CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 1. Khái niệm nuôi cấy mô [2] Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật đưa một mô, bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có kiểm soát về: thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận đó sinh trưởng, phát triển theo mục đích của người nuôi cấy. Kỹ thuật này dựa trên hai nguyên tắc sau: 1.
Tính toàn năng của tế bào Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Năm 1922 con người đã nuôi được đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo trong 12 ngày. Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào được chứng minh bằng thực nghiệm. Sau 43 năm (năm 1965), đã nuôi từng tế bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống nghiệm.
Kết quả này chứng minh đầy đủ tính toàn năng của tế bào. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng từ tế bào phôi. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này quay trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa.
Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó thì càng khó xảy ra quá trình phản biệt hóa, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh động vật. Người ta đã kết rằng: những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. 5 Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản rất dễ xảy ra quá trình phản biệt hóa.
Vì vậy nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murashige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật là giảm dần theo chiều hướng từ ngọn xuống gốc. Các tế bào động vật nói chung khó nuôi cấy hơn do chúng đã được biệt hóa quá sâu sắc và vì thế quá trình phản biệt hóa rất khó thực hiện. Các kỹ thuật nhân giống in vitro [3] 1. Nuôi cấy đốt thân Sử dụng mẫu cấy là một đoạn thân ngắn có chứa chồi ngủ.
Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá được hình thành. Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡng thích hợp đến khi đủ số lượng cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh trưởng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi.
Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh. Gieo hạt in vitro Hạt giống lan Gấm gieo trên môi trường nền có bổ sung các chất hữu cơ, hạt giống sẽ nảy mầm sau 4 tháng nuôi cấy. Cấy chuyển sang môi trường thích hợp có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, sau 4 tháng cấy chuyển qua môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Khi cây được 10 tháng tuổi, chuyển cây lan Gấm in vitro ra trồng trong khay ngoài vườn ươm có hệ thống làm mát (cooling pad hoặc phun sương).
6 Để nâng cao tỉ lệ nảy mầm của hạt lan gấm, hiện nay người ta dùng nấm Rhizoctonia cộng sinh với hạt, đã làm tăng tỉ lệ nảy mầm lên 80% trong môi trường OMA, gồm bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar. Các bước nhân giống in vitro [4] Để nhân giống được một cây con hoàn chỉnh có khả năng thích ứng với môi trường tự nhiên bằng phương pháp nhân giống in vitro thì trải qua 4 bước: Tạo thể nhân giống in vitro Nhân giống in vitro Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Chuyển cây in vitro ra vườn ươm. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi và thể cắt đốt, ngoài ra còn có thể giò.
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Nhân giống in vitro Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra ngoài vườn ươm.
Cây con phải mạnh khỏe nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy 7 ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Thường dùng các chất thuộc nhóm Auxin kích thích ra rễ.
Chuyển cây in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm.
Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo thành trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ. Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nhân giống in vitro [4] 1.
Ưu điểm So với các phương pháp nhân giống khác thì phương pháp nhân giống in vitro có một số thuận lợi là: Những cây nhân giống in vitro đồng nhất về di truyền. Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn… mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. Hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. Được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm. Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. Tạo dòng toàn cây cái hoặc toàn cây đực theo mong muốn. Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen.
8 Ngoài ra, phương pháp vi nhân giống còn giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dữ trữ lâu dài và chiếm ít thời gian so với phương pháp nhân giống truyền thống. Hạn chế Hạn chế chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quí hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo tồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy mô và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ.
Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiêu hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô [5] 1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản Nuôi cấy mô đã sớm mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống.
Thông qua nuôi cấy mô và tế bào chúng ta đã tiến hành so sánh đặc tính của cơ thể và các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể. Thực tế đã chứng minh là cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó là nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo và từ mô sẹo có thể kích thích thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương pháp nuôi cấy mô chúng ta có thể tiến hành tìm hiểu và nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ vì vậy mà bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản.
