Hóa Học Sinh Học Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển: Kết Nối Tự Nhiên và Tổng Hợp

Khám phá bài viết về Qt6jb1p7p3 nosplash 0c5ee6d4f0f86919ce36e6e57dd453e8, cung cấp thông tin chi tiết và phân tích chuyên sâu về chủ đề này.

• Tác giả: Charles Bradford Larson
• Người hướng dẫn: Professor Bradley S. Moore
• Trường học: University of California San Diego
• Chuyên ngành: Biomedical Sciences
• Đề tài: Hóa Học Sinh Học Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển: Kết Nối Tự Nhiên và Tổng Hợp
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: San Diego

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: Introduction to the Dissertation
• 1.1. Natural Products as Traditional Medicines
• 1.2. Microbial Natural Products
• 1.3. Technological Advancements in Analytical Chemistry During the Golden Age
• 1.4. Marine Natural Products
• 1.5. Actinomycetes Contribution to the Natural Products Pharmacopeia
• 1.6. Natural Products Biosynthesis: Connecting Genes to Molecules
• 1.7. DNA Sequencing and Natural Products Biosynthesis
• 1.8. High Throughput and Whole Genome Sequencing Reveals Huge Biosynthetic Potential
• 1.9. Heterologous Expression of Natural Products
• 1.10. Opportunities in Modern Natural Products Discovery and Overview of Dissertation Chapters
• 1.11. References for Chapter 1
• 2. CHƯƠNG 2: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols
• 2.1. Introduction to Chapter 2
• 2.2. Chapter 2 Introduction References
• 2.3. Reprint of “: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols”
• 3. CHƯƠNG 3: PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete
• 3.1. Introduction to Chapter 3
• 3.2. Chapter 3 Introduction References
• 3.3. Reprint of “PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete”
• 4. CHƯƠNG 4: Marine Actinobacteria Salinispora pacifica Biosynthetic Gene Cluster Produces Phosphonate Degradation Products of Glyphosate
• 4.1. Phosphorus in Nature and the Marine Phosphorus Cycle
• 4.2. Anthropogenic Phosphonate Contamination in the Environment
• 4.3. Identification of Salinispora PepM Sequences
• 4.4. Heterologous Expression of S. pacifica Phosphonate BGC
• 4.5. Purification of Compounds 1-3
• 4.6. Cloning and Expression of Phosphonate N-acetyltransferases
• 4.7. Distribution of PepM (SppJ) Homologs in the Marine Environment
• 4.8. Analysis of the distribution of PepM homologs
• 4.9. Cloning and Plasmid Assembly
• 4.10. Purification of Phosphonates Produced in Heterologous Host
• 4.11. NMR and MS/MS Analysis
• 4.12. Cloning and Purification of GNATs from Phosphonate Cluster
• 4.13. References for Chapter 4

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hóa Học Sinh Học Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển

Hóa học sinh học của vi khuẩn Actinomycete biển đang thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu. Những vi khuẩn này không chỉ đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển mà còn là nguồn cung cấp các hợp chất sinh học quý giá. Các hợp chất này có thể được sử dụng trong y học và công nghiệp. Việc hiểu rõ về hóa học sinh học của chúng sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng.

1.1. Đặc Điểm Của Vi Khuẩn Actinomycete Biển

Vi khuẩn Actinomycete biển có khả năng sản xuất nhiều hợp chất sinh học độc đáo. Chúng thường sống trong môi trường biển khắc nghiệt, nơi mà sự cạnh tranh về tài nguyên rất cao. Điều này đã dẫn đến sự phát triển của các cơ chế sinh học độc đáo giúp chúng tồn tại và phát triển.

1.2. Vai Trò Của Actinomycete Trong Hệ Sinh Thái Biển

Actinomycete đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy chất hữu cơ và tái chế dinh dưỡng trong hệ sinh thái biển. Chúng giúp duy trì sự cân bằng sinh thái và hỗ trợ sự phát triển của các sinh vật khác trong môi trường biển.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu về hóa học sinh học của Actinomycete biển gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như sự đa dạng sinh học cao và khó khăn trong việc nuôi cấy các chủng vi khuẩn này trong phòng thí nghiệm đã làm hạn chế khả năng khai thác các hợp chất sinh học của chúng.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Nuôi Cấy Actinomycete

Nhiều chủng Actinomycete biển không thể được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm thông thường. Điều này làm cho việc nghiên cứu và khai thác các hợp chất sinh học của chúng trở nên khó khăn hơn.

2.2. Đa Dạng Sinh Học Cao Của Actinomycete

Sự đa dạng sinh học của Actinomycete biển tạo ra nhiều thách thức trong việc phân loại và xác định các chủng khác nhau. Điều này có thể dẫn đến việc bỏ lỡ các hợp chất sinh học tiềm năng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Để vượt qua các thách thức trong nghiên cứu, các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp hiện đại. Các kỹ thuật như giải trình tự DNA, phân tích khối phổ và mạng lưới phân tử đã được sử dụng để khám phá tiềm năng sinh học của Actinomycete biển.

3.1. Giải Trình Tự DNA Trong Nghiên Cứu Actinomycete

Giải trình tự DNA giúp xác định các gen liên quan đến sản xuất hợp chất sinh học trong Actinomycete. Phương pháp này đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát hiện các hợp chất mới.

3.2. Phân Tích Khối Phổ Để Khám Phá Hợp Chất

Phân tích khối phổ cho phép xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sinh học được sản xuất bởi Actinomycete. Kỹ thuật này giúp phát hiện các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng trong y học.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Các hợp chất sinh học từ Actinomycete biển có nhiều ứng dụng trong y học và công nghiệp. Chúng có thể được sử dụng làm thuốc kháng sinh, thuốc chống ung thư và các sản phẩm sinh học khác. Việc khai thác các hợp chất này có thể mang lại lợi ích kinh tế lớn.

4.1. Hợp Chất Kháng Sinh Từ Actinomycete

Nhiều hợp chất kháng sinh quan trọng đã được phát hiện từ Actinomycete biển. Những hợp chất này có thể giúp điều trị các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc.

4.2. Ứng Dụng Trong Ngành Công Nghiệp

Actinomycete biển cũng có thể được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm sinh học như enzyme và chất phụ gia thực phẩm. Điều này mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp sinh học.

