Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực thiết yếu nuôi sống khoảng một nửa dân số thế giới, tập trung chủ yếu tại châu Á, châu Phi và Nam Mỹ. Tại Việt Nam, lúa gạo là cây trồng chủ lực, chiếm hơn 90% tổng sản phẩm nông nghiệp. Mặc dù diện tích canh tác có xu hướng giảm nhẹ do chuyển đổi cơ cấu sử dụng đất (năm 2020 đạt 7,28 triệu ha; năm 2021 đạt 7,24 triệu ha), năng suất lúa bình quân vẫn duy trì ở mức cao (58,7 tạ/ha năm 2020 và 60,6 tạ/ha năm 2021), đóng góp vào sản lượng xuất khẩu 6,2 triệu tấn gạo năm 2021 với tỷ trọng gạo chất lượng cao trên 89%.
Tuy nhiên, sản xuất lúa luôn đối mặt với rủi ro nghiêm trọng từ các loại dịch hại. Ba đối tượng gây thiệt hại nặng nề nhất đến bộ lá và năng suất lúa bao gồm:
- Bệnh bạc lá (cháy bìa lá) do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, có khả năng làm giảm năng suất từ 10% đến 80%, thậm chí mất trắng. Tại miền Bắc Việt Nam, các chủng vi khuẩn Xoo phổ biến (đặc biệt là chủng 2 và 3) có độc tính cao, trong khi các biện pháp hóa học kém hiệu quả và gây hại môi trường.
- Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia grisea (đồng danh Pyricularia oryzae) gây hại trên lá, đốt thân, cổ bông và hạt, có thể làm giảm năng suất tới 75%.
- Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) gây hại trực tiếp qua việc chích hút nhựa làm khô héo cây ("cháy rầy"), đồng thời là môi giới truyền hai bệnh virus nguy hiểm là vàng lùn và lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus), làm giảm năng suất đến 70% hoặc gây mất trắng.
Thực tế sản xuất cho thấy phần lớn diện tích lúa tại miền Bắc sử dụng giống nhập nội (chủ yếu từ Trung Quốc) có năng suất cao nhưng khả năng chống chịu với nguồn bệnh bản địa kém bền vững; trong khi các giống địa phương chỉ thích nghi hẹp. Các giống chọn tạo trong nước trước đây chủ yếu tập trung vào năng suất hoặc chỉ mang đơn gen kháng, dễ bị bẻ gãy tính kháng khi xuất hiện các nòi sinh học mới. Do đó, việc ứng dụng chỉ thị phân tử (MAS - Marker-Assisted Selection) để phát hiện, chọn lọc và quy tụ nhiều gen kháng (pyramiding) vào các nguồn giống triển vọng là hướng tiếp cận tất yếu nhằm xây dựng nền nông nghiệp bền vững.
Mục tiêu nghiên cứu:
Khảo sát nguồn gen để phát hiện được các mẫu, giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng tốt, đồng thời mang các gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, Xa7), gen kháng bệnh đạo ôn (Pi-ta, Pi-ta 2) và gen kháng bệnh rầy nâu (Bph4), cung cấp vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống lúa mới.
Nhiệm vụ và yêu cầu nghiên cứu (được xác định cụ thể trong văn bản):
- Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học quan trọng liên quan đến sinh trưởng, phát triển, các chỉ tiêu năng suất và chất lượng thương trường của các mẫu giống lúa.
- Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá phục vụ đánh giá lây nhiễm nhân tạo.
- Sử dụng chỉ thị phân tử DNA (chỉ thị SSR và STS) qua phản ứng PCR để phát hiện sự hiện diện của gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, Xa7), gen kháng bệnh đạo ôn (Pi-ta, Pi-ta 2) và gen kháng bệnh rầy nâu (Bph4).
