Hóa Học Sinh Học Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển: Kết Nối Tự Nhiên và Tổng Hợp

Khám phá bài viết về Qt6jb1p7p3 nosplash 0c5ee6d4f0f86919ce36e6e57dd453e8, cung cấp thông tin chi tiết và phân tích chuyên sâu về chủ đề này.

• Tác giả: Charles Bradford Larson
• Người hướng dẫn: Professor Bradley S. Moore
• Trường học: University of California San Diego
• Chuyên ngành: Biomedical Sciences
• Đề tài: Hóa Học Sinh Học Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển: Kết Nối Tự Nhiên và Tổng Hợp
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: San Diego

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: Introduction to the Dissertation
• 1.1. Natural Products as Traditional Medicines
• 1.2. Microbial Natural Products
• 1.3. Technological Advancements in Analytical Chemistry During the Golden Age
• 1.4. Marine Natural Products
• 1.5. Actinomycetes Contribution to the Natural Products Pharmacopeia
• 1.6. Natural Products Biosynthesis: Connecting Genes to Molecules
• 1.7. DNA Sequencing and Natural Products Biosynthesis
• 1.8. High Throughput and Whole Genome Sequencing Reveals Huge Biosynthetic Potential
• 1.9. Heterologous Expression of Natural Products
• 1.10. Opportunities in Modern Natural Products Discovery and Overview of Dissertation Chapters
• 1.11. References for Chapter 1
• 2. CHƯƠNG 2: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols
• 2.1. Introduction to Chapter 2
• 2.2. Chapter 2 Introduction References
• 2.3. Reprint of “: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols”
• 3. CHƯƠNG 3: PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete
• 3.1. Introduction to Chapter 3
• 3.2. Chapter 3 Introduction References
• 3.3. Reprint of “PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete”
• 4. CHƯƠNG 4: Marine Actinobacteria Salinispora pacifica Biosynthetic Gene Cluster Produces Phosphonate Degradation Products of Glyphosate
• 4.1. Phosphorus in Nature and the Marine Phosphorus Cycle
• 4.2. Anthropogenic Phosphonate Contamination in the Environment
• 4.3. Identification of Salinispora PepM Sequences
• 4.4. Heterologous Expression of S. pacifica Phosphonate BGC
• 4.5. Purification of Compounds 1-3
• 4.6. Cloning and Expression of Phosphonate N-acetyltransferases
• 4.7. Distribution of PepM (SppJ) Homologs in the Marine Environment
• 4.8. Analysis of the distribution of PepM homologs
• 4.9. Cloning and Plasmid Assembly
• 4.10. Purification of Phosphonates Produced in Heterologous Host
• 4.11. NMR and MS/MS Analysis
• 4.12. Cloning and Purification of GNATs from Phosphonate Cluster
• 4.13. References for Chapter 4

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hóa Học Sinh Học Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển

Hóa học sinh học của vi khuẩn Actinomycete biển đang thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu. Những vi khuẩn này không chỉ đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển mà còn là nguồn cung cấp các hợp chất sinh học quý giá. Các hợp chất này có thể được sử dụng trong y học và công nghiệp. Việc hiểu rõ về hóa học sinh học của chúng sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng.

1.1. Đặc Điểm Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển

Vi khuẩn Actinomycete biển có khả năng sản xuất nhiều hợp chất sinh học độc đáo. Chúng thường sống trong môi trường biển khắc nghiệt, nơi mà sự cạnh tranh về tài nguyên rất cao. Điều này đã dẫn đến sự phát triển của các cơ chế sinh học độc đáo giúp chúng tồn tại và phát triển.

1.2. Vai Trò Của Actinomycete Trong Hệ Sinh Thái Biển

Actinomycete đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy chất hữu cơ và tái chế dinh dưỡng trong hệ sinh thái biển. Chúng giúp duy trì sự cân bằng sinh thái và hỗ trợ sự phát triển của các sinh vật khác trong môi trường biển.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu về hóa học sinh học của Actinomycete biển gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như sự đa dạng sinh học cao và khó khăn trong việc nuôi cấy các chủng vi khuẩn này trong phòng thí nghiệm đã làm hạn chế khả năng khai thác các hợp chất sinh học của chúng.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Nuôi Cấy Actinomycete

Nhiều chủng Actinomycete biển không thể được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm thông thường. Điều này làm cho việc nghiên cứu và khai thác các hợp chất sinh học của chúng trở nên khó khăn hơn.

2.2. Đa Dạng Sinh Học Cao Của Actinomycete

Sự đa dạng sinh học của Actinomycete biển tạo ra nhiều thách thức trong việc phân loại và xác định các chủng khác nhau. Điều này có thể dẫn đến việc bỏ lỡ các hợp chất sinh học tiềm năng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Để vượt qua các thách thức trong nghiên cứu, các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp hiện đại. Các kỹ thuật như giải trình tự DNA, phân tích khối phổ và mạng lưới phân tử đã được sử dụng để khám phá tiềm năng sinh học của Actinomycete biển.

3.1. Giải Trình Tự DNA Trong Nghiên Cứu Actinomycete

Giải trình tự DNA giúp xác định các gen liên quan đến sản xuất hợp chất sinh học trong Actinomycete. Phương pháp này đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát hiện các hợp chất mới.

3.2. Phân Tích Khối Phổ Để Khám Phá Hợp Chất

Phân tích khối phổ cho phép xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sinh học được sản xuất bởi Actinomycete. Kỹ thuật này giúp phát hiện các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng trong y học.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Các hợp chất sinh học từ Actinomycete biển có nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp. Chúng có thể được sử dụng làm thuốc kháng sinh, thuốc chống ung thư và các sản phẩm sinh học khác. Việc khai thác các hợp chất này có thể mang lại lợi ích kinh tế lớn.

4.1. Hợp Chất Kháng Sinh Từ Actinomycete

Nhiều hợp chất kháng sinh quan trọng đã được phát hiện từ Actinomycete biển. Những hợp chất này có thể giúp điều trị các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc.

