Sử Dụng Dữ Liệu Vùng Gen nrLSU-nrSSU-RPB1 Ứng Dụng Hỗ Trợ Định Danh Một Số Loài Thuộc Chi Nấm Ký Sinh Côn Trùng Cordyceps S.L

• Tác giả: Lê Thị Tuyết Trinh
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Sử Dụng Dữ Liệu Vùng Gen nrLSU-nrSSU-RPB1 Ứng Dụng Hỗ Trợ Định Danh Một Số Loài Thuộc Chi Nấm Ký Sinh Côn Trùng Cordyceps S.L
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Phân loại khoa học
• 1.2. Các hoạt chất trong Cordyceps và ứng dụng
• 1.2.1. Nucleoside và bazo của nó
• 1.2.2. Peptide vòng
• 1.2.3. Sterols
• 1.2.4. Alkaloids
• 1.2.5. Polysaccharide
• 1.2.6. Những thành phần khác
• 1.3. Kỹ thuật PCR và giải trình tự
• 1.3.1. Kỹ thuật PCR
• 1.3.2. Giải trình tự
• 1.4. Nghiên cứu phát sinh loài
• 1.4.1. Định danh phân tử
• 1.4.2. Nhóm gen giữ nhà (house keeping gene) trong định danh phân tử các loài nấm
• 1.4.3. Nghiên cứu phát sinh loài
• 1.4.3.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài
• 1.4.3.2. Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh loài
• 1.4.4. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng
• 2.2. Dụng cụ-thiết bị-hóa chất
• 2.3. Danh mục các phần mềm và trang web trực tuyến
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Khảo sát mồi khuếch đại gen nrSSU, nrLSU, RPB1
• 2.4.2. Tiến hành thực nghiệm
• 2.4.3. Xây dựng bộ dữ liệu đơn gen và đa gen
• 2.4.4. Đồng bộ hóa bộ dữ liệu
• 2.4.5. Dò tìm mô hình tiến hóa
• 2.4.6. Dựng cây phả hệ phân tử
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả khảo sát mồi
• 3.1.1. Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5
• 3.1.2. Kết quả kiểm tra cặp mồi NS1/NS4
• 3.1.3. Kết quả kiểm tra cặp mồi CRPB1/RPB1Cr
• 3.2. Kết quả thực nghiệm
• 3.2.1. Kết quả kiểm tra chất lượng DNA thu nhận
• 3.2.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR
• 3.2.3. Kết quả giải và hiệu chỉnh trình tự
• 3.3. Kết quả định danh phân tử
• 3.3.1. Xây dựng bộ dữ liệu DNA
• 3.3.2. Kết quả dựng cây phát sinh loài
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Định Danh Nấm Cordyceps s

Nấm là một nhóm sinh vật đa dạng, có ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Chi Cordyceps s.l., nấm ký sinh côn trùng, được khai thác trong y dược nhờ các chất điều hòa miễn dịch và ức chế tế bào ung thư. Mỗi loài nấm có đặc tính và giá trị dinh dưỡng khác nhau, việc xác định tên loài và đặc điểm nổi bật để ứng dụng trong y học là rất quan trọng. Định danh chính xác các loài trong chi nấm này là cần thiết và có tính ứng dụng cao. Trước đây, định danh dựa trên phân tích hình thái theo Kobayasi (1982). Tuy nhiên, các loài trong chi nấm này sinh sản theo cả hai hình thức hữu tính và vô tính, ngoài ra còn bị tác động bởi môi trường gây ra những biến dị hình thái gây nên khó khăn cho các nhà khoa học trong định danh chi nấm Cordyceps. Cần có phương pháp chính xác hơn để phân loại nấm.

1.1. Giới thiệu chi nấm Cordyceps sensu lato Cordyceps s.l.

Chi nấm Cordyceps s.l. có sự phân bố rộng khắp thế giới, phần lớn trong số khoảng 400 loài sinh sống chủ yếu tại châu Á. Kobayasi (1941, 1982) đã chia Cordyceps s.l. thành 3 chi phụ và 7 nhóm nhỏ dựa vào đặc điểm hình thái giải phẫu. Cordyceps là một chi nấm ký sinh côn trùng. Những giá trị về mặt y dược của chi nấm này ngày càng được các nhà khoa học nghiên cứu và khẳng định. Đại diện chi Cordyceps phải kể đến Cordyceps sinensis, hay còn gọi là đông trùng hạ thảo.

1.2. Tầm quan trọng của định danh nấm chính xác trong y học

Việc định danh chính xác các loài nấm, đặc biệt là chi Cordyceps, có vai trò quan trọng trong việc ứng dụng chúng vào y học. Mỗi loài có những đặc tính và thành phần hóa học khác nhau, dẫn đến các tác dụng dược lý khác nhau. Xác định chính xác loài giúp đảm bảo sử dụng đúng loại nấm, từ đó đạt hiệu quả điều trị tốt nhất và tránh các tác dụng phụ không mong muốn. Định danh sai có thể dẫn đến sử dụng sai loài, gây nguy hiểm cho sức khỏe người sử dụng.

