Tổng quan nghiên cứu

Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells – MSC) là loại tế bào gốc đa năng có khả năng biệt hóa đa dòng và tiết ra các phân tử sinh học quan trọng, đóng vai trò thiết yếu trong y học tái tạo. Từ năm 1970, MSC đã được phân lập từ nhiều nguồn như tủy xương, máu dây rốn, dây rốn và mô mỡ. Trong đó, mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn được đánh giá là nguồn thu thập ít xâm lấn, có tính đạo đức cao và tiềm năng ứng dụng rộng rãi. Nghiên cứu này tập trung đánh giá khả năng tạo mạch máu in vitro của MSC phân lập từ ba nguồn trên, đồng thời khảo sát tiềm năng sử dụng hệ hạt nano SiO2@FITC COOH làm chất đánh dấu tế bào trong quá trình nghiên cứu tạo mạch.

Mục tiêu chính của luận văn là phân lập và nuôi cấy MSC từ máu dây rốn, dây rốn và mô mỡ, đánh giá khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô và tạo mạch in vitro trên nền Matrigel, cũng như đánh giá tính tương thích sinh học và ảnh hưởng của hệ hạt nano SiO2@FITC COOH đến các hoạt động sinh lý của MSC và tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn (HUVEC). Nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec, Hà Nội, trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2022.

Việc phát triển mạch máu nhân tạo từ MSC có ý nghĩa quan trọng trong y học tái tạo, đặc biệt trong điều trị các bệnh tim mạch và tổn thương mô. Kết quả nghiên cứu góp phần mở rộng hiểu biết về tiềm năng tạo mạch của MSC từ các nguồn khác nhau, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng hệ hạt nano trong đánh dấu và theo dõi tế bào trong nghiên cứu tạo mạch.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Tiêu chí định nghĩa MSC của Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (ISCT): MSC phải bám dính trên bề mặt nuôi cấy, có hình thái nguyên bào sợi, khả năng biệt hóa thành xương, mỡ, sụn và biểu hiện các dấu ấn bề mặt CD105, CD73, CD90 (>95%) đồng thời không biểu hiện các dấu ấn CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19 và HLA-DR (<2%).

  • Khả năng biệt hóa đa dòng của MSC: MSC có thể biệt hóa thành các tế bào trung mô truyền thống (xương, mỡ, sụn) và các tế bào biểu mô như tế bào nội mô, thần kinh, cơ tim.

  • Vai trò của MSC trong tạo mạch máu: MSC kích thích tạo mạch thông qua tiết các yếu tố tăng trưởng như VEGF, HGF, FGF, TGF-β, PDGF-BB và có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô, góp phần hình thành mạch máu mới.

  • Mô hình tạo mạch in vitro trên Matrigel: Đây là phương pháp phổ biến để đánh giá khả năng hình thành cấu trúc mạch máu của tế bào nội mô và MSC, dựa trên sự hình thành các ống mạch trên nền protein Matrigel.

  • Ứng dụng hạt nano SiO2@FITC COOH trong đánh dấu tế bào: Hạt nano silica chứa tâm màu FITC có kích thước 70-100 nm, mật độ 8.10^12 hạt/mL, có khả năng phát huỳnh quang bền, tương thích sinh học cao, được sử dụng để đánh dấu và theo dõi tế bào trong nghiên cứu tạo mạch.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu máu dây rốn, dây rốn và mô mỡ được thu thập từ người hiến tặng tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec, Hà Nội, trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2022. Thể tích trung bình mẫu thu thập gồm: máu dây rốn 120 mL (n=3), dây rốn dài 20 cm (n=3), mô mỡ 65 mL (n=3).

  • Phân lập và nuôi cấy tế bào: MSC được phân lập theo các phương pháp chuẩn sử dụng enzyme collagenase loại I và Ficoll-Paque để tách tế bào đơn nhân, nuôi cấy trong môi trường StemMACS MSC không chứa huyết thanh hoặc bổ sung huyết thanh tự thân. Tế bào nội mô HUVEC được phân lập từ tĩnh mạch dây rốn bằng collagenase và nuôi cấy trong môi trường EGM-2.