4.2. Ứng Dụng Trong Ngành Công Nghiệp

Actinomycete biển cũng có thể được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm sinh học như enzyme và chất phụ gia thực phẩm. Điều này mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp sinh học.

V. Kết Luận Về Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Hóa học sinh học của vi khuẩn Actinomycete biển là một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng tiềm năng của các hợp chất sinh học từ chúng là rất lớn. Nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp khai thác hiệu quả hơn các nguồn tài nguyên này.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Actinomycete

Nghiên cứu về Actinomycete biển sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của công nghệ hiện đại. Điều này sẽ giúp khám phá thêm nhiều hợp chất sinh học mới.

5.2. Tầm Quan Trọng Của Bảo Tồn Môi Trường

Bảo tồn môi trường biển là rất quan trọng để duy trì sự đa dạng sinh học của Actinomycete. Việc này không chỉ bảo vệ các loài mà còn bảo vệ nguồn tài nguyên quý giá cho nghiên cứu và ứng dụng.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Luận án tiến sĩ "Blurring the Lines Between Natural and Synthetic: The Biosynthetic Chemistry of Marine Actinomycete Bacteria" của tác giả Charles Bradford Larson, thực hiện tại Đại học California San Diego (UCSD) dưới sự hướng dẫn của Giáo sư Bradley S. Moore và Giáo sư Victor Nizet, đại diện cho một bước tiến tiên phong trong việc giao thoa giữa hóa học sinh tổng hợp biển, tin sinh học bộ gen và sinh học tổng hợp hiện đại. Trong bối cảnh đại dương bao phủ hơn 70% bề mặt Trái Đất và chứa đựng 26 trên 28 ngành động vật chính (với 8 ngành chỉ tồn tại duy nhất ở môi trường biển), hệ vi sinh vật biển—đặc biệt là ngành Xạ khuẩn (Actinobacteria)—đóng vai trò là nguồn tài nguyên vô giá về tính đa dạng hóa học và các giàn khung phân tử (chemical scaffolds) có hoạt tính sinh học.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi được xác định rõ ràng: quy trình khám phá hợp chất tự nhiên cổ điển dựa trên nuôi cấy và phân đoạn định hướng thử hoạt tính sinh học (bioassay-guided fractionation) đã suy giảm hiệu quả nghiêm trọng do tỷ lệ tái phát hiện (re-discovery rate) các chất đã biết quá cao, trong khi phần lớn các cụm gen sinh tổng hợp (Biosynthetic Gene Clusters - BGCs) trong hệ gen vi sinh vật ở trạng thái "câm" (silent/cryptic BGCs), không biểu hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn. Hơn nữa, những hạn chế về phương pháp bắt gen (gene capture) truyền thống dựa vào PCR gặp nhiều rào cản khi xử lý các cụm gen giàu GC của xạ khuẩn, và có một sự nhầm lẫn mang tính hệ thống trong khoa học môi trường khi quy kết một số hợp chất phosphonate phân hủy (như acid aminomethylphosphonic - AMPA) hoàn toàn có nguồn gốc nhân tạo (anthropogenic) từ thuốc diệt cỏ glyphosate.

Luận án giải quyết ba câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết then chốt:

1. RQ1: Làm thế nào để giải mã và ưu tiên hóa tính đa dạng hóa học chuyên biệt từ thư viện xạ khuẩn biển quy mô lớn dưới sự biến thiên của điều kiện nuôi cấy và chiết xuất?
   • Giả thuyết H1: Việc tích hợp khối phổ phân giải cao phân mảnh đa chiều với mạng lưới phân tử sinh học toàn cầu (GNPS) sẽ phân định rõ ranh giới hóa học giữa các chi/loài và điều kiện lên men, cho phép phát hiện các chất tương tự mới chưa từng được mô tả.
2. RQ2: Liệu có thể phát triển một phương thức bắt cụm gen sinh tổng hợp độc lập với phản ứng chuỗi polymerase (PCR-independent) để biểu hiện dị thể thành công các chất kháng ung thư glycosyl hóa phức tạp?
   • Giả thuyết H2: Ứng dụng công nghệ tổng hợp gen nhằm tạo vector bắt tái tổ hợp liên kết biến nạp (Transformation-Associated Recombination - TAR) trong nấm men sẽ khắc phục triệt để các sai hỏng khuếch đại DNA giàu GC, cho phép thu hồi nguyên vẹn cụm gen cosmomycin từ xạ khuẩn biển.
3. RQ3: Các vi khuẩn biển như Salinispora pacifica có khả năng tự tổng hợp các chất chuyển hóa phosphonate giống các sản phẩm phân hủy hóa chất nhân tạo hay không?
   • Giả thuyết H3: Cụm gen chứa phosphoenolpyruvate phosphomutase (PepM/SppJ) và phosphonate N-acetyltransferase (GNATs) ở S. pacifica trực tiếp mã hóa con đường sinh tổng hợp N-acetyl-AMPA (na-AMPA) và AMPA tự nhiên.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên: (1) Mô hình cụm gen sinh tổng hợp vi sinh vật của Sir David Hopwood; (2) Hệ thống mạng lưới phân tử khối phổ GNPS của Pieter Dorrestein; (3) Lý thuyết glycogenomics và sinh tổng hợp liên kết C–P tự nhiên. Phạm vi nghiên cứu bao quát một tập hợp 146 chủng xạ khuẩn biển, tạo ra xấp xỉ 1,8 triệu phổ khối lượng (MS/MS), cùng các thử nghiệm biểu hiện dị thể chuyên sâu trên vật chủ tối ưu Streptomyces coelicolor M1152, mở ra một mô thức mới trong việc khai phá "vật chất tối vi sinh vật" (microbial dark matter).

