CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về chi Bacillus Chi Bacillus thuộc ngành Firmicutes, là các vi khuẩn hình que, di động, Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng sinh nội bào tử (hình 1. Vi khuẩn Bacillus dễ dàng được tìm thấy trong các môi trường như đất, đá, bụi, nước, thảm thực vật, thực phẩm và đường tiêu hóa của các loài côn trùng cũng như động vật khác nhau. Các loài thuộc chi Bacillus không đồng nhất về mặt kiểu hình và kiểu gene, do đó chúng thể hiện các đặc tính sinh hóa khá đa dạng như khả năng phân hủy nhiều cơ chất khác nhau có nguồn gốc từ thực vật và động vật, ví dụ: cellulose, tinh bột, protein, hydrocacbon và cả nhiên liệu sinh học. Khả năng sản sinh bào tử còn giúp Bacillus chống chịu với nhiệt độ, chất khử trùng và các phương pháp xử lý khác, do đó tăng khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất [7].
Ngoài ra chi Bacillus còn là nhà sản xuất phổ biến các hợp chất kháng khuẩn như polyketide, lipopeptide và bacteriocin [6]. Một loạt các loài Bacillus đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp chứng chỉ GRAS như Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis và Bacillus pumilus. Một số trong số chúng như Bacillus clausii, Brevibacillus laterosporus, Bacillus coagulans và Baenibacillus polymyxa thậm chí còn được bán trên thị trường dưới dạng chế phẩm sinh học probiotics [6].1 Kết quả nhuộm Gram của Bacillus [7] 1.2 Các hợp chất kháng khuẩn từ bacillus 1.1 Enzyme thủy phân Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng sản xuất nhiều enzyme thủy phân với tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Chức năng chính của các enzyme ngoại bào này là giải phóng các chất dinh dưỡng từ các cơ chất khác nhau.
Ngoài ra, các enzyme được tiết ra cùng với các hợp chất kháng khuẩn có thể được vi khuẩn sử dụng để cạnh tranh với các loài vi sinh vật khác và duy trì môi trường sinh thái. Những enzyme thủy phân này được quan tâm và sử dụng như là chất bảo quản thực phẩm và chất kiểm soát sinh học. Proteolytic từ chi Bacillus có khả năng ức chế tác động của vi khuẩn gây bệnh trên khoai tây bằng cơ chế ly giải thành tế bào vi khuẩn Pectobacterium carotovorum [8]. Peptidoglycan hydrolase được phân lập từ nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, được báo cáo là có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn Gram dương như Streptococcus spp.
Elastase từ Bacillus subtilis gây ra sự ly giải các tế bào của vi khuẩn Gram âm như Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi [10].2 Hợp chất bay hơi Bacillus có thể tạo ra nhiều hợp chất bay hơi đa dạng với các vai trò quan trọng. Các hợp chất dễ bay hơi thường được phân thành hai loại: vô cơ (VIC) và hữu cơ (VOC). 5 Các hợp chất bay hơi vô cơ do vi sinh vật tổng hợp chủ yếu là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất sơ cấp như CO2, CO, H2, HCN, H2S, N2, NH3 và NO. Hoạt động kháng khuẩn của các hợp chất VIC từ Bacillus khá đa dạng.
Ví dụ: Xyanua hydro, có nguồn gốc từ quá trình dị hóa glycine, cho thấy hoạt động đối kháng trực tiếp với vi sinh vật hiếu khí bằng cách ức chế các enzyme chứa kim loại như cytochrome c oxidase hoạt động trong chuỗi hô hấp [12]. Ở sâu hơn trong đất, dưới nồng độ oxy thấp, vi khuẩn có xu hướng tạo ra các VIC khác nhau như H2 hoặc H2S. Những hợp chất đó có thể đóng vai trò như chất nhận điện tử, chất chuyển hóa kháng khuẩn. Hyđro sulfua (H2S) được tạo ra bởi Bacillus từ quá trình khử sulfate hoặc là sản phẩm phụ của quá trình dị hóa L-methionine và L-cysteine [22].
