Khóa luận tốt nghiệp bảo vệ thực vật đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới

Khóa luận đánh giá khả năng phòng trừ của vi khuẩn đối kháng Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây cà chua trong phòng thí nghiệm.

• Tác giả: Trần Thị Câm Thu
• Người hướng dẫn: TS. Lê Khắc Hoàng
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Phòng Trừ Vi Khuẩn Gây Bệnh Héo Xanh Trên Cây Cà Chua
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình sản xuất cây cà chua
• 1.2. Tổng quan về bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum
• 1.2.1. Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum
• 1.2.2. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh
• 1.2.3. Biện pháp phòng trừ
• 1.3. Sơ lược về vi khuẩn Ralstonia solanacearum
• 1.3.1. Lịch sử nghiên cứu
• 1.3.2. Đặc điểm cấu tạo và điều kiện phát triển
• 1.3.3. Hình thức xâm nhập vào cây kí chủ
• 1.4. Tổng quan về vi khuẩn đối kháng và cơ chế đối kháng
• 1.4.1. Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae
• 1.4.2. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens
• 1.4.3. Vi khuẩn Actinobacteria (Xạ khuẩn)
• 1.4.4. Vi khuẩn Enterobacteriaceae
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong phòng thí nghiệm
• 2.4.2. Đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong điều kiện nhà lưới
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong phòng thí nghiệm
• 3.1.1. Đánh giá khả năng phòng bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong phòng thí nghiệm
• 3.1.2. Đánh giá khả năng trừ bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong phòng thí nghiệm
• 3.2. Đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong điều kiện nhà lưới
• 3.2.1. Đánh giá khả năng phòng bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong điều kiện nhà lưới
• 3.2.2. Đánh giá khả năng trừ bệnh của các vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên cà chua trong điều kiện nhà lưới
• 3.3. Chỉ số bệnh
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khả Năng Phòng Trừ Vi Khuẩn Gây Bệnh Héo Xanh

Bệnh héo xanh trên cây cà chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là một trong những vấn đề nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp. Vi khuẩn này có khả năng tồn tại lâu dài trong đất và tàn dư thực vật, gây thiệt hại nặng nề cho năng suất cây trồng. Việc đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng là cần thiết để tìm ra giải pháp hiệu quả cho vấn đề này.

1.1. Tình Hình Sản Xuất Cây Cà Chua Hiện Nay

Cà chua là loại rau được trồng rộng rãi với diện tích lớn, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới. Tuy nhiên, bệnh héo xanh do Ralstonia solanacearum đã gây ra nhiều thiệt hại cho nông dân, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.2. Nguyên Nhân Gây Bệnh Héo Xanh Trên Cà Chua

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum có khả năng xâm nhập vào cây qua rễ và phát triển trong hệ thống mạch dẫn, gây ra hiện tượng héo và chết cây. Điều kiện môi trường như độ ẩm cao và nhiệt độ thích hợp cũng tạo điều kiện cho bệnh phát triển.

II. Vấn Đề Thách Thức Trong Phòng Trừ Bệnh Héo Xanh

Việc phòng trừ bệnh héo xanh gặp nhiều khó khăn do vi khuẩn có phạm vi ký chủ rộng và khả năng tồn tại lâu dài trong đất. Các biện pháp hóa học thường không hiệu quả và có thể gây ô nhiễm môi trường. Do đó, cần tìm kiếm các biện pháp sinh học an toàn và hiệu quả hơn.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Kiểm Soát Bệnh

Bệnh héo xanh có thể gây thiệt hại lên đến 100% cây trồng trong điều kiện thuận lợi. Việc phát hiện sớm và xử lý kịp thời là rất quan trọng nhưng thường gặp khó khăn do triệu chứng bệnh không rõ ràng.

2.2. Tác Động Của Vi Khuẩn Đối Kháng

Vi khuẩn đối kháng có thể giúp giảm thiểu sự phát triển của Ralstonia solanacearum. Tuy nhiên, việc lựa chọn và áp dụng đúng loại vi khuẩn đối kháng là một thách thức lớn trong nghiên cứu.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Khả Năng Phòng Trừ Vi Khuẩn

Nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới, nhằm đánh giá khả năng phòng trừ của các vi khuẩn đối kháng với Ralstonia solanacearum. Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với nhiều nghiệm thức khác nhau để đảm bảo tính chính xác.

3.1. Thiết Kế Thí Nghiệm Trong Phòng Thí Nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện với 14 nghiệm thức, trong đó có 11 nghiệm thức sử dụng vi khuẩn đối kháng. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.