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: 22 mẫu giống lúa được lưu giữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen cây trồng; các dòng chuẩn đẳng gen chứa gen kháng bạc lá (IRBB4, IRBB7), dòng chuẩn kháng đạo ôn (IRBL2, IRBL24); giống đối chứng ST24.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng, cùng Khu thí nghiệm đồng ruộng thuộc Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen cây trồng – Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian thực hiện: Vụ Đông – Xuân, từ tháng 01/2022 đến tháng 07/2022.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và các gen mục tiêu
Nghiên cứu dựa trên cơ sở di truyền học phân tử và chọn giống cây trồng bằng chỉ thị phân tử. Cụ thể, các gen kháng mục tiêu đã được chứng minh có phổ kháng hữu hiệu với các nòi/chủng gây hại tại Việt Nam và Đông Nam Á:
- Gen kháng bệnh bạc lá: Khoa học đã xác định được 30–36 gen kháng bạc lá. Trong đó, tổ hợp các gen Xa4 (gen trội liên kết chỉ thị Npb181) và Xa7 (liên kết chỉ thị P3) có khả năng tạo phổ kháng rộng và bền vững trước các chủng vi khuẩn Xoo ở miền Bắc.
- Gen kháng bệnh đạo ôn: Trong số hơn 30 locus gen kháng đã biết, locus gen Pi-ta (định vị trên nhiễm sắc thể số 12, nhận diện bằng chỉ thị STS YL155/YL87) và Pi-ta 2 (nhận diện bằng chỉ thị SSR RM7102) thể hiện tính kháng hữu hiệu cao nhất đối với đa số các nòi nấm P. oryzae.
- Gen kháng rầy nâu: Hiện có 10 gen kháng được công bố; trong đó gen Bph4 (được xác định liên kết với chỉ thị SSR RM190L) là một trong những gen kháng hữu hiệu đối với các biotype rầy nâu phổ biến tại khu vực Đông Nam Á.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
[MẪU GIỐNG LÚA (n = 22)]
[ĐÁNH GIÁ ĐỒNG RUỘNG] [PHÂN TÍCH PHÂN TỬ]
[Nông sinh học] [Chất lượng gạo] [Tách chiết DNA] [Phân lập vi khuẩn]
- Thời gian ST - Dài, rộng hạt (Quy trình CTAB) - Môi trường Wakimoto
[PCR & Điện di]
- Bạc lá: Xa4, Xa7
- Đạo ôn: Pi-ta, Pi-ta 2
- Rầy nâu: Bph4
-
Khảo sát ngoài đồng ruộng:
- Bố trí thí nghiệm: Gieo cấy theo từng ô riêng biệt cho mỗi mẫu giống, diện tích ô $5\text{ m}^2$, mật độ 33 khóm/$\text{m}^2$ (khoảng cách cây cách cây $15\text{ cm}$, hàng cách hàng $20\text{ cm}$), cấy 1 dảnh/khóm, mỗi giống cấy từ 2 đến 5 hàng dài $5\text{ m}$, khoảng cách giữa các giống là $30\text{ cm}$. Ngày gieo mạ: 04/01/2022 (Vụ Đông – Xuân).
- Hệ thống chỉ tiêu nông sinh học: Theo dõi thời gian sinh trưởng (từ gieo đến trỗ, trỗ đến chín), số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu, chiều cao cây, chiều dài bông, kích thước lá đòng và các yếu tố cấu thành năng suất theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 01-55:2011/BNNPTNT và tiêu chuẩn của IRRI (1996). Phân loại chiều dài/chiều rộng lá đòng theo tiêu chuẩn của Nguyễn Văn Hiển (2000).
- Chỉ tiêu chất lượng thương trường hạt gạo: Xác định chiều dài, chiều rộng hạt thóc và hạt gạo, tỷ lệ Dài/Rộng (D/R) theo QCVN 01-65:2011/BNNPTNT; đánh giá độ bạc bụng theo thang điểm 0 - 1 - 5 - 9 của IRRI (1996).
-
Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo):
- Thu mẫu lá lúa bệnh bạc lá ngoài thực địa, khử trùng bề mặt bằng cồn $70^\circ$ và ngâm dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2\ 3%$ trong 3–5 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
- Phân lập đơn khuẩn lạc theo phương pháp của Taura (2004) trên môi trường chuyên biệt Wakimoto cải tiến (thành phần: khoai tây $300\text{ g}$, đường saccarose $15\text{ g}$, peptone $5\text{ g}$, thạch agar $15\text{ g}$, $\text{Na}_2\text{HPO}_4\cdot4\text{H}_2\text{O}\ 0,5\text{ g}$, nước cất 2 lần $1000\text{ ml}$, pH 6,8–7,0; hấp khử trùng $121^\circ\text{C}$ trong 40 phút). Cấy chuyển làm thuần 4 lần, nuôi ủ ở $30^\circ\text{C}$ trong 1–2 ngày và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học.