II. Thách Thức Định Danh Nấm Cordyceps s

Việc định danh nấm Cordyceps dựa trên đặc điểm hình thái gặp nhiều khó khăn. Các loài nấm này sinh sản cả hữu tính và vô tính. Môi trường sống cũng tác động đến hình thái, tạo ra các biến dị gây nhầm lẫn. Sự khác biệt giữa các loài có thể rất nhỏ, đòi hỏi chuyên gia có kinh nghiệm. Do đó, cần có phương pháp định danh chính xác và khách quan hơn. Phương pháp phân tử sử dụng dữ liệu DNA là một giải pháp tiềm năng. Các kỹ thuật phân tích di truyền hiện đại cung cấp thông tin chính xác về quan hệ phát sinh loài và cho phép phân biệt các loài nấm một cách tin cậy.

2.1. Những hạn chế của phương pháp định danh hình thái truyền thống

Phương pháp định danh hình thái truyền thống gặp nhiều hạn chế. Các loài nấm Cordyceps có thể có hình thái tương tự nhau, đặc biệt là ở giai đoạn sinh sản vô tính. Môi trường sống cũng ảnh hưởng đến hình thái, gây khó khăn trong việc phân biệt. Sự khác biệt về kinh nghiệm và chủ quan của người định danh cũng có thể dẫn đến sai sót. Do đó, cần có phương pháp định danh khách quan và chính xác hơn.

2.2. Tại sao cần đến phương pháp định danh phân tử dựa trên DNA

Phương pháp định danh phân tử dựa trên DNA khắc phục được những hạn chế của phương pháp hình thái. DNA là vật chất di truyền ổn định, ít bị ảnh hưởng bởi môi trường. Các kỹ thuật phân tích DNA hiện đại cho phép xác định chính xác trình tự nucleotide, từ đó phân biệt các loài nấm một cách khách quan. Phương pháp này cũng cho phép xác định quan hệ phát sinh loài giữa các loài nấm, cung cấp thông tin quan trọng cho việc phân loại.

III. Phương Pháp Dữ Liệu Vùng Gen nrLSU nrSSU RPB1 Định Danh 58

Nghiên cứu này sử dụng dữ liệu vùng gen nrLSU, nrSSU, và RPB1 để định danh nấm ký sinh côn trùng Cordyceps s.l. Các vùng gen này chứa các đoạn nucleotide biến đổi, cho phép phân biệt các loài. Sự kết hợp giữa tin sinh học và sinh học phân tử cho phép xác định loài và hệ thống phát sinh loài dựa trên nền tảng xây dựng cây phả hệ phân tử, thể hiện mối quan hệ giữa các loài thuộc và không thuộc chi Cordyceps. Việc sử dụng đồng thời nhiều vùng gen giúp tăng độ chính xác của định danh. Kết quả phân tích phả hệ phân tử sẽ cung cấp thông tin về mối quan hệ giữa các loài Cordyceps s.l. và các loài nấm khác.

3.1. Vai trò của các vùng gen nrLSU nrSSU và RPB1 trong định danh nấm

Các vùng gen nrLSU, nrSSU, và RPB1 đóng vai trò quan trọng trong định danh nấm. Chúng là các vùng bảo tồn, nhưng vẫn chứa các đoạn nucleotide biến đổi giữa các loài. Vùng nrLSU và nrSSU là các gen ribosome, có vai trò trong tổng hợp protein. Vùng RPB1 là gen mã hóa tiểu đơn vị lớn nhất của RNA polymerase II, enzyme quan trọng trong quá trình phiên mã. Sự kết hợp thông tin từ cả ba vùng gen giúp tăng độ chính xác của định danh.

3.2. Quy trình phân tích trình tự gen nấm Cordyceps chi tiết

Quy trình phân tích trình tự gen nấm Cordyceps bao gồm các bước sau: (1) Thu thập mẫu nấm và chiết xuất DNA. (2) Khuếch đại các vùng gen nrLSU, nrSSU, và RPB1 bằng kỹ thuật PCR. (3) Giải trình tự các sản phẩm PCR. (4) Hiệu chỉnh và so sánh các trình tự thu được với các trình tự tham khảo trong cơ sở dữ liệu. (5) Phân tích phả hệ phân tử để xác định mối quan hệ giữa các loài nấm. (6) Kết quả giải và hiệu chỉnh trình tự

IV. Thực Nghiệm Khảo Sát Mồi Khuếch Đại Gen nrSSU nrLSU RPB1 56

Nghiên cứu tiến hành khảo sát mồi khuếch đại gen nrSSU, nrLSU, RPB1. Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4 và CRPB1/RPB1Cr được thực hiện. Sau đó tiến hành thực nghiệm. Kết quả kiểm tra chất lượng DNA thu nhận được đánh giá. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các đoạn DNA có kích thước phù hợp. Kết quả giải và hiệu chỉnh trình tự được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu DNA. Các kết quả khảo sát mồi có ảnh hưởng lớn đến tính chính xác của phương pháp định danh nấm. Từ đó ta có thể xây dựng nên cây phát sinh loài.