V. Kết Luận Về Hóa Học Sinh Học Actinomycete Biển

Hóa học sinh học của vi khuẩn Actinomycete biển là một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng tiềm năng của các hợp chất sinh học từ chúng là rất lớn. Nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp khai thác hiệu quả hơn các nguồn tài nguyên này.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Actinomycete

Nghiên cứu về Actinomycete biển sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của công nghệ hiện đại. Điều này sẽ giúp khám phá thêm nhiều hợp chất sinh học mới.

5.2. Tầm Quan Trọng Của Bảo Tồn Môi Trường

Bảo tồn môi trường biển là rất quan trọng để duy trì sự đa dạng sinh học của Actinomycete. Việc này không chỉ bảo vệ các loài mà còn bảo vệ nguồn tài nguyên quý giá cho nghiên cứu và ứng dụng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ của Charles Bradford Larson mang tiêu đề "Blurring the Lines Between Natural and Synthetic: The Biosynthetic Chemistry of Marine Actinomycete Bacteria" (Tạm dịch: Làm mờ ranh giới giữa tự nhiên và tổng hợp: Hóa học sinh tổng hợp của vi khuẩn xạ khuẩn biển), được hoàn thành năm 2019 tại Đại học California San Diego (UCSD) dưới sự hướng dẫn của Giáo sư Bradley S. Moore (Chủ tịch hội đồng) và Giáo sư Victor Nizet (Đồng chủ tịch hội đồng). Luận án thuộc chuyên ngành Khoa học Y sinh (Biomedical Sciences), với hướng tiếp cận hỗn hợp kết hợp hóa học các hợp chất tự nhiên biển, sinh học phân tử, tin sinh học, giải trình tự hệ gen và hóa phân tích hiện đại.

1. Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp (secondary metabolites) từ vi sinh vật là nguồn cung cấp chủ yếu cho nhiều loại thuốc lâm sàng. Tuy nhiên, quy trình phát hiện truyền thống dựa trên phân lập vi sinh vật đất liền, lên men và phân đoạn định hướng hoạt tính sinh học (bioassay-guided fractionation) trong giai đoạn sau "Kỷ nguyên vàng" (Golden Age) đã bộc lộ hạn chế lớn: tỷ lệ tái phát hiện (re-discovery) các phân tử đã biết tăng cao, trong khi số lượng khung cacbon mới suy giảm rõ rệt. Thực trạng này khiến nhiều tập đoàn dược phẩm thu hẹp hoặc từ bỏ các chương trình sàng lọc chất tự nhiên từ đầu những năm 2000.

Trong bối cảnh đó, môi trường biển mở ra nguồn đa dạng sinh học rộng lớn, bao phủ hơn 70% bề mặt Trái Đất và chứa hơn 80% sự sống với 26/28 ngành động vật chính (trong đó 8 ngành chỉ tồn tại ở biển). Ngành xạ khuẩn (Actinobacteria), đặc biệt là các loài xạ khuẩn biển bắt buộc như chi Salinispora và các chủng Streptomyces biển, đại diện cho nguồn tài nguyên di truyền học cổ xưa và khác biệt so với các chủng trên đất liền.

Sự phát triển của công nghệ giải trình tự hệ gen thế hệ mới (NGS) và các thuật toán tin sinh học đã bộc lộ một khoảng trống nghiên cứu then chốt: các chủng xạ khuẩn biển sở hữu một số lượng khổng lồ các cụm gen sinh tổng hợp (Biosynthetic Gene Clusters - BGCs) "ngủ yên" hoặc "kín tiếng" (silent/cryptic BGCs) không được biểu hiện trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm (được ví như "vật chất tối vi sinh vật" - microbial dark matter). Phương pháp tiếp cận truyền thống tập trung vào một vài chủng riêng lẻ không đủ khả năng xử lý quy mô dữ liệu lớn, trong khi kỹ thuật bắt cụm gen (gene capture) truyền thống dựa vào phản ứng chuỗi polymerase (PCR) gặp nhiều cản trở đối với DNA có hàm lượng guanine-cytosine (G+C) rất cao của xạ khuẩn. Do đó, yêu cầu cấp thiết được đặt ra là phải xây dựng các phương pháp tiếp cận đa diện: từ phân tích chuyển hóa quy mô lớn (metabolomics "big data"), phát triển công cụ bắt cụm gen độc lập PCR, đến làm sáng tỏ các con đường sinh tổng hợp phân tử nhỏ có giá trị sinh học và môi trường.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định ba mục tiêu nghiên cứu cụ thể gắn với các dự án thực nghiệm:

1. Mục tiêu 1: Khảo sát và tối ưu hóa sự đa dạng chuyển hóa trên quy mô lớn từ bộ sưu tập 146 chủng xạ khuẩn biển bằng cách thay đổi môi trường nuôi cấy, thời gian và dung môi chiết xuất, kết hợp nền tảng mạng lưới phân tử (molecular networking) để ưu tiên hóa các chủng sản sinh hợp chất mới.
2. Mục tiêu 2: Phát triển và kiểm chứng một phương pháp bắt gen độc lập PCR dựa trên kỹ thuật tái tổ hợp liên kết biến nạp (Transformation-Associated Recombination - TAR) kết hợp công nghệ tổng hợp gen hóa học nhằm thu nhận, biểu hiện dị nguồn và xác định các dẫn xuất anthracycline glycosyl hóa thuộc cụm gen cosmomycin từ chủng Streptomyces sp. CNT-302.
3. Mục tiêu 3: Khai phá cụm gen sinh tổng hợp phosphonate từ xạ khuẩn biển Salinispora pacifica, thực hiện biểu hiện dị nguồn, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất chứa liên kết cacbon-photpho (C-P), đồng thời đánh giá chức năng của các enzyme phosphoenolpyruvate mutase (PepM/SppJ) và N-acetyltransferase (GNAT) đối với các phân tử thoái giáng của thuốc trừ sâu glyphosate trong môi trường biển.

3. Câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu

• Giả thuyết 1: Việc thay đổi các thông số sinh trưởng (môi trường, thời gian lên men) và quy trình chiết xuất (dung môi, pha chiết) trên bộ sưu tập 146 chủng xạ khuẩn biển sẽ tác động có hệ thống đến sự biểu hiện của các chất chuyển hóa thứ cấp, cho phép sử dụng mạng lưới phân tử MS/MS để dẫn đường phát hiện các dẫn xuất chuyển hóa chưa từng được mô tả.
• Giả thuyết 2: Kỹ thuật bắt gen TAR trực tiếp không qua khuếch đại PCR từ mẫu DNA bộ gen gốc có thể vượt qua rào cản hàm lượng G+C cao của xạ khuẩn biển, giúp thu nhận nguyên vẹn cụm gen sinh tổng hợp cosmomycin phức tạp chứa ba enzyme glycosyltransferase chuyên biệt và biểu hiện thành công trong vật chủ dị nguồn.
• Giả thuyết 3: Các chủng xạ khuẩn biển thuộc chi Salinispora sở hữu các cụm gen phosphonate có khả năng sinh tổng hợp tự nhiên các chất chuyển hóa aminophosphonate chuỗi ngắn (như AMPA và dẫn xuất acetyl hóa của nó), chứng minh rằng sự hiện diện của các chất này trong tự nhiên không thuần túy bắt nguồn từ sự phân hủy nhân tạo của hóa chất bảo vệ thực vật.

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Bộ sưu tập 146 chủng vi khuẩn xạ khuẩn biển (chủ yếu thuộc các chi Streptomyces, Salinispora, Micromonospora...); cụm gen sinh tổng hợp cosmomycin từ chủng Streptomyces sp. CNT-302; cụm gen sinh tổng hợp phosphonate từ chủng Salinispora pacifica CNT-138; các chất chuyển hóa thứ cấp (anthracycline, phosphonate, arenicolide, staurosporine); các hệ thống biểu hiện dị nguồn (Streptomyces coelicolor M1152, nấm men Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli).
• Phạm vi không gian: Các mẫu vi khuẩn được phân lập từ các trầm tích đáy biển và sinh vật biển, lưu giữ và nghiên cứu tại Viện Hải dương học Scripps (Scripps Institution of Oceanography - SIO) và Trường Dược Skaggs thuộc Đại học California San Diego, Hoa Kỳ.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai và hoàn thành trong giai đoạn 2012 - 2019.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

1. Các hướng nghiên cứu trước mà tác giả điểm lại

Luận án hệ thống hóa chi tiết tiến trình phát triển của ngành hóa học các hợp chất tự nhiên qua các giai đoạn lịch sử:

• Tri thức y học cổ truyền và chiết xuất hoạt chất: Tác giả dẫn chứng tài liệu chữ hình nêm vùng Lưỡng Hà (Mesopotamia) ghi chép việc dùng dầu cây tuyết tùng (Cedrus), bách (Cupressus sempervirens), cam thảo (Glycyrrhiza glabra), mộc dược (Commiphora) và hoa thuốc phiện (Papaver somniferum). Bản thảo y học Ai Cập cổ đại (1500 TCN) ghi nhận 700 phương thuốc; y văn Trung Quốc cổ đại ghi nhận từ năm 1100 TCN (bản thảo Mã Vương Đôi). Về mặt hóa học thực nghiệm, Friedrich Sertürner phân lập thành công morphine từ Papaver somniferum năm 1803, làm tiền đề cho diacetylmorphine và codeine. Salicin từ vỏ cây liễu (Stone, 1763) làm nền tảng cho acetylsalicylate (aspirin). Quinine được phân lập từ vỏ cây Cinchona succirubra (được FDA phê duyệt năm 2004). Artemisinin và các dẫn xuất trị sốt rét kháng thuốc được phân lập từ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua).
• Kỷ nguyên vàng của kháng sinh vi sinh vật (1940 - 1970): Khởi đầu từ phát hiện penicillin của Alexander Fleming (1929) từ nấm Penicillium notatum. Sau Thế chiến thứ hai, hàng loạt nhóm hóa chất được phân lập từ xạ khuẩn đất: kháng sinh nhóm aminoglycoside (streptomycin), tetracycline, cephalosporin; chất ức chế miễn dịch (cyclosporin, rapamycin); thuốc hạ cholesterol (mevastatin, lovastatin); thuốc trị ký sinh trùng (ivermectin); các chất kháng sinh chống ung thư từ Streptomyces gồm anthracycline (daunomycin, doxorubicin, idarubicin, epirubicin), bleomycin A2 và B2, d-actinomycin, mitosanes, mithramycin, streptozocin, deoxycoformycin và calicheamicin.
• Sự phát triển của hóa phân tích: Luận án nêu rõ sự hỗ trợ của các phát minh: dụng cụ Kaliapparat của Justus Liebig (1830) phân tích định lượng C, H, O; hoàn thiện phương pháp phân tích đốt của Joseph Louis Gay-Lussac; quang phổ học do Gustav Kirchhoff và Robert Bunsen khởi xướng (1860); máy quang phổ hồng ngoại tự động (1937); khối phổ (MS) khởi nguồn từ thí nghiệm ống phóng điện và phát hiện đồng vị neon-20, neon-22 của J.J. Thomson (1913), tiếp nối bởi các kỹ thuật ion hóa ESI, MALDI, FT-ICR và bẫy ion (ion trap); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) với các mốc đo mômen từ hạt nhân (1938), máy NMR đầu tiên (1952), và sự phát triển của kỹ thuật NMR hai chiều (2D NMR).
• Hợp chất tự nhiên biển: Kỹ thuật lặn bình khí SCUBA (thập niên 1940) cho phép thu mẫu ở độ sâu 10 - 120 feet, bổ trợ bởi tàu ngầm và robot lặn (ROV). Các phát hiện tiêu biểu: nucleoside β-D-arabinofuranose từ bọt biển Cryptotethia crypta dẫn đến cytarabine (Ara-C) trị bệnh bạch cầu tủy cấp và định hình liệu pháp kháng virus; ecteinascidin 743 (trabectedin) từ hải tiêu Ecteinascidia turbinata; halichondrin A/B từ bọt biển Halichondria okadai dẫn đến thuốc eribulin; dolastatin 10 từ thỏ biển Dolabella auricularia dẫn đến monomethyl auristatin E điều trị u lympho Hodgkin; ziconotide (ω-conotoxin) từ ốc cối Conus magus gắn thụ thể calci kênh N trị đau mạn tính; các công cụ sinh học thần kinh như axit kainic từ tảo đỏ Digenia simplex, saxitoxin từ sò Saxidomus giganteus và tetrodotoxin từ cá nóc.
• Di truyền sinh tổng hợp và hệ gen học: David Hopwood cùng cộng sự xác lập bản đồ di truyền Streptomyces coelicolor A3(2), chứng minh cụm gen methylenomycin A trên plasmid SCP1 (1975) và cụm gen actinorhodin trên nhiễm sắc thể (1984, nhân dòng vào Streptomyces parvulus). Sự khám phá enzyme polyketide synthase loại I (PKS I trong Saccharopolyspora erythraea), PKS loại II (granaticin, tetracenomycin C gồm KSα, KSβ, ACP), PKS loại III và non-ribosomal peptide synthetase (NRPS - Lipmann 1968, gen tycA mã hóa tyrocidine synthetase 1 từ Bacillus brevis). Giải trình tự toàn bộ hệ gen S. coelicolor A3(2) (Bentley và cs., 2002) bộc lộ hơn 20 BGCs; Streptomyces avermitilis (Omura và cs., 2001) chứa 38 BGCs. Các công cụ tin sinh học dự đoán BGC gồm antiSMASH, NaPDoS, NRPSPredictor, BAGEL, PKSIIIexplorer. Về nhân dòng dị nguồn, kỹ thuật TAR trong nấm men được Vladimir Larionov phát triển và Sean Brady ứng dụng cho DNA môi trường (eDNA), cùng các công trình bắt cụm gen taromycin A, enterocin và alterochromide của nhóm Bradley Moore.

2. Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án định vị nghiên cứu vào việc giải quyết ba rào cản thực tế:

1. Thiếu hụt phương pháp phân tích chuyển hóa tổng thể có thể liên kết đồng thời hàng triệu dữ liệu khối phổ từ nhiều điều kiện nuôi cấy/chiết xuất với các dữ liệu hệ gen xạ khuẩn biển có sẵn.
2. Nhu cầu cấp thiết về một quy trình bắt cụm gen TAR hoàn toàn độc lập với phản ứng PCR từ bộ gen mẫu, tránh hiện tượng đột biến hoặc thất bại khi xử lý các cụm gen kháng sinh kích thước lớn giàu G+C như anthracycline.
3. Sự thiếu hiểu biết về con đường sinh tổng hợp phosphonate ở vi khuẩn biển Salinispora, nơi các hợp chất phân hủy của thuốc diệt cỏ glyphosate (như AMPA) bị nghi ngờ chỉ bắt nguồn từ ô nhiễm nhân tạo mà chưa từng được chứng minh nguồn gốc sinh tổng hợp tự nhiên.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Cơ sở lý thuyết, khái niệm và khung phân tích

• Khái niệm chất chuyển hóa thứ cấp (Specialized/Secondary Metabolites): Các phân tử hữu cơ không trực tiếp tham gia vào các chức năng sống thiết yếu (như axit nucleic, axit amin, lipid, đường) mà đóng vai trò chức năng đối ngoại (extrinsic function), giúp tăng cường khả năng cạnh tranh sinh thái, truyền tín hiệu nhận biết mật độ (quorum sensing), điều hòa quá trình tạo bào tử, hoặc đối kháng ức chế sinh vật khác (kháng sinh, độc tố).
• Khung phân tích cụm gen sinh tổng hợp (BGC): Các gen mã hóa enzym sinh tổng hợp lõi, enzym hoàn thiện cấu trúc (tailoring enzymes), protein điều hòa và cơ chế tự kháng (resistance determinants) nằm kề cận nhau trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid của vi khuẩn.
• Khung phân tích Glycogenomics: Tiếp cận tích hợp giữa khối phổ MS/MS và giải trình tự gen nhằm phát hiện nhanh các phân tử được gắn gốc đường (glycosylated metabolites) trong dịch chiết thô, định vị số lượng và loại glycosyltransferase trong BGC tương ứng.
• Lý thuyết sinh tổng hợp phosphonate: Quá trình tạo liên kết C-P trực tiếp thông qua phản ứng đồng phân hóa phosphoenolpyruvate thành phosphonopyruvate bởi enzyme phosphoenolpyruvate mutase (PepM). Khung phân tích mở rộng đến các enzyme Gcn5-related N-acetyltransferase (GNAT) thực hiện phản ứng acetyl hóa nhóm amine để biến đổi các aminophosphonate.

2. Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án áp dụng phương pháp tiếp cận hỗn hợp thực nghiệm, bao gồm:

• Phương pháp khối phổ và mạng lưới phân tử (Metabolomics & Molecular Networking):
  • Nuôi cấy 146 chủng xạ khuẩn biển trên nhiều môi trường lỏng khác nhau (ISP2, v.v.), thu mẫu tại các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau.
  • Chiết xuất các chất chuyển hóa bằng các dung môi hữu cơ khác nhau (ethyl acetate, v.v.), tách riêng pha lỏng và pha hạt nhựa hấp phụ (media phases).
  • Thu nhận khoảng 1,8 triệu phổ khối lượng thông qua hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ phân giải cao (LC-MS/MS).
  • Xử lý dữ liệu bằng nền tảng Mạng lưới phân tử xã hội chất tự nhiên toàn cầu (Global Natural Product Social Molecular Networking - GNPS), nhóm các phổ MS/MS tương đồng về phân mảnh thành các cụm (clusters), giúp nhận diện các hợp chất đã biết và định vị các dẫn xuất cấu trúc mới.
• Phương pháp sinh học phân tử và di truyền học:
  • Kỹ thuật bắt gen TAR độc lập PCR (PCR-independent TAR cloning): Thiết kế và tổng hợp hóa học các cánh tương đồng (homology arms) đặc hiệu với hai đầu của cụm gen mục tiêu, tích hợp vào vector bắt (capture vector) mà không cần bước khuếch đại PCR từ DNA bộ gen xạ khuẩn.
  • Đưa vector bắt và DNA bộ gen vào nấm men Saccharomyces cerevisiae để thực hiện tái tổ hợp liên kết biến nạp. Sàng lọc khuẩn lạc nấm men bằng kỹ thuật PCR thuộc dòng; kiểm tra sự nguyên vẹn của vector tái tổ hợp bằng cắt enzyme giới hạn và giải trình tự.
  • Biểu hiện dị nguồn: Chuyển vector chứa cụm gen hoàn chỉnh vào chủng vi khuẩn chủ Streptomyces coelicolor M1152 để sản xuất chất chuyển hóa.
  • Tạo dòng và biểu hiện enzyme in vitro: Nhân dòng các gen mã hóa enzyme GNAT vào plasmid, biểu hiện trong E. coli, tinh sạch protein dung hợp có đuôi histidine bằng cột ái lực HisTrap (kiểm tra độ tinh sạch qua gel polyacrylamide 10%), thực hiện thử nghiệm enzyme với cơ chất aminomethylphosphonic acid (AMPA) và 2-aminoethylphosphonic acid (2-AEP).
• Phương pháp phân tích và xác định cấu trúc hóa học:
  • Sắc ký tương tác thân dịch (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography - HILIC) chuyên biệt dùng để phân tách và tinh sạch các chất chuyển hóa phosphonate có tính phân cực rất cao.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo phổ 1D gồm 1H NMR, 31P NMR; đo phổ 2D gồm HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), COSY (Correlation Spectroscopy) và 1H/31P HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation).
  • Kỹ thuật tách dải rộng (Broadband decoupling) trên máy đo NMR nhằm xác định ảnh hưởng tương tác spin-spin của hạt nhân photpho (31P) lên các đỉnh tín hiệu proton (1H).
  • Phân tích khối phổ phân giải cao (HRMS) xác định giá trị m/z chính xác và công thức phân tử.
  • Kỹ thuật bổ sung chất chuẩn (spiking experiments) đối chiếu trực tiếp dịch chiết lên men với các hóa chất chuẩn tổng hợp (synthetic standards) gồm na-AMPA, AMPA và 2-HEP.
• Phương pháp tin sinh học và phân tích dữ liệu lớn:
  • Khai phá hệ gen bằng thuật toán antiSMASH và BLAST (NCBI).
  • Xây dựng Mạng lưới tương đồng trình tự (Sequence Similarity Network - SSN) cho các enzyme tương đồng PepM/SppJ từ cơ sở dữ liệu hệ gen và metagenome biển (MAR DB).

