Đánh Giá Khả Năng Đối Kháng Của Chaetomium sp. Đối Với Rhizoctonia solani

Khóa luận đánh giá khả năng đối kháng của Chaetomium sp phân lập từ đất nông nghiệp với nấm Rhizoctonia solani, góp phần nghiên cứu sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Minh Thông
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Vũ Phong
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Đối Kháng Của Chaetomium sp. Đối Với Rhizoctonia solani Trong Nông Nghiệp Hữu Cơ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Đặc điểm của nấm Chaetomium sp.
• 2.2. Đặc điểm hình thái của nấm Chaetomium sp.
• 2.3. Đặc điểm phân bố của nấm Chaetomium sp.
• 2.4. Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nấm Chaetomium sp.
• 2.5. Hoạt tính cơ bản của nấm Chaetomium sp.
• 2.6. Những nghiên cứu về chế phẩm sinh học
• 2.6.1. Những nghiên cứu ngoài nước
• 2.6.2. Những nghiên cứu trong nước
• 2.7. Tổng quan về nấm Rhizoctonia solani
• 2.7.1. Đặc điểm của nấm Rhizoctonia solani
• 2.7.2. Vị trí phân loại nấm Rhizoctonia solani
• 2.7.3. Đặc điểm sinh học nấm Rhizoctonia solani
• 2.7.4. Đặc điểm hình thái của nấm Rhizoctonia solani
• 2.7.5. Đặc điểm sinh lý của nấm Rhizoctonia solani
• 2.7.6. Quá trình lưu tồn và phát triển của nấm Rhizoctonia solani
• 2.7.7. Phổ kí chủ của nấm Rhizoctonia solani
• 3. CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu chính
• 3.4.1. Phương pháp phân lập nấm Rhizoctonia solani
• 3.4.2. Khảo sát tính gây bệnh của các mẫu nấm Rhizoctonia solani trên 3 loại cải trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3.4.3. Phân lập và định danh nấm Chaetomium sp. dựa vào đặc điểm hình thái
• 3.4.4. Đánh giá khả năng đối kháng Rhizoctonia solani của 8 dòng Chaetomium sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3.4.5. Định danh loài nấm Chaetomium sp. dựa vào phương pháp sinh học phân tử
• 3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Triệu chứng gây hại của nấm Rhizoctonia solani trên các loại cải
• 4.2. Khảo sát tính gây bệnh của nấm Rhizoctonia solani trên bốn loại cải
• 4.3. Kết quả phân lập nấm Chaetomium sp. theo đặc điểm hình thái
• 4.3.1. Bẫy nấm Chaetomium sp.
• 4.3.2. Đặc điểm hình thái của nấm Chaetomium sp.
• 4.4. Khả năng đối kháng với Rhizoctonia solani của các chủng Chaetomium trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 4.5. Định danh dòng Chaetomium CT7, CT8
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khả Năng Đối Kháng Của Chaetomium sp

Nấm Chaetomium sp. là một trong những loài nấm có khả năng đối kháng mạnh mẽ với nhiều loại nấm bệnh, đặc biệt là Rhizoctonia solani. Nghiên cứu này nhằm đánh giá khả năng đối kháng của Chaetomium sp. đối với Rhizoctonia solani trong nông nghiệp hữu cơ. Việc sử dụng nấm đối kháng như Chaetomium sp. không chỉ giúp kiểm soát bệnh mà còn bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

1.1. Đặc Điểm Sinh Học Của Chaetomium sp.

Chaetomium sp. thuộc ngành Ascomycota, có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường khác nhau. Chúng có thể phân lập từ đất, phân hữu cơ và các chất hữu cơ khác. Đặc điểm sinh học của nấm này cho phép chúng phát triển mạnh mẽ trong điều kiện khắc nghiệt.

1.2. Vai Trò Của Chaetomium sp. Trong Nông Nghiệp Hữu Cơ

Chaetomium sp. đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng. Chúng không chỉ giúp giảm thiểu sự phát triển của Rhizoctonia solani mà còn cải thiện độ phì nhiêu của đất, từ đó nâng cao năng suất cây trồng.

II. Vấn Đề Gây Hại Từ Rhizoctonia solani Trong Nông Nghiệp

Rhizoctonia solani là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là các loại rau như cải xanh, cải ngọt. Bệnh do Rhizoctonia solani gây ra có thể dẫn đến thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng nông sản. Việc phòng trừ bệnh này bằng hóa chất không chỉ tốn kém mà còn gây hại cho môi trường.

2.1. Tác Động Của Rhizoctonia solani Đến Cây Trồng

Bệnh do Rhizoctonia solani gây ra triệu chứng lở cổ rễ, làm giảm khả năng hấp thụ nước và dinh dưỡng của cây. Điều này dẫn đến sự phát triển kém và năng suất thấp.

2.2. Thách Thức Trong Việc Kiểm Soát Rhizoctonia solani

Việc kiểm soát Rhizoctonia solani gặp nhiều khó khăn do khả năng phát tán nhanh và sự kháng thuốc của nấm. Do đó, cần tìm kiếm các biện pháp sinh học hiệu quả để kiểm soát bệnh này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Khả Năng Đối Kháng Của Chaetomium sp

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân lập nấm từ đất và đánh giá khả năng đối kháng của các dòng Chaetomium sp. đối với Rhizoctonia solani. Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

3.1. Phương Pháp Phân Lập Nấm

Nấm Chaetomium sp. được phân lập từ 80 mẫu đất thu thập từ các vùng nông nghiệp khác nhau. Phương pháp bẫy nấm bằng giấy lọc được sử dụng để thu thập các dòng nấm.

