H2O2 sẽ tạo ra các gốc oxy tự do có khả năng phản ứng cao với lipid, carbohydrate, protein, DNA tạo ra sản phẩm độc cho tế bào (Hình 2.1: Các nguồn và sự phát sinh các dạng oxy hoạt động khác nhau (Ajuwon et al., 2015) Các gốc superoxide (O2🞄-) còn được sinh ra ở lưới nội chất, từ sự thực bào của bạch cầu trong các phản ứng viêm.

Điều kiện sống ảnh hưởng rất nhiều đến sự hình thành gốc tự do như tiếp xúc với bức xạ ion hóa, tia tử ngoại, ô nhiễm môi trường, stress, uống nhiều rượu, dùng thuốc, hút thuốc có thể làm gia tăng sự hình thành ROS dẫn đến sự mất cân bằng trạng thái oxy hóa (Poljsak et al. Các gốc tự do thường rất không bền với thời gian nên nó thường nhận điện tử từ các phân tử khác để đạt được cấu trúc bền vững. Quá trình này tạo thành một dây chuyền phản ứng và dẫn đến sự hư hại các phân tử chung quanh (Devasagayam et al.2 Tác hại của các dạng oxy hoạt động Trong cơ thể sống, các superoxide (O2🞄-) và H2O2 ở nồng độ thấp thực hiện nhiều chức năng sinh lý quan trọng. Tuy nhiên nếu nồng độ H2O2 cao sẽ dẫn đến sự tổn 4 thương mô (van der Vliet and Janssen-Heininger, 2014).

Tất cả các phân tử sinh học đều có thể bị ROS tấn công. Trong các tổ chức màng, thành phần chính là acid béo chưa no và màng phospholipid, do đó có thể dễ dàng bị ROS tấn công dẫn đến quá trình peroxide hóa. Nếu không có mặt các chất kháng oxy hóa, quá trình peroxide hóa lipid sẽ làm cho các phân tử sinh học bị biến đổi dẫn đến thay đổi tính thấm và do đó phá hủy màng, làm chết tế bào và thúc đẩy quá trình lão hóa. Ngoài ra, ROS sinh ra quá mức sẽ tấn công vào DNA, protein, enzyme.

Sự tấn công vào DNA sẽ làm sai lệch trong cấu trúc hóa học DNA, sai lệch trong cấu trúc gen. ROS tấn công vào các phân tử protein làm thay đổi vị trí các acid amin, bẻ gãy các liên kết peptide dẫn đến thoái hóa không hồi phục của protein, thúc đẩy quá trình lão hóa. Theo các nhà khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra trên 100 bệnh, đáng kể nhất là các bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, đái tháo đường, cao huyết áp, xơ gan (Devasagayam et al., 2004; Poljsak et al.2 Chất kháng oxy hóa 2.1 Khái niệm về chất kháng oxy hóa Chất kháng oxy hóa là các phân tử vẫn ổn định sau khi nhường một electron để trung hòa các tác nhân oxy hóa, chấm dứt chuỗi phản ứng do tác nhân oxy hóa gây ra nhưng không tạo ra tác nhân oxy hóa khác và làm giảm tác hại của chúng đối với các đại phân tử. Chất kháng oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn tổn thương do tác nhân oxy hóa gây ra chủ yếu thông qua cơ chế trung hòa các tác nhân oxy hóa (Halliwell, 1995).

Hệ thống bảo vệ cơ thể bao gồm các chất kháng oxy hóa có chức năng khác nhau, một số chất kháng oxy hóa có thể là protein và enzyme, trong khi những chất kháng oxy hóa khác là những phân tử nhỏ. Dựa vào chức năng và cơ chế của chúng, các chất này có thể phân loại thành các chất ngăn chặn các chất oxy hóa, các chất đánh bắt gốc tự do, các chất sửa chữa sự sai hỏng do oxy hóa (Niki et al.2 Phân loại chất kháng oxy hóa Dựa vào nguồn gốc, chất kháng oxy hóa được chia thành chất kháng oxy hóa nội sinh và chất kháng oxy hóa ngoại sinh. Chất kháng oxy hóa nội sinh Các chất kháng oxy hóa nội sinh bao gồm các enzyme kháng oxy hóa và các chất kháng oxy hóa không enzyme. Hệ thống enzyme bao gồm superoxide dismustase (SOD), catalase (CAT), glutathion peroxidase (GSH-Px).

Đây là các enzyme điều hòa gốc tự do nhằm duy trì giới hạn an toàn của các anion superoxide, H2O2 và hydroperoxide hữu cơ tương ứng. Các enzyme này được xem là các enzyme giải độc chính trong cơ thể (Halliwell, 2012).