Đồ án hcmute tổng hợp và đánh giá các đặc tính xúc tác giả enzyme horseradish peroxidase của hệ hemin biến tính bằng gelatin

Khám phá đồ án hcmute về đặc tính xúc tác của enzyme horseradish peroxidase từ hemin biến tính bằng gelatin trong nghiên cứu khoa học.

• Tác giả: Dương Anh Tú
• Người hướng dẫn: TS. Đào Vĩnh Ái
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Vật liệu
• Đề tài: Đánh Giá Đặc Tính Xúc Tác Của Enzyme Horseradish Peroxidase Từ Hemin Biến Tính Bằng Gelatin
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Các xúc tác cho quá trình tạo hydrogel
• 1.2. Enzyme Horseradish Peroxidase (HRP enzyme)
• 1.3. Hydrogel trên cơ sở Gelatin
• 1.4. Cơ sở, mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài
• 1.5. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Hóa chất và thiết bị sử dụng trong thực nghiệm
• 2.2. Thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Tổng hợp hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin
• 2.3.1. Tổng hợp Gelatin–Histamine
• 2.3.2. Tổng hợp Gelatin–Histamine–Hemin
• 2.4. Hoạt hóa Hemin trong môi trường kiềm (Hemin–NaOH)
• 2.5. Hiệu suất tổng hợp Gelatin–Histamine–Hemin
• 2.6. Đánh giá hoạt lực của Gelatin–Histamine–Hemin trên Guaiacol
• 2.7. Đánh giá hoạt tính xúc tác của hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin trên Pyrogallol
• 2.8. Xác định độc tính trên nguyên bào sợi (Fibroblast)
• 2.8.1. Phương pháp nhuộm Sulforhodamine B
• 2.8.2. Phương pháp nhuộm Acridine Orange/Ethidium Bromide
• 2.9. Đánh giá khả năng tạo hydrogel trên Ge–Tyr và khả năng thay thế enzyme HRP
• 2.10. Khảo sát thời gian gel hóa khi thay đổi hàm lượng H2O2
• 2.11. Khảo sát thời gian gel hóa khi thay đổi hàm lượng xúc tác
• 2.12. Đánh giá khả năng tạo hydrogel của hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin, Hemin–NaOH và Horseradish Peroxidase enzyme
• 2.13. Các phương pháp phân tích sản phẩm
• 2.13.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H–NMR)
• 2.13.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT–IR)
• 2.13.3. Quang phổ tán xạ Raman
• 2.13.4. Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV–Vis)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tổng hợp hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin
• 3.1.1. Tổng hợp Gelatin–Histamine
• 3.1.2. Tổng hợp Gelatin–Histamine–Hemin
• 3.2. Đánh giá hoạt lực trên Guaiacol
• 3.3. Đánh giá hoạt tính xúc tác trên Pyrogallol
• 3.4. Kết quả gây độc tế bào nguyên bào sợi
• 3.4.1. Kết quả theo phương pháp nhuộm Sulforhodamine B
• 3.4.2. Kết quả theo phương pháp nhuộm Acridine Orange/Ethidium Bromide
• 3.5. Đánh giá khả năng tạo hydrogel trên Gelatin–Tyramine
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Horseradish Peroxidase HRP và Hemin

Khóa luận tập trung vào việc đánh giá đặc tính xúc tác của hệ horseradish peroxidase (HRP) biến tính từ hemin bằng gelatin. HRP, một oxidant enzyme, nổi tiếng với hoạt tính xúc tác cao trong nhiều phản ứng sinh hóa. Hemin, nhóm prostetic của HRP, đóng vai trò trung tâm trong hoạt động xúc tác của enzyme. Tuy nhiên, hemin tự do thường khó hòa tan trong môi trường nước trung tính, hạn chế ứng dụng. Nghiên cứu này đề xuất sử dụng gelatin, một polymer sinh học tự nhiên, để biến tính hemin, cải thiện độ hòa tan và ổn định của nó.