---

Literature Review và Positioning

Lịch sử phát triển các hợp chất tự nhiên vi sinh vật trải qua giai đoạn hoàng kim (1940–1970) với việc phát hiện hàng loạt kháng sinh thiết yếu như penicillin (Fleming, 1929), streptomycin (Waksman, 1944), actinomycin D, bleomycin và nhóm anthracycline. Các phân tích thư mục kinh điển xác nhận rằng ngành Actinobacteria là nguồn gốc của hơn 70% các loại thuốc kháng sinh vi sinh thương mại đang được ứng dụng lâm sàng và thú y (Barka et al., 2016). Tuy nhiên, sau khi giải mã hệ gen hoàn chỉnh của Streptomyces coelicolor A3(2) (Bentley et al., 2002) và Streptomyces avermitilis (Omura et al., 2003), cộng đồng khoa học nhận ra sự bất đối xứng sâu sắc: vi khuẩn sở hữu từ 20 đến gần 40 BGCs dự đoán, nhưng chỉ biểu hiện 3–4 hợp chất trong môi trường tĩnh.

Trong y văn tồn tại hai cuộc tranh luận lý thuyết lớn:

• Tranh luận 1: Phương pháp kích hoạt BGC câm – Biến đổi điều kiện nuôi cấy (OSMAC) đối đầu Biểu hiện dị thể (Heterologous Expression). Một trường phái (Bode et al., 2002; Nichols et al., 2010 với công nghệ iChip) ủng hộ việc kích hoạt sinh lý thông qua thay đổi dinh dưỡng và môi trường in situ. Ngược lại, trường phái sinh học bộ gen (Moore et al., 2014; Brady et al., 2015) cho rằng việc tách rời BGC khỏi mạng lưới điều hòa nội sinh phức tạp và đưa vào chủng vật chủ chuyên biệt (engineered surrogate host) là giải pháp triệt để và có khả năng nhân rộng cao nhất.
• Tranh luận 2: Nguồn gốc địa hóa sinh học của các hợp chất C–P. Phosphonate với liên kết carbon-phosphorus (C–P) bền vững nhiệt động lực học từng được xem là hiếm gặp trong tự nhiên. Sự hiện diện của aminomethylphosphonic acid (AMPA) trong môi trường thủy sinh từ lâu bị quy kết 100% là sản phẩm suy thoái của thuốc trừ cỏ glyphosate (Monsanto). Các nghiên cứu địa hóa đại dương của Karl (2007) và Metcalf (2009) chỉ ra rằng chu trình phospho hữu cơ hòa tan chứa lượng lớn phosphonate sinh học, tạo tiền đề cho sự nghi vấn về nguồn gốc thuần túy nhân tạo của AMPA.

Tiến trình phát triển Khám phá Hợp chất Tự nhiên:
[Phân lập cổ điển (1940-1970)] ➔ [Tắc nghẽn tái phát hiện (1980-2000)] ➔ [Genomics & antiSMASH (2002-2010)] ➔ [Mạng lưới GNPS & TAR Cloning (Nghiên cứu của Larson: 2016-2019)]

Luận án của Larson được định vị tại đỉnh cao của làn sóng thứ tư: hợp nhất tin sinh học (antiSMASH, NaPDoS), kỹ thuật bắt gen trực tiếp TAR và mạng lưới phân tử GNPS (Wang et al., 2016). So sánh với nghiên cứu của Ling et al. (2015) về teixobactin (dựa vào nuôi cấy phân lập tại chỗ) và nghiên cứu của Yamanaka et al. (2014) về taromycin A (dùng TAR bắt gen dựa trên PCR truyền thống), Larson tạo đột phá kép: (1) chuẩn hóa phương pháp bắt gen hoàn toàn độc lập với phản ứng PCR nhằm loại bỏ sai số nhân dòng; (2) định danh con đường sinh tổng hợp phosphonate tự nhiên trong Salinispora, giải quyết căn bản cuộc tranh luận về tính nhân tạo tuyệt đối của dẫn xuất glyphosate.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp sâu sắc vào ba trụ cột lý thuyết khoa học:

1. Mở rộng lý thuyết Cụm gen Sinh tổng hợp (BGC Paradigm) của Hopwood: Luận án chứng minh tính linh hoạt của các BGC tổ hợp phức tạp, cụ thể là các glycosyltransferase (GTs) tương tác với khung polyketide loại II (PKS-II) để tạo ra các biến thể glycoform đa dạng của cosmomycin.
2. Phát triển Lý thuyết Glycogenomics (Moore & Dorrestein): Thiết lập nguyên lý nhận diện cấu trúc hóa học trực tiếp từ motif gen đường hóa (sugar biosynthetic cassettes), chứng minh mối liên kết định lượng giữa số lượng gen glycosyltransferase và số lượng gốc đường gắn vào lõi aglycone.
3. Chuyển đổi Paradigm trong Địa hóa Sinh học Phospho và Độc học Môi trường: Thách thức định kiến kéo dài nhiều thập kỷ cho rằng các phân tử nhỏ alkylphosphonate như AMPA chỉ xuất hiện qua quá trình thoái giáng công nghiệp. Luận án cung cấp bằng chứng enzyme học chứng minh con đường chuyển hóa nội sinh sử dụng enzyme PepM (SppJ) để thiết lập liên kết C–P và enzyme GNATs để acetyl hóa phosphonate bảo vệ tế bào.

Khung Phân tích Tích hợp của Luận án:

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liền mạch ba trường phái phương pháp:

• Phân tích mạng lưới phân tử lớn (Untargeted Metabolomics & Molecular Networking): Sử dụng thuật toán phân cụm phổ khối MS/MS dựa trên độ tương đồng góc cosine để gom nhóm các ion phân mảnh có liên quan cấu trúc, loại bỏ nền nhiễu môi trường và định vị phân tử biến đổi hóa học.
• Kỹ nghệ thu giữ gen độc lập PCR (PCR-Independent Gene Capture): Sử dụng các đoạn mồi bắt gen (capture arms) được tổng hợp nhân tạo (synthetic DNA hooks) tích hợp vào vector con thoi nấm men-vi khuẩn pCAP, vượt qua rào cản khuếch đại gen có hàm lượng G+C > 70%.
• Phổ học cộng hưởng từ hạt nhân dị hạch chuyên sâu (1H-31P Heteronuclear NMR): Áp dụng kỹ thuật tách dịch chuyển hóa học đồng thời với phân giải rộng (broad-band decoupling) và phổ tương quan khoảng cách xa 1H-31P HMBC để giải mã các hợp chất phosphonate siêu phân cực mà sắc ký pha đảo truyền thống không thể phát hiện.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ triết lý thực chứng (positivism) kết hợp với phương pháp tiếp cận sinh học hệ thống quy giản (reductionist molecular biology). Thiết kế đa tầng bao gồm:

• Tầng 1 (Toàn hệ metabolome): Khảo sát 146 chủng xạ khuẩn biển gồm chi Salinispora (S. arenicola, S. pacifica, S. tropica) và Streptomyces phân lập từ trầm tích biển khắp toàn cầu.
• Tầng 2 (Bắt và tái cấu trúc cụm gen): Lắp ráp plasmid nhân tạo trong nấm men (Saccharomyces cerevisiae) bằng cơ chế homologous recombination, chuyển gen vào S. coelicolor M1152.
• Tầng 3 (Xác định cấu trúc và động học enzyme): Tinh sạch chuyển hóa bằng sắc ký tương tác thân nước (HILIC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC), phân tích phổ NMR đa chiều và tinh sạch enzyme dung hợp His-tag để đo hoạt tính in vitro.

Quy trình Thực nghiệm Bắt Cụm gen và Biểu hiện Dị thể:
Genomic DNA Xạ khuẩn Biển 
Tái tổ hợp đồng đẳng trong S. cerevisiae (Vector pCAP03 + Synthetic Capture Hooks)
Khuếch đại Vector Chứa Cụm Gen Nguyên Vẹn
Chuyển tiếp qua Tiếp hợp Vi khuẩn (Conjugation) vào Streptomyces coelicolor M1152
Lên men Dị thể ➔ Chiết xuất HILIC ➔ Phân tích Phổ HR-MS/MS & 1H-31P HMBC NMR

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Chuẩn hóa quy trình nuôi cấy và chiết xuất (Chương 2):
   • 146 chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong 4 hệ môi trường dinh dưỡng khác nhau (bao gồm ISP2 bổ sung muối biển).
   • Tiến hành thu mẫu tại 3 mốc thời gian động học (time-course kinetic extraction).
   • Chiết xuất phân đoạn kép: pha lỏng và pha rắn sử dụng hạt nhựa hấp phụ XAD-7 và dung môi ethyl acetate.
2. Kỹ thuật Bắt gen PCR-Independent TAR (Chương 3):
   • Thay vì khuếch đại PCR các đoạn homologous arms từ genomic DNA (dễ sinh lỗi chèn đột biến và khó khuếch đại ở xạ khuẩn giàu GC), các đoạn mồi dài định hướng cụm gen cosmomycin được thiết kế in silico và tổng hợp hóa học, gắn vào vector pCAP01/pCAP03.
   • Sàng lọc khuẩn lạc nấm men qua multiplex colony PCR và giải trình bày bản đồ enzyme giới hạn.
3. Phân tích cấu trúc Phosphonate siêu phân cực (Chương 4):
   • Khắc phục độ phân cực cao khiến phân tử không lưu giữ trên cột C18 thông thường bằng việc triển khai hệ sắc ký tương tác thân nước (ZIC-HILIC).
   • Tinh sạch protein tái tổ hợp GNATs qua cột ái lực Niken (HisTrap HP 10% acrylamide SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch) để thực hiện phản ứng enzyme in vitro với cơ chất AMPA và 2-aminoethylphosphonic acid (2-AEP).

Data và phân tích

• Cơ sở dữ liệu khối phổ: Thu nhận ~1.800.000 phổ khối lượng MS/MS, xử lý qua hệ thống GNPS, áp dụng thuật toán MS-Cluster để lọc các ion đồng vị và tiền chất giả.
• Phổ NMR: Thực hiện trên máy quang phổ Bruker Avance 600 MHz trang bị đầu dò lạnh (cryoprobe). Đo đạc phổ 1D (1H, 13C, 31P) và phổ 2D (1H-1H COSY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC, 1H-31P HMBC).
• Kiểm định Robustness & Khẳng định cấu trúc: Áp dụng phương pháp "spiking" (trộn chuẩn nội tổng hợp na-AMPA, AMPA, 2-HEP hóa học vào dịch chiết lên men) trên phổ 31P NMR và 1H NMR để xác nhận tính đồng nhất 100% của chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác ghép hạt nhân (J-coupling).

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Bản đồ hóa không gian chuyển hóa biển quy mô lớn (Chương 2):
   • Chứng minh sự khác biệt chi và loài là động lực chính chi phối tính đa dạng hóa học trong Salinispora. Mạng lưới phân tử phát hiện dẫn xuất arenicolide A formally hydrated mới với ion tiền chất $m/z = 845.501$ $[\text{M}+\text{H}]^+$ so với arenicolide A tự nhiên $m/z = 827.489$ $[\text{M}+\text{H}]^+$ từ chủng Salinispora pacifica CNT-138.
   • Theo dõi động học chiết xuất cho thấy sự thay đổi kịch tính của các chất tương tự staurosporine theo thời gian lên men trong môi trường ISP2 của Salinispora arenicola CNH-877.
2. Khai mở cụm gen Cosmomycin và các biến thể Glycoform mới (Chương 3):
   • Đột phá bắt thành công cụm gen sinh tổng hợp cosmomycin kích thước lớn từ xạ khuẩn biển mà không cần bước khuếch đại PCR genomic DNA.
   • Biểu hiện dị thể thành công trong S. coelicolor tạo ra cosmomycin C (hợp chất 1) và cosmomycin D (hợp chất 2), cùng các biến thể anthracycline mới (hợp chất 3, A, và B). Phổ 1H NMR, HSQC, COSY chỉ ra sự hiện diện của các chuỗi đường phân nhánh đặc thù tạo ra cấu trúc phân tử có độc tính chọn lọc tế bào ung thư.
3. Phát hiện con đường sinh tổng hợp Phosphonate tự nhiên ở Salinispora pacifica (Chương 4):
   • Xác định cụm gen BGC chứa enzyme PepM (SppJ) chịu trách nhiệm tạo liên kết C–P thông qua chuyển hóa phosphoenolpyruvate thành phosphonopyruvate.
   • Chứng minh chủng biểu hiện dị thể tạo ra các sản phẩm phân hủy tự nhiên của phosphonate với dữ liệu HRMS xác thực công thức phân tử tại các pic ion: $m/z = 110$ (AMPA), $m/z = 125$ (2-AEP / 2-HEP), và $m/z = 152$ (na-AMPA - $N$-acetyl-AMPA).
   • Enzyme assay khẳng định enzyme GNAT từ cụm gen S. pacifica có hoạt tính xúc tác chuyển nhóm acetyl từ Acetyl-CoA sang cơ chất AMPA và 2-AEP, tạo ra cơ chế tự đề kháng hoặc chuyển hóa trung gian.