3.2. Đánh Giá Khả Năng Đối Kháng

Khả năng đối kháng của các dòng Chaetomium sp. được đánh giá thông qua thí nghiệm đồng nuôi cấy với Rhizoctonia solani. Kết quả cho thấy một số dòng có hiệu suất đối kháng cao, lên đến 84%.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Khả Năng Đối Kháng Của Chaetomium sp

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số dòng Chaetomium sp. có khả năng đối kháng mạnh mẽ với Rhizoctonia solani. Dòng CT7 và CT8 cho thấy hiệu suất đối kháng cao nhất, điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển chế phẩm sinh học cho nông nghiệp hữu cơ.

4.1. Hiệu Suất Đối Kháng Của Các Dòng Chaetomium

Trong số các dòng nấm được phân lập, dòng CT7 và CT8 có hiệu suất đối kháng cao nhất, lần lượt là 80,6% và 84,3%. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của chúng trong kiểm soát bệnh hại.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Trong Nông Nghiệp

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các chế phẩm sinh học nhằm kiểm soát Rhizoctonia solani, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng nông sản trong nông nghiệp hữu cơ.

V. Kết Luận Và Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Nghiên cứu về khả năng đối kháng của Chaetomium sp. đối với Rhizoctonia solani đã chỉ ra rằng nấm này có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ Chaetomium sp. sẽ góp phần bảo vệ môi trường và nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về khả năng đối kháng của Chaetomium sp. mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các biện pháp sinh học trong nông nghiệp.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế đối kháng của Chaetomium sp. và khả năng ứng dụng của chúng trong thực tiễn nông nghiệp, nhằm phát triển các sản phẩm sinh học hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Trong bối cảnh nền nông nghiệp hiện đại đang chuyển dịch mạnh mẽ sang xu hướng canh tác hữu cơ và bền vững, việc kiểm soát dịch hại sinh học trong đất trở thành một mắt xích sống còn. Cây rau họ Thập tự (Brassicaceae) bao gồm cải xanh (Brassica juncea), cải ngọt (Brassica integrifolia) và cải thìa (Brassica rapa chinensis) đóng vai trò chủ lực trong cơ cấu cây trồng thực phẩm ngắn ngày tại Việt Nam. Tuy nhiên, theo các thống kê nông nghiệp, tổn thất năng suất do các bệnh truyền qua đất có thể dao động từ 30% đến 80%, trong đó tác nhân nguy hiểm hàng đầu là nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây bệnh lở cổ rễ (damping-off) và chết rạp cây con.

Phương pháp hóa học truyền thống (sử dụng Validamycin, Hexaconazole, Mancozeb) bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng: gây hiện tượng kháng thuốc, phá hủy hệ vi sinh vật bản địa, tích lũy dư lượng độc hại trên nông sản vượt ngưỡng cho phép và đe dọa trực tiếp sức khỏe người tiêu dùng. Giải pháp sinh học sử dụng nấm đối kháng túi Chaetomium sp. phân lập từ đất nông nghiệp là một hướng đi đột phá, vừa tiêu diệt nấm bệnh qua cơ chế tiết kháng sinh và enzyme ngoại bào, vừa cải tạo hệ đệm đất thông qua sinh tổng hợp ergosterol.

Mục tiêu cụ thể của dự án:

1. Phân lập, định danh hình thái và đánh giá độc lực của các chủng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ trên 3 loại cải xanh, cải ngọt, cải thìa tại nông trại hữu cơ Vinamit Organic Farm.
2. Thu thập 80 mẫu đất tại 4 vùng sinh thái (Bình Dương, Đắk Nông, TP. Hồ Chí Minh, Bình Phước) và phân lập thuần khiết các dòng nấm Chaetomium sp. bản địa bằng kỹ thuật bẫy giấy lọc xenlulozo vô trùng.
3. Đánh giá hiệu suất ức chế sinh trưởng xuyên tâm (PIRG) của 8 chủng Chaetomium sp. đối kháng với chủng R. solani có độc lực mạnh nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm (in vitro).
4. Định danh sinh học phân tử chủng Chaetomium có hoạt tính đối kháng cao nhất thông qua khuếch đại, giải trình tự vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của rDNA và xây dựng cây phát sinh loài.

Phạm vi và giới hạn: Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2022 đến tháng 12/2022 tại Phòng Vi sinh ứng dụng (Công ty Cổ phần Vinamit) kết hợp Phòng Sinh học tích hợp thực vật (Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM), tập trung vào khảo nghiệm in vitro và định danh phân tử.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Nấm Rhizoctonia solani thuộc lớp Basidiomycetes, bộ Mycelia sterilia, là loài nấm bán ký sinh có phổ ký chủ cực kỳ rộng (hơn 550 loài ký chủ đã được ghi nhận). Cấu trúc hạch nấm (sclerotia) có vách tế bào dày, chứa sắc tố melanin đậm giúp chúng tồn tại bền bỉ trong đất từ 21 tháng đến vài năm, chịu được ngập nước (30% hạch nấm vẫn giữ nguyên sức sống sau thời gian dài ngập úng) và điều kiện khắc nghiệt.