3. Nguồn tư liệu và dữ liệu

• Dữ liệu thô từ 1,8 triệu phổ khối lượng LC-MS/MS của 146 chủng xạ khuẩn biển.
• Thư viện chủng vi khuẩn biển tại Viện Hải dương học Scripps (SIO).
• Dữ liệu trình tự hệ gen hoàn chỉnh và bản đồ giải trình tự metagenome biển từ cơ sở dữ liệu MAR DB và NCBI.
• Các mẫu hóa chất đối chứng tổng hợp hóa học (synthetic phosphonate standards).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chapter 1: Introduction to the Dissertation

Chương này cung cấp bức tranh toàn cảnh về lịch sử phát hiện thuốc từ các nền y học cổ truyền, sự hình thành ngành công nghiệp kháng sinh trong Kỷ nguyên vàng, và vai trò của các phát minh hóa phân tích (Liebig, quang phổ, MS, NMR). Tác giả làm rõ vị thế của xạ khuẩn biển như một nguồn cung cấp hơn 70% các loại thuốc vi sinh học được ứng dụng thực tế. Chương 1 phân tích cơ sở di truyền sinh tổng hợp (mô hình BGC, các hệ enzyme PKS I, II, III và NRPS), đồng thời trình bày sự chuyển dịch từ giải trình tự Sanger cổ điển sang các nền tảng giải trình tự thế hệ mới công suất cao (Roche 454, Illumina HiSeq, PacBio RS) giúp phát hiện "vật chất tối vi sinh vật". Cuối cùng, tác giả khái quát nguyên lý biểu hiện dị nguồn và đặt nền móng lý thuyết cho ba nghiên cứu thực nghiệm ở các chương tiếp theo.

Chapter 2: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols

Nội dung chương là bản in lại công trình nghiên cứu công bố trên Journal of Natural Products (2016). Tác giả cùng nhóm nghiên cứu đã xử lý tập dữ liệu lớn gồm 146 chủng xạ khuẩn biển nhằm tìm ra các yếu tố chi phối sự đa dạng hóa học.

Thông số / Yếu tố thực nghiệm	Điều kiện khảo sát	Kết quả và phát hiện chính
Quy mô dữ liệu khối phổ	Chiết xuất từ 146 chủng xạ khuẩn biển	Tạo ra khoảng 1,8 triệu phổ khối lượng MS/MS, phân tích qua mạng lưới phân tử GNPS
Phân loại vi sinh vật (Taxonomy)	Cấp chi (Genus) và cấp loài (Species)	Chi và loài là các yếu tố chính phân định mạng lưới phân tử; các chủng thuộc chi Salinispora tạo các cụm phân tử đặc thù rõ rệt so với Streptomyces
Môi trường nuôi cấy (Medium)	Môi trường lỏng khác nhau (ISP2, v.v.)	Ảnh hưởng mạnh mẽ đến việc kích hoạt hoặc ức chế các cụm chuyển hóa; làm thay đổi quang phổ phân tử
Dung môi chiết xuất (Solvent)	Ethyl acetate và các dung môi phân cực khác	Dung môi quyết định dải phân cực của các chất tách chiết; ethyl acetate cho hiệu suất tách cao đối với các phân tử macrolide
Động học thời gian (Time course)	Salinispora arenicola CNH-877 (4 môi trường lỏng, 3 mốc thời gian)	Ghi nhận sự phân bố chất chuyển hóa thay đổi theo thời gian; mạng lưới phân tử ghi nhận sự tích lũy của các dẫn xuất staurosporine
Dẫn xuất arenicolide mới	Dịch chiết ethyl acetate từ Salinispora pacifica CNT-138	So sánh phổ MS/MS giữa arenicolide A (m/z 827,489) và một dẫn xuất arenicolide dạng ngậm nước mới (formally hydrated arenicolide analogue, m/z 845,501)

Phân tích mạng lưới phân tử trên nền tảng GNPS cho thấy việc kết hợp dữ liệu giải trình tự hệ gen với phổ MS/MS đa điều kiện cho phép ưu tiên hóa các chủng vi khuẩn sản sinh chuyển hóa mới mà không cần qua quy trình phân đoạn sinh học truyền thống.

Chapter 3: PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete

Nội dung chương là bản in lại công trình nghiên cứu công bố trên Journal of Natural Products (2017), tập trung vào cụm gen sinh tổng hợp anthracycline glycosyl hóa từ chủng xạ khuẩn biển Streptomyces sp. CNT-302.