-
Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện gen kháng:
- Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng quy trình CTAB (Doyle & Doyle, 1990) có cải tiến gồm 9 bước, sử dụng đệm chiết CTAB 2% ($\text{NaCl}\ 1,5\text{M}$, $\text{EDTA}\ 50\text{mM}$, $\text{Tris-HCl}\ 100\text{mM}$, $\beta\text{-mercaptoethanol}\ 1%$), dung môi hữu cơ Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) và Chloroform:Isopropanol (24:1), kết tủa bằng ethanol lạnh, hòa tan trong đệm TE chứa $10\text{ mg/ml}$ RNase A. Kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
- Phản ứng PCR: Thực hiện trên hệ thể tích $20\ \mu\text{l}$ ($10\ \mu\text{l}$ PCR Master Mix 2X, $1\ \mu\text{l}$ mồi xuôi $0,5\ \text{pmol}/\mu\text{l}$, $1\ \mu\text{l}$ mồi ngược $0,5\ \text{pmol}/\mu\text{l}$, $1\ \mu\text{l}$ DNA khuôn, $7\ \mu\text{l}$ $\text{nuclease-free water}$).
| Tên gen |
Chỉ thị phân tử |
Trình tự mồi (5' - 3') |
Loại chỉ thị |
Tài liệu tham khảo |
Chu trình nhiệt PCR |
| Xa4 |
Npb181 |
F: ATCGATCGATCTTCACGAGG
R: GTGCTATAAAGGCATTCGGG |
SSR |
Yoshida et al. (1991) |
$94^\circ\text{C}$ (4 phút); 34 chu kỳ ($94^\circ\text{C}$ 1 phút, $56^\circ\text{C}$ 1 phút, $72^\circ\text{C}$ 2 phút); $72^\circ\text{C}$ (8 phút) |
| Xa7 |
P3 |
F: CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT
R: CATCACGGTCACCGCCATATCGGA |
SSR |
Taura et al. (2004) |
$94^\circ\text{C}$ (4 phút); 34 chu kỳ ($94^\circ\text{C}$ 1 phút, $56^\circ\text{C}$ 1 phút, $72^\circ\text{C}$ 2 phút); $72^\circ\text{C}$ (8 phút) |
| Pi-ta |
YL155 / YL87 |
F: AGCAGGTTATAAGCTAGGCC
R: CTACCAACAAGTTCATCAAA |
STS |
Yu et al. (2002) |
$95^\circ\text{C}$ (3 phút); 29 chu kỳ ($95^\circ\text{C}$ 30 giây, $50^\circ\text{C}$ 30 giây, $72^\circ\text{C}$ 30 giây); $72^\circ\text{C}$ (7 phút) |
| Pi-ta 2 |
RM7102 |
F: CGGCTTGAGAGCGTTTTTAG
R: TACTTGGTTACTCGGGTCGG |
SSR |
McCouch et al. (2002) |
$94^\circ\text{C}$ (5 phút); 35 chu kỳ ($94^\circ\text{C}$ 1 phút, $55^\circ\text{C}$ 30 giây, $72^\circ\text{C}$ 1 phút); $72^\circ\text{C}$ (7 phút) |
| Bph4 |
RM190L |
F: CTTTGTCTATCTCAAGACAC
R: TTGCAGATGTTCTTCCTGATG |
SSR |
Jairin et al. (2007) |
$95^\circ\text{C}$ (5 phút); 30 chu kỳ ($95^\circ\text{C}$ 30 giây, $50^\circ\text{C}$ 30 giây, $72^\circ\text{C}$ 1 phút); $72^\circ\text{C}$ (10 phút) |
- Điện di sản phẩm: Điện di trên gel agarose 2% trong dung dịch đệm TAE 0,5X bổ sung chất nhuộm RedSafe, chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại (UV).
- Xử lý số liệu: Thống kê mô tả và phân tích số liệu trên phần mềm Microsoft Excel 2010 và Minitab 16.