Nó được biết là có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn truyền qua thực phẩm hoặc mầm bệnh ở người như Aspergillus. Các hợp chất bay hơi hữu cơ là những hợp chất nhỏ có ít hơn 20 nguyên tử carbon và được đặc trưng bởi khối lượng phân tử thấp (100 - 500 Da), áp suất hơi cao, nhiệt độ sôi thấp và một gốc ưa béo. Những đặc điểm này đảm bảo sự bay hơi dễ dàng và phân bố khoảng cách xa, thuận tiện trong một chất nền phức tạp như đất [14]. Sự khuếch tán và sản sinh của các VOC từ các vi sinh vật trong đất phụ thuộc mạnh mẽ vào các yếu tố như: chất dinh dưỡng, oxy, nhiệt độ, độ pH, trạng thái sinh lý của vi sinh vật, độ ẩm, kết cấu của đất [15]–[17].
VOC bắt nguồn từ quá trình oxy hóa glucose liên quan đến quá trình đường phân, chu trình acid tricarboxylic, con đường chuyển hóa carbon dị dưỡng hiếu khí, quá trình lên men, quá trình tổng hợp terpen,…[14],[18]. Cho đến nay, khoảng 2.000 hợp chất bay hơi hữu cơ được tạo ra bởi gần 1.000 loài vi sinh vật, chúng đã được liệt kê trong cơ sở dữ liệu về hợp chất bay hơi hữu cơ mVOC 2. Theo cơ sở dữ liệu này, gần 70% VOC từ Bacillus đã được ghi nhận. Hợp chất bay hơi 1,3-butadiene hoặc 2,3-butanediol được biết là có thể gây ra những thay đổi trong sự biểu hiện gen của các tác nhân gây bệnh Ralstonia solanacearum và Pectobacterium carotovorum [20], [21].
Isoprene và monoterpene α-terpineol (hình 1. subtilis sản xuất thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn lam [22]. Pyrazine từ các chủng B. subtilis biểu hiện 6 hoạt động kháng khuẩn ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Proteus vulgaris [22].2 Cấu trúc hóa học của isoprene và 1,3 butadiene 1.3 Polyketide Trong số các hợp chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi vi sinh vật, polyketide được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y tế với phổ hoạt động rộng bao gồm khả năng kháng khuẩn, ức chế các phản ứng miễn dịch, kháng u và nhiều khả năng đối kháng khác.
Bacillaene, difficidin và macrolactin (hình 1.3) là 3 họ polyketide có khả năng kháng khuẩn được sinh tổng hợp từ B. Các hợp chất này thể hiện các hoạt động kháng khuẩn thông qua việc ức chế có chọn lọc quá trình tổng hợp protein. Bacillaene thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn như Myxococcus xanthus và Staphylococcus aureus [22], [23]. Hardidin và oxydifficidin đều ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Clostridium perfringens, Erwinia amylovora, E.
coli hoặc Xanthomonas oryza [22]. Macrolactin và các dẫn xuất của chúng cho thấy các hoạt động kháng khuẩn R.3 Cấu trúc hóa học của bacillaene, difficidin và macrolactin 1.4 Peptide kháng khuẩn từ chi bacillus 1.1 Peptide kháng khuẩn sinh tổng hợp từ ribosome: bacteriocin a. Định nghĩa bacteriocin Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn được sinh tổng hợp ở ribosome của cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Bacteriocin đối kháng với các vi sinh vật cạnh tranh trong cùng ổ sinh thái và có khả năng kháng cùng loài hoặc khác loài.
Peptide kháng khuẩn này được tổng hợp khi vi khuẩn gặp căng thẳng từ các tác động của môi trường sống như sự cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống.Vi khuẩn sản sinh ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Các bacteriocin vẫn có hoạt tính kháng khuẩn cao dù ở nồng độ rất thấp. Nó có đặc tính kháng khuẩn với phổ pH rộng, tương đối bền ở nhiệt độ cao và thường ít bị ảnh hưởng bởi các dung môi hữu cơ. Các loại bacteriocin thông thường là các cation peptide nhỏ từ 20 đến 60 amino acid với các đặc điểm lưỡng tính và điểm đẳng điện cao.