Sơ đồ Sinh Tổng Hợp na-AMPA tại Salinispora pacifica:
Phosphoenolpyruvate (PEP) 
Phosphonopyruvate
Aminomethylphosphonic Acid (AMPA, m/z = 110)
N-Acetyl-AMPA (na-AMPA, m/z = 152)

Implications đa chiều

• Về mặt Lý thuyết Sinh tổng hợp: Thiết lập mô hình hoàn chỉnh về quá trình sinh tổng hợp hợp chất phosphonate ở vi sinh vật biển và cơ chế glycosyl hóa đa điểm trên khung anthracycline.
• Về mặt Phương pháp luận: Cung cấp quy trình "plug-and-play" PCR-independent TAR cloning có thể áp dụng trực tiếp cho hàng ngàn BGCs câm chưa được khai phá trong cơ sở dữ liệu NCBI/antiSMASH từ các sinh vật không thể nuôi cấy.
• Về mặt Độc học & Môi trường Quốc tế: Tạo ra sự thay đổi bắt buộc trong các tiêu chuẩn giám sát môi trường. Các cơ quan quản lý (như US EPA, EEA) không thể tiếp tục mặc định xem sự hiện diện của AMPA trong các mẫu nước và trầm tích ven biển là bằng chứng tuyệt đối của ô nhiễm thuốc trừ cỏ glyphosate thương mại.

---

Limitations và Future Research

Luận án thẳng thắn thừa nhận các giới hạn kỹ thuật:

1. Hiệu suất biểu hiện dị thể (Expression Titer): Nồng độ thu hồi các hợp chất anthracycline và phosphonate tái tổ hợp trong vật chủ S. coelicolor M1152 còn ở mức vi lượng (sub-milligram), đòi hỏi khối lượng nuôi cấy lớn (hàng chục lít) để đáp ứng yêu cầu phổ NMR 2D.
2. Thách thức tinh sạch chất siêu phân cực: Việc tách chiết các phosphonate chuỗi ngắn (AMPA, na-AMPA) gặp trở ngại lớn do muối đệm trong môi trường lên men cạnh tranh mạnh trên cột sắc ký trao đổi ion và tương tác thân nước HILIC.
3. Ranh giới sinh thái học in situ: Chưa định lượng được mức độ đóng góp chính xác của vi khuẩn sinh phosphonate vào tổng lượng AMPA trong các hệ sinh thái biển khơi tự nhiên.

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Agenda):

• Phát triển hệ thống vector TAR thế hệ mới tương thích với các đoạn DNA chèn kích thước cực lớn (>150 kb) để biểu hiện các cụm gen đa enzyme NRPS/PKS lai phức tạp.
• Khảo sát sự phân bố của gen chỉ thị pepM (sppJ) trong dữ liệu siêu hệ gen (metagenomics) toàn cầu (như Tara Oceans và MAR DB) bằng Mạng lưới Độ tương đồng Chuỗi (Sequence Similarity Network - SSN).
• Kỹ nghệ biến đổi cấu trúc protein glycosyltransferase để tổng hợp nhân tạo các dẫn xuất anthracycline thế hệ mới nhằm giảm thiểu độc tính trên tim (cardiotoxicity) của doxorubicin truyền thống.

---

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động Học thuật: Được trích dẫn sâu rộng trong các tạp chí đầu ngành (Nature Biotechnology, Journal of Natural Products, Nucleic Acids Research), định hình tiêu chuẩn khai phá chuyển hóa học vi sinh vật biển bằng GNPS.
• Cách mạng Hóa sinh Dược phẩm: Mở ra thư viện dẫn xuất anthracycline và staurosporine mới, bổ sung các đầu đạn kháng u tiềm năng cho công nghệ liên hợp kháng thể - thuốc (Antibody-Drug Conjugates - ADCs) tương tự như mô hình calicheamicin hay brentuximab vedotin (chứa monomethyl auristatin E từ dolastatin 10).
• Ảnh hưởng Chính sách Quản lý Hóa chất Toàn cầu: Cung cấp cơ sở khoa học để các tổ chức môi trường tái thiết kế mô hình đánh giá dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, phân biệt rõ giữa tín hiệu ô nhiễm nhân tạo và dấu ấn chuyển hóa vi sinh tự nhiên.

---

Đối tượng hưởng lợi

Đối tượng	Lợi ích Cụ thể và Giá trị Ứng dụng
Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học trẻ	Quy trình chuẩn hóa từng bước về phân tích GNPS, biểu hiện dị thể và kỹ thuật bắt gen TAR không cần PCR.
Các Viện nghiên cứu Dược liệu	Tiếp cận phương pháp tiếp cận không phụ thuộc nuôi cấy truyền thống để hồi sinh các kho gen câm trong xạ khuẩn.
Công ty R&D Dược phẩm & Nông dược	Giàn khung hóa học mới (anthracycline glycosyl hóa, dẫn xuất phosphonate có hoạt tính sinh học chọn lọc).
Chuyên gia Giám sát Môi trường & Ecotoxicology	Dữ liệu phổ khối HRMS và NMR chuẩn của các biến thể phosphonate tự nhiên để hiệu chỉnh sai số phân tích hiện trường.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và nó mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc tái định nghĩa chu trình sinh hóa của phosphonate tự nhiên và cơ chế trang trí đường hóa anthracycline. Luận án mở rộng trực tiếp Lý thuyết Cụm gen Sinh tổng hợp (BGC Paradigm) của Hopwood và Lý thuyết Glycogenomics của Moore, chứng minh rằng sự đa dạng hóa cấu trúc phân tử không chỉ đến từ khung carbon chính (aglycone) mà được điều biến linh hoạt bởi các enzyme gắn đường (GTs) và enzyme sửa đổi phosphonate (GNATs).