Nội dung chính theo từng phần của khóa luận
Phần 1: Mở đầu
Tác giả trình bày tính cấp thiết của nghiên cứu xuất phát từ thực trạng thiệt hại do 3 loài dịch hại nghiêm trọng (bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo, bệnh đạo ôn do nấm P. oryzae, rầy nâu N. lugens) đối với ngành lúa gạo Việt Nam; phân tích hạn chế của phương pháp chọn giống truyền thống và khẳng định vai trò của công nghệ chỉ thị phân tử trong việc rút ngắn thời gian chọn giống mang tổ hợp đa gen kháng. Xác lập mục đích, 3 yêu cầu cụ thể và phạm vi đề tài.
Phần 2: Tổng quan tài liệu nghiên cứu
- Tổng quan về cây lúa và sản xuất lúa gạo: Nguồn gốc tiến hóa, phân loại chi Oryza, tình hình sản xuất và tiêu thụ gạo toàn cầu (sản lượng toàn cầu tháng 01/2022 theo USDA đạt 42,5 triệu tấn; IGC đạt 42,62 triệu tấn; Trung Quốc dẫn đầu thế giới với 148,3 triệu tấn niên vụ 2020/2021) và thực trạng cơ cấu giống tại Việt Nam (giống nhập nội, địa phương, chọn tạo trong nước).
- Bệnh bạc lá và công tác chọn giống kháng: Tác hại làm tàn lụi lá đòng, giảm quang hợp, lép hạt; triệu chứng (bạc lá, héo xanh kresek, vàng nhợt); đặc tính vi khuẩn Xoo (Gram âm, hình gậy, một lông roi, kích thước $1-2 \times 0,5-0,9\ \mu\text{m}$, không khử $\text{NO}_3$, tạo $\text{H}_2\text{S}$, nhiệt độ tối ưu $26-30^\circ\text{C}$). Tổng quan 30 gen kháng và các công trình ứng dụng chỉ thị Npb181, P3, RG556, pTA248 tại Việt Nam (Phan Hữu Tôn, Lã Vinh Hoa, Vũ Hồng Quảng, Dương Xuân Tú).
- Bệnh đạo ôn và công tác chọn giống kháng: Triệu chứng vết bệnh hình thoi trên lá, tổn thương cổ bông gây lép lửng; sinh học nấm P. oryzae (nhiệt độ tối ưu $24-28^\circ\text{C}$, ẩm độ $>80%$, tiết độc tố pyricularin). Lược sử nghiên cứu các locus Pi-ta, Pi46(t) trên thế giới (Y Jia, Kei Matsushita) và các tổ hợp gen Pi-1, Pi-5, Pi-ta, Pi-ta 2 tại Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa, Trần Viết Thắng, Phạm Thiên Thành).
- Rầy nâu và công tác chọn giống kháng: Cơ chế gây cháy rầy và truyền virus vàng lùn, lùn xoắn lá. Tổng quan các chỉ thị STS, SSR liên kết gen kháng Bph1, Bph2, Bph3, Bph4, Bph10 (Lang et al., Dongjin Qing, Phạm Thị Thanh Mai, Lê Tuấn Tú, Nguyễn Trí Yến Chi).
Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết danh mục 22 mẫu giống lúa thí nghiệm, các dòng chuẩn đối chứng, địa điểm, thời gian biểu, 3 nội dung nghiên cứu, thiết kế ô thí nghiệm ngoài đồng, tiêu chuẩn QCVN 01-55:2011/BNNPTNT, công thức tính năng suất lý thuyết (NSLT = số bông/khóm $\times$ mật độ cấy $\times$ số hạt chắc/bông $\times$ khối lượng 1000 hạt $\times 10^{-4}$), quy trình vi sinh phân lập Xoo trên môi trường Wakimoto, quy trình tách chiết DNA bằng CTAB cải tiến và điều kiện chu trình nhiệt PCR cho 5 cặp mồi chỉ thị.
Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
1. Đánh giá thời gian sinh trưởng (TGST)
Theo dõi quá trình sinh trưởng từ gieo đến trỗ và từ trỗ đến chín hoàn toàn của 22 mẫu giống cùng giống đối chứng ST24 trong vụ Đông – Xuân 2022.
| STT |
Tên giống |
Thời gian từ gieo đến trỗ (ngày) |
Thời gian từ trỗ đến chín hoàn toàn (ngày) |
Tổng thời gian sinh trưởng (ngày) |
Phân nhóm thời gian sinh trưởng |
| 1 |
1234F8-1 |
109 |
33 |
142 |
Trung bình |
| 2 |
574F10 |
106 |
29 |
135 |
Ngắn |
| 3 |
TC1-4 |
114 |
32 |
146 |
Trung bình |
| 4 |
T62-14 |
121 |
30 |
151 |
Trung bình |
| 5 |
T62-TC2 |
118 |
32 |
150 |
Trung bình |
| 6 |
TC1-5 |
114 |
35 |
149 |
Trung bình |
| 7 |
T62-TC4 |
112 |
36 |
146 |
Trung bình |
| 8 |
T62-TC1 |
116 |
31 |
147 |
Trung bình |
| 9 |
T62-2 |
115 |
38 |
153 |
Trung bình |
| 10 |
T62-12 |
120 |
34 |
154 |
Trung bình |
| 11 |
T62-3 |
114 |
37 |
151 |
Trung bình |
| 12 |
TC1-1 |
119 |
31 |
150 |
Trung bình |
| 13 |
T62-13 |
120 |
37 |
157 |
Trung bình |
| 14 |
T62-7 |
117 |
33 |
150 |
Trung bình |
| 15 |
T62-11 |
113 |
34 |
147 |
Trung bình |
| 16 |
T62-8 |
118 |
30 |
148 |
Trung bình |
| 17 |
T62-4 |
122 |
37 |
159 |
Trung bình |
| 18 |
T62-6 |
119 |
41 |
160 |
Trung bình |
| 19 |
T62-10 |
116 |
36 |
152 |
Trung bình |
| 20 |
TC1-2 |
110 |
39 |
149 |
Trung bình |
| 21 |
T62-9 |
118 |
40 |
158 |
Trung bình |
| 22 |
T62-1 |
116 |
31 |
147 |
Trung bình |
| ĐC |
ST24 |
115 |
30 |
145 |
Trung bình |
- Thời gian từ gieo đến trỗ: Biến động từ 106 đến 122 ngày. Mẫu 574F10 trỗ sớm nhất (106 ngày, sớm hơn đối chứng ST24 là 9 ngày); mẫu T62-4 trỗ muộn nhất (122 ngày, muộn hơn ST24 là 7 ngày).
- Thời gian từ trỗ đến chín: Biến động từ 29 đến 41 ngày. Mẫu 574F10 chín nhanh nhất (29 ngày); mẫu T62-6 kéo dài nhất (41 ngày); có 7 mẫu có thời gian chín tập trung dưới 32 ngày (tương đương ST24: 30 ngày).
- Tổng thời gian sinh trưởng: Dao động từ 135 đến 160 ngày.
- Nhóm ngắn ngày (115–135 ngày): Có 01 mẫu giống duy nhất là 574F10 (135 ngày, sớm hơn ST24 là 10 ngày). Giống này phù hợp cho việc tránh rét muộn và gieo mạ muộn ở miền Bắc hoặc luân canh tăng vụ.
- Nhóm trung ngày (136–160 ngày): Chiếm đa số với 21/22 mẫu giống (tỷ lệ 96%), trong đó giống T62-6 có TGST dài nhất (160 ngày).
- Nhóm dài ngày (>160 ngày): 0 mẫu.
2. Kết quả phân lập vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Sau 4 lần cấy chuyển trên môi trường Wakimoto, phân lập được dòng khuẩn lạc thuần khiết có hình tròn đặc trưng, màu vàng sáp, rìa nhẵn bóng, tế bào hình gậy ngắn nhuộm Gram âm dưới kính hiển vi quang học, đảm bảo tiêu chuẩn làm nguồn vật liệu lây nhiễm nhân tạo.
3. Kết quả phát hiện gen kháng bằng chỉ thị phân tử (PCR)
- Gen kháng bạc lá (Xa4, Xa7): Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi Npb181 (Xa4) và P3 (Xa7) cho thấy có 12/22 mẫu giống mang đồng thời cả 2 gen kháng Xa4 và Xa7.
- Gen kháng đạo ôn (Pi-ta, Pi-ta 2): Phân tích sản phẩm PCR với mồi STS YL155/YL87 (Pi-ta) và SSR RM7102 (Pi-ta 2) phát hiện 4/22 mẫu giống mang đồng thời cả 2 gen Pi-ta và Pi-ta 2.
