MỞ ĐẦU Loãng xƣơng là bệnh về xƣơng phổ biến, là hậu quả của sự rối loạn quá trình chuyển hóa xƣơng dẫn đến mất chất khoáng trong xƣơng, làm giảm mật độ xƣơng, suy thoái cấu trúc xƣơng, do đó tăng nguy cơ gãy xƣơng [5, 60]. Có nhiều nguyên nhân gây loãng xƣơng nhƣ: lối sống ít vận động, hút thuốc [15], uống nhiều bia rƣợu [26], lạm dụng thuốc có chứa corticoid [25, 83]… Tuy nhiên, nguyên nhân hay gặp nhất là sự giảm estrogen ở phụ nữ sau mãn kinh [27, 60]. Loãng xƣơng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng và bất lợi cho cuộc sống của ngƣời bệnh, gia đình và cộng đồng, thậm chí nó có thể gây tử vong [13, 76]. Số ngƣời mắc bệnh loãng xƣơng ngày càng tăng do dân số đang già hóa và lối sống công nghiệp [61], vì thế bệnh loãng xƣơng đang là vấn đề cho các xã hội hiện đại.
Bình thƣờng, mô xƣơng luôn đƣợc thay đổi, làm mới và duy trì sự phát triển cân bằng nhờ quá trình tái tạo xƣơng (bone remodeling) gồm hai hoạt động tƣơng tác chặt chẽ với nhau là hoạt động tạo xƣơng do tế bào tạo xƣơng thực hiện và hoạt động hủy xƣơng thực hiện bởi tế bào hủy xƣơng [31, 62]. Hoạt động hủy xƣơng lấn át hoạt động tạo xƣơng sẽ gây mất cân bằng nội mô xƣơng dẫn đến loãng xƣơng [68, 69]. Nhiều nghiên cứu về loãng xƣơng vẫn đang tập trung tìm hiểu các yếu tố và cơ chế liên quan tới chuyển hóa xƣơng, nhằm tìm ra thuốc và liệu pháp chữa trị bệnh hiệu quả hơn [28]. Các nghiên cứu này chủ yếu dùng động vật có vú làm mô hình thí nghiệm nhƣng việc sử dụng chúng còn có một số hạn chế [79].
Gần đây, cá medaka (Oryzias latipes) đã đƣợc chứng tỏ là mô hình tốt, có thể bổ sung cho các mô hình động vật có vú trong nghiên cứu về xƣơng [63-65, 75, 77, 78]. Hơn hết, nó có cơ chế sinh học phân tử và tế bào về xƣơng tƣơng tự nhƣ ở ngƣời [19, 64, 65, 75, 78] và những ƣu điểm của động vật mô hình mà động vật có vú không có [56, 86]. Đặc biệt, mô hình cá medaka cho phép dễ dàng biến đổi gen và ghi lại các quá trình sinh học in vivo sinh động bằng các kĩ thuật hình ảnh [64, 75, 78]. 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.
Đại học Quốc gia Singapo đã tạo ra cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP mang cấu trúc gen chuyển bao gồm một promoter cảm ứng nhiệt điều khiển hai chiều đồng thời gen rankl và gen mã hóa cho protein chỉ thị huỳnh quang CFP làm mô hình nghiên cứu bệnh loãng xƣơng. Ấu trùng cá này khi bị sốc nhiệt biểu hiện Rankl ngoại sinh làm tế bào hủy xƣơng hình thành và hoạt động, gây ra sự phá hủy mô xƣơng đang đƣợc khoáng hóa tạo ra kiểu hình giống loãng xƣơng ở giai đoạn phát triển rất sớm [78]. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi muốn sử dụng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP nhận từ Đại học Quốc gia Singapo làm mô hình để sàng lọc hoạt chất chống loãng xƣơng. Tuy nhiên, do hạn chế của phƣơng pháp chuyển gen bằng kĩ thuật meganuclease và cách dòng cá này đƣợc duy trì (bằng cách nội phối qua nhiều thế hệ) nên các cá thể cá rankl:HSE:CFP ban đầu chúng tôi nhận đƣợc không có sự đồng đều về di truyền với gen chuyển rankl, dẫn đến các mức độ tổn thƣơng xƣơng khác nhau, gây khó khăn cho việc đánh giá tác dụng của hoạt chất.
Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lai phân tách dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu thành một số dòng cá có sự đồng đều về di truyền với gen chuyển và đồng đều về mức độ tổn thƣơng xƣơng của các cá thể trong mỗi dòng. Hơn nữa, để sử dụng đƣợc các dòng cá này cho nghiên cứu, chúng tôi cũng cần phải xây dựng đƣợc phƣơng pháp đánh giá mức độ khoáng hóa của ấu trùng cá để qua đó có thể đánh giá mức độ tổn thƣơng mô xƣơng của ấu trùng và tác dụng của hoạt chất, vì các phƣơng pháp xác định mật độ xƣơng trên ngƣời và động vật có vú không thể áp dụng trên ấu trùng cá với kích thƣớc nhỏ. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng và đánh giá mức độ khoáng hóa xƣơng của cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP” để hoàn thiện mô hình cá này sử dụng cho các nghiên cứu bệnh loãng xƣơng. 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.
RANKL VÀ BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1. Cân bằng nội mô xƣơng và quá trình tái tạo xƣơng Xƣơng là mô liên kết đƣợc chuyên hóa đặc biệt [20], nó gồm hai thành phần chính là thành phần vô cơ và hữu cơ [11]. Trong đó, phần vô cơ chủ yếu là hydroxyapatit chiếm khoảng 70% khối lƣợng xƣơng, giúp xƣơng cứng và rắn chắc. Phần hữu cơ chiếm khoảng 30% khối lƣợng xƣơng, gồm các tế bào xƣơng nhƣ: tế bào tạo xƣơng (osteoclasts), tế bào hủy xƣơng (osteoclasts), tế bào xƣơng (osteocytes) và collagen (chiếm 90%) làm cho xƣơng có tính đàn hồi, mềm dẻo [11, 14].
Do vậy, xƣơng vừa rắn chắc, vừa mềm dẻo, linh hoạt để có thể đảm nhận nhiều vai trò quan trọng: làm bộ khung cho cơ thể, nâng đỡ và bảo vệ các cơ quan bên trong; cùng với hệ cơ và gân tạo ra chuyển động của cơ thể; dự trữ canxi [20]. Xƣơng rất cứng chắc và có vẻ ít thay đổi nhƣng thực tế nó lại liên tục đƣợc sửa chữa và làm mới nhờ quá trình tái tạo xƣơng (bone remodeling) (Hình 1. Quá trình này gồm hai hoạt động hủy xƣơng và tạo xƣơng đƣợc thực hiện tƣơng ứng bởi tế bào hủy xƣơng và tế bào tạo xƣơng phối hợp chặt chẽ, tƣơng tác và điều khiển lẫn nhau giúp mô xƣơng đƣợc phát triển cân bằng [31, 62]. Tế bào tạo xƣơng có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi trung bì [12], nó tổng hợp và tiết ra thành phần hữu cơ của xƣơng (gọi là osteoid) trƣớc khi khoáng hóa osteoid bằng hydroxyapatit và các muối vô cơ để hoàn tất quá trình tạo xƣơng [12, 48].
Tế bào hủy xƣơng là tế bào đa nhân, kích thƣớc lớn và có cùng nguồn gốc với đại thực bào; nó đƣợc biệt hóa từ tế bào gốc tạo máu (hemopoietic stem cell) ở tủy xƣơng. Nó có thể tạo ra môi trƣờng a-xít để hòa tan các thành phần vô cơ của xƣơng, sau đó tiết ra các enzyme phân giải osteoid [74, 82]. Quá trình tái tạo xƣơng bắt đầu bằng hoạt động hủy xƣơng của tế bào hủy xƣơng phá hủy phần xƣơng già, hỏng hay cần đƣợc thay thế, tiếp sau đó là hoạt 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com động của tế bào tạo xƣơng tạo xƣơng mới thay cho xƣơng đã bị phá hủy (Hình 1.1: Quá trình tái tạo xƣơng với 4 giai đoạn: hoạt hóa (activation), hủy xƣơng (resorption), trung gian (reversal), tạo xƣơng (bone formation) và khoáng hóa (mineralization) [21] Quá trình tái tạo xương được bắt đầu khi tế bào hủy xương (osteoclasts) được biệt hóa và hoạt động, loại bỏ xương già, hỏng. Sau đó, tế bào tạo xương tổng hợp các thành phần hữu cơ và vô cơ của xương thay thế phần xương đã được loại bỏ.