  • Đánh giá đặc điểm tế bào: Sử dụng flow cytometry để xác định biểu hiện các dấu ấn bề mặt MSC (CD73, CD90, CD105) và HUVEC (CD31, CD146, CD105), đồng thời đánh giá khả năng biệt hóa đa dòng (xương, mỡ, sụn) bằng các bộ kit biệt hóa chuyên dụng và nhuộm đặc hiệu.

  • Đánh giá khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô: Nuôi cấy MSC trong môi trường EGM-2 trong 21 ngày, theo dõi sự thay đổi hình thái và biểu hiện các dấu ấn nội mô (CD31, CD34, CD146).

  • Đánh giá khả năng tạo mạch in vitro: Thí nghiệm tạo mạch trên nền Matrigel sử dụng bộ kit Angiogenesis Assay Kit (Abcam), gieo 2x10^4 tế bào/giếng, theo dõi hình thành mạch trong 10 giờ, định lượng bằng phần mềm ImageJ.

  • Đánh giá tác động của hệ hạt nano SiO2@FITC COOH: Đánh dấu tế bào MSC và HUVEC với các nồng độ hạt 50 và 100 µg/mL, đánh giá ảnh hưởng đến tăng sinh (xét nghiệm MTT), di chuyển (phương pháp tạo vết rạch), già hóa tế bào (bộ kit nhuộm đặc hiệu) và khả năng tạo mạch trên Matrigel.

  • Phân tích thống kê: Sử dụng Anova để đánh giá ý nghĩa thống kê, với mức p < 0,05 được coi là có ý nghĩa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và đặc điểm MSC: MSC từ mô mỡ (ADMSC), dây rốn (UCMSC) và máu dây rốn (UCBMSC) đều đáp ứng tiêu chí ISCT với tỷ lệ biểu hiện dấu ấn dương CD73, CD90, CD105 trên 95% và dấu ấn âm tính dưới 2%. Hình thái tế bào giống nguyên bào sợi, khả năng biệt hóa thành xương, mỡ, sụn được xác nhận qua nhuộm đặc hiệu. Thời gian xuất hiện tế bào bám dính nhanh nhất ở ADMSC và UCMSC (24h), chậm hơn ở UCBMSC (khoảng 2 tuần).

  2. Phân lập và đặc điểm HUVEC: Tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn biểu hiện cao các dấu ấn CD31 (99,23%), CD146 (99,7%) và CD105 (99,5%), đồng thời không biểu hiện các dấu ấn MSC như CD90 và Myosin heavy chain (<1%). Hình thái tế bào đặc trưng, phù hợp với tiêu chuẩn tế bào nội mô.

  3. Khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô của MSC: Sau 21 ngày nuôi cấy trong môi trường EGM-2, MSC từ cả ba nguồn thay đổi hình thái, giảm biểu hiện các dấu ấn MSC (CD90 giảm từ 99,9% xuống còn 43,4% ở UCMSC; CD105 giảm mạnh xuống dưới 10%), tuy nhiên biểu hiện các dấu ấn nội mô (CD31, CD34, CD146) vẫn rất thấp (<5%), cho thấy quá trình biệt hóa chưa hoàn chỉnh.

  4. Khả năng tạo mạch in vitro trên Matrigel: MSC từ mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn đều hình thành cấu trúc mạch trên Matrigel, tuy nhiên mật độ và số lượng mạch tạo ra thấp hơn nhiều so với tế bào HUVEC. Tế bào HUVEC tạo mạch hiệu quả hơn, phù hợp với vai trò nội mô chuyên biệt.