4.1. Đánh giá chất lượng và hiệu quả của các cặp mồi PCR

Việc lựa chọn và đánh giá chất lượng của các cặp mồi PCR là rất quan trọng. Các cặp mồi phải có khả năng khuếch đại đặc hiệu các vùng gen mong muốn, đồng thời không tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn. Hiệu quả khuếch đại cũng cần được đánh giá để đảm bảo thu được đủ lượng DNA cần thiết cho quá trình giải trình tự. Các phương pháp như Annhyb và BLAST được sử dụng để kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi.

4.2. Các bước tiến hành thực nghiệm và kiểm tra chất lượng DNA

Quy trình thực nghiệm bao gồm các bước: Chiết xuất DNA từ mẫu nấm, khuếch đại các vùng gen mục tiêu bằng PCR, điện di sản phẩm PCR để kiểm tra kích thước và chất lượng, và giải trình tự các sản phẩm PCR. Kiểm tra chất lượng DNA là bước quan trọng để đảm bảo kết quả giải trình tự chính xác. Các phương pháp như đo độ hấp thụ UV được sử dụng để đánh giá độ tinh sạch và nồng độ DNA.

V. Kết Quả Phân Tích Phát Sinh Loài Cordyceps s

Kết quả định danh phân tử dựa trên việc xây dựng cây phát sinh loài từ dữ liệu DNA. Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa giữa các loài nấm. Các mẫu nấm được định danh bằng cách so sánh vị trí của chúng trên cây với các loài đã được biết đến. Nghiên cứu này đã xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen dựa trên các trình tự gen nrLSU, nrSSU, RPB1. Cây phát sinh loài dựa trên vùng gen nrSSU thể hiện mức độ tin cậy cao hơn. Khi kết hợp các gen thì làm tăng số lượng nucleotide trong bộ dữ liệu, có ích trong việc phân tích phả hệ, tạo ra hướng giải quyết cho cây phát sinh loài.

5.1. Xây dựng bộ dữ liệu DNA và dựng cây phát sinh loài chi tiết

Quá trình xây dựng bộ dữ liệu DNA bao gồm việc thu thập trình tự từ các mẫu nấm và từ các nguồn dữ liệu công khai. Các trình tự này được căn chỉnh và hiệu chỉnh để tạo ra một bộ dữ liệu thống nhất. Cây phát sinh loài được dựng bằng các phần mềm chuyên dụng, sử dụng các thuật toán phân tích phả hệ khác nhau. Các phương pháp thống kê như bootstrap được sử dụng để đánh giá độ tin cậy của các nhánh trên cây.

5.2. Phân tích và diễn giải cây phát sinh loài để định danh nấm

Việc phân tích và diễn giải cây phát sinh loài đòi hỏi kiến thức chuyên môn về phân loại nấm và các phương pháp phân tích phả hệ. Các mẫu nấm được định danh bằng cách so sánh vị trí của chúng trên cây với các loài đã được biết đến. Độ tin cậy của việc định danh được đánh giá dựa trên độ hỗ trợ của các nhánh trên cây và sự phù hợp với các thông tin khác về loài nấm, ví dụ như đặc điểm hình thái và phân bố địa lý.

VI. Ứng Dụng Định Danh Nấm Cordyceps s

Định danh chính xác nấm Cordyceps s.l. có nhiều ứng dụng quan trọng. Trong y học, nó giúp xác định các loài có giá trị dược liệu cao, từ đó phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe và điều trị bệnh. Nghiên cứu về đa dạng sinh học nấm Cordyceps cũng góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm. Phương pháp định danh bằng vùng gen nrLSU-nrSSU-RPB1 có thể được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu Cordyceps. Các ứng dụng có tiềm năng để nâng cao chất lượng cuộc sống và bảo vệ sức khỏe con người.

6.1. Tiềm năng ứng dụng trong phát triển dược phẩm và thực phẩm chức năng

Các loài nấm Cordyceps chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, có tiềm năng ứng dụng trong phát triển dược phẩm và thực phẩm chức năng. Việc định danh chính xác các loài giúp xác định các loài có hàm lượng cao các hợp chất mong muốn, từ đó tối ưu hóa quá trình sản xuất. Các sản phẩm từ nấm Cordyceps có thể được sử dụng để tăng cường sức khỏe, hỗ trợ điều trị bệnh và kéo dài tuổi thọ.

6.2. Bảo tồn đa dạng sinh học nấm Cordyceps và nguồn gen quý hiếm

Việc nghiên cứu và định danh các loài nấm Cordyceps có vai trò quan trọng trong việc bảo tồn đa dạng sinh học. Nhiều loài nấm Cordyceps đang bị đe dọa do mất môi trường sống và khai thác quá mức. Việc định danh chính xác các loài giúp có các biện pháp bảo tồn hiệu quả, đảm bảo nguồn gen quý hiếm này được duy trì cho các thế hệ tương lai.