1.1 Đặc tính của Horseradish Peroxidase HRP

Horseradish peroxidase (HRP) là một enzyme phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, từ analytical biochemistry đến biotechnology. HRP có đặc tính xúc tác mạnh mẽ, đặc biệt trong các phản ứng oxy hóa khử, dựa trên hoạt động của nhóm hemin. Các đặc điểm quan trọng của HRP bao gồm enzyme activity, substrate specificity, kinetic parameters (theo Michaelis-Menten kinetics), turnover number, enzyme stability (bao gồm thermal stability và pH stability). Hiểu rõ các đặc tính này là cơ sở để đánh giá hiệu quả của hệ gelatin-hemin biến tính trong nghiên cứu.

1.2 Hemin và thách thức trong ứng dụng

Hemin, là một phức hợp porphyrin chứa ion sắt, là thành phần hoạt động xúc tác chính trong HRP. Tuy nhiên, hemin tự do có độ hòa tan thấp trong môi trường nước trung tính, hạn chế ứng dụng trực tiếp. Việc biến tính hemin nhằm mục đích tăng độ hòa tan, ổn định và hiệu quả xúc tác. Protein denaturation có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của hemin, vì vậy việc lựa chọn phương pháp biến tính phù hợp là rất quan trọng. Nghiên cứu này sử dụng gelatin để giải quyết vấn đề này.

II. Phương pháp biến tính Hemin bằng Gelatin và Enzyme Immobilization

Khóa luận trình bày chi tiết phương pháp biến tính hemin bằng gelatin. Đây là một dạng enzyme immobilization, trong đó hemin được gắn vào ma trận gelatin. Phương pháp này bao gồm các bước tổng hợp gelatin-enzyme conjugate thông qua quá trình bioconjugation hoặc crosslinking. Protein-protein interaction giữa gelatin và hemin đóng vai trò quan trọng trong quá trình này. Việc đánh giá hiệu quả của quá trình biến tính dựa trên các kỹ thuật phân tích như spectroscopy (UV-Vis, FT-IR, Raman) và chromatography. Mục tiêu là tạo ra một hệ immobilized enzyme với hoạt tính xúc tác cao và độ ổn định tốt.

2.1 Tổng hợp và đặc trưng hệ Gelatin Hemin

Quá trình tổng hợp hệ gelatin-hemin được mô tả chi tiết, bao gồm các điều kiện phản ứng, tỷ lệ phối trộn, và các phương pháp kiểm soát chất lượng. Các kỹ thuật spectroscopy như UV-Vis, FT-IR, và Raman được sử dụng để xác định cấu trúc và tính chất của sản phẩm. Enzyme characterization bao gồm việc đánh giá peroxidase activity bằng các enzymatic activity assay, sử dụng các chất nền như guaiacol và pyrogallol. Spectrophotometry được sử dụng để đo nồng độ sản phẩm phản ứng, từ đó tính toán hoạt tính enzyme.

2.2 Đánh giá enzyme activity và catalytic properties

Hoạt tính xúc tác của hệ gelatin-hemin được đánh giá thông qua việc xác định kinetic parameters, bao gồm Michaelis-Menten constant (Km) và turnover number (kcat), sử dụng phương pháp Michaelis-Menten kinetics. Catalytic efficiency (kcat/Km) được sử dụng để so sánh hiệu quả xúc tác của hệ gelatin-hemin với HRP tự do. Substrate binding và reaction mechanism được phân tích để hiểu rõ hơn về quá trình xúc tác.

III. Ứng dụng và Kết luận

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực enzyme engineering và biocatalysis. Hệ gelatin-hemin biến tính có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như biosensors, bioremediation, và công nghiệp. Application of HRP được mở rộng nhờ khả năng cải thiện độ ổn định và hòa tan của hemin. Kết quả nghiên cứu đóng góp vào việc phát triển các industrial enzyme hiệu quả và bền vững. Khóa luận cũng nêu bật những hạn chế và đề xuất cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1 Ứng dụng tiềm năng của hệ gelatin hemin

Hệ gelatin-hemin biến tính, với hoạt tính xúc tác cải thiện và độ ổn định cao, có nhiều ứng dụng tiềm năng. Bioremediation là một lĩnh vực ứng dụng hứa hẹn, sử dụng hệ thống này để xử lý các chất ô nhiễm môi trường. Trong lĩnh vực biosensors, hệ này có thể được sử dụng để phát triển các cảm biến sinh học nhạy và đặc hiệu. Các ứng dụng công nghiệp khác cũng được cân nhắc, như trong sản xuất các sản phẩm hóa chất xanh.