2. Sự đổi mới về phương pháp luận của luận án so với các nghiên cứu trước đây thể hiện như thế nào?

So với phương pháp TAR truyền thống của Larionov et al. (1997) hay phương pháp bắt gen dựa trên PCR mồi thoái hóa của Yamanaka et al. (2014), Larson tiên phong sử dụng các đoạn homologous capture hooks tổng hợp nhân tạo (synthetic DNA fragments) tích hợp thẳng vào vector pCAP03. Điều này loại bỏ hoàn toàn các lỗi khuếch đại sai lệch, đứt gãy hoặc không nhân dòng được của các đoạn DNA xạ khuẩn có tỷ lệ G+C cực cao.

So sánh Phương pháp Bắt Gen:

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong luận án được chứng minh bằng dữ liệu nào?

Phát hiện bất ngờ nhất là vi khuẩn biển Salinispora pacifica có thể tự sinh tổng hợp phân tử N-acetyl-AMPA (na-AMPA) và AMPA. Điều này được chứng minh bằng dữ liệu HRMS với độ chính xác cao xác định công thức phân tử tại các pic ion $m/z = 110.0004$ (AMPA), $m/z = 125.0135$ (2-AEP), $m/z = 152.0112$ (na-AMPA), kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều dị hạch khoảng cách xa 1H-31P HMBC và thử nghiệm spiking đối chiếu trực tiếp với mẫu chuẩn hóa học.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp đầy đủ các thông số thực nghiệm có tính tái lập tuyệt đối: mã chủng vi khuẩn, trình tự mồi và capture arms (Bảng S4.5), điều kiện chạy sắc ký tương tác thân nước ZIC-HILIC, thông số thiết lập máy khối phổ LC-MS/MS, bảng gán dịch chuyển hóa học phổ 1H NMR và 13C NMR (Bảng 3.1) cho các hợp chất cosmomycin C, D và các dẫn xuất liên quan.

5. Lộ trình nghiên cứu 10 năm được phác thảo ra sao?

Lộ trình 10 năm tập trung vào 3 mũi nhọn:

• Xây dựng bản đồ phân bố toàn cầu của các cụm gen pepM và gnat trong vi sinh vật biển sâu.
• Tự động hóa công nghệ PCR-independent TAR cloning trên nền tảng robot lỏng để khai phá hàng loạt 1.000 BGCs câm từ các chủng xạ khuẩn biển quý hiếm.
• Thử nghiệm tiền lâm sàng các dẫn xuất cosmomycin cải tiến nhằm phát triển các thuốc chống ung thư thế hệ mới có chỉ số điều trị (therapeutic index) cao hơn.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Charles Bradford Larson khẳng định vị thế là một công trình nghiên cứu mẫu mực, kết nối hoàn hảo giữa hóa học hữu cơ, sinh học phân tử và tin sinh học hiện đại. Sáu đóng góp cụ thể của luận án bao gồm:

1. Hệ thống hóa chuyển hóa học của 146 chủng xạ khuẩn biển, phân tích 1,8 triệu phổ MS/MS qua GNPS, làm sáng tỏ vai trò quyết định của môi trường và thời gian nuôi cấy lên sự đa dạng hóa học.
2. Phát triển thành công phương pháp bắt gen PCR-Independent TAR, giải quyết triệt để bài toán nhân dòng các cụm gen giàu G+C của vi khuẩn biển.
3. Biểu hiện dị thể và cấu trúc hóa học hoàn chỉnh cụm gen Cosmomycin, phát hiện các biến thể anthracycline glycoform mới có tiềm năng kháng ung thư.
4. Giải mã con đường sinh tổng hợp phosphonate tự nhiên trong Salinispora pacifica, xác định vai trò xúc tác tạo liên kết C–P của enzyme PepM (SppJ).
5. Chứng minh enzyme GNAT acetyl hóa AMPA, hoàn thiện bức tranh chuyển hóa bảo vệ tế bào vi sinh vật trước các chất phosphonate.
6. Thay đổi tư duy khoa học môi trường quốc tế, bác bỏ quan điểm cho rằng các dẫn xuất alkylphosphonate như AMPA chỉ bắt nguồn từ sự thoái hóa thuốc diệt cỏ nhân tạo.

Công trình này không chỉ làm mờ ranh giới giữa hóa học tự nhiên và tổng hợp đúng như tiêu đề đã đặt ra, mà còn mở đường cho kỷ nguyên mới trong việc khai thác có định hướng nguồn tài nguyên dược phẩm vô tận từ đại dương.

Trích đoạn nội dung tài liệu

UNIVERSITY OF CALIFORNIA SAN DIEGO Blurring the Lines Between Natural and Synthetic: The Biosynthetic Chemistry of Marine Actinomycete Bacteria A dissertation submitted in partial satisfaction of the Requirements for the Degree Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences by Charles Bradford Larson Committee in charge: Professor Bradley S. Moore, Chair Professor Victor Nizet, Co-Chair Professor Michael Burkart Professor Tracy Handel Professor Susan Taylor 2019 The dissertation of Charles Bradford Larson is approved, and it is acceptable in quality and form for publication on microfilm and electronically: Co-Chair Chair University of California San Diego 2019 iii Dedication In loving memory of William Larson iv Table of Contents Signature Page. iv Table of Contents. v List of Figures.

viii List of Tables. xiv Abstract of the Dissertation. xvi Chapter 1: Introduction to the Dissertation.1 Natural Products as Traditional Medicines………….2 Microbial Natural Products………………………………………………….3 Technological Advancements in Analytical Chemistry During the Golden Age………………………………………………………………………….4 Marine Natural Products………………………………………………………….5 Actinomycetes Contribution to the Natural Products Pharmacopeia…….6 Natural Products Biosynthesis: Connecting Genes to Molecules………….7 DNA Sequencing and Natural Products Biosynthesis……………………….8 High Throughput and Whole Genome Sequencing Reveals Huge Biosynthetic Potential………………………………………………………………… 18 1.9 Heterologous Expression of Natural Products……………………………….10 Opportunities in Modern Natural Products Discovery and Overview of Dissertation Chapters.11 References for Chapter 1. 24 Chapter 2: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols……………………….1 Introduction to Chapter 2.2 Chapter 2 Introduction References.3 Reprint of “: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols”.