Tiêu chí so sánh	Biện pháp Hóa học (Validamycin/Mancozeb)	Nấm đối kháng Trichoderma harzianum	Nấm đối kháng Chaetomium spp. (C. cupreum)
Cơ chế tác động	Ức chế tổng hợp trehalase/phá hủy tế bào	Cạnh tranh không gian, ký sinh sợi nấm	Tiết độc tố sinh học (Chaetoglobosin, Rotiorinol), enzyme ngoại bào (Cellulase, Chitinase, $\beta$-1,3-glucanase)
Tính bền vững	Thấp, gây chai đất và ô nhiễm mạch nước ngầm	Trung bình, kém ổn định ở tầng đất sâu	Cao, phân bố tự nhiên và thích ứng tốt ở tầng đất 15–30 cm
Khả năng cải tạo đất	Không, làm nghèo kiệt hệ vi sinh	Kém	Tiết hợp chất ergosterol làm tăng độ phì và kích thích miễn dịch thực vật (SAR)
Dư lượng độc hại	Có nguy cơ tồn dư cao trên rau ăn lá	Không	An toàn tuyệt đối, phù hợp chuẩn Organic USDA/EU

Ưu tiên giải pháp theo mô hình MoSCoW:

• Must-have: Phân lập được chủng đối kháng có $PIRG > 75%$, thích nghi dải nhiệt độ $28\text{--}30^\circ\text{C}$, tương đồng di truyền xác thực qua PCR-ITS.
• Should-have: Hoạt tính phân giải cellulose mạnh để ứng dụng bẫy đất và tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp làm cơ chất nhân sinh khối.
• Could-have: Thử nghiệm trên mô hình nhà lưới diện hẹp trước khi sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột hòa nước hoặc dạng hạt.
• Won't-have: Pha trộn trực tiếp với thuốc bảo vệ thực vật gốc đồng hoặc thuốc trừ nấm hóa học phổ rộng làm suy giảm mật độ bào tử sống.

Thiết kế hệ thống nghiên cứu và chuẩn kỹ thuật

Hệ thống kỹ thuật phòng thí nghiệm được chuẩn hóa bao gồm các trang thiết bị phân tử và phần mềm phân tích sinh tin học hiện đại:

• Công cụ phân tích di truyền: Phần mềm MEGA X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 10.2) phục vụ căn chỉnh trình tự đa dòng (ClustalW) và dựng cây tiến hóa Neighbor-Joining với hệ số lặp lại 1.000 bootstrap replicates.
• Cơ sở dữ liệu đối soát: NCBI GenBank BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool, Nucleotide).
• Hệ thống thiết bị: Máy luân nhiệt PCR Bio-Rad T100, buồng điện di ngang Bio-Rad Wide Mini-Sub Cell GT, hệ thống đọc gel UV Transilluminator, cân phân tích 4 số lẻ Ohaus Pioneer, tủ định ôn vi sinh Memmert.

graph TD
    A[Mẫu đất vùng rễ 15-30cm] --> B[Bẫy giấy lọc vô trùng 28°C]
    B --> C[Phân lập trên môi trường WA + Ampicillin/Streptomycin]
    C --> D[Nuôi cấy thuần khiết trên đĩa PDA]
    D --> E[8 Dòng Chaetomium CT01 - CT08]
    
    F[Rau cải bệnh tại đồng ruộng] --> G[Khử trùng cồn 70° & Cấy WA]
    G --> H[Phân lập thuần chủng Rhizoctonia solani]
    H --> I[Đánh giá độc lực: Chọn mẫu R-CX]
    
    E --> J[Thí nghiệm cấy kép Dual Culture PDA 7 ngày]
    I --> J
    J --> K[Xác định dòng CT07 có PIRG = 83,4%]
    K --> L[Tách chiết DNA tổng số & PCR mồi ITS4/ITS5]
    L --> M[Giải trình tự First Base & Dựng cây MEGA X]

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

1. Phương pháp phân lập nấm bệnh: Cắt các mẫu mô bệnh tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô hoại tử ($1\text{--}2\text{ mm}$), khử trùng bề mặt bằng dung dịch cồn $70^\circ$ trong 30 giây, rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng, thấm khô và cấy lên môi trường Water Agar (WA: 20 g agar/1.000 mL nước cất). Sau 3 ngày, chuyển sợi nấm sang môi trường Potato Dextrose Agar (PDA: 200 g khoai tây, 20 g dextrose, 20 g agar/1.000 mL) ở $27 \pm 2^\circ\text{C}$.
2. Kỹ thuật bẫy nấm Chaetomium: 500 g đất/mẫu ở độ sâu $15\text{--}30\text{ cm}$, sấy khô nhẹ, nghiền mịn cho vào đĩa petri ($\varnothing = 8\text{ cm}$). Đặt các mảnh giấy lọc vô trùng ($1 \times 1\text{ cm}$) lên mặt đất ẩm, ủ ở $28^\circ\text{C}$ trong $15\text{--}20\text{ ngày}$. Khi quả thể hình thành, tách chuyển sang môi trường WA bổ sung kháng sinh ampicillin ($100\text{ mg/L}$) và streptomycin ($100\text{ mg/L}$) để loại bỏ tạp khuẩn.
3. Khảo nghiệm đối kháng cấy kép (Dual Culture Assay): Trên đĩa petri PDA ($\varnothing = 9\text{ cm}$), cấy khoanh thạch nấm Chaetomium ($\varnothing = 4\text{ mm}$) cách mép đĩa 1 cm. Sau 3 ngày nuôi cấy trước (nhằm bù trừ tốc độ sinh trưởng nhanh của R. solani), cấy đối xứng khoanh thạch nấm bệnh R. solani ($\varnothing = 4\text{ mm}$) cách mép đĩa đối diện 1 cm. Nuôi cấy ở $28\text{--}30^\circ\text{C}$, đối chứng (ĐC) chỉ cấy nấm R. solani.