3.2 Kết luận và hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu đã thành công trong việc tổng hợp và đánh giá đặc tính xúc tác của hệ gelatin-hemin. Kết quả cho thấy hệ này có hoạt tính xúc tác cao hơn so với hemin tự do. Tuy nhiên, việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng và khảo sát thêm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cần được thực hiện trong các nghiên cứu tiếp theo. Việc nghiên cứu enzyme purification và protein purification kỹ hơn cũng cần được xem xét để đảm bảo độ tinh khiết và hiệu quả của sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Hydrogel Hydrogel là mạng lưới polymer ưa nước có cấu trúc không gian ba chiều, có thể trương trong nước mà không tan (trong thời gian ngắn), có khả năng hấp thụ lượng nước lớn gấp hàng nghìn lần khối lượng khô của chúng. Tính chất hấp thụ nước của hydrogel khiến chúng trở nên có ích trong những ứng dụng thực tế. Hydrogel có thể được điều chế bằng các phương pháp khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc và ứng dụng.

Phương pháp chung của sự hình thành hydrogel được mô tả trong biểu đồ sơ đồ Hình 1.1 trong đó quá trình tạo liên kết ngang được hình thành bằng các phương pháp vật lý hoặc hoá học giữa các chuỗi polymer [12]. Sơ đồ biểu diễn các bước hình thành một hydrogel [12] Liên kết ngang về mặt vật lý rất được quan tâm trong thời đại hiện nay do không có các tác nhân liên kết ngang và tương đối dễ sản xuất. Các hydrogel vật lý (còn gọi là hydrogel tự lắp ráp) được hình thành khi các đại phân tử tự lắp ráp thông qua các tương tác phân tử thứ cấp, không cộng hóa trị như liên kết kỵ nước, tĩnh điện và liên kết hydro. Trong gel liên kết ngang vật lý, sự hòa tan bị ngăn cản bởi các tương tác vật lý, tồn tại giữa các chuỗi polymer khác nhau (Hình 1.

Tất cả những tương tác này thuận nghịch và có thể bị gián đoạn bởi những thay đổi về điều kiện vật lý hoặc do tác dụng của ứng suất [12]. 1 do an Hình 1. Sơ đồ biểu diễn liên kết ngang vật lý của hydrogel [12] Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp vật lý (gel vật lý) là mối tương tác vật lý giữa các phân tử polymer bao gồm các tương tác: tương tác tạo liên kết hydro, tương tác tại vị trí kị nước, tương tác ion và tương tác tạo phức lập thể. Tương tác tạo liên kết hydro: tương tác liên kết hydro xảy ra giữa một cặp nguyên tử có ái lực điện tử cao.

Một số gel đã được điều chế thông qua tương tác liên kết H mạnh giữa các chuỗi có nhóm chức năng hydroxyl. Sự có mặt của hai nhóm chức năng tạo ra liên kết hydro với nước để tạo thành cấu trúc gel. Hydrogel được mở rộng bởi kỹ thuật này bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau như nồng độ polymer, tỷ lệ mol của mỗi polymer, loại dung môi, nhiệt độ dung dịch và mức độ liên kết của các nhóm chức năng trong polymer. Khi nồng độ polymer cao hơn, gel ngày càng trở nên có tổ chức hơn và ổn định hơn do tương tác liên kết hydro nhiều hơn.

Sự hình thành liên kết hydro chỉ xảy ra khi các nhóm carboxylic acid được proton hóa. Tuy nhiên, mạng lưới liên kết hydro sẽ bị pha loãng và phân tán trong vài giờ [13]. Tương tác tạo liên kết hydro của hyaluronic acid và methylcellulose [13] 2 do an Tương tác tại vị trí kỵ nước: Các hydrogel được hình thành thông qua tương tác kỵ nước chủ yếu được điều chế bằng cách đồng trùng hợp monomer ưa nước với một lượng nhỏ comonomer kỵ nước, điển hình nhất là theo cơ chế gốc tự do. Lực tương tác kỵ nước tương đối mạnh hơn các lực liên phân tử khác (tức là tương tác Van der Waals hoặc liên kết hydro).