Một số bacteriocin sinh tổng hợp từ chi Bacillus như subtilin từ 8 B. subtilis; coagulin từ B. coagulans; bacthuricin F4, thuricin 17, entomocin 9 và tochicin từ B. thuringiensis; cerecin 7 từ B.
cereus; bacillocin 490 từ B. Phân loại bacteriocin Sơ đồ phân loại này đã được Klaenhammer thiết lập năm 1993 và sau đó Van Belkum đã điều chỉnh và phân loại lại [106]. Phần lớn bacteriocin được phân loại dựa vào cấu trúc peptide, yếu tố quyết định di truyền và cơ chế sinh tổng hợp của nó [29]–[32]. Các bacteriocin từ các loài Bacillus có thể được chia thành hai nhóm chính đó là nhóm peptide biến đổi sau dịch mã và peptide không biến đổi sau dịch mã.
Chúng được phân thành 5 lớp cơ bản như sau: Các bacteriocin lớp I thuộc nhóm peptide được biến đổi sau dịch mã với đại diện tiêu biểu là lantibiotic [33]–[35]. Lantibiotic là peptide kháng khuẩn với cấu trúc vòng lanthionine, các trình tự acid amin đầu chuỗi trong quá trình sinh tổng hợp có vai trò liên quan tới quá trình biến đổi sau dịch mã của nó. Các bacteriocin lớp II thường là các peptide nhỏ (0.77–10 kDa), không biến đổi sau dịch mã và mạch thẳng, bền với nhiệt và pH. Một số đại diện của lớp này là: coagulin, thuricin HD2, thuricin 7, cerein MRX1, entomocin 9, thuricin 17, tochicin HD868, tolworthcin 524 và bacthuricin F4, thuricin B439 [37].
Đặc biệt cerein 7 và cerein 8A được sinh tổng hợp từ B. cereus có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể trên Listeria monocytogenes [38]. Nhóm III là các bacteriocin có kích thước phân tử lớn (> 30 kDa) và không bền nhiệt như megacin A (66–68 kDa), NCPP32355 (45–76 kDa) và SW1-1 (38 kDa) [39], [40]. Nhóm IV là nhóm bacteriocin phức tạp mang các gốc lipid hoặc carbohydrate trong cấu trúc phân tử.
Cấu trúc và chức năng của lớp này ít được nghiên cứu và các bacteriocin của lớp này từ Bacillus ít được biết tới. Cấu trúc phân tử của glycocin hay còn gọi là glycopeptide bacteriocin có một hoặc hai phân tử đường liên quan đến hoạt động kháng khuẩn của chúng [41], [42]. Glycocin sublancin 168 sinh tổng hợp từ B. subtilis 168 có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các mầm bệnh kháng thuốc như S.
aureus kháng methicillin (MRSA) và Enterococcus sp. kháng vancomycin [41], [43]. Nhóm V là các bacteriocin được 9 biến đổi sau dịch mã, có cấu trúc dạng vòng thông qua liên kết peptide giữa đầu tận cùng N – C của một prepeptide. Phần lớn trong số chúng có cấu trúc phân tử 3-D bao gồm một hoặc nhiều xoắn α bao quanh lõi kỵ nước [44], [45].
Chúng cũng nổi tiếng bởi khả năng ổn định nhiệt và điểm đẳng điện cao. Amylocyclicin là một ví dụ điển hình của nhóm V [44]–[46].2 Peptide kháng khuẩn không được sinh tổng hợp từ ribosome Năm 1974, Berdy đã báo cáo 167 loại hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi chi Bacillus, bao gồm 66 loại peptide kháng khuẩn từ B. subtilis và 23 peptide kháng khuẩn từ B. Kể từ đó, một số lượng đáng kể các chất kháng khuẩn mới đã thu được từ chi Bacillus và ứng dụng trong dược lý, thú y và công nghiệp thực phẩm.
Peptide kháng khuẩn có thể do vi khuẩn sản xuất ra vào thời điểm khi tế bào vi khuẩn bắt đầu biệt hóa (như là quá trình hình thành bào tử).