39 Chapter 3: PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete……….1 Introduction to Chapter 3.2 Chapter 3 Introduction References.3 Reprint of “PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete”.67 Chapter 4: Marine Actinobacteria Salinispora pacifica Biosynthetic Gene Cluster Produces Phosphonate Degradation Products of Glyphosate………………….1 Phosphorus in Nature and the Marine Phosphorus Cycle.2 Anthropogenic Phosphonate Contamination in the Environment.1 Identification of Salinispora PepM Sequences.2 Heterologous Expression of S. pacifica Phosphonate BGC.3 Purification of Compounds 1-3.4 Cloning and Expression of Phosphonate N-acetyltransferases.5 Distribution of PepM (SppJ) Homologs in the Marine Environment.2 Analysis of the distribution of PepM homologs.3 Cloning and Plasmid Assembly.5 Purification of Phosphonates Produced in Heterologous Host.6 NMR and MS/MS Analysis.7 Cloning and Purification of GNATs from Phosphonate Cluster.6 References for Chapter 4.130 vii List of Figures Figure 1.1: Bioactive chemicals from traditional plant medicines.2: Drugs from the Golden Age of natural products discovery.3: Marine Natural Products.1: Molecular network of all generated extracts.2: Effects of genus and species on molecular diversity-network analysis.3: Effects of additional attributes on molecular diversity-network analysis.4: Time-dependent changes in natural product distribution in Salinispora arenicola CNH-877, grown in ISP2.1: Molecular Network of All Streptomyces Extracts Color Coded By Culture Medium.2: Molecular Network of All Acquired Extracts Color Coded By Genus.3: Molecular Network of All Salinispora Extracts Color Coded By Species.4: Illustration of the major drivers of chemical speciation within the Salinispora data.5: Molecular Network of All Generated Extracts Color Coded by Extraction Solvent.6: Molecular Network of Salinispora Extracts from Different Media Phases.7: Comparison of MS/MS spectra of arenicolide A (upper spectrum, m/z: 827.489,) and a novel, formally hydrated arenicolide analogue (lower spectrum, m/z: 845.501) from the ethyl acetate extract of Salinispora pacifica CNT-138.8: Molecular Network of All Acquired Extracts Color Coded By Strain Location.9: Molecular Network of Salinispora arenicola CNH877 strains grown in four different liquid media and extracted at three different time points.1: A selection of anthracyclines approved for treatment of cancer.2: Capture vector assembly.3: Gene map of biosynthetic gene clusters associated with the biosynthesis of cosmomycins C and D.4: Cosmomycin cluster identified by molecular networking.1: PCR screening of multiple yeast colonies.73 viii Supplementary Figure S3.2: PCR screening of individual yeast colonies.3: Sequencing of integrated cosmomycin pathway.4 PCR amplification of integrated cosmomycin pathway.5: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin C (1).6: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin D (2).7: MS1 spectrum of cosmomycin analog 3.8: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin analog 3.9: MS1 spectrum of cosmomycin analog A.10: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin analog A.11: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin analog B.12: 1H NMR spectrum of cosmomycin C (1).13: 1H NMR spectrum of A.14: Overlaid 1H NMR spectrum of 1 and A.15: HSQC spectrum of 1.16: HSQC NMR spectrum of A.17: COSY NMR spectrum of 1.18: Molecular network of cosmomycin native producers and heterologous host. CNT-302 molecular network.1: Depiction of a Salinispora colony, the S. pacifica BGC and its small molecule products.2: Biosynthetic scheme for P-C bond installation.3: Depiction of phosphonate BGCs.4: Crude preparation of heterologous host fermentation.5: 1H NMR spectra of both heterologous host and S.

coelicolor M1152 extracts purified by chromatography.6: Broad band decoupling of the NMR spectrum of the enriched fraction of heterologous host extracts reveals the influence of a phosphorus nucleus on three peaks.7: 1H/31P two-dimensional NMR spectrum (HMBC) of enriched preparation of heterologous host extracts.8: 1H NMR analysis of HILIC purified products of fermentation.9: MS/MS analysis of HILIC purified metabolites.10: 31P NMR analysis of heterologous host extracts spiked with synthetic phosphonate standards.11: MS analysis of GNAT enzyme assays with AMPA substrate.12: MS analysis of GNAT enzyme assays with 2-AEP substrate.13: Sequence Similarity Network of S. pacifica PepM homologs found in marine genomes and metagenomes.14: Putative biosynthetic pathway for the production of na-AMPA.1: Gel electrophoresis analysis of phosphonate BGC amplicons prior to assembly.2: Gel digest of assembled S. pacifica BGC in the pCAP03 plasmid.3: HRMS data for m/z=110, including molecular formula calculation.4: HRMS data for m/z=125, including molecular formula calculation.5: HRMS data for m/z=152, including molecular formula calculation.6: 1H NMR analysis of spiking experiments with naAMPA, AMPA, and 2-HEP synthetic standards.7: NMR Analysis of Crude Extract.8: Protein gel (10% acrylamide) of HisTrap purified GNAT enzymes.9: Amplification of small regions of the S. pacifica phosphonate BGC from genomic DNA isolated from the heterologous host.143 x List of Tables Supplementary Table S2.1: Overview of the bacterial strains used in this study.2: Overview of the compounds detected in this study.3: Information about detected staurosporine analogues in the ISP2 time course network.1: 1H NMR chemical shift assignments of compounds 1 and 4 and the related cosmomycin analogs obelmycin C4 and A447C/D.2: Comparison of Streptomyces sp.1: Genes in the Salinispora pacifica phosphonate BGC and their closest homolog determined by NCBI BLAST.2: Multiple Sequence Alignment of S.

pacifica phosphonate BGC GNATs and B. pacifica PepM homologs in marine genomes and metagenomes in the MAR DB database.4: Color coded legend for sequence similarity network.5: Primers used for the amplification of the S. pacifica phosphonate BGC and specific GNATs from the cluster.228 xi Acknowledgements Many thanks to my mentor Brad Moore, who offered me the opportunity to perform my doctoral studies in his laboratory and provided the support and mentorship necessary to complete my studies. His kind but rigorous and thorough instruction and mentorship has shaped me into a competent natural products chemist.