Độ bền của các tương tác kỵ nước phụ thuộc vào một số yếu tố bao gồm nhiệt độ, số lượng nguyên tử carbon trên các khối kỵ nước và hình dạng của các khối kỵ nước. Để tạo ra các tương tác kỵ nước mạnh giữa các chuỗi polymer ưa nước, một số lượng lớn polymer kỵ nước gốc carbon được sử dụng. Đặc biệt, nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến tương tác kỵ nước giữa các phân đoạn polymer kỵ nước và tương tác kỵ nước giữa các phân đoạn polymer ưa nước và phân tử nước. Các dẫn xuất cellulose được alkyl hóa phong phú nhất là methyl, ethyl, hydroxyetyl và hydroxypropyl methyl cellulose.

Khi đun nóng các dung dịch của các polymer này trên một nhiệt độ nhất định, tùy thuộc vào mức độ alkyl hóa xenlulozơ, người ta thu được các hydrogel. Tương tác kỵ nước xảy ra giữa các nhóm hydroxyl được alkyl hóa và ở nhiệt độ thấp, các chuỗi cellulose bị hydrate hóa, trong khi ở nhiệt độ cao, nước bị đẩy khỏi chuỗi và các nhóm hydroxyl được alkyl hóa tương tác với nhau để tạo thành hydrogel [13]. Tương tác kỵ nước [13] Tương tác ion: Các polymer ionic có thể được liên kết ngang bằng cách bổ sung các tiền tố hóa trị hai hoặc ba. Phương pháp này làm nền tảng cho nguyên tắc tạo dung dịch polyelectrolyte (ví dụ, Na+ + alginate-) với một ion đa hóa trị có điện tích trái dấu (ví dụ, Ca2+ + 2Cl-); tức là, cơ chế trao đổi ion đơn giản xảy ra để tạo thành hydrogel.

Alginate là một ví dụ nổi tiếng về một polymer có thể được liên kết ngang bằng tương tác ion. Nó là một polysaccharide với dư lượng mannuronic và glucuronic acid và có thể được liên kết ngang bởi các ion calci. Martínez-Ruvalcaba 3 do an và cộng sự. đã phát triển liên kết ngang về mặt ion của hai polyelectrolytes tự nhiên, chitosan và xanthane; vì chitosan là một polymer polyelectrolyte cation với các anion nhóm amin có thể ion hóa, xanthane được sử dụng làm chất liên kết ngang ion để tạo thành hydrogel.

Các liên kết ngang thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng và pH sinh lý; do đó, chúng đặc biệt hấp dẫn trong các ứng dụng chữa lành vết thương, hệ dẫn truyền thuốc và kỹ thuật mô [13]. Tương tác ion [13] Tương tác tạo phức lập thể: xảy ra giữa các chuỗi polymer hoặc các phân tử nhỏ có thành phần hóa học tương tự nhưng lập thể khác nhau. Đặc biệt, tương tác lập thể xảy ra mạnh mẽ giữa các khối polylactide với L– và D– lập thể. Các polymer tự nhiên cũng có thể tạo liên kết ngang bằng tương tác tạo phức lập thể.

Ghép các đồng phân L– và D– có thể tạo ra các hydrogel có tính chất tương thích sinh học và phân hủy sinh học tốt mà không đòi hỏi việc sử dụng các điều kiện biến tính khắc nghiệt như dung môi hữu cơ, hóa chất tạo liên kết ngang [13]. Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp hóa học (gel hóa học) là mối tương tác hóa học giữa các phân tử polymer. Trong gel liên kết ngang về mặt hóa học, các liên kết cộng hóa trị hình thành giữa các chuỗi polymer khác nhau. Thông thường, các biến đổi hóa học được thực hiện để tạo ra các dẫn xuất cellulose bằng cách ester hóa hoặc ether hoá.

Liên kết ngang hóa học là một phương pháp rất linh hoạt để tạo ra hydrogel có độ ổn định cơ học tốt. Hydrogel loại này bền hơn so với hydrogel liên kết ngang vật lí bởi liên kết ngang được tạo thành là liên kết cộng hóa trị. Hydrogel được tạo thành bởi phương pháp này thường có cấu trúc ổn định trừ khi các yếu tố 4 do an không bền được đưa vào một cách có chủ ý trong mạng lưới. Tuy nhiên, các chất liên kết ngang được sử dụng thường là các hợp chất độc hại, chúng sẽ được chiết xuất từ gel trước khi chúng được sử dụng [12].