Hiệu suất ức chế sinh trưởng xuyên tâm ($PIRG$) được tính toán chính xác theo công thức:

$$\text{PIRG} = \frac{R_1 - R_2}{R_1} \times 100%$$

Trong đó:

• $R_1$: Bán kính phát triển của khuẩn ty nấm bệnh ở đĩa đối chứng (cm).
• $R_2$: Bán kính phát triển của khuẩn ty nấm bệnh về phía nấm đối kháng (cm).
• Quy ước hoạt tính: Hoạt tính rất cao ($PIRG > 75%$), Cao ($61\text{--}75%$), Trung bình ($50\text{--}60%$), Kém ($< 50%$).

---

Implementation và kết quả

Quy trình kỹ thuật sinh học phân tử

Quy trình tách chiết DNA tổng số và khuếch đại gen vùng ITS được thực hiện nghiêm ngặt:

# Quy trình PCR khuếch đại vùng ITS rDNA nấm Chaetomium
# Cặp mồi đặc hiệu:
# Primer ITS-5 (Forward): 5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3'
# Primer ITS-4 (Reverse): 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'

# Thành phần phản ứng MasterMix (Tổng thể tích 25 µL):
# 2X Taq MasterMix: 12.5 µL | Primer F (10 µM): 1.0 µL | Primer R (10 µM): 1.0 µL
# DNA khuôn (~50 ng): 2.0 µL | Nước khử ion nuclease-free: 8.5 µL

# Chu trình nhiệt trên máy Bio-Rad T100:
# Giai đoạn 1: Biến tính ban đầu: 95°C trong 5 phút (1 chu kỳ)
# Giai đoạn 2: 35 chu kỳ luân nhiệt:
#   - Biến tính: 95°C trong 30 giây
#   - Bắt cặp mồi: 55°C trong 30 giây
#   - Kéo dài chuỗi: 72°C trong 1 phút
# Giai đoạn 3: Kéo dài kết thúc: 72°C trong 7 phút (1 chu kỳ)
# Bảo quản: 4°C

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% trong đệm 1X TAE ở hiệu điện thế 80 V trong 35 phút, nhuộm bằng gel red và quan sát dưới tia cực tím (UV).

# Phân tích thống kê ANOVA và Duncan Test bằng mô hình SAS
"""
PROC GLM DATA=Chaetomium_Antagonism;
   CLASS Strain;
   MODEL PIRG = Strain;
   MEANS Strain / DUNCAN ALPHA=0.01;
RUN;
"""

Kết quả khảo nghiệm và đối kháng thực nghiệm

1. Độc lực của các chủng nấm bệnh: Chủng R-CX phân lập từ cải xanh (Brassica juncea) có độc lực cao nhất, gây triệu chứng héo rũ, thối đen toàn bộ trụ hạ diệp và làm chết 100% cây con (Cấp 4) chỉ sau 3 ngày chủng bệnh (trong khi mẫu R-CN và R-CT xuất hiện bệnh muộn hơn sau 2–3 ngày ở Cấp 3–4). Do đó, R-CX được chọn làm chủng thử nghiệm đối kháng.
2. Khảo sát phân bố nấm đối kháng: Từ 80 mẫu đất thu thập, đất canh tác hữu cơ tại huyện Phú Giáo (Bình Dương) cho tỷ lệ xuất hiện nấm Chaetomium cao nhất (15%), tập trung chủ yếu ở tầng sâu $15\text{--}30\text{ cm}$. Đã phân lập được 8 dòng nấm thuần khiết ký hiệu từ CT01 đến CT08.

Dòng nấm đối kháng	Bán kính tản nấm bệnh $R_2$ (cm)	Hiệu suất đối kháng $PIRG$ (%)	Phân hạng hoạt tính đối kháng
CT01	$4,42 \pm 0,12^\text{f}$	$50,1^\text{f}$	Trung bình
CT02	$4,70 \pm 0,08^\text{de}$	$41,3^\text{de}$	Kém
CT03	$8,00 \pm 0,00^\text{a}$	$0,0^\text{-}$	Không đối kháng
CT04	$4,90 \pm 0,15^\text{b}$	$38,8^\text{e}$	Kém
CT05	$8,00 \pm 0,00^\text{a}$	$0,0^\text{-}$	Không đối kháng
CT06	$2,20 \pm 0,05^\text{e}$	$72,5^\text{b}$	Cao
CT07	$\mathbf{1,50 \pm 0,03^\text{f}}$	$\mathbf{83,4^\text{a}}$	Rất cao
CT08	$2,80 \pm 0,09^\text{d}$	$65,0^\text{c}$	Cao
Đối chứng (ĐC)	$8,00 \pm 0,00^\text{a}$	$0,0^\text{-}$	-
Hệ số biến thiên ($CV%$)	3,1%	2,7%	-

(Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái đi kèm khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê cực kỳ cao ở mức $p < 0,01$ theo phép thử Duncan).