3.2. Đánh Giá Hiệu Quả Phòng Trừ Bệnh

Kết quả thí nghiệm cho thấy các nghiệm thức sử dụng kết hợp nhiều vi khuẩn đối kháng có hiệu quả phòng trừ bệnh tốt hơn so với các nghiệm thức sử dụng ít vi khuẩn hơn.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Từ Nghiên Cứu Khả Năng Phòng Trừ

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng vi khuẩn đối kháng có thể là một giải pháp hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh héo xanh trên cây cà chua. Các biện pháp sinh học này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn thân thiện với môi trường.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Trong Điều Kiện Thực Tế

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng vi khuẩn đối kháng trong thực tế có thể giảm tỷ lệ bệnh héo xanh từ 73,42% đến 82,28%, cho thấy tiềm năng lớn trong việc ứng dụng rộng rãi.

4.2. Lợi Ích Của Vi Khuẩn Đối Kháng

Sử dụng vi khuẩn đối kháng không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh héo xanh mà còn góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người, tạo ra sản phẩm nông nghiệp an toàn hơn.

V. Kết Luận Về Tương Lai Của Nghiên Cứu Phòng Trừ Bệnh Héo Xanh

Nghiên cứu khả năng phòng trừ vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây cà chua mở ra hướng đi mới trong việc phát triển nông nghiệp bền vững. Việc áp dụng các biện pháp sinh học sẽ là xu hướng chính trong tương lai.

5.1. Xu Hướng Nghiên Cứu Trong Tương Lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả hơn, nhằm nâng cao khả năng phòng trừ bệnh héo xanh trên cây cà chua.

5.2. Tầm Quan Trọng Của Nông Nghiệp Bền Vững

Việc phát triển nông nghiệp bền vững không chỉ giúp bảo vệ môi trường mà còn đảm bảo an ninh lương thực cho tương lai. Các biện pháp sinh học sẽ đóng vai trò quan trọng trong chiến lược này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cà chua (Solanum lycopersicum L., đồng danh Lycopersicon esculentum L.) thuộc họ Cà (Solanaceae), là cây rau ăn quả có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu luân canh và tăng vụ nông nghiệp. Theo thống kê của FAOSTAT (2020), diện tích sản xuất cà chua trên thế giới đạt khoảng 5,05 triệu ha, phân bố tại 166 quốc gia. Tại Việt Nam, diện tích gieo trồng dao động trong khoảng 23.000 – 25.000 ha (Nguyễn Thế Nhuận, 2020), mở rộng từ vùng đồng bằng và trung du Bắc Bộ sang miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ nhờ việc tiếp nhận các bộ giống thích nghi mới.

Tuy nhiên, điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm tại Việt Nam tạo môi trường thuận lợi cho nhiều loại dịch hại bùng phát, nghiêm trọng nhất là bệnh héo xanh vi khuẩn do Ralstonia solanacearum gây ra. Đây là một trong năm đối tượng bệnh hại cây trồng được quan tâm hàng đầu trong Chương trình Quản lý Dịch hại Tổng hợp (IPM) của FAO (1992). Vi khuẩn xâm nhập và phá hủy hệ thống bó mạch dẫn, gây tắc nghẽn quá trình vận chuyển nước và khoáng, dẫn đến hiện tượng héo rũ nhanh chóng và có thể làm chết 100% cây trồng trên ruộng (Nguyễn Thị Hồng Hải, 2005).

Việc kiểm soát Ralstonia solanacearum gặp nhiều trở ngại do mầm bệnh có phổ ký chủ rộng (trên 200 loài thuộc hơn 50 họ thực vật), khả năng tồn lưu bền vững trong đất từ 5 – 6 năm và trong hạt giống tới 7 tháng (Vũ Triệu Mân, 2007; Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Bên cạnh đó, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học không mang lại hiệu quả cao do vi khuẩn khu trú sâu bên trong mạch dẫn thực vật, đồng thời làm phát sinh hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và để lại dư lượng độc hại trên nông sản. Do đó, định hướng nghiên cứu ứng dụng các tác nhân vi sinh vật đối kháng (PGPR - Plant Growth Promoting Rhizobacteria) nhằm phòng trừ sinh học bệnh héo xanh là giải pháp kỹ thuật đáp ứng yêu cầu phát triển nông nghiệp bền vững.

Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát và đánh giá khả năng phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra trên cây cà chua của các tổ hợp vi khuẩn đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Đánh giá hiệu lực phòng bệnh và trừ bệnh héo xanh của các chủng vi khuẩn đối kháng đơn lẻ và kết hợp trên hạt cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro).
2. Đánh giá hiệu lực phòng bệnh và trừ bệnh héo xanh, cùng ảnh hưởng của các tổ hợp vi khuẩn đối kháng đến các chỉ tiêu nông học, sinh trưởng của cây cà chua trong điều kiện nhà lưới (in vivo).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum (chủng CXT3); 4 chủng vi khuẩn đối kháng có tiềm năng gồm Klebsiella pneumoniae (chủng ĐXT1), Actinobacteria (chủng CC-LĐ 2.2), Bacillus amyloliquefaciens (chủng DXT6), Enterobacteriaceae (chủng ĐHT1); giống cà chua lai F1 (PN-209 của Công ty TNHH Hạt giống Phú Nông).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bệnh cây thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật và Nhà lưới Trại thực nghiệm - Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được tiến hành từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Đề tài dựa trên cơ sở khoa học về tương tác đối kháng vi sinh vật và kích kháng sinh học trong bảo vệ thực vật:

• Tác nhân gây bệnh: Vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que (kích thước 0,5 – 1,5 µm), có lông roi đơn cực, phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 25 – 35°C và pH 6,8 – 7,2. Vi khuẩn xâm nhiễm qua chóp rễ, vết thương cơ giới hoặc lỗ thở tự nhiên, di chuyển vào mô giác và nhân lên làm tắc mạch gỗ, đồng thời tiết độc tố làm mô mạch hóa nâu và thối rữa rễ.
• Cơ chế tác động của các nhóm vi khuẩn đối kháng:
  • Klebsiella pneumoniae (chủng ĐXT1): Vi khuẩn Gram âm, kỵ khí không bắt buộc thuộc họ Enterobacteriaceae, có khả năng kích thích sinh trưởng (PGPR), tổng hợp meso-2,3-butanediol (BDO) giúp tạo tính kháng lưu dẫn và cố định đạm thông qua hệ gen nifH.
  • Bacillus amyloliquefaciens (chủng DXT6): Vi khuẩn Gram dương sinh nội bào tử chịu nhiệt, hình thành màng sinh học (biofilm) bảo vệ bề mặt rễ, tổng hợp các kháng sinh lipopeptide vòng (bacillomycin D, surfactin, iturin, fengycin) làm biến tính màng tế bào mầm bệnh và hòa tan phosphate.
  • Actinobacteria (chủng CC-LĐ 2.2): Xạ khuẩn đất tiết các enzyme ngoại bào (chitinase, protease, amylase), hợp chất siderophore cạnh tranh dinh dưỡng sắt và các kháng sinh nhóm macrolide, aminoglycoside gây ức chế tế bào vi khuẩn gây bệnh.
  • Enterobacteriaceae (chủng ĐHT1): Vi khuẩn nội sinh và vùng rễ có hoạt tính PGPR, cạnh tranh không gian sống và sản sinh các chất ức chế sự xâm nhiễm của vi khuẩn héo xanh.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng phương pháp thực nghiệm sinh học bệnh cây kết hợp xử lý thống kê:

• Thí nghiệm phòng thí nghiệm (In vitro): Tiến hành theo phương pháp của Silva và ctv (2003) có cải tiến. Bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) đơn yếu tố với 14 nghiệm thức (11 nghiệm thức phối hợp từ 4 chủng đối kháng và 3 nghiệm thức đối chứng: đối chứng bệnh CXT3, đối chứng nước cất vô trùng, đối chứng chỉ xử lý vi khuẩn đối kháng), lặp lại 3 lần (mỗi lần lặp là 1 đĩa petri chứa môi trường Water Agar - WA đặt nghiêng 60°, đáy bọc giấy bạc, 10 hạt/đĩa). Mật độ vi khuẩn đối kháng chuẩn bị ở mức $10^5\text{ CFU/ml}$, vi khuẩn bệnh CXT3 ở mức $10^8\text{ CFU/ml}$.
  • Quy trình phòng bệnh: Ngâm hạt nảy mầm (0,5 – 2 mm) trong dịch đối kháng 30 phút $\rightarrow$ thấm khô $\rightarrow$ ngâm dịch khuẩn bệnh 30 phút $\rightarrow$ cấy lên đĩa WA.
  • Quy trình trừ bệnh: Ngâm hạt trong dịch khuẩn bệnh 30 phút $\rightarrow$ thấm khô $\rightarrow$ ngâm dịch vi khuẩn đối kháng 30 phút $\rightarrow$ cấy lên đĩa WA.
• Thí nghiệm nhà lưới (In vivo): Bố trí theo tiêu chuẩn ngành 10TCN 714:2006 có cải tiến. Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) 14 nghiệm thức, 3 lần lặp lại (mỗi lần lặp gồm 10 chậu, mỗi chậu 5 cây; giá thể phối trộn đất : xơ dừa : phân hữu cơ theo tỷ lệ 2:1:1). Mật độ vi khuẩn đối kháng và vi khuẩn bệnh xử lý là $10^7\text{ CFU/ml}$.
  • Quy trình phòng bệnh: Ngâm hạt trong dịch đối kháng 30 phút $\rightarrow$ ngâm dịch khuẩn bệnh 30 phút $\rightarrow$ gieo vào chậu.
  • Quy trình trừ bệnh: Ngâm hạt trong dịch khuẩn bệnh 30 phút $\rightarrow$ ngâm dịch đối kháng 30 phút $\rightarrow$ gieo vào chậu.
• Chỉ tiêu theo dõi và công thức tính toán:
  • Chỉ tiêu sinh trưởng: Chiều cao cây (cm/mm), chiều dài rễ (cm/mm), trọng lượng tươi (g/mg), trọng lượng khô (sấy ở 70°C đến khối lượng không đổi).
  • Chỉ tiêu bệnh học: Tỷ lệ bệnh (TLB %), Chỉ số bệnh (CSB %) theo thang phân cấp 0 – 5 của Ateka và ctv (2001), Chỉ số diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC) theo Jeger và Viljanen-Rollinson (2001), Hiệu lực phòng trừ (HLPT %) tính theo công thức Abbott (1925).
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thu thập được tổng hợp bằng Microsoft Excel 2016, phân tích phương sai ANOVA và trắc nghiệm so sánh trung bình hạng Duncan ở mức ý nghĩa $\alpha = 0,05$ và $\alpha = 0,01$ bằng phần mềm thống kê SAS 9.1 (các giá trị tỷ lệ được chuyển đổi sang dạng $\text{Arcsin}\sqrt{%}$ trước khi phân tích).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến tình hình canh tác cà chua, đặc điểm sinh học và bệnh học của mầm bệnh Ralstonia solanacearum, cùng tiềm năng ứng dụng của các nhóm vi sinh vật đối kháng:

• Trình bày nguồn gốc thực vật họ Solanaceae, yêu cầu sinh thái của cây cà chua, tầm quan trọng kinh tế và hiện trạng mở rộng diện tích trồng trọt tại Việt Nam cũng như trên thế giới.
• Mô tả chi tiết triệu chứng bệnh héo xanh: cây con héo rũ đột ngột; cây trưởng thành héo xanh lá ngọn vào ban ngày rồi lan dần toàn cây, phần gốc thân sần sùi, bó mạch hóa nâu, cắt ngang thấy giọt dịch vi khuẩn màu trắng sữa ứa ra, rễ thối đen.
• Tổng kết lịch sử danh pháp từ Pseudomonas solanacearum (Smith, 1896), chuyển sang Burkholderia solanacearum (Yabuuchi và ctv, 1992) và xác lập danh pháp Ralstonia solanacearum (Yabuuchi và ctv, 1995). Phân tích các yếu tố dịch tễ học như nhiệt độ đất $>14^\circ\text{C}$, nhiệt độ không khí $>20^\circ\text{C}$, độ ẩm cao và kỹ thuật tưới rãnh làm gia tăng mức độ lây nhiễm.
• Tổng quan năng lực ức chế mầm bệnh và kích thích tăng trưởng của 4 nhóm vi khuẩn: Klebsiella pneumoniae sản sinh 2,3-butanediol và cố định đạm; Bacillus amyloliquefaciens tổng hợp các kháng sinh lipopeptide (bacillomycin D, surfactin, iturin) và màng biofilm; Actinobacteria (xạ khuẩn) tiết kháng sinh và enzyme phân hủy; họ Enterobacteriaceae nội sinh cạnh tranh vị trí xâm nhiễm trong mạch dẫn.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày toàn bộ thiết kế thực nghiệm, quy trình chuẩn bị vật liệu, môi trường nuôi cấy và các bước tiến hành:

• Giới thiệu danh mục các chủng vi khuẩn sử dụng gồm CXT3 (R. solanacearum), ĐXT1 (K. pneumoniae), CC-LĐ 2.2 (Actinobacteria), DXT6 (B. amyloliquefaciens) và ĐHT1 (Enterobacteriaceae), xuất xứ từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật và công trình phân lập của Đặng Thị Huỳnh Như (2022).
• Trình bày công thức môi trường Luria Broth (LB: 10 g peptone, 5 g cao nấm men, 10 g NaCl, 20 g agar, 1000 ml nước cất, khử trùng $121^\circ\text{C}$ trong 20 phút) và môi trường Water Agar (WA: 20 g agar/1000 ml nước cất).
• Chi tiết hóa quy trình bố trí thí nghiệm 1a, 1b (in vitro) và thí nghiệm 2a, 2b (in vivo nhà lưới) với 14 công thức nghiệm thức: phối hợp 2 khuẩn (6 nghiệm thức: ĐXT1+DXT6, ĐXT1+ĐHT1, ĐXT1+CC-LĐ2.2, DXT6+ĐHT1, DXT6+CC-LĐ2.2, ĐHT1+CC-LĐ2.2), phối hợp 3 khuẩn (4 nghiệm thức: ĐXT1+DXT6+ĐHT1, ĐXT1+DXT6+CC-LĐ2.2, ĐXT1+ĐHT1+CC-LĐ2.2, DXT6+ĐHT1+CC-LĐ2.2), phối hợp cả 4 khuẩn (1 nghiệm thức: ĐXT1+DXT6+ĐHT1+CC-LĐ2.2), cùng 3 nghiệm thức đối chứng (ĐC Bệnh, ĐC Nước cất, ĐC Đối kháng).
• Định nghĩa các thang phân cấp bệnh của Ateka và ctv (2001) từ cấp 0 (không héo) đến cấp 5 (toàn bộ lá héo chết) và các phương trình toán học tính CSB, AUDPC, HLPT.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày chi tiết các dữ liệu thực nghiệm thu được từ cả hai điều kiện môi trường:

1. Khả năng phòng và trừ bệnh trong phòng thí nghiệm (In vitro)

• Thí nghiệm phòng bệnh (7 ngày sau cấy):
  • Chiều cao cây dao động từ 11,77 đến 32,11 mm; nghiệm thức phối hợp 3 khuẩn ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 đạt chiều cao lớn nhất (31,96 mm), khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng nước cất (32,11 mm) nhưng vượt trội so với đối chứng bệnh (11,77 mm).
  • Chiều dài rễ lớn nhất ghi nhận ở nghiệm thức ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 (22,15 mm), cao hơn rõ rệt so với đối chứng bệnh (10,05 mm).
  • Tỷ lệ bệnh ở các nghiệm thức phối hợp 3 và 4 khuẩn đạt mức rất thấp (6,67% – 26,67%), trong đó nghiệm thức ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 có tỷ lệ bệnh thấp nhất (6,67%), trong khi đối chứng bệnh bị nhiễm 100%. Các tổ hợp 2 khuẩn có tỷ lệ bệnh cao hơn (43,33% – 90,00%).
• Thí nghiệm trừ bệnh (7 ngày sau cấy):
  • Nghiệm thức phối hợp 4 chủng (ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2) đạt sinh trưởng tốt nhất với chiều cao cây 31,99 mm, chiều dài rễ 24,80 mm, trọng lượng tươi 375,33 mg và tỷ lệ bệnh thấp nhất (6,67%), tương đương với đối chứng nước cất và khác biệt có ý nghĩa với đối chứng bệnh (chiều cao 11,77 mm, rễ 10,05 mm, tỷ lệ bệnh 100%).

2. Khả năng phòng và trừ bệnh trong điều kiện nhà lưới (In vivo)

• Thí nghiệm phòng bệnh (theo dõi tại 14, 21 và 28 ngày):
  • Sinh trưởng tại 28 ngày: Chiều cao cây dao động 9,22 – 18,48 cm; nghiệm thức ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 đạt 17,16 cm và nghiệm thức 4 khuẩn đạt 16,14 cm (đối chứng bệnh chỉ đạt 9,22 cm). Chiều dài rễ nghiệm thức 4 khuẩn đạt 9,15 cm. Trọng lượng tươi và khô của nghiệm thức ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 đạt lần lượt 24,67 g và 3,55 g.
  • Chỉ tiêu bệnh học tại 28 ngày: Tỷ lệ bệnh của các tổ hợp 3 và 4 khuẩn dao động từ 12,22% đến 15,56%, thấp hơn nhiều so với nhóm 2 khuẩn (22,22% – 50,00%) và đối chứng bệnh (84,44%).
  • Chỉ số bệnh (CSB) của nghiệm thức ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 đạt thấp nhất (9,33%), tương ứng chỉ số AUDPC thấp nhất (38,89) so với đối chứng bệnh (CSB 52,67%, AUDPC 334,44).
  • Hiệu lực phòng trừ bệnh héo xanh tại thời điểm 28 ngày đạt từ 73,42% đến 82,28% ở các nghiệm thức phối hợp 3 và 4 khuẩn, trong đó nghiệm thức ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 đạt hiệu lực cao nhất (82,28%).
• Thí nghiệm trừ bệnh (theo dõi tại 14, 21 và 28 ngày):
  • Sinh trưởng tại 28 ngày: Nghiệm thức 4 khuẩn cho chiều cao cao nhất (20,81 cm), trọng lượng tươi 26,67 g. Chiều dài rễ lớn nhất ở nghiệm thức DXT6 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2 (16,34 cm) và trọng lượng khô cao nhất ở nghiệm thức ĐXT1 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2 (3,58 g).
  • Tỷ lệ bệnh tại 28 ngày: Các tổ hợp 3 và 4 khuẩn giữ tỷ lệ bệnh thấp từ 12,22% đến 17,78% (nghiệm thức 4 khuẩn và ĐXT1 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2 đều đạt 12,22%), trong khi nhóm 2 khuẩn dao động từ 40,00% đến 55,56% và đối chứng bệnh là 84,44%.
  • Hiệu lực phòng trừ trong thí nghiệm trừ bệnh ở nhóm phối hợp 3 và 4 khuẩn đạt mức 71,74% – 80,43%.