Tương tác lập thể D – lactide và L – lactide [13] Hình 1. Sơ đồ biểu diễn liên kết ngang hoá học của hydrogel [12] Liên kết ngang bằng phản ứng hóa học của các nhóm bổ sung: các polymer ưa nước có một số nhóm ưa nước là NH2, COOH, OH có thể được sử dụng để phát triển hydrogel. Các phản ứng như amin-cacboxylic acid hoặc phản ứng isocyanate-OH / NH2 hoặc sự hình thành base Schiff có thể được sử dụng để hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các chuỗi polymer [2]. 5 do an Hình 1.

Tạo liên kết ngang bằng phản ứng Schiff–base [2] Liên kết ngang bằng aldehyde: các polymer ưa nước có nhóm –OH, ví dụ rượu polyvinyl có thể được liên kết ngang thông qua glutaraldehyde. Để hình thành liên kết ngang, các điều kiện chặt chẽ được áp dụng (pH thấp, thêm methanol làm chất tắt mạch, nhiệt độ cao). Ngoài ra, các polymer có nhóm amine có thể được liên kết ngang bằng cách sử dụng cùng một chất liên kết ngang trong điều kiện đơn giản trong đó base Schiff được hình thành. Nó được thiết kế đặc biệt để tổng hợp protein liên kết ngang như gelatin, albumin và amine chứa polysaccharides [14].

Tạo liên kết ngang bằng Glutaraldehyde [14] Liên kết ngang bằng phương pháp ngưng tụ: polyester và polyamide có thể được tổng hợp thông qua phản ứng trùng ngưng giữa các nhóm –OH hoặc –NH2 với – COOH hoặc các dẫn xuất tương ứng. Những phản ứng này có thể được sử dụng để tổng hợp hydrogel. Thuốc thử hiệu quả cao cho các polymer ưa nước liên kết ngang có nhóm amide là N, N- (3 dimetylaminopropyl) -N-etyl cacbodiimit (EDC). Để hạn 6 do an chế bất kỳ phản ứng phụ nào và có mật độ liên kết ngang trong hydrogel nhiều hơn, N-hydroxysuccinimide đã được thêm vào trong quá trình phản ứng.

Liên kết ngang bằng sự trùng hợp bức xạ: Kỹ thuật trùng hợp bức xạ là một kỹ thuật mới nổi để tổng hợp hydrogel dựa trên cellulose. Các bức xạ năng lượng cao như tia gamma và chùm electron được sử dụng để trùng hợp các chất không no. Các polymer không tan trong nước có thể được chuyển thành hydrogel bằng cách sử dụng bức xạ năng lượng cao. Các bức xạ ion hóa, chẳng hạn như chùm điện tử và tia γ, có năng lượng cao đến mức cần thiết để ion hóa các phân tử đơn giản trong không khí hoặc nước.

Trong quá trình chiếu xạ dung dịch polymer, nhiều vị trí phản ứng được tạo ra cùng với các sợi polymer. Sau đó, sự kết hợp của các gốc này dẫn đến hình thành một số lượng lớn các liên kết ngang. Bức xạ chùm điện tử (bức xạ ion hóa) bắt đầu liên kết ngang và tạo ra hydrogel tinh khiết, vô trùng và không có cặn. Không giống như các phương pháp liên kết ngang hóa học thông thường, phương pháp này không yêu cầu thêm chất xúc tác hoặc bất kỳ chất phụ gia nào khác để thay đổi vật liệu.

Sử dụng phương pháp này, có thể dễ dàng kiểm soát mức độ liên kết ngang và kích thước lỗ của hydrogel, yếu tố quyết định mức độ trương, bằng cách thay đổi cường độ chiếu xạ [12]. Liên kết ngang bằng phản ứng trùng hợp gốc tự do: các hydrogel liên kết ngang về mặt hóa học có thể được tạo ra bằng cách trùng hợp gốc tự do với các polymer ưa nước được dẫn xuất nhóm polymer hóa, bên cạnh sự trùng hợp gốc tự do của hỗn hợp vinyl monomer. Để tổng hợp gel thông qua con đường này, các polymer ưa nước tự nhiên, tổng hợp và bán tổng hợp đã được áp dụng [12].