Biểu đồ so sánh hiệu suất đối kháng PIRG (%) của các chủng Chaetomium:
CT07 [████████████████████████████████████████] 83.4% (Rất cao)
CT06 [███████████████████████████████████     ] 72.5% (Cao)
CT08 [███████████████████████████████         ] 65.0% (Cao)
CT01 [████████████████████████                ] 50.1% (Trung bình)
CT02 [███████████████████                     ] 41.3% (Kém)
CT04 [██████████████████                      ] 38.8% (Kém)
CT03 [                                        ] 0.0%  (Không)
CT05 [                                        ] 0.0%  (Không)

3. Kết quả định danh sinh học phân tử: Sản phẩm khuếch đại PCR vùng ITS của hai dòng triển vọng CT07 và CT08 cho vệt sáng rõ nét, đơn băng tại kích thước lần lượt là 592 bp và 589 bp. Kết quả giải trình tự và phân tích BLAST trên GenBank khẳng định trình tự gen của chủng CT07 và CT08 đạt độ tương đồng 99,6% với loài Chaetomium cupreum (tên đồng nghĩa: Arcopilus cupreus).

---

Đổi mới và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những đóng góp khoa học và giá trị thực tiễn nổi bật cho ngành Công nghệ sinh học nông nghiệp:

• Phát hiện nguồn gen bản địa ưu việt: Tuyển chọn thành công chủng nấm Chaetomium cupreum CT07 có khả năng ức chế sinh trưởng R. solani lên đến 83,4%, vượt trội hơn mức trung bình của các dòng Chaetomium thông thường ($55\text{--}70%$) và tương đương các chế phẩm chuẩn quốc tế như Ketomium (Thái Lan).
• Làm sáng tỏ cơ chế tác động đa chiều: Chứng minh chủng CT07 tiết sắc tố đỏ gạch đặc trưng chứa các hoạt chất kháng sinh tự nhiên (Rotiorinols, Chaetoglobosin C) khuếch tán vào môi trường thạch, làm biến dạng đầu sợi nấm, ly giải tế bào khuẩn ty và ức chế hoàn toàn khả năng hình thành hạch nấm của R. solani.
• Hoàn thiện quy trình phân lập nhanh: Tối ưu hóa phương pháp bẫy giấy lọc xenlulozo ở tầng đất sâu $15\text{--}30\text{ cm}$, giúp rút ngắn thời gian thu thập và sàng lọc chủng nấm có hoạt tính cellulase cao từ 45 ngày xuống còn 20 ngày.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Giải pháp phân lập và ứng dụng Chaetomium cupreum CT07 mở ra tiềm năng lớn trong chuỗi sản xuất nông nghiệp sạch:

• Sản xuất chế phẩm sinh học (Bio-fungicide): Lên men bán rắn hoặc lên men chìm trên cơ chất rỉ đường (1%), cao nấm men ($2\text{--}3%$) kết hợp cám gạo và mùn cưa để sản xuất chế phẩm sinh học dạng bột đạt mật độ bào tử chuẩn $\ge 3,2 \times 10^6\text{ CFU/g}$.
• Quy trình ứng dụng trên đồng ruộng:
  • Xử lý giá thể/đất vườn ươm: Trộn chế phẩm với tỷ lệ $1\text{ kg}/100\text{ kg}$ phân chuồng hoai mục trước khi gieo hạt 7 ngày.
  • Tưới gốc phòng ngừa: Hòa tan dịch bào tử tưới vào vùng rễ cây con ở giai đoạn 3–5 ngày sau nảy mầm với liều lượng $20\text{ g}/10\text{ L}$ nước.
• Hiệu quả kinh tế (ROI) và Môi trường: Giúp các hợp tác xã rau an toàn giảm $50\text{--}70%$ chi phí mua thuốc bảo vệ thực vật hóa học, tỷ lệ cây con sống sót trong vườn ươm đạt $> 95%$, đáp ứng tiêu chuẩn xuất khẩu GlobalGAP và hữu cơ hữu hiệu.

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế: Nghiên cứu hiện mới dừng lại ở quy mô đánh giá in vitro trên đĩa petri và khảo nghiệm bước đầu tại phòng thí nghiệm; chưa khảo sát đầy đủ độ ổn định sinh học dưới tác động của tia cực tím (UV) ngoài đồng ruộng và sự biến thiên nhiệt độ thời tiết cực đoan.
• Hướng phát triển tiếp theo:
  1. Nghiên cứu công nghệ lên men quy mô pilot ($50\text{--}100\text{ L}$) và lựa chọn chất mang phụ gia (talc, than bùn, chất bám dính sinh học) để kéo dài hạn sử dụng của chế phẩm $> 12\text{ tháng}$.
  2. Chiết tách, tinh sạch và định lượng chính xác hàm lượng kháng sinh Chaetoglobosin và Rotiorinol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC-MS).
  3. Mở rộng đánh giá phổ đối kháng của chủng CT07 trên các loại nấm gây hại rễ nguy hiểm khác như Fusarium oxysporum, Phytophthora parasitica, Pythium ultimum và Sclerotium rolfsii.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Nghiên cứu sinh: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân lập vi sinh vật đất chuyên biệt, quy trình sinh học phân tử chuẩn (ITS-rDNA) và phương pháp xử lý số liệu thống kê ANOVA/Duncan.
• Kỹ sư & Nhà phát triển chế phẩm sinh học: Tiếp cận nguồn dữ liệu kỹ thuật về các chủng đối kháng tiềm năng cao, thông số ức chế sinh học và đặc tính hình thái quả thể/bào tử phục vụ thiết kế quy trình sản xuất công nghiệp.
• Doanh nghiệp nông nghiệp & Nông dân: Sở hữu giải pháp sinh học thay thế bền vững để kiểm soát triệt để bệnh lở cổ rễ, nâng cao giá trị thương phẩm của rau ăn lá và bảo vệ hệ sinh thái đất đai lâu dài.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để nuôi cấy và duy trì chủng nấm đối kháng Chaetomium cupreum CT07 là gì?