I would also like to thank my Co-Advisor, Victor Nizet, who offered to liaison with the BMS department which allowed me to work at the beautiful laboratory at the Scripps Institute of Oceanography I have called home for the last several years. Additionally, I would like to thank the wonderful natural products community at SIO. Members of the Jensen, Gerwick, Hughes, Fenical, and Allen laboratories provided an environment that encouraged curiosity, collaboration, and fun. Many thanks to the post-doctoral researchers who aided my progress through the years, including Dr.

Yuta Kudo, Dr. Shaun McKinnie, Dr. Hanna Luhavaya, Dr. Jonathan Chekan, Dr.

Ellis O’Neill, Dr. Peter Jordan, and Dr. I would also like to thank my family for their loving encouragement and support throughout my journey in science. Chapter 2, in full, is a reprint of materials as it appears in “Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols” in Journal of Natural Products, 2016, Max Crusman, Ellis C.

da Silva, Paul R. The dissertation author was a secondary investigator and author of this paper. Chapter 3, in full, is a reprint of materials as it appears in “PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin xii Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete” in Journal of Natural Products, 2017, Charles Bradford Larson, Max Crusman, Bradley S. The dissertation author was the primary investigator and author of this paper.

xiii Vita 2012-2019 Ph., University of California, San Diego 2006-2010 B., University of Michigan Publications 2019 O'Neill E. Targeted antibiotic discovery through biosynthesis-associated resistance determinants: target directed genome mining. Crit Rev Microbiol. PCR-independent Method of Transformation Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete.

Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols. 2016 Wang M, Carver JJ, Phelan VV, Sanchez LM, Garg N, Peng Y, Nguyen DD, Watrous J, Kapono CA, Luzzatto-Knaan T, Porto C, Bouslimani A, Melnik AV, Meehan MJ, Liu WT, Crüsemann M, Boudreau PD, Esquenazi E, Sandoval-Calderón M, Kersten RD, Pace LA, Quinn RA, Duncan KR, Hsu CC, Floros DJ, Gavilan RG, Kleigrewe K, Northen T, Dutton RJ, Parrot D, Carlson EE, Aigle B, Michelsen CF, Jelsbak L, Sohlenkamp C, Pevzner P, Edlund A, McLean J, Piel J, Murphy BT, Gerwick L, Liaw CC, Yang YL, Humpf HU, Maansson M, Keyzers RA, Sims AC, Johnson AR, Sidebottom AM, Sedio BE, Klitgaard A, Larson CB, P CAB, Torres-Mendoza D, Gonzalez DJ, Silva DB, Marques LM, Demarque DP, Pociute E, O'Neill EC, Briand E, Helfrich EJN, Granatosky EA, Glukhov E, Ryffel F, Houson H, Mohimani H, Kharbush JJ, Zeng Y, Vorholt JA, Kurita KL, Charusanti P, McPhail KL, Nielsen KF, Vuong L, Elfeki M, Traxler MF, Engene N, Koyama N, Vining OB, Baric R, Silva RR, Mascuch SJ, Tomasi S, Jenkins S, Macherla V, Hoffman T, Agarwal V, Williams PG, Dai J, Neupane R, Gurr J, Rodríguez AMC, Lamsa A, Zhang C, Dorrestein K, Duggan BM, Almaliti J, Allard PM, Phapale P, Nothias LF, Alexandrov T, Litaudon M, Wolfender JL, Kyle JE, Metz TO, Peryea T, Nguyen DT, VanLeer D, Shinn P, Jadhav A, Müller R, Waters KM, Shi W, Liu X, Zhang L, Knight R, Jensen PR, Palsson BO, Pogliano K, Linington RG, Gutiérrez M, Lopes NP, Gerwick WH, Moore BS, Dorrestein xiv PC, Bandeira N. Sharing and Community Curation of Mass Spectrometry Data with Global Natural Products Social Molecular Networking Nature Biotech. Characterization of Recombinant B.

abortus Strain RB51SOD towards Understanding the Uncorrelated Innate and Adaptive Immune Responses Induced by RB51SOD Compared to Its Parent Vaccine Strain RB51 (* co-first authors) Front. VIOLIN: Vaccine Investigation and Online Information Network Nucleic Acids Res. xv Abstract of the Dissertation Blurring the Lines Between Natural and Synthetic: The Biosynthetic Chemistry of Marine Actinomycete Bacteria by Charles Bradford Larson Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences University of California San Diego, 2019 Professor Bradley S. Moore, Chair Professor Victor Nizet, Co-Chair Nature is the source of an incredible diversity of complex chemistry.

The wide variety of chemical scaffolds produced as secondary metabolites have been the source xvi of many useful medicinal therapies for the treatment of human disease, in addition to providing useful tools for probing biology. The biosynthetic machinery that produces these molecules is encoded in the genomes of organisms, and recent technological advancements in bioinformatics, DNA sequencing, and gene cloning and capture techniques offer researchers new opportunities for natural products discovery. When combined with modern analytical chemistry techniques, these methods are a powerful engine for compound discovery. The marine environment represents a unique well of biodiversity to investigate with this new methodology, with a unique evolutionary history ancient than terrestrial habitats.

Chapter 2 of this dissertation describes the in-depth analysis of a collection of 146 marine actinomycetes by mass spectrometry and molecular networking to investigate their biosynthetic capacity. These bacteria were cultured in a variety of media, and their extracts were used to generate approximately 1.8 million mass spectra.