  5. Ảnh hưởng của hệ hạt nano SiO2@FITC COOH: Hệ hạt nano không gây độc tế bào ở nồng độ 1-100 µg/mL, không ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng tăng sinh và di chuyển của MSC và HUVEC. Hạt nano giúp đánh dấu tế bào hiệu quả với tín hiệu huỳnh quang rõ ràng, duy trì trong thời gian dài. Không ghi nhận sự gia tăng già hóa tế bào do hệ hạt nano. Khả năng tạo mạch của HUVEC không bị ảnh hưởng khi có mặt hệ hạt nano.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và đặc điểm MSC từ ba nguồn phù hợp với các nghiên cứu trước đây, khẳng định mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn là nguồn MSC tiềm năng với ưu điểm thu thập ít xâm lấn và khả năng biệt hóa đa dòng. Sự khác biệt về thời gian bám dính và hình thái tế bào ban đầu phản ánh đặc tính sinh học riêng biệt của từng nguồn.

Khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô của MSC chưa đạt hiệu quả cao, biểu hiện qua tỷ lệ thấp các dấu ấn nội mô, cho thấy cần tối ưu hóa điều kiện biệt hóa hoặc sử dụng các yếu tố kích thích bổ sung để thúc đẩy quá trình này. Điều này phù hợp với một số báo cáo cho rằng MSC chủ yếu hỗ trợ tạo mạch qua cơ chế tiết paracrine hơn là biệt hóa trực tiếp thành tế bào nội mô.

Mô hình tạo mạch trên Matrigel cho thấy MSC có khả năng hình thành cấu trúc mạch nhưng kém hiệu quả hơn so với HUVEC, phản ánh vai trò hỗ trợ của MSC trong tạo mạch. Việc sử dụng hệ hạt nano SiO2@FITC COOH làm chất đánh dấu tế bào được chứng minh là an toàn, hiệu quả và không ảnh hưởng đến chức năng tế bào, mở ra hướng ứng dụng trong nghiên cứu theo dõi tế bào và mô hình tạo mạch.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tỷ lệ biểu hiện dấu ấn bề mặt, hình ảnh huỳnh quang tế bào được đánh dấu bằng hạt nano, và biểu đồ định lượng các chỉ số tạo mạch trên Matrigel, giúp minh họa rõ ràng sự khác biệt giữa các nhóm tế bào và điều kiện thử nghiệm.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa điều kiện biệt hóa MSC thành tế bào nội mô: Áp dụng các yếu tố tăng trưởng bổ sung như VEGF, bFGF hoặc điều chỉnh môi trường nuôi cấy để nâng cao hiệu quả biệt hóa, nhằm tăng tỷ lệ biểu hiện các dấu ấn nội mô trên MSC trong vòng 21-28 ngày. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học, thời gian 6-12 tháng.

  2. Phát triển mô hình tạo mạch 3D kết hợp MSC và tế bào nội mô: Thiết kế mô hình đồng nuôi cấy MSC với HUVEC hoặc các tế bào mạch máu khác để tăng cường sự hình thành mạch ổn định và chức năng, phục vụ nghiên cứu y học tái tạo. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm mô học, thời gian 12 tháng.

  3. Ứng dụng hệ hạt nano SiO2@FITC COOH trong đánh dấu và theo dõi tế bào in vivo: Nghiên cứu mở rộng đánh giá tính an toàn và hiệu quả của hạt nano trong các mô hình động vật, phục vụ mục tiêu theo dõi tế bào gốc trong điều trị lâm sàng. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu vật liệu sinh học, thời gian 12-18 tháng.

  4. Khảo sát tác động của MSC tạo mạch trong mô hình bệnh lý tim mạch: Thực hiện các nghiên cứu tiền lâm sàng để đánh giá khả năng tái tạo mạch và cải thiện chức năng tim của MSC được biệt hóa hoặc phối hợp với tế bào nội mô, nhằm phát triển liệu pháp tế bào hiệu quả. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu y sinh, thời gian 18-24 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và y học tái tạo: Tài liệu cung cấp dữ liệu chi tiết về phân lập, đặc điểm và khả năng tạo mạch của MSC từ các nguồn khác nhau, hỗ trợ phát triển các nghiên cứu về tế bào gốc và mô nhân tạo.

  2. Bác sĩ và chuyên gia điều trị bệnh tim mạch: Thông tin về tiềm năng ứng dụng MSC trong tái tạo mạch máu và điều trị thiếu máu cục bộ, giúp mở rộng lựa chọn liệu pháp tế bào trong lâm sàng.