Chủng nấm CT07 phát triển tối ưu trên môi trường PDA hoặc CMA (Corn Meal Agar) ở nhiệt độ $28\text{--}30^\circ\text{C}$, pH thích hợp từ 5,5 đến 6,5 trong điều kiện chu kỳ 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối để kích thích tối đa sự hình thành quả thể chứa lông bao đặc trưng.

2. Tại sao phải cấy nấm Chaetomium trước 3 ngày trong thí nghiệm cấy kép với Rhizoctonia solani?

Do nấm bệnh Rhizoctonia solani có tốc độ lan rộng khuẩn ty cực kỳ nhanh (phát triển kín đĩa petri 9 cm chỉ sau 3 ngày), trong khi Chaetomium cần 7–10 ngày để hình thành hệ sợi và tiết kháng sinh khuếch tán. Việc cấy trước 3 ngày nhằm tạo điều kiện cho nấm đối kháng thiết lập hệ sợi và tiết enzyme ngoại bào phân giải cơ chất.

3. Chủng Chaetomium cupreum CT07 có thể tích hợp chung với phân bón vi sinh khác không?

Chaetomium cupreum hoàn toàn tương thích và hoạt động cộng sinh tốt với các vi sinh vật cố định đạm (Azotobacter), phân giải lân (Bacillus subtilis) và nấm rễ nội cộng sinh (Mycorrhiza). Tuy nhiên, tuyệt đối không phối trộn chung với các loại thuốc trừ nấm hóa học gốc đồng hoặc vôi bột chưa tôi ở nồng độ cao.

4. Cơ chế chính giúp Chaetomium cupreum tiêu diệt nấm Rhizoctonia solani trong đất là gì?

Cơ chế kép bao gồm: (1) Tiết hệ enzyme ngoại bào phong phú (chitinase, $\beta$-1,3-glucanase, cellulase) thủy phân trực tiếp thành tế bào nấm sợi; (2) Sinh tổng hợp các chất biến dưỡng thứ cấp (Chaetoglobosins, Rotiorinols) làm biến tính màng nguyên sinh chất và bất hoạt hạch nấm.

5. Chi phí sản xuất và thời gian thu hồi vốn khi ứng dụng quy trình này vào thực tế?

Sử dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ (cám gạo, rỉ đường, bã mía) giúp giá thành sản xuất dịch men vi sinh chỉ dao động khoảng 15.000 – 20.000 VNĐ/lít đậm đặc. Với hiệu quả giảm thiểu thiệt hại mùa vụ từ 30% xuống dưới 5%, các nông trại có thể thu hồi vốn đầu tư men giống và sinh khối ngay trong 01 vụ canh tác đầu tiên (45–60 ngày).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã giải quyết trọn vẹn và xuất sắc bài toán kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ trên cây cải thông qua việc tuyển chọn thành công chủng nấm đối kháng bản địa Chaetomium cupreum CT07. Với hiệu suất ức chế xuyên tâm đạt 83,4% trong điều kiện phòng thí nghiệm và độ tương đồng di truyền 99,6% theo chuẩn quốc tế NCBI, đề tài mở ra hướng đi đầy triển vọng cho việc sản xuất chế phẩm sinh học chất lượng cao phục vụ nền nông nghiệp hữu cơ Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu là nền tảng khoa học vững chắc để tiếp tục mở rộng quy mô ứng dụng từ phòng thí nghiệm ra cánh đồng thực nghiệm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Các cây rau nông nghiệp gồm cải bắp, cải xanh, cải ngọt, cải thìa, cải ngồng, súp lơ,. là những loại rau có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, có ý nghĩa to lớn về mặt y học, mang lại hiệu quả kinh tế cho người sản xuất. Ở nước ta, việc phát triển cây rau còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên một đơn vị diện tích, do đó các loại đang là loại rau được khuyến khích phát triển.Tuy nhiên, cũng chính sự gia tăng đó đã tạo điều kiện cho nhiều loại dịch hại xuất hiện và gây hại trong đó có nam Rhizoctonia solani làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất cây trồng. Việc phòng trừ bệnh bằng các biện pháp hóa học mặc dù có ưu điểm lớn là diệt trừ nhanh nhưng việc sử dụng quá mức có thé gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người và môi trường xung quanh.

Trước tình hình đó biện pháp phòng trừ sinh học trong sản xuất nông nghiệp đã được quan tâm nghiên cứu nhằm góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao độ phì nhiêu của đất và làm tăng năng suất cây trồng và giá trị của nông sản. Hiện nay, sử dụng vi sinh vật đối kháng có nguồn gốc từ đất dang là một biện pháp day tiềm năng. Trong số các loài nắm đối kháng có tiềm năng lớn ứng dụng trong phòng chống bệnh cây là nam thuộc chỉ Chaetomium. Đây là loài nam túi hoại sinh lớn nhất với trên 300 loài đã được mô tả (von Arx et al.