Hạng mục / Thông số	Chi tiết thực nghiệm trong luận án
Cụm gen mục tiêu	Cụm gen sinh tổng hợp cosmomycin C và D, chứa 3 gen glycosyltransferase riêng biệt
Phương pháp bắt gen	Tái tổ hợp liên kết biến nạp độc lập PCR (PCR-independent TAR cloning) bằng cách sử dụng vector bắt lắp ráp từ các đoạn DNA tổng hợp nhân tạo
Hệ thống kiểm tra dòng bắt	Biến nạp vào nấm men Saccharomyces cerevisiae; sàng lọc bằng PCR trên nhiều khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ; giải trình tự và cắt enzyme giới hạn kiểm tra tính toàn vẹn
Biểu hiện dị nguồn	Tích hợp cụm gen vào hệ gen của vật chủ Streptomyces coelicolor M1152
Hợp chất phân lập và định danh	Cosmomycin C (hợp chất 1), cosmomycin D (hợp chất 2), dẫn xuất cosmomycin 3, dẫn xuất A (4) và dẫn xuất B
Dữ liệu phân tích cấu trúc	Phân tích phân mảnh MS2 của hợp chất 1, 2, 3, A, B; phổ MS1 của 3 và A; đo phổ 1D/2D NMR gồm 1H NMR, HSQC, COSY; gán dịch chuyển hóa học 1H NMR so sánh giữa 1, 4, obelmycin C4 và A447C/D
Mạng lưới phân tử	Mạng lưới phân tử GNPS đối chiếu trực tiếp giữa chủng sản xuất tự nhiên CNT-302 và chủng biểu hiện dị nguồn M1152

Nghiên cứu chứng minh phương pháp TAR độc lập PCR giúp loại bỏ các sai sót do phản ứng PCR trên khuôn mẫu giàu G+C, đồng thời làm sáng tỏ chức năng gắn các chuỗi đường phức tạp của ba enzyme glycosyltransferase lên khung anthracycline.

Chapter 4: Marine Actinobacteria Salinispora pacifica Biosynthetic Gene Cluster Produces Phosphonate Degradation Products of Glyphosate

Chương này khảo sát cụm gen sinh tổng hợp phosphonate từ xạ khuẩn biển Salinispora pacifica, làm sáng tỏ sự tạo thành các phân tử chứa liên kết C-P.

Bước nghiên cứu / Đối tượng	Phương pháp và Kết quả thực nghiệm cụ thể
Nhận diện BGC phosphonate	Xác định trình tự gen pepM (sppJ) trong hệ gen Salinispora pacifica; phân tích cấu trúc BGC và các gen lân cận bằng NCBI BLAST
Lắp ráp và biểu hiện dị nguồn	Nhân dòng và lắp ráp BGC phosphonate từ S. pacifica vào vector pCAP03; biểu hiện thành công trong Streptomyces coelicolor M1152
Tinh sạch hợp chất	Xử lý dịch lên men thô; tinh sạch các hợp chất phân cực cao 1-3 bằng sắc ký tương tác thân dịch (HILIC)
Xác định khối lượng chính xác (HRMS)	Đo phổ HRMS và tính toán công thức phân tử cho các ion phân mảnh: m/z = 110; m/z = 125; m/z = 152
Xác định cấu trúc bằng NMR	Đo phổ 1H NMR dịch chiết phân đoạn; kỹ thuật tách dải rộng (broadband decoupling) xác định tương tác của hạt nhân 31P lên ba đỉnh tín hiệu proton; đo phổ 2D 1H/31P HMBC; đo phổ 31P NMR
Thí nghiệm bổ sung chất chuẩn	Phân tích spiking phổ 1H NMR và 31P NMR với các chất chuẩn tổng hợp: na-AMPA (N-acetyl-AMPA), AMPA, 2-HEP và 2-AEP
Hoạt tính enzyme GNAT in vitro	Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch các enzyme GNAT bằng cột HisTrap; thử nghiệm hoạt tính xúc tác cho thấy enzyme chuyển nhóm acetyl thành công lên cơ chất AMPA và 2-AEP
Phân tích tin sinh học môi trường	Xây dựng Mạng lưới tương đồng trình tự (SSN) cho các homolog PepM trong cơ sở dữ liệu hệ gen và metagenome biển MAR DB; đề xuất con đường sinh tổng hợp tạo ra na-AMPA

Kết quả khẳng định Salinispora pacifica có khả năng tự tổng hợp các aminophosphonate, trong đó có AMPA và na-AMPA.

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

• Xác lập nguồn gốc sinh tổng hợp tự nhiên của các dẫn xuất glyphosate: Nghiên cứu tại Chương 4 chứng minh rằng các phân tử aminophosphonate như AMPA và dẫn xuất acetyl hóa na-AMPA có thể được sinh tổng hợp tự nhiên bởi vi khuẩn biển Salinispora pacifica thông qua con đường enzym PepM và GNAT. Phát hiện này bổ sung một luận điểm khoa học quan trọng: các hợp chất trước đây bị coi hoàn toàn là chất ô nhiễm nhân tạo do thoái giáng thuốc diệt cỏ glyphosate thực tế có nguồn gốc sinh học nội sinh trong chu trình photpho biển.
• Làm sáng tỏ con đường sinh tổng hợp cosmomycin: Luận án giải mã thành công cụm gen sinh tổng hợp cosmomycin C và D từ chủng Streptomyces biển CNT-302, làm rõ vai trò cấu trúc và chức năng của ba enzyme glycosyltransferase trong việc glycosyl hóa khung anthracycline, cung cấp dữ liệu về mối quan hệ giữa cấu trúc gen và sự hình thành chuỗi đường phức tạp.

2. Đóng góp về mặt phương pháp học và thực tiễn

• Thiết lập phương pháp TAR độc lập PCR: Tác giả xây dựng thành công quy trình bắt gen kích thước lớn dựa trên tái tổ hợp trong nấm men sử dụng các cánh tương đồng tổng hợp hóa học, khắc phục triệt để khó khăn trong khuếch đại PCR trên các hệ gen có hàm lượng G+C cao của xạ khuẩn, cung cấp một công cụ hữu hiệu để khai phá các BGC kín tiếng.
• Quy trình phân tích chuyển hóa "Big Data" với GNPS: Luận án chuẩn hóa quy trình phân tích mạng lưới phân tử từ 1,8 triệu phổ khối lượng LC-MS/MS trên 146 chủng xạ khuẩn, tạo cơ sở thực tiễn để định hướng nuôi cấy, lựa chọn dung môi và phát hiện nhanh các phân tử mới (như dẫn xuất ngậm nước của arenicolide A ở m/z 845,501).
• Quy trình phân tích phổ cho phosphonate tự nhiên: Thiết lập phương pháp tích hợp sắc ký HILIC với phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1H/31P HMBC, broadband decoupling) và khối phổ HRMS để tách chiết và nhận diện các hợp chất phosphonate có tính phân cực cực cao trong dịch lên men vi sinh.

3. Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Luận án khuyến nghị các cơ quan quan trắc môi trường biển cần tính toán đến nguồn gốc sinh học tự nhiên của các hợp chất aminophosphonate (như AMPA) khi đánh giá mức độ ô nhiễm glyphosate tại các vùng nước biển ven bờ và trầm tích đại dương.
• Đề xuất ứng dụng phương pháp TAR độc lập PCR kết hợp biểu hiện dị nguồn trong Streptomyces coelicolor M1152 như một quy trình chuẩn để giải mã các cụm gen sinh tổng hợp polyketide và anthracycline chưa được khai thác.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

1. Hạn chế của luận án

• Khó khăn trong tinh sạch phosphonate: Do các hợp chất phosphonate chuỗi ngắn (AMPA, na-AMPA) có tính phân cực cực cao và tan mạnh trong nước, việc phân tách hoàn toàn các chất này ra khỏi hỗn hợp muối biển và môi trường lên men phức tạp gặp nhiều rào cản kỹ thuật, đòi hỏi phải dựa một phần vào kỹ nghiệm spiking với chất chuẩn để khẳng định phổ NMR.
• Giới hạn trong biểu hiện dị nguồn: Luận án mới chỉ tập trung biểu hiện thành công một số cụm gen chọn lọc (cosmomycin, phosphonate); phần lớn các cụm gen "kín tiếng" khác trong số 146 chủng xạ khuẩn vẫn chưa được biểu hiện toàn diện do điều kiện sinh trưởng trong phòng thí nghiệm chưa mô phỏng hết áp lực sinh thái tự nhiên.
• Phạm vi dữ liệu metagenome biển: Mặc dù mạng lưới tương đồng trình tự (SSN) đã sử dụng cơ sở dữ liệu MAR DB, số lượng mẫu metagenome biển sâu vẫn còn hạn chế so với sự đa dạng thực tế của đại dương.

2. Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiến hành thử nghiệm tinh sạch sâu và xác định cấu trúc tinh thể học của các enzyme GNAT từ Salinispora pacifica để làm rõ cơ chế chọn lọc cơ chất đối với AMPA và 2-AEP.
• Mở rộng ứng dụng công nghệ TAR độc lập PCR để bắt và tái cấu trúc các cụm gen PKS I và NRPS kích thước lớn từ các chủng xạ khuẩn biển chưa nuôi cấy được (uncultured bacteria).
• Khảo sát sâu hơn sự phân bố địa lý và vai trò sinh thái học của các vi khuẩn sản sinh phosphonate trong chu trình photpho tại các tầng nước sâu của đại dương.

---

Giá trị tham khảo

Luận án của Charles Bradford Larson mang lại giá trị tham khảo chuyên môn rõ rệt cho các nhóm đối tượng nghiên cứu sau:

• Nghiên cứu sinh và nhà nghiên cứu Hóa học hợp chất tự nhiên: Cung cấp phương pháp luận chi tiết tại Chương 2 về việc xây dựng mạng lưới phân tử GNPS từ hàng triệu phổ khối lượng LC-MS/MS, giúp tối ưu hóa việc lựa chọn dung môi chiết xuất và môi trường nuôi cấy để phát hiện hợp chất mới.
• Nhà nghiên cứu Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học vi sinh: Bản thiết kế quy trình TAR độc lập PCR tại Chương 3 là tài liệu kỹ thuật giá trị để thao tác bắt các cụm gen lớn, giàu G+C mà không bị ảnh hưởng bởi sai hỏng PCR.
• Nhà khoa học Môi trường và Độc chất học: Dữ liệu thực nghiệm tại Chương 4 chứng minh khả năng sản sinh AMPA và na-AMPA từ xạ khuẩn biển Salinispora pacifica, cung cấp cơ sở dữ liệu đối chứng quan trọng trong việc phân tích và đánh giá ô nhiễm thuốc trừ sâu nhóm phosphonate trong môi trường nước.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nền tảng nào được sử dụng để phân tích 1,8 triệu phổ khối lượng của 146 chủng xạ khuẩn biển trong Chương 2?

Tác giả sử dụng nền tảng Mạng lưới phân tử xã hội chất tự nhiên toàn cầu (Global Natural Product Social Molecular Networking - GNPS). Nền tảng này nhóm các phổ MS/MS dựa trên sự tương đồng của các mảnh ion phân đoạn, giúp lập bản đồ phân tử, phân biệt các chủng theo chi và loài, đồng thời nhận diện các dẫn xuất chuyển hóa mới như phân tử arenicolide ngậm nước.

2. Điểm khác biệt mấu chốt của phương pháp TAR trong Chương 3 so với kỹ thuật TAR truyền thống là gì?

Phương pháp TAR truyền thống đòi hỏi phải sử dụng phản ứng khuếch đại PCR từ DNA bộ gen mục tiêu để tạo ra các cánh tương đồng (homology arms), quy trình này dễ gặp sai hỏng hoặc thất bại trên các đoạn gen giàu G+C của xạ khuẩn. Luận án khắc phục rào cản này bằng cách áp dụng công nghệ tổng hợp gen hóa học để tạo ra trực tiếp vector bắt (capture vector) chứa các cánh tương đồng mà không cần bước khuếch đại PCR từ mẫu DNA bộ gen gốc (PCR-independent TAR).

3. Phổ khối lượng đã phát hiện dẫn xuất mới nào của arenicolide từ dịch chiết Salinispora pacifica CNT-138?

Phân tích phổ MS/MS trong Chương 2 đã phát hiện một dẫn xuất arenicolide dạng ngậm nước mới (formally hydrated arenicolide analogue) có giá trị m/z là 845,501 trong dịch chiết ethyl acetate của chủng Salinispora pacifica CNT-138, khi đối chiếu phân mảnh với phân tử arenicolide A đã biết (m/z 827,489).

4. Phát hiện về cụm gen phosphonate ở Salinispora pacifica làm thay đổi nhận thức nào về môi trường?

Nghiên cứu ở Chương 4 chứng minh vi khuẩn biển Salinispora pacifica sở hữu cụm gen sinh tổng hợp phosphonate mã hóa enzyme PepM và GNAT, có khả năng tự sản sinh các phân tử như aminomethylphosphonic acid (AMPA) và N-acetyl-AMPA (na-AMPA). Phát hiện này bác bỏ nhận định trước đây cho rằng AMPA tồn tại trong môi trường thuần túy là sản phẩm phân hủy nhân tạo từ thuốc diệt cỏ glyphosate.

5. Những kỹ thuật NMR nào được dùng để chứng minh sự hiện diện của hạt nhân photpho trong các chất chuyển hóa ở Chương 4?