Quá trình tái tạo xƣơng kéo dài suốt đời, giúp làm mới và sửa chữa xƣơng. Để mô xƣơng phát triển ổn định, hoạt động hủy xƣơng và tạo xƣơng luôn phải cân bằng nhau, phù hợp với yêu cầu hoạt động và phát triển của cơ thể trong từng thời điểm. Nếu sự cân bằng này bị mất đi sẽ dẫn đến những rối loạn về xƣơng, trong đó có hai trƣờng hợp rất phổ biến là bệnh loãng xƣơng (osteoporosis) và xƣơng đá (osteopetrosis). Loãng xƣơng thƣờng xảy ra khi quá trình hủy xƣơng lấn át quá trình tạo xƣơng [60, 84], ngƣợc lại, khi tạo xƣơng nhiều hơn hủy xƣơng sẽ dẫn tới hiện tƣợng xƣơng đá [72, 77].
4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Bệnh loãng xƣơng Loãng xƣơng là bệnh về xƣơng rất phổ biến và đang trở thành mối quan tâm về vấn đề sức khỏe trên thế giới, đặc biệt khi dân số toàn cầu đang già hóa. Đặc trƣng của bệnh là sự giảm mật độ và khối lƣợng của xƣơng, mất chất khoáng trong xƣơng, các vi cấu trúc xƣơng bị phá hủy, mô xƣơng bị tổn thƣơng dẫn tới tăng nguy cơ gãy xƣơng [5, 60]. Gãy xƣơng là hậu quả nghiêm trọng nhất của bệnh loãng xƣơng, gây đau đớn kéo dài làm ảnh hƣởng tới cuộc sống sinh hoạt bình thƣờng của bệnh nhân và thậm chí dẫn tới tử vong [13, 76].
Theo số liệu thống kê của tổ chức sức khỏe thế giới, năm 1994 có hơn 75 triệu ngƣời ở Mỹ, Nhật, Châu Âu bị loãng xƣơng [58]. Loãng xƣơng gây ra hơn 1,5 triệu trƣờng hợp gãy xƣơng mỗi năm, trong đó, 300 nghìn ca gãy xƣơng hông, 700 nghìn ca gãy xƣơng cột sống, 250 nghìn ca gãy xƣơng tay và 300 nghìn ca gãy xƣơng những vị trí khác [52]. Phụ nữ có nguy cơ mắc loãng xƣơng cao hơn nam giới, đặc biệt là phụ nữ lớn tuổi [38]. Ở Châu Âu, 40% phụ nữ mắc loãng xƣơng, trong khi nam giới là 13%, tỉ lệ mắc loãng xƣơng của những phụ nữ trên 50 tuổi so với nam giới là 2:1 [24].
Loãng xƣơng là một căn bệnh có diễn biến âm thầm, không gây triệu chứng đặc hiệu cho đến khi xƣơng bị gãy, do đó, nghiên cứu về liệu pháp điều trị bệnh này rất phức tạp và mất nhiều thời gian [22, 45, 59]. Hậu quả mà loãng xƣơng gây ra không chỉ dừng lại ở mức ảnh hƣởng tới cuộc sống sinh hoạt, đe dọa sức khỏe của bệnh nhân, tạo gánh nặng cho gia đình bệnh nhân và xã hội mà hơn thế nữa, điều trị loãng xƣơng không hề dễ dàng và cực kỳ tốn kém. Theo thống kê, chi phí điều trị gãy xƣơng do loãng xƣơng mỗi năm ở nƣớc Anh khoảng 1,7 tỉ ơ-rô [88]; nƣớc Mỹ chi khoảng 20 tỉ đô-la [53]. Bệnh loãng xƣơng có thể là hậu quả của rất nhiều yếu tố: các sai hỏng về di truyền, lối sống thiếu lành mạnh (dinh dƣỡng không cân bằng, ít vận động, hút thuốc lá, lạm dụng đồ uống có cồn…), lạm dụng thuốc corticoid hay sự suy giảm hormon.
Tuy nhiên, loãng xƣơng xảy ra phổ biến nhất là với phụ nữ sau mãn kinh, khi lƣợng hormon estrogen trong cơ thể suy giảm rõ rệt [27, 66]. 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. RANKL kích thích sự hình thành, biệt hóa và hoạt động của tế bào hủy xƣơng Ở ngƣời và động vật có vú, RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor kappa-β ligand) là một protein đƣợc mã hóa bởi gen RANKL. Protein này đƣợc sản xuất bởi tế bào tạo xƣơng và đóng vai trò nhƣ một chất truyền tin tế bào với nhiều đích tác động khác nhau.