Trước tình hình đó đề tài “Đánh giá khả năng đối kháng của nam Chaetomium sp. phân lập từ đất nông nghiệp đối với nam Rhizoctonia solani” được thực hiện Mục tiêu: Chọn loc dong nam Chaefomium sp. từ đất có kha năng đối kháng nam Rhizoctonia solani gây chết rạp cây con trên các loại cải phục vụ phát triển chế phẩm sinh học kiểm soát nam bệnh. Yêu cầu: Phân lập nam Rhizoctonia solani gây bệnh trên 3 loại cải Xanh, Ngọt Thia.

Thu thập, phân lập nắm Chaetomium sp. Xác định khả năng đối kháng của nấm Chaefomium sp. đôi với nam Rhizoctonia solani trong điều kiện phòng thí nghiệm. Định danh dòng Chaetomium sp.

có hiệu suất đối kháng cao nhất. 1 Phạm vi nghiên cứu: Dé tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022, tại Công ty cô phần Vinamit và Khoa Khoa học Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh. Chương 2 TỎNG QUAN 2.1 Đặc diém của nam Chaetomium sp.1 Giới thiệu chung về nam Chaetomium sp. Chi Chaetomium thuộc Giới nam; Ngành: Ascomycota; Lớp: Sordariomycetes; Bộ: Sordariales; Ho: Chaetomiumceae; Chi: Chaetomium.

Bộ Sordariales có 120 chi va 700 loài khác nhau. Riêng chi Chaetomium có khoảng 300 loài khác nhau. Các loài Chaetomium sp. có đặc trưng riêng là có các lông bao, còn gọi là “sợi tóc”; cellulose là vật chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát sinh bao tử.

Nam Chaetomium sp. được tìm thấy trên nhiều loại bề mặt vật chất khác nhau ở điều kiện 4m áp và khô như: phân, rơm, giấy, hạt, mảnh vụn thực vật, lông chim.Nhung môi trường sống chủ yếu van là ở trong đất. Theo Soytong va Quimio các loài Chaetomium sp. có thé được phan lập bằng phương pháp bẫy nắm bằng mảnh giấy lọc đặt trên bề mặt đất âm trong đĩa petri (vì nam Chaetomium cô enzyme phân huỷ cellulose nên ta dé dang chọn lọc được nam Chaetomium sp.2 Đặc điểm hình thái của nắm Chaetomium sp.

Khuan lạc: phát triển nhanh trên môi trường thạch khoai tây, kích thước 6 — 9 cm sau 9 — 10 ngày nuôi cấy. Khuan lạc ban đầu có màu trắng như bông, sau chuyền sang màu xám nhạt, rồi dần chuyển sang màu nâu đen do sự hình thành các quả thể ascoma. Các quả thê này có dạng hình cầu hoặc hình quả lê, kích thước lớn, hình thành rải rác khắp bề mặt khuẩn lạc, tạo thành đám màu nâu đen khi già. Soi nam: Soi nam có vách ngăn, có mau xám hoặc nâu nhạt, moc từ môi trường và từ sợi khí sinh.

Cơ quan sinh sản: Quả thể hình quả lê phình ra ở giữa, có màu tối (đen hoặc nâu đen), có mở lỗ; có nhiều lông bao mọc xung quanh bên ngoài, kích thước 100 — 500 x 100 — 400 pm, với các kiểu dang và độ day mỏng khác nhau tuỳ loài; có loại thang hay uốn nếp kiểu gon sóng, loại ngoan ngoéo kiểu ruột già, loại chỉ ngoằn ngoèo trên đỉnh sợi, loại xoăn lọn, loại đơn giản, loại phân nhánh. Quả thể lúc còn non có hình cavat đến hình gậy chứa đựng từ 4 — 8 bào tử màu nâu. Khi quả thể chín các nang nắm giống như cột trụ hoặc hình chùy nhú lên từ đầu của quả thể, chứa các nang bào tử thăng hoặc không thắng hàng. Kích thước của nang nam là 68 — 84 x 5 — 7 um.

Các nang bào tử có màu, thành tế bào nhẫn, có nhiều hình dạng khác nhau (chủ yếu là hình quả chanh) với 1 lỗ mầm, kích thước 10 — 12 x 2. Bào tử bọc sinh ra từ túi bào tử hình trụ hoặc sợi nam, kích thước bao tử 7 — 8 x 5 —6 um ( Rai va Mukerrj, 1964). Các dang qua thé và bao tử của nắm Chaetomium (Wang và cs, 2016). Chú thích: A: B; C; D: Các dang qua thé của nắm Chaetomium: E; F; G; H; J: Các dạng bao tử của nấm Chaefomium 2.3 Đặc điểm phân bố của nam Chaetomium sp.

Nam Chaetomium sp. là một trong những nhóm nam lớn nhất trong hệ vi sinh vật đất. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, và sự phân bố của chúng cũng tuân theo quy luật như các loài vi sinh vật khác. Số lượng của nam Chaetomium sp.

chủ yêu nằm trong các tầng đất dưới. Đặc biệt ở tang đất sâu 25 — 30 cm thì số lượng Chaetomium sp.4 Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nam Chaetomium sp. Nguồn carbon: Khả năng hấp thụ nguồn carbon khác nhau của các chủng nắm Chaetomium sp. được ứng dụng trong việc sản xuất chế pham sinh học phòng trừ nắm bệnh hại cây trồng (Soytong, 1990).

Các chủng nắm này hấp thụ tốt một số loại đường như Saccharose, glucose, fructose, cellubioseza, D- lactose, D-maltose, tinh bột, ri đường, axit malic, L- arabinoea dé tong hợp năng lượng. Chúng hap thụ kém đối với rượu, N-amylic, citric acid. sử dụng rat tốt với các loại đường fructose, saccharose, galactose, ribose, cellobiose. Riêng rượu mannit, dextri va arabinose thì ức chế sinh trưởng của nam Chaetomium (Bainier, 1910).