Bảng tổng hợp so sánh các chỉ tiêu bệnh học tiêu biểu trong điều kiện nhà lưới (28 ngày sau trồng):

Nghiệm thức	TLB phòng bệnh (%)	CSB phòng bệnh (%)	AUDPC phòng bệnh	HLPT phòng bệnh (%)	TLB trừ bệnh (%)
ĐXT1 + DXT6	35,56	23,11	134,56	56,12	54,44
DXT6 + ĐHT1	50,00	30,44	177,33	42,19	40,00
DXT6 + CC-LĐ2.2	22,22	16,44	84,00	68,78	55,56
ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1	12,22	9,33	38,89	82,28	17,78
ĐXT1 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2	15,56	14,00	58,33	73,42	12,22
DXT6 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2	14,44	11,78	49,00	77,64	14,44
ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2	13,33	10,89	45,89	79,32	12,22
Đối chứng vi khuẩn bệnh (CXT3)	84,44	52,67	334,44	0,00	84,44
Đối chứng nước cất	0,00	0,00	0,00	-	0,00

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Xác định được khả năng đối kháng rõ rệt của cả 4 chủng vi khuẩn (Klebsiella pneumoniae ĐXT1, Bacillus amyloliquefaciens DXT6, Actinobacteria CC-LĐ 2.2, Enterobacteriaceae ĐHT1) đối với vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum chủng CXT3 trên cây cà chua.
• Chứng minh tính ưu việt của việc phối hợp đa chủng vi sinh vật đối kháng: Việc kết hợp từ 3 đến 4 chủng vi khuẩn luôn cho kết quả vượt trội so với kết hợp 2 chủng đơn lẻ trên mọi chỉ tiêu theo dõi.
  • Trong phòng thí nghiệm: Tỷ lệ bệnh giảm xuống còn 6,67% (ở tổ hợp ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 trong phòng bệnh và tổ hợp 4 khuẩn trong trừ bệnh) so với 100% ở đối chứng bệnh.
  • Trong nhà lưới: Hiệu lực phòng bệnh héo xanh ở nhóm 3 - 4 khuẩn đạt 73,42% – 82,28% (cao nhất là tổ hợp ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 đạt 82,28%); hiệu lực trừ bệnh đạt 71,74% – 80,43%. Tỷ lệ bệnh ở ngày thứ 28 giảm từ 84,44% (đối chứng bệnh) xuống còn 12,22% – 15,56%.
• Ghi nhận tác động thúc đẩy sinh trưởng cây trồng rõ rệt: Các nghiệm thức chỉ xử lý vi khuẩn đối kháng hoặc kết hợp 3-4 chủng giúp tăng chiều cao thân, chiều dài rễ, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây con tương đương với đối chứng nước cất và vượt trội so với cây bị nhiễm bệnh.

Đóng góp của đề tài

• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm có hệ thống về hiệu quả kết hợp đa chủng vi khuẩn đối kháng thuộc các nhóm phân loại khác nhau (xạ khuẩn, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn tạo bào tử, vi khuẩn đường ruột) trong kiểm soát sinh học mầm bệnh mạch dẫn Ralstonia solanacearum.
• Khẳng định khả năng ứng dụng của các tổ hợp vi khuẩn tiềm năng (đặc biệt là tổ hợp 3 chủng ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 và tổ hợp 4 chủng ĐXT1 + DXT6 + ĐHT1 + CC-LĐ2.2) làm cơ sở khoa học để phát triển các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật đa tính năng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Đề tài mới dừng lại ở phạm vi đánh giá hiệu lực sinh học trên 4 chủng vi khuẩn đối kháng cụ thể (ĐXT1, CC-LĐ 2.2, DXT6, ĐHT1) và 1 chủng vi khuẩn gây bệnh (CXT3) trên 1 giống cà chua lai F1 (PN-209).
• Thời gian theo dõi và thử nghiệm chỉ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới với quy mô chậu thí nghiệm (theo dõi đến 28 ngày sau trồng), chưa đánh giá trên đồng ruộng sản xuất thực tế với các điều kiện đất đai và thời tiết biến động.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiếp tục khảo sát và đánh giá hiệu lực phòng trừ của các tổ hợp vi khuẩn đối kháng triển vọng trên quy mô đồng ruộng thực tế qua các vụ mùa khác nhau.
• Nghiên cứu cơ chế tương tác chi tiết giữa các chủng vi khuẩn đối kháng khi phối hợp chung trong môi trường đất và vùng rễ (khả năng tương hỗ, mật độ tồn lưu, sự tiết kháng sinh và cạnh tranh màng sinh học).
• Thử nghiệm phối chế các chủng vi khuẩn đối kháng này thành các dạng chế phẩm sinh học thương mại (dạng bột hòa nước, hạt hoặc dung dịch) và khảo sát thời hạn bảo quản.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn phục vụ cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:

• Sinh viên và học viên ngành Bảo vệ Thực vật, Nông học, Công nghệ Sinh học: Tham khảo quy trình bố trí thí nghiệm đối kháng vi sinh vật in vitro (phương pháp đĩa thạch nghiêng WA cải tiến từ Silva và ctv) và thí nghiệm nhà lưới in vivo (theo chuẩn 10TCN 714:2006); phương pháp đánh giá bệnh học thực vật (phân cấp Ateka, tính toán AUDPC và công thức Abbott).
• Cán bộ nghiên cứu bệnh cây và vi sinh vật nông nghiệp: Tham khảo dữ liệu thực nghiệm về tương tác đối kháng giữa Ralstonia solanacearum với các chi vi khuẩn Bacillus, Klebsiella, Enterobacter và nhóm xạ khuẩn Actinobacteria.
• Cơ sở nghiên cứu và phát triển chế phẩm sinh học: Dữ liệu về tỷ lệ phối hợp đa chủng vi khuẩn hỗ trợ định hướng phát triển các dòng chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây họ Cà.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Trong các tổ hợp vi khuẩn đối kháng, công thức nào cho hiệu lực phòng bệnh héo xanh cao nhất trong điều kiện nhà lưới?
Nghiệm thức kết hợp 3 chủng ĐXT1 (Klebsiella pneumoniae) + DXT6 (Bacillus amyloliquefaciens) + ĐHT1 (Enterobacteriaceae) đạt hiệu lực phòng bệnh cao nhất tại thời điểm 28 ngày sau trồng với hiệu lực đạt 82,28%, tỷ lệ bệnh giảm xuống còn 12,22% và chỉ số AUDPC thấp nhất là 38,89 (so với đối chứng bệnh có tỷ lệ bệnh 84,44% và AUDPC là 334,44).

2. Sự khác biệt về hiệu quả giữa việc phối hợp 2 vi khuẩn so với phối hợp 3 hoặc 4 vi khuẩn là gì?
Kết quả thực nghiệm ở cả phòng thí nghiệm và nhà lưới cho thấy các nghiệm thức kết hợp 3 và 4 vi khuẩn luôn cho kết quả vượt trội hơn nhóm kết hợp 2 vi khuẩn. Trong nhà lưới ở thời điểm 28 ngày, nhóm 3 – 4 khuẩn đạt hiệu lực phòng trừ 73,42% – 82,28% (tỷ lệ bệnh 12,22% – 15,56%), trong khi nhóm 2 khuẩn chỉ đạt hiệu lực phòng trừ 42,19% – 68,78% (tỷ lệ bệnh từ 22,22% đến 50,00%).

3. Mật độ tế bào vi khuẩn được sử dụng trong các thí nghiệm phòng thí nghiệm và nhà lưới là bao nhiêu?
Trong thí nghiệm phòng thí nghiệm, mật độ vi khuẩn đối kháng được chuẩn bị ở mức $10^5\text{ CFU/ml}$ và mật độ vi khuẩn gây bệnh R. solanacearum chủng CXT3 là $10^8\text{ CFU/ml}$. Trong thí nghiệm nhà lưới, mật độ dịch vi khuẩn đối kháng và vi khuẩn bệnh đều được hiệu chỉnh ở mức $10^7\text{ CFU/ml}$.

4. Thang phân cấp bệnh và các chỉ tiêu bệnh học được sử dụng trong nghiên cứu gồm những gì?
Nghiên cứu sử dụng thang phân cấp bệnh héo xanh gồm 6 cấp (từ cấp 0 đến cấp 5) theo tiêu chuẩn của Ateka và ctv (2001) dựa trên tỷ lệ lá bị héo. Các chỉ tiêu bệnh học bao gồm Tỷ lệ bệnh (TLB %), Chỉ số bệnh (CSB %), Diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC theo Jeger và Viljanen-Rollinson, 2001) và Hiệu lực phòng trừ (HLPT % theo Abbott, 1925).