- Gen kháng rầy nâu (Bph4): Phản ứng PCR với mồi RM190L xác định 13/22 mẫu giống mang gen kháng Bph4.
4. Chọn lọc mẫu giống triển vọng
Tổng hợp các chỉ tiêu nông sinh học, hình thái hạt và kết quả phân tích phân tử, nghiên cứu đã tuyển chọn được 2 mẫu giống triển vọng nhất là T62-14 và T62-4, mang đầy đủ các tổ hợp gen kháng bệnh bạc lá, đạo ôn và rầy nâu, đồng thời có tiềm năng năng suất và phẩm chất thương trường tốt.
Phần 5: Kết luận và kiến nghị
Tóm tắt toàn bộ kết quả khảo sát phân tử và nông sinh học của 22 mẫu giống, đồng thời đề xuất kiến nghị sử dụng các dòng triển vọng cho chương trình lai tạo tiếp theo.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
-
Định dạng thời gian sinh trưởng quần thể giống:
- Xác định được $96%$ tập đoàn mẫu giống (21/22 mẫu) thuộc nhóm sinh trưởng trung ngày (136–160 ngày).
- Phát hiện 01 mẫu giống ngắn ngày ưu tú là 574F10 với thời gian sinh trưởng 135 ngày (gieo đến trỗ 106 ngày, trỗ đến chín 29 ngày).
-
Dữ liệu phân tử về các nguồn gen kháng:
- Xác định 12 mẫu giống mang đồng thời 2 gen kháng bạc lá (Xa4 + Xa7).
- Xác định 4 mẫu giống mang đồng thời 2 gen kháng đạo ôn (Pi-ta + Pi-ta 2).
- Xác định 13 mẫu giống mang gen kháng rầy nâu (Bph4).
-
Chọn lọc giống triển vọng:
- Tuyển chọn thành công 2 mẫu giống T62-14 (TGST 151 ngày) và T62-4 (TGST 159 ngày) quy tụ các gen kháng chủ lực đối với cả ba đối tượng bệnh bạc lá, đạo ôn và rầy nâu, có các đặc điểm nông sinh học tốt.
-
Vật liệu vi sinh:
- Phân lập, làm thuần và lưu giữ thành công chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae phục vụ công tác lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng tính kháng kiểu hình.
Đóng góp của đề tài
- Cung cấp dữ liệu nhận diện kiểu gen kháng cho 22 mẫu giống lúa đang được lưu giữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen cây trồng – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Xác định được các mẫu giống mang đa gen kháng làm vật liệu khởi đầu cho các chương trình lai quy tụ gen (gene pyramiding), hỗ trợ công tác chọn tạo giống lúa kháng sâu bệnh bền vững tại các tỉnh phía Bắc.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Giá trị tham khảo
- Đối tượng tham khảo:
- Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các ngành: Công nghệ sinh học, Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa học cây trồng, Bảo vệ thực vật.
- Cán bộ nghiên cứu tại các viện, trung tâm chọn tạo giống lúa và bảo tồn nguồn gen thực vật.
- Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
- Quy trình chi tiết 9 bước tách chiết DNA lá lúa bằng phương pháp CTAB cải tiến cho độ tinh sạch cao.
- Thông số chu trình nhiệt và cặp mồi chuẩn (Npb181, P3, YL155/YL87, RM7102, RM190L) ứng dụng trực tiếp trong kỹ thuật chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS).
- Quy trình pha chế môi trường Wakimoto và phân lập thuần khiết vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae từ mô bệnh tự nhiên.
- Bộ dữ liệu về thời gian sinh trưởng của 22 dòng/mẫu giống lúa phục vụ bố trí cơ cấu mùa vụ.
Câu hỏi thường gặp
1. Nghiên cứu sử dụng những chỉ thị phân tử và cặp mồi cụ thể nào để xác định từng gen kháng?
Tác giả sử dụng 5 cặp mồi chỉ thị phân tử chuyên biệt:
- Gen Xa4 (bạc lá): Chỉ thị SSR
Npb181 (F: 5'-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3', R: 5'-GTGCTATAAAGGCATTCGGG-3').