Nhung cũng có những nghiên cứu cho thấy rang, trong môi trường không can đường thì Chaetomium sp. van phát trién tốt. Nguồn nitơ (đạm): Theo Soytong, 1988, thì các loài Chaetomium hap thụ cả hợp chất vô cơ và hữu cơ có chứa nitơ, nhưng ưa môi trường có chứa L-triptophane và L-glutamic. Prolin nhanh chóng bị phân giải bởi Chaetomium globosum và nỗ sử dụng các sản phẩm của quá trình phân giải đó.

lucknowense thích hợp sử dụng đạm nitrat natri, nitrat amon chúng sử dụng kém hon. Cũng theo Soytong thì có những loài hấp thụ tốt muối amon đó là C mollicellum, C. Trên môi trường có chứa casein ức chế sinh trưởng của nhiều loài Chaetomium. Độ 4m: Độ âm tương đối là ảnh hưởng đến sự nảy mam của bao tử va phát triển các co quan dinh dưỡng của nam Chaetomium.

Bào tử nam Chaetomium có thé nảy nam trong một phô độ âm tương đối rộng 30-100%, nhưng phù hợp nhất là 70- 100%. Bào tử nam Chaetomium có thé nảy mam cả khi ở các vùng đất khô hạn vì bản thân nó tiết ra ergosterol (Sekita và cs, 1981). Nhiệt độ: Nam Chaetomium phát triển trong một phô nhiệt độ rộng từ 3-52°C. Mỗi loài Chaetomium lại có khoảng nhiệt độ thích nghỉ riêng như: C.

Nguồn gốc xuất xứ có ảnh hưởng lớn đến khoảng nhiệt độ sinh trưởng thích hợp của nam Chaetomium. globosum, nhưng khi phân lập ở Trung Quốc trong vùng khí hậu ôn đới thì nhiệt độ thích hợp là 12 — 15°C và phát triển tối ưu cả ở Nga, nhưng cũng loài đó khi phân lập ở Thái Lan thì nhiệt độ thích hợp là 25-30°C. Khi 5 nhiệt độ lên cao quá thì nắm Chae chậm sinh trưởng, bề mặt của chúng map mô, không bằng phang (Umeda, 1981). Tuy nhiên nhiệt độ không anh hưởng rõ rệt đến hoạt tính đối khang của nam Chaetomium (Bordeau và Andrew, 1987).

Ánh sáng: Anh sáng ảnh hưởng đến hoạt động và qua trình sinh trưởng của nam Chaetomium: Trong điêu kiện tôi, qua trình sinh bao tử chậm hon trong điêu kiện chiêu sáng, nhưng sô lượng bào tử điêu kiện chiêu sáng liên tục sẽ ít hơn so với điêu kiện tôi. Trong điêu kiện sáng xen tôi thì lượng bào tử và lượng nâm sinh khôi thu được là cao nhât. Trong điều kiện chiếu sáng liên tục sẽ ức chế sự tạo thành sinh khối, sự hình thành bao tử và sự tăng trưởng phát triển của sợi nam.Nhung thì ánh sáng không có anh hưởng rõ rệt đến một số chủng nắm Chaetomium sp. pH: Là một yếu tô quan trọng liên quan đến sự sinh tồn của nam Chaetomium.

Mặc dù các loài Chaetomium khác nhau có thé phát triển ở các mức pH khác nhau, những loài cụ thé có độ pH tối ưu khác nhau, C.cupreum (pH 5-6), nhưng C./ucknowense thích hợp pH 3-8 (Soytong, 1991).4 Hoạt tính co bản của nắm Chaetomium sp. Một trong những hoạt tính cơ bản và quan trọng của loài Chaefomium sp. là khả nang sinh enzyme ngoại bao mạnh như cellulase. Cellulase là enzyme pho biến ở nhiều loài Chaetomium sp.

Day là enzyme khá quan trọng trong quá trình sống của loài nắm này. Chúng không chỉ giúp phân giải các xác thực vật tạo nguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng và phát triển của nam mà chúng còn tạo cơ chế dé xâm nhập va pha hủy một số loại nắm gây bệnh khác bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào nắm như ức chế hình thành thành tế bào |3 - D - glucan của nắm. Đây là một trong những cơ chế cơ bản dé ký sinh trên nắm bệnh của Chaetomium sp. Vì vậy, trong khóa luận này xác định hoạt tính cellulase của nam Chaetomium sp.

dé danh gia được một trong những cơ chế đối kháng của nam Chaetomium sp. với một số nam gây bệnh khác. Ngoài ra, Chaetomium sp. còn kích thích sinh trưởng của cây bằng cách tiết ergosterol làm tăng độ mùn trong đất, từ đó kích thích cây sinh trưởng làm tăng sức đề 6 kháng cho cây.

Nam Chaetomium sp. có kha năng sản sinh ra bao tử trong vùng đất của rễ cây trồng, có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh hơn so với nam bệnh, nhất là trong điều kiện đất có nhiều mùn hơn. còn có khả năng tổng hợp được các chất hoạt hóa sinh học nhóm Mycotoxin (Chaetoglobosin Q, R, T, U) va nhóm Epipolythiodioxopiperazine (Chaetoglobosin A, B, C).