5. Các chủng vi khuẩn đối kháng có ảnh hưởng như thế nào đến sự sinh trưởng của cây cà chua?
Các chủng vi khuẩn đối kháng (đặc biệt là nghiệm thức chỉ xử lý đối kháng hoặc tổ hợp 3-4 khuẩn) không gây hại mà còn thúc đẩy sinh trưởng cây cà chua. Tại thời điểm 28 ngày trong nhà lưới, chiều cao cây (đạt 16,14 – 17,16 cm), chiều dài rễ (8,75 – 9,15 cm) và trọng lượng tươi khô ở các nghiệm thức này đều tương đương với đối chứng nước cất và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng bệnh (cây bị bệnh chỉ đạt chiều cao 9,22 cm và rễ dài 5,88 cm).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Thị Cẩm Thu đã thực hiện đánh giá thực nghiệm toàn diện về khả năng phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum) trên cây cà chua bằng 4 chủng vi khuẩn đối kháng thuộc các nhóm Klebsiella pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens, Actinobacteria và họ Enterobacteriaceae. Kết quả nghiên cứu chứng minh việc kết hợp đa chủng vi khuẩn (tổ hợp 3 và 4 chủng) mang lại hiệu lực phòng bệnh đạt 73,42% – 82,28% và trừ bệnh đạt 71,74% – 80,43% trong điều kiện nhà lưới, đồng thời hỗ trợ cải thiện rõ rệt các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cà chua. Công trình cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng phục vụ công tác nghiên cứu bệnh cây và định hướng phát triển chế phẩm sinh học quản lý bệnh hại cây trồng bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Tình hình sản xuất cây cà chua Cây cà chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum L., thuộc họ ca (Solanaceae) là một loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Theo Somraj và ctv (2017); Nalla và ctv (2016) thì cà chua là một loại cây rau quan trọng, phô biến và được trồng rộng rãi khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Theo tô chức lương thực thé giới (FAO, 2020), điện tích trồng cà chua trên thé giới vào khoảng 5.983 ha với sản lượng 186. Là cây rau có giá trị, có sản lượng chiếm 1/6 tổng sản lượng rau hàng năm trên thế giới và luôn đứng ở vị trí số 1 về sản lượng.

Cà chua có tầm quan trọng chỉ sau khoai tây ở nhiều quốc gia và đứng thứ nhất về rau được bảo quản, chế bién và cả mục đích sử dụng tươi.2 Tổng quan về bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum 1.1 Triệu chứng gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum Một trong những bệnh nguy hiểm đối với nhiều loài cây trồng là bệnh héo xanh do vi khuân Ralstonia solanacearum, đặc biệt là những cây họ cà, họ bau bí, họ đậu và nhiều loại cây trồng khác (Wicker và ctv, 2007). Bệnh xuất hiện trên cây con và cây lớn từ ra hoa đến thu hoạch. Khi cây còn non toàn bộ lá héo rũ đột ngột và chết nhanh chóng. Trên cây đã lớn thì héo đầu tiên ở các lá ngọn héo rũ có màu xanh tái, sau đó các lá phía dưới, các cành héo dần vào ban ngày và ban đêm có thể hồi phục, cây bi còi cọc, nhưng sau 2 - 5 ngày toàn cây héo han và chết (Agrios, 2005).

Vỏ thân gần gôc của cây bị bệnh san sùi, khi cắt ngang thay bó mach bị hóa nâu. Trong điêu kiện âm độ cao, thân cây bị bệnh dân dân thôi mêm, ân mạnh gân miệng cắt có thé thay dịch nhay vi khuẩn tiết ra màu trăng sữa. Rễ có màu nâu đen và thối (Kucharek, 1998).2 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh Bệnh phát triển nhanh và mạnh trong điều kiện nhiệt độ cao, mưa gió, phổ biến trên đất cát pha, thịt nhẹ hoặc đất đã nhiễm vi khuẩn. Bệnh xuất hiện rõ khi nhiệt độ phải trên 20°C, nhiệt độ đất trên 14°C, am độ cao, tưới nhiều, tưới ngập rãnh là điều kiện tốt nhất cho bệnh xâm nhiễm, phát triển và lan truyền dễ dàng (Vũ Triệu Mân, 2007).

Vi khuẩn có thể tồn lưu trong đất từ 5 — 6 năm, trong cơ thể ký chủ thực vật hoặc trong hạt giống có thé sống tới 7 thang, còn néu bám dính trên bề mặt hạt chỉ tồn tại 2 — 7 ngày (Vũ Triệu Man và Lê Lương Té, 1998). Khi đã xâm nhập vào cây, chúng sinh sản rất nhanh khi vào bên trong làm bít các lỗ mạch, tiết ra độc tố làm các bó mạch hóa nâu, đen và gây ra hiện tượng héo do cây bị thiếu nước. Vi khuẩn có thé di chuyên ra bên ngoài môi trường đất khi gặp điều kiện thuận lợi, đó cũng là sự tương tác giữa rễ và đất, rễ bị nhiễm vi khuẩn từ đất và đất bị nhiễm khuẩn khi chúng từ trong cây ra môi trường đất (Hồ Thanh Hoàng, 2005). Bệnh phát sinh phát triển phụ thuộc vao điều kiện đất đai như trên các chân đất cao bệnh thường nặng hơn các chân dat thấp, đất được luân canh với lúa nước làm giảm tỉ lệ bệnh đáng kể.

Thời vụ trồng, mật độ trồng cao cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh. Phương pháp tưới cũng là điều kiện cần được quan tâm, do nước tưới là nguồn lây lan bệnh chủ yếu.