Tác giả đã kết hợp kỹ thuật tách dải rộng (broadband decoupling) để làm rõ ảnh hưởng của hạt nhân photpho lên ba đỉnh tín hiệu proton trên phổ 1H NMR, đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều dị hạt nhân 1H/31P HMBC, phổ 31P NMR, cùng với các thí nghiệm bổ sung chất chuẩn tổng hợp (spiking experiments) gồm na-AMPA, AMPA và 2-HEP.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Charles Bradford Larson đã kết hợp thành công các công cụ hóa phân tích hiện đại, sinh học phân tử và tin sinh học để làm sáng tỏ tiềm năng sinh tổng hợp của xạ khuẩn biển. Thông qua việc phân tích mạng lưới phân tử quy mô lớn từ 146 chủng vi khuẩn, phát triển kỹ thuật bắt gen TAR độc lập PCR để giải mã cụm gen anthracycline cosmomycin, và chứng minh nguồn gốc sinh học của các chất chuyển hóa phosphonate trong Salinispora pacifica, luận án đã cung cấp các bằng chứng thực nghiệm quan trọng cho ngành hóa học các hợp chất tự nhiên. Các kết quả đạt được không chỉ mở rộng hiểu biết về năng lực di truyền của vi khuẩn biển mà còn cung cấp cơ sở khoa học giá trị cho công tác nghiên cứu chu trình photpho và quan trắc môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

UNIVERSITY OF CALIFORNIA SAN DIEGO Blurring the Lines Between Natural and Synthetic: The Biosynthetic Chemistry of Marine Actinomycete Bacteria A dissertation submitted in partial satisfaction of the Requirements for the Degree Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences by Charles Bradford Larson Committee in charge: Professor Bradley S. Moore, Chair Professor Victor Nizet, Co-Chair Professor Michael Burkart Professor Tracy Handel Professor Susan Taylor 2019 The dissertation of Charles Bradford Larson is approved, and it is acceptable in quality and form for publication on microfilm and electronically: Co-Chair Chair University of California San Diego 2019 iii Dedication In loving memory of William Larson iv Table of Contents Signature Page. iv Table of Contents. v List of Figures.

viii List of Tables. xiv Abstract of the Dissertation. xvi Chapter 1: Introduction to the Dissertation.1 Natural Products as Traditional Medicines………….2 Microbial Natural Products………………………………………………….3 Technological Advancements in Analytical Chemistry During the Golden Age………………………………………………………………………….4 Marine Natural Products………………………………………………………….5 Actinomycetes Contribution to the Natural Products Pharmacopeia…….6 Natural Products Biosynthesis: Connecting Genes to Molecules………….7 DNA Sequencing and Natural Products Biosynthesis……………………….8 High Throughput and Whole Genome Sequencing Reveals Huge Biosynthetic Potential………………………………………………………………… 18 1.9 Heterologous Expression of Natural Products……………………………….10 Opportunities in Modern Natural Products Discovery and Overview of Dissertation Chapters.11 References for Chapter 1. 24 Chapter 2: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols……………………….1 Introduction to Chapter 2.2 Chapter 2 Introduction References.3 Reprint of “: Prioritizing Natural Product Diversity in a Collection of 146 Bacterial Strains Based on Growth and Extraction Protocols”.

39 Chapter 3: PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete……….1 Introduction to Chapter 3.2 Chapter 3 Introduction References.3 Reprint of “PCR-Independent Method of Transformation-Associated Recombination Reveals the Cosmomycin Biosynthetic Gene Cluster in an Ocean Streptomycete”.67 Chapter 4: Marine Actinobacteria Salinispora pacifica Biosynthetic Gene Cluster Produces Phosphonate Degradation Products of Glyphosate………………….1 Phosphorus in Nature and the Marine Phosphorus Cycle.2 Anthropogenic Phosphonate Contamination in the Environment.1 Identification of Salinispora PepM Sequences.2 Heterologous Expression of S. pacifica Phosphonate BGC.3 Purification of Compounds 1-3.4 Cloning and Expression of Phosphonate N-acetyltransferases.5 Distribution of PepM (SppJ) Homologs in the Marine Environment.2 Analysis of the distribution of PepM homologs.3 Cloning and Plasmid Assembly.5 Purification of Phosphonates Produced in Heterologous Host.6 NMR and MS/MS Analysis.7 Cloning and Purification of GNATs from Phosphonate Cluster.6 References for Chapter 4.130 vii List of Figures Figure 1.1: Bioactive chemicals from traditional plant medicines.2: Drugs from the Golden Age of natural products discovery.3: Marine Natural Products.1: Molecular network of all generated extracts.2: Effects of genus and species on molecular diversity-network analysis.3: Effects of additional attributes on molecular diversity-network analysis.4: Time-dependent changes in natural product distribution in Salinispora arenicola CNH-877, grown in ISP2.1: Molecular Network of All Streptomyces Extracts Color Coded By Culture Medium.2: Molecular Network of All Acquired Extracts Color Coded By Genus.3: Molecular Network of All Salinispora Extracts Color Coded By Species.4: Illustration of the major drivers of chemical speciation within the Salinispora data.5: Molecular Network of All Generated Extracts Color Coded by Extraction Solvent.6: Molecular Network of Salinispora Extracts from Different Media Phases.7: Comparison of MS/MS spectra of arenicolide A (upper spectrum, m/z: 827.489,) and a novel, formally hydrated arenicolide analogue (lower spectrum, m/z: 845.501) from the ethyl acetate extract of Salinispora pacifica CNT-138.8: Molecular Network of All Acquired Extracts Color Coded By Strain Location.9: Molecular Network of Salinispora arenicola CNH877 strains grown in four different liquid media and extracted at three different time points.1: A selection of anthracyclines approved for treatment of cancer.2: Capture vector assembly.3: Gene map of biosynthetic gene clusters associated with the biosynthesis of cosmomycins C and D.4: Cosmomycin cluster identified by molecular networking.1: PCR screening of multiple yeast colonies.73 viii Supplementary Figure S3.2: PCR screening of individual yeast colonies.3: Sequencing of integrated cosmomycin pathway.4 PCR amplification of integrated cosmomycin pathway.5: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin C (1).6: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin D (2).7: MS1 spectrum of cosmomycin analog 3.8: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin analog 3.9: MS1 spectrum of cosmomycin analog A.10: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin analog A.11: MS2 fragmentation analysis of cosmomycin analog B.12: 1H NMR spectrum of cosmomycin C (1).13: 1H NMR spectrum of A.