  3. Nhà phát triển vật liệu sinh học và hạt nano: Nghiên cứu đánh giá tính tương thích và ứng dụng của hạt nano SiO2@FITC COOH trong đánh dấu tế bào, cung cấp cơ sở cho phát triển các công nghệ đánh dấu và theo dõi tế bào.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, y sinh học: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về phương pháp nghiên cứu tế bào gốc, kỹ thuật phân lập, nuôi cấy, đánh giá chức năng và ứng dụng trong y học tái tạo.

Câu hỏi thường gặp

  1. MSC có thể biệt hóa thành tế bào nội mô hiệu quả không?
    Hiện tại, MSC từ mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô nhưng tỷ lệ biểu hiện các dấu ấn nội mô còn thấp (<5%). Cần tối ưu điều kiện nuôi cấy và bổ sung yếu tố tăng trưởng để nâng cao hiệu quả biệt hóa.

  2. Tại sao sử dụng Matrigel để đánh giá tạo mạch in vitro?
    Matrigel cung cấp môi trường protein tự nhiên hỗ trợ sự gắn kết, di chuyển và biệt hóa của tế bào nội mô, giúp mô phỏng quá trình hình thành mạch máu trong ống nghiệm một cách nhanh chóng và dễ dàng định lượng.

  3. Hệ hạt nano SiO2@FITC COOH có ảnh hưởng đến chức năng tế bào không?
    Nghiên cứu cho thấy hệ hạt nano không gây độc tế bào, không ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh, di chuyển, già hóa và tạo mạch của MSC và HUVEC ở các nồng độ thử nghiệm, đồng thời giúp đánh dấu tế bào hiệu quả.

  4. Nguồn MSC nào phù hợp nhất cho ứng dụng tạo mạch?
    Mỗi nguồn MSC có ưu nhược điểm riêng, mô mỡ và dây rốn cho khả năng bám dính nhanh và biệt hóa đa dòng tốt hơn, trong khi máu dây rốn có đặc điểm hình thái và phân bố tế bào khác biệt. Lựa chọn nguồn phù hợp tùy thuộc mục tiêu nghiên cứu và ứng dụng cụ thể.

  5. Làm thế nào để theo dõi tế bào MSC trong quá trình tạo mạch?
    Sử dụng hệ hạt nano SiO2@FITC COOH làm chất đánh dấu tế bào giúp quan sát và theo dõi tế bào MSC trong quá trình tạo mạch bằng kính hiển vi huỳnh quang, cung cấp thông tin về vị trí và hoạt động của tế bào trong mô hình in vitro và tiềm năng in vivo.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công MSC từ mô mỡ, dây rốn và máu dây rốn, đáp ứng tiêu chuẩn ISCT về đặc điểm tế bào và khả năng biệt hóa đa dòng.
  • MSC có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô nhưng hiệu quả còn hạn chế, biểu hiện các dấu ấn nội mô thấp.
  • MSC tạo được cấu trúc mạch trên Matrigel nhưng kém hiệu quả hơn tế bào nội mô HUVEC.
  • Hệ hạt nano SiO2@FITC COOH là chất đánh dấu tế bào an toàn, hiệu quả, không ảnh hưởng đến chức năng MSC và HUVEC.
  • Nghiên cứu mở ra hướng phát triển mô hình tạo mạch nhân tạo và ứng dụng tế bào gốc trong y học tái tạo, đề xuất các bước tiếp theo bao gồm tối ưu hóa biệt hóa, phát triển mô hình 3D và ứng dụng hạt nano trong theo dõi tế bào.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhóm nghiên cứu tiếp tục tối ưu điều kiện biệt hóa MSC, mở rộng nghiên cứu ứng dụng hạt nano trong mô hình in vivo và phát triển liệu pháp tế bào cho bệnh tim mạch. Để biết thêm chi tiết và hợp tác nghiên cứu, vui lòng liên hệ nhóm tác giả.