- Gen Xa7 (bạc lá): Chỉ thị SSR
P3 (F: 5'-CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT-3', R: 5'-CATCACGGTCACCGCCATATCGGA-3').
- Gen Pi-ta (đạo ôn): Chỉ thị STS
YL155/YL87 (F: 5'-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3', R: 5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3').
- Gen Pi-ta 2 (đạo ôn): Chỉ thị SSR
RM7102 (F: 5'-CGGCTTGAGAGCGTTTTTAG-3', R: 5'-TACTTGGTTACTCGGGTCGG-3').
- Gen Bph4 (rầy nâu): Chỉ thị SSR
RM190L (F: 5'-CTTTGTCTATCTCAAGACAC-3', R: 5'-TTGCAGATGTTCTTCCTGATG-3').
2. Mẫu giống lúa nào có thời gian sinh trưởng ngắn nhất và có ý nghĩa gì trong thực tiễn?
Mẫu giống 574F10 có thời gian sinh trưởng ngắn nhất trong tập đoàn nghiên cứu với tổng số 135 ngày (thời gian từ gieo đến trỗ 106 ngày, từ trỗ đến chín hoàn toàn 29 ngày), ngắn hơn giống đối chứng ST24 là 10 ngày. Giống này có giá trị thực tiễn cao tại miền Bắc giúp nông dân chủ động bố trí thời vụ, gieo mạ muộn nhằm tránh các đợt rét đậm, rét hại đầu vụ, hạn chế sâu bệnh và thuận lợi cho luân canh cây vụ đông.
3. Hai mẫu giống nào được đánh giá là triển vọng nhất và căn cứ lựa chọn là gì?
Hai mẫu giống triển vọng nhất là T62-14 (tổng thời gian sinh trưởng 151 ngày) và T62-4 (tổng thời gian sinh trưởng 159 ngày). Căn cứ lựa chọn là sự tích hợp đồng thời các gen kháng bệnh bạc lá, đạo ôn và rầy nâu qua kiểm tra PCR, kết hợp với các đặc tính sinh trưởng, phát triển và chất lượng thương trường tốt.
4. Môi trường và điều kiện phân lập vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae được tiến hành như thế nào?
Vi khuẩn Xoo được phân lập trên môi trường Wakimoto gồm khoai tây ($300\text{ g}$), saccarose ($15\text{ g}$), peptone ($5\text{ g}$), agar ($15\text{ g}$), $\text{Na}_2\text{HPO}_4\cdot4\text{H}_2\text{O}$ ($0,5\text{ g}$), $1000\text{ ml}$ nước cất, $\text{pH } 6,8-7,0$, hấp khử trùng ở $121^\circ\text{C}$ trong 40 phút. Mẫu bệnh sau khi khử trùng bề mặt bằng cồn $70^\circ$ và $\text{H}_2\text{O}_2\ 3%$ được cấy trải, ủ ấm ở $30^\circ\text{C}$ từ 1–2 ngày và cấy chuyển 4 lần để thu đơn khuẩn lạc thuần khiết màu vàng sáp.
5. Kết quả kiểm tra tỷ lệ mang gen kháng trong 22 mẫu giống lúa đạt được như thế nào?
Kết quả phân tích phân tử ghi nhận: có 12/22 mẫu giống mang cả 2 gen kháng bạc lá Xa4 và Xa7; 4/22 mẫu giống mang cả 2 gen kháng đạo ôn Pi-ta và Pi-ta 2; và 13/22 mẫu giống mang gen kháng rầy nâu Bph4.
Kết luận
Khóa luận đã khảo sát toàn diện 22 mẫu giống lúa tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen cây trồng thông qua đánh giá nông sinh học đồng ruộng và phân tích chỉ thị phân tử DNA. Nghiên cứu đã xác định được đặc điểm thời gian sinh trưởng của tập đoàn giống, phân lập thành công vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae và sàng lọc được tỷ lệ cao các mẫu giống mang các gen kháng Xa4, Xa7, Pi-ta, Pi-ta 2, Bph4. Kết quả đã tuyển chọn được 2 mẫu giống triển vọng T62-14 và T62-4 cùng dòng ngắn ngày 574F10, đóng góp nguồn vật liệu khởi đầu có giá trị cho công tác chọn tạo giống lúa kháng sâu bệnh tại Việt Nam.
